（生物化学与分子生物学专业论文）奎尼酸生物合成的代谢工程研究.pdf

奎尼酸生物合成的代谢工程研究中文摘要中文摘要奎尼酸是一种具有极高价值的精细化工产品和医药中间体，在医药工业、食品工业、化工等行业均有较大的用途。本研究是将代谢工程技术应用于产奎尼酸基因工程菌的构建。根据代谢工程原理系统分析了细胞代谢网络，并利用d n a重组技术合理设计细胞代谢途径及其遗传修饰，进而完成细胞特性改造。目的是在大肠杆菌中构建奎尼酸生物合成途径，将碳代谢流最大程度的引向奎尼酸生成的方向。利用大肠杆菌莽草酸途径合成新的代谢物奎尼酸，需要提高上游几种代谢中间产物p e p 、e 4 p 、d a h p 、d h q 的含量，与之对应的编码其合成酶的几种基因分别是p p s a ，t k t a ，a r o g ，a r o b 。另外须在宿主细胞引入编码与奎尼酸合成有关的异源酶基因扩展代谢途径，然后串联表达酶基因，同时适量增加不同种属的多个关键酶的有效含量，改善限速反应。利用同源重组进行基因整合和基因破坏，改造染色体结构定向改变微生物代谢途径。本文主要从以下几个方面对奎尼酸基因工程菌进行了改造：1 编码奎尼酸脱氢酶的q u t b 基因是来自于构巢曲霉。在现有的基础上构建了一系列包含q u t b 基因的表达重组质粒。s d 序列与起始密码子不同距离的p b v q u t b l ，p b v q u t b 2 ；具有q u t b 双拷贝三基因串联的p b v q u t b q u t b a r o g ；具有p p s a 、t k t a 、q u t b 三基因串联的p b v p t b ，以及新构建的单基因重组质粒p e t q u t b ，p b v t a c q u t b ，p t r c q u t b 。并对含有q u t b 基因的一系列重组质粒在大肠杆菌中进行了表达与否的验证。结果显示p t r c q u t b ，p b v t a c q u t b 没有特异的蛋白表达带，说明p t r c 9 9 a 和p b v t a e 载体不适合用于q u t b 基因的表达。p e t q u t b 经过i p t g 诱导后有特异的蛋白表达，并且在2 - - 5 小时内随着时间的延长而增加，但是时间更长( 7 h ) 则因为蛋白降解而出现表达蛋白减少的迹象。p b v q u t b l 和p b v q u t b 2 同本实验室保存的p b v q u t b 没有出现明显的蛋白表达量上的差异，这说明利用p b v 2 2 0 表达载体表达q u t b 基因，起始密码子与s d 序列之间距离的远近并不是影响其表达量的关键。含有两个q u t b 基因和一个a r o g 基因的多基因串连质粒p b v q u t b q u t b a r o g ，经过热诱奎尼酸生物合成的代谢工程研究中文摘要导，也出现了非常明显的表达条带。2 对含有q u t b 基因在大肠杆菌中可以表达几种重组质粒进行酶活测定，与含有p b v q u f l 3 的对照菌相比，含有p b v q u t b l ，p b v q u t b 2 的菌株的奎尼酸脱氢酶的酶活没有明显变化，三基因串联的p b v q u t b q u t b a r o g 甚至出现了酶活降低的现象。3 成功地从粗糙脉孢菌的基因组中克隆了奎尼酸脱氢酶的基因口口一3 ，并与几种表达载体连接得到了p b v q a 3 、p e t q a 3 、p b v t a c q a 3 、p t r c q a 3 ，但是这些质粒重组子在大肠杆菌中均没有观察到该基因的特异表达条带。4 结合卵一3 基因的密码子的特点和计算机模拟的m r n a 二级结构，对g 一3 基因的密码子和m r n a 二级结构进行改造，优化该基因的密码子结构，降低形成m r n a 二级结构的自由能，得到新的基因q a 3 r g m 。构建的p b v q a 3 r g m重组质粒在大肠杆菌中成功的表达了奎尼酸脱氢酶，酶活也比对照明显提高。同时还构建了p p s a 、t k t a 、q a 3 r g 印三基因串联的重组质粒p b v p t a 。5 成功的构建了p u c - d k 、p u c d a k 、p u c d b k 并制备了线性化片段d k 、d a k 、d b k ，为基因敲除和基因替换做好了准备。利用r e d 重组系统成功的地进行了基因敲除和基因替换，并稳定了敲除和替换菌株的基因型，把这株菌株定名为大肠杆菌3 1 k 。6 成功的构建奎尼酸发酵的工程菌5 、a p 、b 、a 、b p 、5 k 、a _ p k 、b k 、a k 、b p k 、2 2 0 k 。通过实验室摇瓶初步发酵，在硅胶板上可以初步确定，菌株a p ( 3 1 b k p b v p t a ) 产生的奎尼酸量最大，也最稳定。7 将菌株a p 扩大摇瓶发酵的规模，然后经过树脂富集，h p l c 制备，得到了微量的奎尼酸样品。经过红外光谱、核磁共振、电子喷雾质谱以及紫外、液质联用等的鉴定可以确定与奎尼酸标准品无差异，由此可以确定我们利用生物合成并且分离鉴定了奎尼酸。总之，为了合成奎尼酸并提高其产量，本研究从分子进化、基因重组、网络构建等不同的方面对奎尼酸生物合成进行了许多有益尝试，既为研究奎尼酸的生物合成奠定了基础，也为基因工程应用于代谢工程提供一定的借鉴意义。