（海洋生物学专业论文）南极普里兹湾深海沉积物微生物低温酶的筛选、基因克隆表达及性质分析.pdf

摘要 南极、深海等极端环境中蕴藏着丰富的资源，其中微生物资源是国内外研究的热 点。它们经过长期的进化、选择，在各种极端的环境条件下形成了独特的组织结构、 酶系统及代谢机制以进行生存和繁衍。对低温酶、冷适应酶独特的生理结构及机能进 行研究，探讨生物适应特殊的生存环境丽发生的基因变异，无论在科学上还是实际开 发应用上都具有重大的意义。由于极端环境样品采集方面的限制，目前大部分的极端 微生物仍未得到认识和研究。低温酶由于在低温下的高催化效率，而在工业、农业、 医药卫生、洗涤、生物制剂、食品等方面都有极其广泛的应用，其中淀粉酶、脂肪 酶、蛋白酶和纤维素酶等是主要酶制剂品种。 本文对南极普里兹湾深海沉积物( p n 5 6 ，7 4 0 2 5 e ，6 6 0 5 5 ，s ，9 0 0 m ) 样品开展研 究。采用传统分离微生物手段获得可培养的微生物共4 2 株，对它们进行选择性培养， 筛到1 7 株细菌明显具有分泌水解酶的能力，其中淀粉酶产生菌6 株，分别有假单胞 菌、红球菌、诺卡氏菌；脂肪酶产生菌8 株，分别有假单胞菌和嗜冷杆菌：蛋白酶产 生菌1 株，为诺卡氏菌。对这1 7 株菌的1 6 sr d n a 迸行进化树分析，1 2 株细菌属于t p r o t e o b a c t e r i a 亚群，有5 株细菌属于革兰氏阳性细菌。复合酶产生菌7 1 9 7 的产酶发酵 条件得到优化：诺卡氏菌7 3 2 6 产的淀粉酶得到了纯化和性质分析；来自嗜冷杆菌7 1 9 5 的低温脂肪酶基因( t i p a l ) 得到了克隆与表达；来自假单胞菌7 3 2 3 的低温脂肪酶( f 豳“) 得 到了克隆与表达：来自假单胞菌7 1 9 7 的淀粉酶基因( a m y p ) 得到了克隆与表达，这些表 达后的蛋白均碍到纯化和性质的分析。此外，采用宏基因组技术，提取该沉积物样品 的宏基因组d n a ，通过设计探针从中克隆到低温脂肪酶基因( 1 i p 3 ) 的开放阅读框完 整序列，构建重组表达载体，在大肠杆菌中获得表达，表达后的重组蛋白也得到了纯化 和性质分析。该研究结果及其所建立的技术为南极丰富的低温酶资源的研究开发奠定 了基础。 关键词：南极；低温淀粉酶；低温脂肪酶；克隆表达；宏基因组 a b s t r a c t a b s t r a c t m i c r o o r g a n i s m sl i v i n gi np e r m a n e n tc o l de n v i r o n m e n t ，s u c ha sd e e ps e aa n da n t a r c t i c ， p r e s u m a b l yh a v ed e v e l o p e dp a r t i c u l a rc h a r a c t e r i s t i c st h a ta l l o wt h e mt o t h r i v ea ts u c h e n v i r o n m e n t f o re x a m p l e ，t h ec o l d a c t i v eo rc o l d a d a p t i v ee n z y m e sh a v ea t t r a c t e dm o r ea n d m o r ei n t e r e s t sa st h e yn o to n l ya r ee s s e n t i a l i ns o m em e c h a n i s ms t u d i e s b u ta l s op r o v i d e p o t e n t i a lf o rc o m m e r c i a ld e v e l o p m e n t r e c e n tm i c r o b i a ls t u d i e so ft h ea n t a r c t i ch a v el e dt o s i g n i f i c a n t l yn e wd i s c o v e r i e so fu n u s u a lm i c r o b i a ld i v e r s i t y ，n e ws p e c i e s ，a n dc o l d a d a p t i v e e n z y m e s h o w e v e r , p a r t i a l l yd u et ot h eg r e a td i f f i c u l t i e si nc o l l e c t i n gs a m p l e s i tr e m a i n s 雒 o n eo ft h em o s tu n k n o w nf i e l d s c o m p a r e dt oo r g a n i cs y n t h e s i s ，b i o c a t a l y s t so f t e nh a v