关键词：奎尼酸，代谢工程，奎尼酸脱氢酶，密码子，r e d 重组，基因敲除奎尼酸生物合成的代谢工程研究英文摘要a b s t r a c tq u i n i ca c i di sa ni m p o r t a n tf i n ec h e m i c a lp r o d u c ta n di n t e r m e d i a t e so fd r a gs y n t h e s i s ，w h i c hc a nb en u m e r o u s l yu s e di nd r a gs y n t h e s i s ，f o o da n dc h e m i s t r yi n d u s t r y i nt h i ss t u d ym e t a b o l i ce n g i n e e r i n ga r ea p p l i e df o rg e n e t i ce n g i n e e r i n gb a c t e r i ao fq u i n i ca c i d t h i sw o r ka b o u tt h ea n a l y s i so fm e t a b o l i cp a t h w a ya n dd e s i g n i n gr a t i o n a lg e n e t i cm o d i f i c a t i o ni st oo p t i m i z ec e l l u l a rp r o p e r t i e sb yu s i n gp r i n c i p l eo fm o l e c u l a rb i o l o g y t h eo b j e c t i o ni st oe s t a b l i s ha na p p r o a c ht oq u i n i ca c i db i o s y n t h e s i si ne c o l ia n dc h a n g et h ec a r b o nf l o wt or e d i r e c ti n t ot h eq u i n i ca c i db i o s y n t h e s i sb r a n c h p r o d u c t i o no fan e wm e t a b o l i t eq u i n i ca c i d u s e ds h i k i m a t ep a t h w a yi ne c o l i , i ti sn e c e s s a r yt oe n h a n c eu p r i v e rm e t a b o l i ci n t e r m e d i a t e ，s u c ha sp e p 、e 4 p 、d a h pa n dd h qw h i c hc o r r e s p o n d i n gg e n ei sp p s a 、t k t a 、a r o g ，a r o b ，r e s p e c t i v e l y i ti sn e c e s s a r yt oe x t e n dm e t a b o l i cp a t h w a yb yi n t r o d u c t i o no fah e t e r o g e n o u sg e n eq u t bo rq a 一3i n t ot h eh o s tc e l l d o u b l es p e c i f i ce n z y m eg e n e so rt h r e eo n e sc o - e x p r e s s e di nas i n g l ep l a s m i dv e c t o rt oi m p r o v et h ee n z y m e s r a t e l i m i t i n gr e a c t i o n s b o t hd i s r u p t i o no ft h ea r o dg e n ea n dd i r e c t e d s i t ei n s e r t i o no ft h ea r o bo rq a - 3o rq u t bg e n em a k eu s eo fh o m o l o g o u sr e c o m b i n et oc h a n g ec h r o m o s o m es t r u c t u r ea n dd i r e c t i o n a l l ys h i f tm e t a b o l i cp a t h w a yo f m i c r o o r g a n i s m t h i st h e s i si m p r o v e dg e n e t i ce n g i n e e r i n gb a c t e r i ao f q u i n i ca c i db i o s y n t h e s i so nt h ef o l l o w i n gr e s p e c t s ：1 as e r i e so fr e c o m b i n a n tp l a s m i di n c l u d i n gq u t bg e n ee n c o d e dq u i n a t ed e h y d r o g e n a s ef r o ma s p e r g i l l u sn i d u l a n sw e r ec o n s t r u c t e d ，s u c ha sp b v q u t b la n dp b v q u t b 2i n v o l v e dd i f f e r e n td i s t a n c eb e t w e e ns ds e q u e n c ea n ds t a r tc o d o n ；p b v q u t b q u t b a r o go f t h r e eg e n e si ns e r i e s ；p b v p t bc o n t a i n e d p p s a 、t k t a 、q u t b ，a sw e l la sp e t q u t b ，p b v t a c q u t b ，p t r c q u t bc o n t a i n e ds i n g l eg e n eq u t b t h e s er e c o m b i n a n tp l a s m i d sw e r ee x p r e s s e di ne c o l ia n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a tp t r c q u t ba n dp b v t a c q u t bl a c k e ds p e c i f i cp r o t e i nb a n d ，e x p l a i n i n gt h ev e c t o r sp t r c 9 9 aa n dp b v t a ca r en o ts u i t a b l ef o rt h ee x p r e s s i o nt h a tu s e df o rt h eg e n eo fq u t b t h ep e t q u t be x p r e s s e st h es p e c i f i cp r o t e i nb a n da f t e ri p t gi n d u c e d ，a n di n2 - 5h o u r st h ee x p r e s s i o ni n c r e a s e sa l o n gw i t hh o r a r ye x t e n s i o nb u tt i m ei sl o n g ( 7h ) t h e nt oa p p e a rt h ee v i d e n c et h a te x p r e s s i o np r o t e i nr e d u c ef o rp r o t e i nd e g r a d a t i o n p b v q u t b la n dp b v q u t b 2c o m p a r e dw i t ht h ep b v q u t bk e p ti nt h i sl a b o r a t o r yd o n ta p p e a rt h eo b v i o u sd i f f e r e n c ea b o u tp r o t e i ne x p r e s s i o n t h i se l u c i d a t i o ns h o w st h a tt h ed i s t a n c eb e t w e e ns t a r tc o d o na n ds ds e q u e n c ew a sn o tt h ek e yt oa f f e c tt h ee x p r e s s i o no fq u t b奎尼酸生物合成的代谢工程研究英丈摘要g e n ew h e nv e c t o rp b v 2 2 0w a su s e d p b v q u t b q u t b a r o gi m p l i e dt w oq u t ba n do n ea r o ga l s oa p p e a r sv e r yo b v i o u s l ys p e c i f i cp r o t e i nb a n d 2 e n z y m ea c t i v i t yo fq u i n a t ed e h y d r o g e n a s ee x p r e s s e db yp b v q u t b l ，p b v q u t b 2i sn o to b v i o u sd i s t i n g u i s hc o m p a r e dw i t hr e f e r e n c eb yp b v q u t b ，b u tb yp b v q u t b q u t b a r o gd e c r e a s e s 3 g 口一3g e n ew a sc l o n e ds u c c e s s f u