ef a r b e t c e rc h e m i c a lp r e c i s i o n ，w h i c hc a nl e a dt om o r ee f f i c i e n tp r o d u c t i o no fs i n g l es t e r e o i s o m e r s ， f e w e rs i d er e a c t i o n s ，a n dal o w e re n v i r o n m e n t a lb u r d e n t h eb u l ku s e so fa m y l a s e s ，l i p a s e s ， p r o t e a s e sa n dc e l l u a s e si ni n d u s t r i a ls e c t o r sa r ei n c l u d i n gf o o da n df e e di n d u s t r y ，p e p t i d e s y n t h e s i s ，l e a t h e ri n d u s t r y ，m a n a g e m e n to fi n d u s t r i a la n dh o u s e h o l dw a s t e ，p h o t o g r a p h i c i n d u s t r y at o t a lo f4 2s t r a i n s ，i s o l a t e df r o md e e ps e as e d i m e n to fp r y d zb a y ，a n t a r c t i c ( 7 4 * 2 5 e ， 6 6 。5 5 s ，d e p t ho f9 0 0m ) ，w h i c hg r o wo n l yb e l o w3 0 。cw e r ei d e n t i f i e db a s e do nt h e m o r p h o l o g i c a ld i f f e r e n c e sa n ds d s p a g eo fc u l t u r es u p e m a t a n t 1 7o ft h e mw e r ef o u n dt o h a v ec o l d - a d a p t i v ea m y l a s e ，l i p a s eo rp r o t e a s ea c t i v i t y s i xs t r a i n ss h o w i n gs t r o n ga m y l o l y t i c a c t i v i 够，e i g h ts t r a i n ss h o w i n gl i p o l y t i ca c t i v i t y ，o n es h o w i n gp r o t e o l y t i ea e t i v i t yu n d e r1 0 0 c w e r ep i c k e do u tf o rf u r t h e rs t u d y t h e yw c r ea f f i l i a t e dw i t ht - p r o t e o b a c t e r i a ( 1 2s t r a i n s ) a n d g r a m p o s i t i v eb a c t e r i a ( 5s t r a i n s ) a sd e t e r m i n e db y1 6 sr d n as e q u e n c e s t h ea m y l a s e - p r o d u c i n gs t r a i n sb e l o n g e dt op s e u d o m o n a s ，r h o d o c o c c u sa n dn o c a r d i o p s i s t h el i p a s e p r o d u c i n gs t r a i n sb e l o n g e dt op s e u d o m o n a s ，p s y c h r o b a c t e r t h ep r o t e a s e p r o d u c i n gs t r a i n s b e l o n g e dt on o c 甜d i 叩s i s t h eo p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o n sf o rt h ee n z y m ep r o d u c t i o no fs t r a i n 7 1 9 7w e r ei n v e s t i g a t e d ；c o l d a d a p t i v ea l p h a - a m y l a s ep r o d u c e db yn o c a r d i o p s i ss p 7 3 2 