l l yf r o mg e n o m eo f n e u r o s p o r ac r a s s aw h i c ha l s oe n c o d e sq u i n a t ed e h y d r o g e n a s ea n dc o n s t r u c t e di n t ov e c t o r st oo b t a i np b v q a 3 、p e t q a 3 、p b v t a c q a 3 、p t r c q a 3 b u tm e yd o n te x p r e s si ne c o l i 4 a c c o r d i n gt oc o d o nu s a g eo f q a 一3a n dc o m p u t e rs i m u l t a t i n gi t sm r n as e c o n d a r ys t r u c t u r e ，s o m ec o d o n sw e r ec h a n g e da n dl o w e r e df r e ee n e r g yal o tf r o m3 7 4 3k j m o lt o 一8 0 5k j m 0 1 n e wg e n eq a 3 r g 。w a se x p r e s s e di nec o l ia n da l s ot h ee n z y m ea c t i v i t yo f q u i n a t e5 - d e h y d r o g e n a s ec o u l db ea c c u r a t e l ys u r v e y e da n di n c r e a s e do b v i o u s l y p b v p t ai n c l u d i n g p p s a 、t k t a 、q d 3 rg ，_ a l s ow a sc o n s t r u c t e d 5 p u c d k 、p u c d a k 、p u c d b kw e r ec o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l ya n dl i n e a rf r a g m e n td k 、d a k 、d b kw e r ep r e p a r e df o rg e n ek n o c k o u ta n dg e n er e p l a c e m e n t i no r d e rt oi n c r e a s i n gt h ei nv i v oc a t a l y t i ca c t i v i t yo f s p e c i f i ce n z y m e s ，t h ec h r o m o s o m a lg e n o m eo fec o l iw a sm o d i f i z a t e db yu s i n gr e dr e c o m b i n a t i o ns y s t e m s t a b i l i z i n gt h eg e n o t y p ea n dn e ws t r a i nw a sn a m e da s3 1 b k 6 a f t e rt r a n s f o r m i n gt h er e c o m b i n a n tp l a s m i di n t o3 1 b k ，t h ef l a s k sf e r m e n t a t i o nd e m o n s t r a t et h a ts t r a i na p ( 3 1 b k p b v p t a ) h a sh i 【g h e ra n ds t a b l e rq u i n i ca c i dp r o d u c t i o ni ne n g i n e e r i n gb a c t e r i u m5 、a p 、b 、a 、b p 、5 k 、a p k 、b k 、a k 、b p k 、2 2 0 kt h r o u g hs i l i c ag e lc h r o m a t o g r a p h y 7 t h ef l a s k sf e r m e n t a t i o no fs t r a i na ph a sb e e ne n l a r g e da n dg a i n e dad r a mo fq u i n i ca c i ds a m p l ep a s s e dt h r o u g he n r i c h m e n tb yr e s i n ，h p l cp r e p a r a t i o ne ta 1 n m r ，f t - i rm i c r o s c o p e ，i o nt r a p ( h c t ) s p e c t r u m ，l c m sa n du vi d e n t i f i e dt h es a m p l ew a sn o td i f f e r e n c ew i t hs t a n d a r d t h i sc o n f o r m st h a tw eu t i l i z et h em e t h o d o fb i o s y n t h e s i st os y n t h e s i z e ，p u r i f ya n di d e n t i f yt h ep r o d u c t i o nq u i n i ca c i d i ns u m m a r y , t h i ss t u d yt r i e st oa c t i v e l ye x p e r i m e n tf r o md i f f e r e n ta s p e c t se g m o l e c u l a re v o l u t i o n ，g e n er e c o m b i n a t i o na n dn e t w o r kc o n s t r u c t i o nt op r o d u c eq aa n de n h a n c e si t sy i e l d a n dt h e s es e t t l et h eg r o u n d w o r kf o rb i o s y n t h e s i so f q u i n i ca c i da n dp r o v i d ear e f e r e n c ef o rg e n e t i ce n g i n e e r i n ga p p l i e dt om e t a b o l i ce n g i n e e r i n g k e yw o r d s ：q u i n i ca c i d ，m e t a b o l i ce n g i n e e r i n g ，c o d o n ，r e d r e c o m b i n a t i o ns y s t e m ，q u i n a t ed e h y d r o g e n a s e ，g e n ek n o c k o u ta n dr e p l a c e m e n t奎尼酸生物合成的代谢工程研究缩略语缩略语奎尼酸生物合成的代谢工程研究缩略语1 1 4军事医学科学院研究生学位论文独创性声明秉承军事医学科学院严谨的学风和科研作风，本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下独立进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得芏主堕鲎至 堂瞳或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。论文作者签字：塑i ：鱼幺签字日期：竺鱼年j 三月上日军事医学科学院研究生学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解至奎匿堂盘堂瞳有关保留、使用学位论文的规定。特授权呈奎匡堂登茔睦可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意将本学位论文的复印件和磁盘送交国家有关部门和机构。( 保密学位论文在解密后适用本授权书)论文作者签字：鱼! ! ：! ! !指导教师签字：黼签字日期：塑翌壶年j 旦月日签字日期：塑! 年二三月一z 一日奎尼酸生物合成的代谢工程研究前言刖百奎尼酸( q u i n i ca c i d ，o a ) 是植物在有氧呼吸过程中，经莽草酸途径形成的一种环状多羟基具有光学活性的化合物。其分子式为c , h ，( o h ) 。c o o h ，化学结构式为1 ，3 ，4 ，5 - 四羟基环己烷- 1 - 羧酸( 图1 ) ，分子量为1 9 2 2 。奎尼酸是一种白色透明的晶体，味甜，易溶于水，微溶于乙醇和冰乙酸，不溶于乙醚，熔点为1 6 2 1 6 3 。c ，比旋度 a 尸= 4 2 - 4 4 。hi图1 奎尼酸的分子结构1 奎尼酸的分布及其应用价值1 1 奎尼酸分布及存在奎尼酸发现于1 7 9 0 年，最早是从金鸡纳树皮中提取纯化获得，故又名金鸡纳酸。现在发现奎尼酸广泛的存在于许多植物中，如金鸡纳树、茶树、烟草叶、木瓜、胡罗h 叶、苹果、梨、蔓越莓、猕猴桃、咖啡、玫瑰、枇杷果实、橡树和一些中草药中如灯盏花、金银花、白花刺参、北五昧子、北刘寄奴等。各种蔬菜、水果和饮料等植物中均含有奎尼酸，如红薯、马铃薯、苹果、猕猴桃、咖啡和茶等，特别是在猕猴桃中奎尼酸是主要的有机酸。因此人们在日常生活当中，都能从食用的蔬菜、水果、茶和果汁中或多或少的摄取奎尼酸类物质。高木满经过测定发现，茶的有机酸含量中，奎尼酸( 8 6 m g k g ) 实际上比草酸( 4 2 m g k g ) 的含量还要高。生咖啡豆中的奎尼酸含量( 干重) 在1 以上，咖啡提取液中的奎尼酸含量为3 ，2 0 0 8 ，7 0 0m g l ，它被认为是咖啡焙炒后苦味增强的原因之一j 。奎尼酸在植物当中存在时含量并不是一成不变的。红薯在受到切断伤害时，奎尼酸含量较高，尔后逐渐减少，4 日后减为一半，可能是被氧化的缘故。高木满发现p 】，奎尼酸的含量因茶品种的不同而不同，但是对于同一品种，新芽中的叫oucp l 嘶奎尼酸生物合成的代谢工程研究前言奎尼酸含量较少，而茎中的奎尼酸含量是较高的。