6w a s p u r i f i e da n dc h a r a c t e r i z a t i o n ；l i p a s ee n c o d i n gg e n e ( 1 i p a l ) f r o mp s y c h r o b a c t e rs p 7 1 9 5w a s c l o n e da n ds e q u e n c e d ，a n de x p r e s s e di nec o l i ：l i p a s e e n c o d i n gg e n e ( p a ) f r o m p s e u d o m o n a ss p 7 3 2 3w a sc l o n e da n ds e q u e n c e d ，a n de x p r e s s e di nec o l i ；a m y l a s e e n c o d i n gg e n e ( a m y p ) f r o mp s e u d o m o n a ss p 7 1 9 7w a sc l o n e da n ds e q u e n c e d ，a n de x p r e s s e d i nec o i lw ea l s oo b t a i n e dt h el i p a s eg e n e ( ，咖3 ) t h r o u g hp c r c l o n i n gw i t hm e t a g e n o m e d n a ，w h i c hw a se x t r a c t e df r o mt h ed e e ps e as e d i m e n to fp r y d zb a y t h e nt h eg e n ew a s e x p r e s s e di nec o l ia n dc h a r a c t e r i z a t i o n t h er e s u l t sa n dt e c h n i q u e sw i l lc o n t r i b u t et ot h e f u r t h e rr e s e a r c hi nt h e 曲u n d a n t c o l d a d a p t i v ee n z y m e sf r o mt h ea n t a r c t i c k e y w o r d s ：a n t a r c t i c ；c o l d - a c t i v ea m y l a s e s ；c o l d a c t i v el i p a s e s ；c l o n i n ga n de x p r e s s i o n ； m e t a g e n o m e 7 前言 1 前言 1 1 南极、深海生态学研究简介 1 1 1 南极概况 南极洲，位于南极点四周，为冰雪覆盖的大陆，周围岛屿星罗棋布。南极洲的面积， 包括南极大陆及其岛屿面积共约1 , 4 0 0 ，0 0 0 k m 2 ，占世界陆地面积的1 0 ，与美国和墨西 哥面积之和相当，是中国陆地面积的1 4 5 倍，是澳大利亚陆地面积的2 倍，为世界第五大 陆。南极洲四周围绕着多风暴且易结冰的南大洋，为大西洋、太平洋和印度洋的延伸， 面积约3 8 ，0 0 0 ，0 0 0k m ：，为方便研究，被称为世界第五大洋。南极洲距离南美洲最近，中 问隔着只有9 7 0 k i n 的德雷克海峡；距离澳大利亚约有3 , 5 0 0 k m ：距离非洲约有 4 , 0 0 0 k i n ；与中国北京的距离约有1 2 ，0 0 0 k m 。南极洲是由冈瓦纳大陆分离解体而成，是 世界上最高的大陆，平均海拔2 , 3 5 0 m 。横贯南极山脉将南极大陆分成东西两部分。这两 部分在地理和地质上差别很大。东南极洲是一块很古老的大陆，据科学家推算，已有几 亿年的历史。它的中心位于难接近点，从任何海边到难接近点的距离都很远。东南极洲 平均海拔高度2 , 5 0 0 r a , 最大高度4 , 8 0 0 m 。在东南极洲有南极大陆最大的活火山，即位于 罗斯岛上的埃里伯斯火山，海拔高度3 , 7 9 5 m ，有四个喷火口。西南极洲面积只有东南极 洲面积的一半，是个群岛，其中有些小岛位于海平面以下。但所有的岛屿都被大陆冰盖 所覆盖。较古老的部分( 包括有玛丽伯德地南部、埃尔斯沃思地、罗斯冰架和毛德皇后 地) 有一由花冈岩和沉积岩组成的山系。该山系向南延伸至向北突出的南极半岛的中 部。西南极洲的北部，即较高的部分是由第三纪地质时期的火山运动所造成的。南极洲 的最高处一文森山地( 5 ，1 4 0 m ) 位于西南极洲。 1 1 2 深海环境简介 占海洋总面积6 5 的深海是人类财富的巨大宝库，蕴藏着丰富的生物资源和矿产 资源，其中多金属矿产资源已经得到深入的研究，目前研究的重点正向多种资源的综 合研究转变。随着研究的深入及科学技术手段的提高，另一种资源异军突起，成为深 海资源研究开发领域的热点，这就是深海生物资源。