奎尼酸不但以单体的形式存在于植物当中，是金鸡纳树皮的主要成分之一，而且还大量的以复合物的形式存在如包括绿原酸在内的咖啡酰奎尼酸类“1 、香豆酰奎尼酸类”1 、咖啡酰奎尼酸酯类”“1 等。绿原酸主要是3 一o _ 咖啡酰基奎尼酸及少量5 一和6 一键合的咖啡酰基奎尼酸，是植物界广泛存在的一类次生物质。1 2 奎尼酸的应用价值1 2 1 医药工业奎尼酸单体的药用价值并不大，但是作为原料或医药中间体合成的其他药物，正在越来越多的得到发现和应用。咖啡酰奎尼酸类是奎尼酸衍生物中比较重要的一类，广泛存在于许多中草药中，如灯盏花、金银花、白花刺参、北五味子、北刘寄奴、旋覆花等。这类药物的重要特点是抗病毒。二咖啡酰奎尼酸( d i c a f f e o y lq u i n i ca c i d ，d c q a ) 可抑制h i v 2 1 整合酶，酚环部分及其乙酰化取代基和羧基是抑制整合酶和抑制病毒活性的必要基团。1 。二咖啡酰奎尼酸抑制h i v 2 1 整合酶的浓度为0 0 6 o 6 6m g l ，抑$ ! j h i v 2 1 复制的浓度为1 4m g l 1 0 1od c q a 是特殊的整合酶抑制剂，它的抑制活性和抗h i v 活性一致，是作为筛选抗h i v 药物的新靶点整合酶抑制剂的有力武器n 1 1 二咖啡酰奎尼酸类化合物普遍存在于保肝利胆中草药中，其中以菜蓟素( c y r a r i n ，1 ，3 - 二一o 咖啡酰奎尼酸) 研究较多。它们多具有保肝利胆作用，对巨噬细胞及四氯化碳引起的肝损伤具有保护作用“”。1 ，5 - 二一o - 咖啡酰奎尼酸( d i c a f f e o y l q u i n i c a c i d ，i b e 5 ) 为中药旋覆花的有效成分，具有较强的抗乙型肝炎病毒作用“。i b e 5 可显著抑制成纤维细胞的增殖，并对细胞活力具显著的促进作用。在7 8 2 5 0 m g l 浓度范围内，i b e 5 对细胞无明显毒性作用，却可显著抑制细胞增殖。胶原合成是确定纤维化的确切指标之一。i b e 5 显著抑制细胞内胶原合成，它的显著降低说明纤维化水平降低，是抗肝纤维化的途径之一。保肝利胆作用和抗乙型肝炎病毒作用相结合，在l 临床治疗病毒性乙型肝炎中将起到协同作用。i b e 5 毒性小，因此其应用前景广阔“。流感病毒神经氨酸酶抑制剂是继金刚烷胺金刚乙胺和病毒疫苗之后的一类全新作用机制的流感预防与治疗药物，可同时抑制甲型及乙型流感病毒，不易引起抗药性且耐受性好“”。o s e l t a m i v i r 磷酸盐( 1 2 ) 是世界上第一种可口服的神经氨酸酶抑制剂类抗流感药物。o s e l t a m i v i r 就是以奎尼酸为起始物，经1 2 步立体选择性反应形成产物抗流感病毒新药。为了得到良好的口服感冒新药“，k i m 等1 9 9 7年从奎尼酸出发，经过一系列改造，设计并合成了一类新型的唾液酸酶抑制剂t a m i f l u ( 即g s 4 0 7 1 ) ，它的乙酯磷酸盐具有良好的口服效果“。奎尼酸生物合成的代谢工程研究前言张卫东等”1 在中药灯盏细辛中发现了2 个酚酸类化合物5 一o _ 咖啡酰基奎尼酸甲酯和4 - 0 - 咖啡酰基奎尼酸甲酯。它们在1 3 5 1 0 1 1 3 5 1 0 1 m o l 1 浓度下，对v e g f 诱导的血管通透作用有强烈的抑制作用( p 0 0 0 1 ) 。v e g f 是细胞内皮生长因子或称细胞通透因予，在体内刺激内皮细胞生长，诱导血管生成，提高血管通透性，与多种心血管疾病有关。这两种化合物显著的抑制作用，显示了其治疗心脑血管疾病的巨大潜力。寺田澄男“”发现二咖啡酰奎尼酸( d c o a ) 类是s m a l l a n t h u ss o n c h i f o l i a 地上部分热水提取物( y w e ) 抑$ o a - 葡糖苷酶活性的重要成分。y w e 所含的3 ，4 - d c q a等d c q a 类到达小肠后，抑制肠内麦芽糖酶，从而具有抑制血糖升高的作用。3 ，5 - d c q a 、4 ，5 - d c q a 均具有抑制淀粉酶及麦芽糖酶的活性。因此认为，s m a l l a n t h u ss o n c h i f o l i a 地上部分有预防糖尿病的作用。此外，卜o - 甲基一3 ，5 一旷二咖啡酰基奎尼酸甲酯对溶血磷脂酰胆碱( l p c ) 致脑微血管内皮细胞损伤有保护作用“。3 ，5 0 - 二咖啡酰奎尼酸对小鼠n k 细胞有激活作用。o s a w ak 在木瓜中发现新的奎尼酸衍生物5 0 - p 一香豆酰奎尼酸丁酯，体外试验表明，新化合物对化合物4 8 8 0 诱导的大鼠肥大细胞组胺释放有抑制作用，5 0 u g m l 剂量时抑制率为7 1 2 o “。1 2 2 食品工业随着奎尼酸的越来越多的功能被发现，在食品工业上也得到越来越广的应用。天然食品抗氧化剂逐渐受到消费者的欢迎，奎尼酸是一种新型高效的天然抗氧化剂。在某些食品中可取代或部分取代目前常用的人工合成抗氧化剂。奎尼酸具有较强的抗氧化性能，可作为一种天然的防腐保鲜剂。食品含有天然抗氧化物质，可延缓氧化过程，防止食品因氧化而变质、霉变，增长贮存期。