由于深海生物生存环境的特殊 性，使其无法通过大规模人工培养而得到应用，必须借助基因工程的技术才能实现资 源的应用，因此，深海生物资源又称作深海生物基因资源或遗传资源。现在深海生物 基因资源已成为具有巨大科学研究价值和商业开发前景的三大深海资源之一【而且， 由于深海生物基因资源独特的利用形式及其法律地位尚未确定，因此它是目前唯一已 进行商业开发的深海资源。近几年来国际上深海生物基因资源的开发应用已产生数十 前言 亿美元的产业价值。深海生物与陆地生物及一般海洋生物相比有很大的特殊性，在当 今生物资源研究开发已经十分深入和资源日益匮乏的情况下，研究深海生物无论在科 学上还是实际开发应用上都具有重大的意义。深海嗜热古细菌的发现改变了人们对生 物界“万物生长靠太阳”的传统观点。传统的生物分类法将生物界分为真核和原核两 界，而对古细菌基因组的研究发现其基因只有4 4 与这两界是同源的，因此，古细菌 成为生物的第三界一太古单胞有机体。同时由于古细菌生存的环境与地球形成初期的原 始环境十分相似，因此人们认为古细菌的研究将有助于揭开地球生命起源的奥秘【2 ，3 1 。 深海生物在各种极端的环境条件下形成了独特的组织结构、酶系统及代谢机制以进行 生存和繁衍，对这些独特的生理结构及机能进行研究，探讨深海生物适应特殊的生存 环境而发生的基因变异，在研究生物种类、生理活动、应激反应等方面的多样性具有 重要的科学意义【4 “。深海生物对所处环境的生态系统的形成、维持和发展起着重要的 作用。例如，大洋中铁锰结核是各种微生物群的独特栖息场所，细菌的活动影响了间 隙水和海底沉积物的成分，在铁锰结核形成的主要阶段中，生物地球化学因素起着重 要的作用，有时甚至起着主导作用；磁铁矿石上附着的细菌具有生物矿化作用，对磁 铁矿的形成起着推动作用；在天然气水合物及热液硫化物的周围生存着大量能利用甲 烷和硫化氢生长和繁殖的细菌，它们进行机体代谢的同时也对环境产生了巨大的影 响，因此深海生物的研究将对海底地质环境的研究提供重要的参考资料。由于生存在 各种极端环境条件下，深海生物具有许多特殊功能，如耐盐性、耐低温，耐高温、耐 高压和高渗透性、固氮、硝酸还原、吸磁性、稀贵金属浓缩能力、环境治理、清污能 力以及加氧化合物交换能力等，有些深海生物还能产生新型抗生素、抗肿瘤、抗病 毒、降压降脂因子，这些特殊功能物质在工业、医疗保健、环境保护、军事等方面都 具有重大的应用价值。 1 1 3 南极微生物学研究进展 南极地区微生物学的研究近年来逐步引起了人们的注意，在南极这个相对简单的 生态系统中，生物的种类较少，只有微生物具有较强的适应性，保存着丰富的微生物 种类和较多的数量，成为该地区生态结构和物质能量循环中的重要环节。 南极特殊的环境决定了南极微生物的研究大部分局限在南极考察站附近的土壤、 排污口、湖泊、冰盖等地方。从南极环境中分离到的微生物大多属于嗜冷或者耐冷 菌。r e d d y 等f 7 j 从南极m c m u r d o 站附近的湖泊中分离到1 3 株橙色产生菌，属于 p l a n o c o c u sp s y c h r o p h i l u ss p p 和p l a n o c o c u sa n t a r c t i c u ss p p ，并利用1 6 sr d n a 序列、细 菌形态、脂肪酸组成等方面证明它们属于新的种。m i l l e r 等【8 】在南极土壤中分离到一株 嗜碱嗜冷的细菌，研究了它的基本细菌学性质。m a u r o 等【9 】则研究了南极附近海域沉积 物中的酶活性，细菌分布和无机物组成之间的关系。b e r n h a r d 等【1 0 】认为甜和1 3 p r o t e o b a c t e r i a 细菌控制着南极湖泊雪层的氨基酸的释放。 南极微生物研究的另一个热点是细菌对南极地区各种污染的反应。g e o r g e 等【1 研 究了南极受污染海边的细菌随季节变化的趋势和生物降解的规律。b a r a n i e e k i 等1 1 2 】从南 极土壤中分离到属于s p h i n g o m o n a ss p 的菌株，可以降解多种有机化合物。d e l i l l e 【l 研 究了南极被石油残留物污染的土壤中细菌的类群和它们对污染物的反应。 分子生物学手段也广泛应用在南极微生物学的研究中。m a r k 等【1 4 】对利用系统发育 手段对南极海冰细菌，古细菌进行了亚群水平上的调查。e v e l y n e l ”】等研究了m c m u r d o 站附近湖泊中可培养和不可培养原核生物，进行了初步的生态分析。 1 1 4 南极普里兹湾生态环境研究进展 南极地区在研究全球变化中具有突出的地位。此区中的大气、冰、海洋和生物通过 生物地化循环、深层大洋环流、大气环流、能量的输运同地球的其他地方发生着联 系，从而影响着整个地区系统。同时，极地地区又对全球气候变化起到“放大器”的作 用，而且，它是地球上唯一未被人类活动大量影响的地区。因此，南极地区生态学研 究越来越受到人们的关注。 普里兹湾呈西南一东北走向，是南大洋中深深嵌入南极大陆的一片水域。它的南 面是与兰姆伯特大冰川相联接的艾默里冰架，北临印度洋，是南极大陆的第三大海 湾。开口的最东端位于7 0 。s ，7 6 。e 左 右，靠近四女士浅滩，最西端位于 6 8 0 s ，6 9 0 e 附近，靠近福拉姆浅滩【1 6 1 7 1 。除了威德尔海和罗斯海以外，在伸入 南极大陆的其它各海湾当中，它是面积最 大的一片，受南极大陆的影响很大。普里 兹湾内的水深较浅，约4 0 0 - 1 0 0 0 m 。普里 兹湾位于东南极，与西南极相比，东南极 的陆地向北更加突出，许多地方( 例如恩 德比地) 都在南极圈以北因此在东南极 图1 生物的生存温度限制 附近的南大洋受南极大陆的影响更甚。 8 酶1t h e ”m5 “r v i r et e m p e m n ”o f b i o i o l 2 y 自从d e a c o n ( 1 9 3 7 ) 根据英国皇家研究船“发现号”的资料对南大洋水团和海流分布给 出了经典性的描述以来，海洋学家对普里兹湾及其附近海域的考察工作进行着不懈的 努力。由于普里兹湾特定的“瓶颈”式的地理环境和海底地形特点，湾内及其相邻的陆 架水和冬季水对严冬的“记忆”，能够长久保持着高盐、低温、大密度的特点而少变。 这种不稳定状态使得普里兹湾被认为对南极底层水( a a b w ) 的形成有贡献【1 8 1 。因此 近年来，普里兹湾及其邻近洋区物理海洋学的研究引起了更多人的关注。同时，由于 碳循环和全球气候变化的紧密联系，海洋碳循环已成为各国海洋科学研究的热点之 一。海洋浮游植物通过光合作用固定c 0 2 以及海洋垂直碳同量生物泵机制的关键过 程，同时作为海洋生态系食物网的基本环节，它又是维系南大洋特有的以磷虾为重要 角色的海洋生态系统的物质基础。因此研究普里兹湾及其邻近海域浮游植物生物量和 生产力及溶解有机碳是普里兹湾生态研究的另一个热点。 1 2 极端生物和极端酶 极端生物( e x t r e m o p h i l e s ) 是指在极端自然环境( e x t r e m en a t u r a le n v i r o n m e n t s ) 下 生存的生物，这些极端环境包括恒定的低温、高温、高压、强碱、强酸、干燥、辐 射、高盐浓度等( 表1 ) 。在极端环境中，普通生物不能生存，而极端生物却生长良 好，甚至赖以为生。从分类角度看，极端生物的成员包括细菌、古菌( a r c h a e a ) 和真 核生物。所有的超高温生物( h y p e r t h e r m o p h i l e s ) 不是古菌就是细菌，而真核生物常见 于嗜冷生物( p s y c h r o p h i l e s ) 、嗜酸生物( a c i d o p h i l e s ) 、嗜碱生物( a l k o p h i l e s ) 、嗜压生 物( b a r o p i e z o p h i l e s ) 、嗜旱生物( x e r o p h i l e s ) 、嗜盐生物( h a l o p h i l e s ) ( 这些生物分别在相应 的环境中旺盛生长，h t t p ：w w w a s t r o b i o l o g y c o m ) 。极端生物中的微生物就是极端微生 物，可见于热泉、火山区、深海、极地等几乎所有的极端环境。 人们认识极端微生物已经有几十年了，对它们的研究正日益加强。这主要是由于 极端微生物通过漫长的自然演化丽拥有了能维持其在极端环境下生存的特殊生理功能 和遗传功能。这些特殊功能不仅吸引了研究者的重视，更激发了工业界对其应用潜力 的兴趣。比如，古菌的细胞膜脂化学性能极度稳定，有人认为可以据此开发出新的药 物递送方式【1 9 l ；嗜盐古菌分泌的胞外多聚物可能作为环保塑料的原料1 2 0 ；产甲烷古菌 可望充当清洁能源的制造者等1 2 1 1 。不过，工业界更期待的是来源于这些生物、在极端 环境下性能卓越的极端酶( e x t r e m o z y m e s ) 1 2 2 1 。工业界投入巨资来研究极端酶可能带 来的商业利益，从制造甜味剂、石洗牛仔服到遗传学鉴定罪犯、诊断传染病和遗传疾 病等。普通酶暴露于高温或其他极端条件时容易失活，而极端酶的优越性将在这些极 端条件下得以体现。制造商就可以利用这些特点，减少为稳定酶的活性而采取的特殊 保护措施，从而增加效率、降低成本。 多数极端微生物为古菌，对古菌的研究导致了重绘生命进化树 2 3 1 。由此在分类学 将生物分为三大域：第一域为缺乏细胞核的细菌域：第二域为具有更复杂细胞结构的 真核生物域；第三域为古菌域。古菌结构上类似细菌，缺少细胞核；遗传上虽然它们 的某些基因与细菌的基因相似，但是古菌还拥有只在真核生物中发现的基因，而且有 很大部分基因是其独有。这些结构和遗传上的差别使古菌区别于细菌和真核生物，成 为独立的第三域。根据所处的不同环境，极端微生物可分为以下几种( 参考表1 ) 。 