紫苏、艾蒿等是常用的药物，其中所含的咖啡酸的奎尼酸酯等也具有抗氧化功效，抗氧化作用在各种脂质过氧化模型、氧化酶系( 脂氧化酶、x o d 、m a o 等)以及整体试验中已被证实o “。红豆浆汁中含有奎尼酸，从医疗价值来看，可能会减少人体在尿道中形成磷酸钙结石的机率。由于人体不能完全分解奎尼酸，且以不变化的形式把它排泄到尿中，它能使尿偏酸，并阻止钙和磷酸盐离子形成不溶解的结石。在某些情况下，也可以使己形成的结石溶解。1 2 3 其他工业在许多化学合成工业中，手性合成是致关重要的一步。以奎尼酸为手性源全合成天然化合物的方法已得到广泛的应用。全合成维生素d 。及类似物的难度主要在于选择性合成a 环和关键中间体的手性中心，吴勇等以奎尼酸为手性源，经两步，以6 8 的收率成功的合成了v i t a m i nd 3 类似物的关键中间体。“。他们还奎尼酸生物合成的代谢工程研究前言同样以奎尼酸为手性源，经9 步，以2 1 的收率合成了a 环嘲1 。在反应步骤，反应条件，试剂价格，总收率等方面与国外同行相比具有优势，是一条较理想的合成方法，可大量合成，具有应用价值。奎尼酸还是杀虫杀菌剂苯并嗯唑嗪酮类化学合成的前体之一。嗯唑嗪酮类化合物是禾本科作物中一种重要的次生代谢物，具有抗菌、抗虫、化感等重要生物活性。奎尼酸衍生物还可应用于农业生产上作为引诱剂。h a r i b a l o ”研究表明，斑马金凤蝶对寄主植物番瓜树( a s i m i n at r i l o b a ) 的挥发性物质反应强烈，提高了栖息率和产卵率，挥发性物质中有效活性物质，即产卵刺激物是3 一咖啡酰一粘一奎尼酸( 3 一c m q a ) 。奎尼酸不仅是一种高价值的精细化工产品和医药中间体，还是一种重要的化工原料。奎尼酸可被镁氧化为工业上重要的有机化合物氢醌和苯醌，可作为一些化学合成试剂和药物的必要来源，例如抗肿瘤制剂埃斯波霉素a( e s p e r a m i c i n a ) 、免疫抑制剂f k 一5 0 6 ，也可用奎尼酸来合成三磷酸肌醇( i p 。)以及具有抗氧化、抗菌作用的绿原酸等。在一些较难获得的天然物质比如霉菌外膜蛋白等的制备中，奎尼酸也起着重要作用。此外，它还可用作食品添加剂、助溶剂及光学材料等。奎尼酸是一种高价值的精细化工产品和医药中间体。奎尼酸可以促进链状球菌的生成和促进心、子宫等器官组织的发育。还可以作为蚕的饲料添加剂和烟草增香剂的替代品等，其用途极为广泛。作为一种重要的精细化工产品和医药中间，随着医药工业、食品工业、化工等行业的不断发展，奎尼酸及其衍生物作用范围的扩大、新的功能逐渐被发现如消炎、抗老化等。4 ，社会对奎尼酸的需求日益增加，国际国内市场对奎尼酸的需求也在不断扩大。目前我国的奎尼酸生产基本上还是空白，全部依赖进口，价格十分昂贵。曾经有报道陈梅芳等啪利用真菌的奎尼酸脱氢酶基因q u t b 在大肠杆菌里面实现了成功的表达并且具有生物活性，在国内对奎尼酸的生物合成开始了有益的尝试。2 生产奎尼酸的方法2 1 目前生产奎尼酸的方法到目前为止，国内尚无奎尼酸合成研究的报道，国外报道有关奎尼酸的制备方法主要有四种：即植物提取法、化学合成法、酶法和微生物直接发酵法。2 1 - 1 植物提取法奎尼酸存在于许多植物中，所以最初人们从含量比较高的植物中主要是从金鸡纳树皮、越桔果汁与熟石灰作用提取得到。但这种方法得到的奎尼酸量比较少，而且，所耗费的原料大大超过了所生成奎尼酸的利用价值。植物提取法法产量低、成本高，阻碍着奎尼酸作为经济初始物质的使用。塔拉单4奎尼酸生物合成的代谢工程研究前言宁( t a r at a n n i n ) 是塔拉豆荚中的主要成分，属水解类没食子单宁，其化学结构为多没食子酰基奎尼酸，水解后可产生没食子酸和奎尼酸。在没食子酸的工业生产中，相当于单宁质量1 5 1 8 的另一水解产物奎尼酸留存于水解母液中，通过对废液的浓缩、溶剂萃取、活性炭吸附、树脂交换等方法分离去除各种杂质，经过精制提纯后，获得附加产品奎尼酸。但是该方法得到的奎尼酸纯度不高，成本仍比较昂贵，还未具备实用价值【3 0 】。2 1 2 化学合成法这是利用有机合成和化学工程相结合的制备方法。1 9 5 4年，g r e w 等首次报道了奎尼酸的化学合成法，该法较直接提取要经济，但是其产物为d l 型外消旋体，必须经过拆分才能得到能够被利用的l 一奎尼酸。后来，6 0年代初s m i s s m a n 和j o s e p hw o l i n s k y 2 f l 以完善，用不对称合成法获得l 一奎尼酸，但工艺过程极其复杂，需耗费大量的化学原料，合成反应中还会产生大量有害物质，污染环境。2 1 i3 酶工程法所谓酶工程法即利用酶催化的立体专一性反应，以奎尼酸化学合成的中间体为底物制备具有光学活性的奎尼酸。酶工程法可高选择性，高收率地获得所需要的光学活性物质。具有工艺简单，周期短，耗能低，专一性强，收率高等特点，但要将它应用于工业化生产，还涉及到底物的价格和酶源两个问题。随着基因工程迅速发展，酶源的获得不再成为困难，关键在于如何获得廉价的底物。奎尼酸的前体物脱氢奎尼酸和中间体莽草酸( s h i k i m a t e ) 等经过酶法转化可合成奎尼酸，但脱氢奎尼酸和莽草酸的价格比较贵，故通过该法获得奎尼酸未能大量展开。2 1 4 微生物发酵法该方法借助产奎尼酸菌的特定性状，通过传统发酵工艺和现代基因工程技术，直接利用碳源物质来生产奎尼酸的方法。