表1 极端生物的分类与举例 t a b l e1t h et a x o n o m ya n de x a m p l e so f e x t r e m o p h i l e s 1 2 1 低温微生物 低温环境在地球上普遍存在，如平均温度维持在1 3o c 的海洋( 占地球表面积二分 之一以上) 、两极地区( 占地球表面积的1 4 ) 、高山、冰川和冷库等。在这些寒冷 的地方也存在着特殊的微生物，即低温微生物。根据m o r i t a l 2 4 1 妁定义，低温微生物可 以分为两类：一类是必须在低温条件下生长，最高生长温度在2 0 0 c 以下，最适生长温 度在1 5 0 c 以下。在0 0 c 可生长繁殖的微生物，称为嗜冷菌( p s y c h r o p h i l e s ) ；还有一类 是最高生长温度高于2 0 0 c 、最适生长温度高于1 5o c 、在0 - 5o c 可生长繁殖的微生物称 为耐冷菌( p s y c h r o t r o p h s ) 。南极和南极水域是获取低温菌的良好来源，而后者的菌 体密度可高达1 0 7 m l ，跟中温水域的最高菌体密度相近【4 “。低温条件下，细胞代时长 达2 - 1 0 h ( 依物种而异) ；高温( 2 0o c 以上) 虽然缩短了代时，却带给细胞的生存造 成压力，一般以细胞密度降低、蛋白分泌减少为特征。来源于南极的菌株培养温度一 般低于5o c ，以减少高温造成的压力，并达到提高菌体密度、高效产胞外酶的目的【2 5 l 。 嗜冷微生物体内没有温控系统，其内部温度与外部环境温度非常接近。虽然低温 对生化反应有较强的负作用，这些低温微生物的生长繁殖速度与常温环境下生活的亲 源关系非常接近的物种却不相上下。所以这些微生物通过非常和谐的调整，发展了多 种适应机制，使其得以在低温环境中存活。在蛋白质层次上的调整包括：特殊的序列 修饰、二硫键和盐桥含量减少、螺旋偶极净电荷减少、与溶剂互作增加、氢键和疏水 作用减少【2 “。总体上，这些适应性调整使蛋白质结构柔韧、富有弹性，并且使其在低 温条件下的催化效率得以提高。 一般而言，乳3 0 0 c 以内，低温酶要比中温酶的活力高，提高温度会导致低温酶变 性。低温酶在低温和常温( 3 0 。c 以内) 条件下的高活性提供了产生经济利益的可能【2 7 捌。大规模反应过程中持续维持低温有利于节约大量能源，一个典型的例证是在工业 上利用蛋白酶进行皮革脱皮处理时，用低温蛋白酶可以不必加热到3 7 0 c 就达到最佳效 果。低温酶还可以用在家居生活中，如低温洗涤能够保护纤维的色彩( 同样也减少耗 能) ，但过去使用的酶类添加剂在冷水中活力不高，使用低温酶可以解决这个问题。 食品工业中，低温果胶酶能够在低温条件下有效地提高果汁的澄清度、减少粘度。还 有面包制造中广泛使用糖苷酶，普通糖苷酶作业之后的残余活性难以完全清除，在保 存过程中会改变面包的结构，而低温糖苷酶可以很好解决这个问题。低温酶对热的不 稳定性可以保证在复杂混合物中迅速、有效、有选择地将酶灭活。 1 2 2 嗜热微生物 嗜热微生物的生长和繁殖要求环境温度高于4 5 0 c 。有的( 超嗜热微生物) 偏爱高 于8 0 0 c 的温度，甚至有些超嗜热微生物在高于1 0 0 0 c 的环境下也能旺盛生长【3 0 】。 t h o m a sd b r o c k 等对热泉微生物进行的早期研究发现了能在7 0 0 c 以上生长的嗜热微生 物。这是种水生栖热细菌( t h e r m u sa q u a t i c u s ) ，它的发现开创了生物研究中的革命 性技术p c r 技术的新时代。随后该研究组在一个极热的酸性泉水中发现了第一个能 在8 5o c 旺盛生长的超嗜热微生物，古菌s u l f o l o b u s 口瓯如瞰f c 盔r 如，【3 1 1 。 高温酶的来源可以是嗜热菌或超嗜热菌。前者生长温度为4 5 0 0 - - 8 0 0 c ，包括细菌 或古菌；后者能够在更高的温度上生长，成员绝大部分是古菌【3 甜，在极高温度( 1 0 3 - 1 1 3 0 c ) 发现的物种绝对是古菌 3 3 1 。多数超嗜热微生物依靠还原硫元素成硫化氢来产生 能量，目前对超嗜热微生物的研究主要集中在两个不依赖硫元素的物种上，p y r o c o c c u s 和t h e r m o c o c c u s 3 2 1 。 1 2 3 嗜酸、嗜碱微生物 地球上有生物栖息的自然环境多数为中性，其p n 值在5 - - 9 之阀，在此范围之外的 自然环境比较罕见，不过同样也有极端微生物生存。在p h 值低于5 的环境中生存的微 生物称为嗜酸微生物，不过这种酸性环境通常与其他极端环境共存 3 4 列，如：高温、 高盐、高浓度重金属等；嗜碱微生物喜欢p h 值高于9 的环境。高酸度环境可能是自然 地球化学活动( 热液出口的含硫气体和某些热泉) 的结果，也可能某些嗜酸微生物代 谢活动所致。低p h 值条件下生存的嗜酸微生物的细胞膜内、外p h 值常相差2 以上 【3 6 】，它们细胞内部不能忍受高酸度，否则d n a 等重要分子将被破坏。不过提供保护的 防御性分子以及跟外部环境接触的分子必须能在低p h 值条件下起作用，已经从一些嗜 酸微生物的细胞壁和细胞膜处分离获得了可以在p h 值低于1 的环境中工作的耐酸酶。 耐酸酶的潜在应用范围包括在酸性溶液中合成化合物时充当催化剂和作为动物食品添 加剂。嗜酸微生物还可以在矿物的生物处理过程中一显身手阳。 嗜碱微生物生活在碳酸盐土壤和苏打湖中。当p h 值高于8 时，生物体内的某些分 子，尤其是有关r n a 构成的分子会降解。因此它们和嗜酸微生物一样，细胞内部也 维持中性，极端酶位于或接近细胞表面，或分泌到胞外。洗涤剂的制造者对嗜碱的极 端酶尤有兴趣。因为去污剂的使用环境趋于高碱性，这种环境会抑制普通酶的活力， 而对耐碱酶的活力却没有负面影响。最有吸引力的洗涤剂添加用酶是蛋白酶和脂肪 酶，还有纤维素酶。目前有些可以在高温或低温作用的耐碱酶已经投入使用或正在开 发之中。耐碱酶随时可能替代目前在生产石洗棉纤维的工艺中占支配地位的常规酶 【3 町。 1 2 4 嘻盐微生物 嗜盐微生物生活在高盐浓度环境中，如天然盐湖和日晒盐池。由于碳酸钠的风化 和某些其他碱性盐的作用，有的高盐浓度环境同样也是碱性的，所以很多嗜盐微生物 同时也嗜碱微生物。在高浓度盐溶液中的细胞容易失水，除非其原生质内的溶质度高 于外部环境。嗜盐微生物形成了特殊的机制以适应浓盐环境，它们或者产生大量的内 部溶质，或者保留从外部获取的溶质以解决上述问题。例如，古菌h a l o b a c t e r i u m s a l i n a r u m 在细胞内浓缩k c i ，细胞内的酶可能只有在高浓度的k c l 存在时才有功能 3 9 1 。耐盐酶的应用潜力还没有定论，不过有的研究者正在探索用嗜盐极端酶以增加油 井粗提物产量i 3 引。 1 2 5 其他极端微生物【4 0 】 深海是筛选嗜压生物的良好来源，对这些生物的研究主要集中在鉴别其与生长有 关的压力调控基因。 抗重金属的生物机制特殊，人们正从金属动态平衡角度去理解其机制。应用上， 除了熟知的在生物修复与成矿方面，还新发现了它们在材料科学中合成复杂化合物的 潜力。 抗辐射微生物曾是很少研究的一类极端微生物，最近因其可在饥饿、氧化压力、 大量d n a 损伤情况下存活而吸引了极大的关注。d e i n o c o c c u $ r a d i o d u r a n s 是已知最抗 辐射的生物，正被改造用于辐射废料的修复。 好氧生物需要抗氧化的酶，如s o d 和过氧化物酶，来消除体内有害的氧衍生物。 微好氧生物缺乏上面提到的酶，而是采用别的抗氧化系统以维持在低浓度氧环境的存 活。极端生物和极端酶的应用参考表2 。 表2 极端生物和极端酶的应用 t a b l e2t h ea p p l i c a t i o no f e x t r e m o p h i l e sa n de x t r e m o z y m e s 1 3 低温微生物和低温酶 低温环境是一种极端环境，在地球这个大的生态系统中存在着广泛的低温环境， 如占地球表面1 4 的两极地区、高山、冰川及冷库等，而9 0 的海水的平均温度为5 o c 或者更低。在这些特殊的环境中生活着一类微生物即冷适应微生物。低温微生物根 据其生长温度特性可细分为两类：一类是生活在低温下且其最高生长温度不超过 2 0 0 c ，最适宜温度在1 5 0 c ，在o c 可生长繁殖的微生物称嗜冷菌( p s y c h r o p h i l e s ) 。嗜 冷菌绝大多数为g 。菌已鉴定的嗜冷菌属于假单胞菌、弧菌、无色杆菌、黄杆菌、嗜 纤维菌和螺菌等。t a n n e r 和h e r b e r t 用数值分类法对南极海洋沉积物中分离的1 4 4 株嗜 冷菌进行研究，得出5 5 为弧菌，2 2 为产碱杆菌，4 为假单胞菌和3 为黄杆菌。 其他1 6 不能用伯杰手册第八版的方法签定。g + 菌比g - 菌出现的频率小得多，厌氧菌 也少，少数嗜冷芽孢梭菌不仅存在于自然界，也存在于冷藏食品和酸奶中【4 1 1 。嗜冷菌 主要分布于常冷的环境如南北两极地区、高山、冰川、冰窟、冷库、深海和土壤等低 温环境中。嗜冷菌的分布受环境温度限制且数量少，即使南北两极常冷的环境中，分 离到的微生物中嗜冷菌只占很少部分。嗜冷菌对温度的变化很敏感，2 0o c 以上很快引 起死亡。另一类低温微生物其最高生长温度高于2 0o c 4 2 1 ，最适温度高于1 5 3 2 ，在 0 - 5o c 可生长繁殖的微生物为耐冷菌( p s y c h r o t r o p h s ) 。这两类微生物的生态分布和适应 低温的分子机制存在一定差异。在底物丰富的条件下，嗜冷菌在0o c 的生长要超过耐 冷菌。嗜冷菌只能在较窄的温度范围内生长，而耐冷菌则在较宽的温度范围内生长 耐冷菌分布范围较宽，从常冷到不稳定的低温环境中均可分离到。低温微生物具有广 泛的微生物区系，已发现的低温微生物既有真细菌、蓝细菌、又有酵母菌、真菌和藻 类。最近又发现嗜冷古细菌【4 3 】。研究这些微生物不仅具有重要的理论意义，而且在实 践应用中已经产生了日益明显的经济意义，同时它们是生物技术和生物产业发展的十 分重要的资源。 