此法可以利用廉价且易得或可再生的原料资源如：玉米、甜菜、甘蔗或用作燃料、能源的植物材料、蔬菜、农业废弃物等，反应又可在常温常压条件下进行。m i c h i g a n 大学的j f r o s t 博士领导的小组利用葡萄糖作为初始原料，在含有奎尼酸合成酶的奎尼酸菌株的参与下，用葡萄糖作为碳源生成了奎尼酸卧3 2 】。由此可见，这是一种可直接用于工业化生产的简单、经济且不会危害环境的合成法，也符合未来绿色化工的需要。2 2 未来生产奎尼酸的方法随着生物技术的发展特别是近年来代谢工程学的兴起，代谢工程在芳香化合物的生物合成研究中的不断应用，应用现代生物技术，应用基因工程的方法，使微生物直接发酵法合成奎尼酸成为一种即经济又环保的合成奎尼酸的方法成为可能，在不久的将来，利用廉价易得的碳源为底物的微生物直接发酵法将成为制备奎尼酸的主要方法。奎尼酸生物合成的代谢工程研究前言代谢工程学的兴起，使得产奎尼酸菌株的构建成为可能( 图2 ) ，应用d n a 重组、基因打靶定向诱变等技术可以进行生产菌的定向育种，并能打破种属界限，集中不同菌株的优点，从而选育出高产、优质、易于自动化生产的产奎尼酸工程菌。利用d n a 重组技术把不同的代谢途径和两种不同微生物体内的酶组合到同一个微生物中，使该微生物出现新的酶活性，产生新的代谢产物或者生产出常规方法无法生产的新产品，这是目前生物高技术产业化研究的一个重要方向。近年来对微生物代谢途径及调控机理的深入研究也为发酵法生产奎尼酸奠定了基础。通过d n a 重组技术改变微生物的代谢途径，一般有两种方法：一是导入一个新基因；另外一种方法就是对已经存在的基因进行改造。这些方法使奎尼酸菌株的构建成为可能。应用d n a 重组、基因定向诱变等技术，利用生物工程操纵大肠杆菌( e c o l i ) 的莽草酸途径，可进行生产菌的定向育种，并能打破种属界限，集中不同菌株的优点，从而选育出高产、优质、易于工业化生产的产奎尼酸基因工程菌。近年来对奎尼酸的代谢途径及调控机理的深入的研究，也为发酵生产奎尼酸奠定了基础。3 代谢工程在奎尼酸生产中的应用3 1 代谢工程概述随着基因工程等生物技术的发展，特别是自1 9 9 1 年，b a i l e y 在 s c i e n c e ) )上发表的题为“t o w a r das c i e n c eo f m e t a b o l i ce n g i n e e r i n g ”的文章首次提出代谢工程 3 3 - 3 5 1 的概念，标志着人类应用生物技术又迈入了一个崭新的阶段。 磊、瓢。磬梆芝k 器冬删盛娜女黻鬻善嚣誉嚣枣图2 大肠杆菌莽草酸途径及建立奎尼酸生物合成途径p e p ，p h o s p h o e n o l p y r u v a t e ；e 4 p，e r y t h r o s e - d - - p h o s p h a t e ；d a h p ，3 - d e o x y - d - a r a b i n o - h e p t u l o s o n a t e 一7 - p h o s p h a t e ；d h q ，3 - d e h y d r o q u i n i ca c i d ；d h s ，3 - d e h y d r o s h i k i m i ca c i d ；q a ，q u i m ca c i d ；g e n e s ：( a r o f ，a r o g ，a r o h ) ，d a h ps y n t h a s e ；a r o b ，d h qs y n t h a s e ；a r o d ，d h qd e h y d r a t a s e ；a r o e ，s h i k i m a t ed e h y d r o g e n a s e ；q u t b q a - 3 ，q u i m ca c i dd e h y d r o g e n a s e瞥椭奎尼酸生物合成的代谢工程研究前言代谢工程( m e t a b o l i ce n g i n e e r i n g ) ，亦称途径工程( p a t h w a ye n g i n e e r i n g )和代谢设计( m e t a b o l i cd e s i g n ) ，是利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络，并通过d n a 重组技术合理设计细胞代谢途径及遗传修饰，进而完成细胞特性改造。细胞代谢网络是由若干乃至上千种酶和膜传递系统及信号传递系统组成的受精密调控又互相协调的复杂系统组成。因此，代谢工程一般是多基因的基因工程 3 6 1 。它涉及到多基因的联合协同表达控制机制，与传统的蛋白多肽单基因表达( 第一代基因工程) 以及基因定向突变( 第二代基因工程) 有显著差别，故有人将它称之为第三代基因工程【3 ”。所以，代谢工程的核心是通过对代谢流的定量分析和细胞的代谢网络进行修饰，对细胞的分解代谢和合成代谢中的多步级联反应进行合理设计，然后利用d n a 重组技术强化和( 或) 灭活控制代谢途径相关基因 3 8 】。近年来，随着分子生物学研究的不断深入，有机体越来越多的生物合成途径被人们所认识，一些微生物基因组全序列的测定【3 9