1 3 1 低温微生物的生态分布 嗜冷菌主要分布在常冷的环境中如南北极地区、冰窟、高山、深海和土壤等低温 环境中2 3 j 。嗜冷菌的分布很受环境温度的限制而且数量少。即使南北极常冷的环境 中，分离到的微生物中嗜冷菌也只占很少部分嗜冷菌对温度的变化很敏感，2 0o c 以 上很快引起死亡。耐冷菌则分布范围较宽，从常冷到不稳定的低温环境中均可以分离 到。在丰富底物存在条件下，嗜冷菌在0o c 的生长要超过耐冷菌。嗜冷菌只能在较窄 的温度范围内生长，而耐冷菌则能在较宽的温度范围内生长。嗜冷菌有广泛的微生物 区系，已发现的嗜冷微生物既有真细菌、蓝细菌，又有酵母菌、真菌和藻类。最近又 发现了嗜冷古细菌。 1 3 2 低温微生物和低温酶的应用及前景 在地球这个大的生态系统中存在着广泛的低温环境，低温微生物就生活在这些特 殊的生态环境，对其进行研究既可丰富生物多样性的研究内容，还可利用其特殊的基 因及产物服务于人类，是生物资源应用的重要方面。自然界中许多污染发生在河流、 湖泊及地下水等相对低温的环境中，在这些环境中低温微生物对污染物的降解与转 化、对自然界的物资循环起重要作用。研究表明耐冷菌能矿化甲苯等多种有机污染物 m 4 5 1 。病原菌p s e u d o m o n a s 通过产生冰核蛋白而引起植物冻害。冰晶产生细菌在3 到 5o c 形成冰晶。将冰晶形成负突变菌株接种到植物上，这些植物可免遭冰晶产生菌的 攻击，从而对植物起到保护作用1 4 6 1 。低温微生物进行低温发酵可用来生产许多风味食 品且可节约能源及减少中温菌的污染。有些分离自嗜冷菌的水解酶在相对低的温度下 具有活性【4 ”。分离自低温微生物的脂酶、蛋白酶及在半乳糖酸在食品工业和洗涤剂添 加剂中具有很大潜力1 4 8 】。低温微生物在低温条件下具有相对高的生长速率且不受中温 菌的污染，因而具有广泛的应用前景 4 9 , 5 0 。 具有高活性的低温酶在中、低温环境有潜在的商业价值 2 9 5 l 巧4 1 ，如在很多工艺处 理过程中都需要外加能量进行反应，而使用低温酶代替中、高温酶则可以而节省能 源。再如，目前在皮革处理工业上使用的中温蛋白酶，使用处理水必须加热到3 7 0 c 以 上才有效果，如果使用低温蛋白酶，直接用自来水就即可 低温酶在家务处理上也很有用处。如在低温下洗涤衣服可以保持织品的色泽和节 省能耗，但如枯草杆菌蛋白酶，脂肪酶，糖萤酶等在自来水环境下加到清洁剂中，则 很难达到去除大分子污物的效果；如果用相应的低温酶代替，则会有很好的效果。 在食品工业，低温酶同样可以应用于一些热敏感食品的转型或精炼。全球2 3 的人 不能容忍乳糖。目前一项关于在牛奶冷储藏过程中，用低温的1 3 牛乳糖酶除去乳糖的 专利已经通过申请。还用在烤焙工业上的使用的低温木聚糖酶专利也通过了申请。另 外，低温果胶酶在低温下有助于降低果汁的粘度，使之变得澄清。 这些低温酶的热不稳定性同样确保它们能在复杂的混合物中进行迅速、高效和有 选择性的失活。在分子生物学上使用热敏感的碱性磷酸酯酶在热处理后不会干扰聚核 苷酸激酶作用的末端标记，该应用被认为是低温酶在生物技术领域上的首例 5 5 1 糖苷酶常用在烘焙工业上，食品在烘焙处理冷却之后，还会有剩余酶活，这使得 最后产品的结果在储藏过程中被改变了，若使用低温糖苷酶则不会有这种情况。然 而，尽管低温酶在生物工艺领域上有如此多的应用，但它们并未得到充分的应用。部 分原因是低温下进行的生产和加工工艺的成本比目前使用的商业酶还要高【5 6 1 。 1 4 微生物淀粉酶研究简介 淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称，广泛存在于动植物和微生物中。在当今生 物工艺学中，淀粉酶是最重要的一类酶，也是最早实现工业生产并且迄今为止用途最 广，产量最大的酶制剂品种。淀粉酶作为工业酶制剂的重要组成部分，占了酶制剂市 场的约2 5 份额【5 7 】。淀粉酶被应用到很多工业中如食品，发酵，纺织，造纸业，制药 业和化学药品工业等，还扩展到其他领域，如临床，医学，分析化学。下面对部分舡 淀粉酶作简单介绍。 1 4 1 微生物m 淀粉酶 淀粉酶种类较多，其水解产物主要是糊精和比糊精更小数量更多的以葡萄糖残基 为单位的小分子多聚物【5 8 】。叶淀粉酶家族中的这样有一群酶，它们对同一种类型的底 物同时具有三个不同水解特异位点，如该底物的葡萄糖残基通过弘1 1 、弘1 4 、静1 6 糖 苷键连接的。该家族中各成员具有许多共同的特点和性质嗍。淀粉酶可以分位两大 类，内切淀粉酶和外切淀粉酶。内切淀粉酶可以从淀粉分子内部任意键作用，产生不 f 司链长直链和分支的低聚糖( 可以水解直链淀粉或糖原分子内部的任意a - l , 4 糖苷键， 但对距淀粉链非还原性末端第五个以后的糖苷键的作用受到抑制。当底物是直链淀 粉，水解产物为葡萄耱和麦芽糖、麦芽三糖以及低聚糖的混合物；当底物是支链淀 粉，则直链部分的a 一1 ，4 一糖苷键被水解，而a - 1 ，6 糖苷键不被水解，水解产物为葡萄糖 和麦芽糖、麦芽三糖等寡聚糖类以及含有旺一1 ，6 一糖苷键的短的分支部分极限糊精( a 极 限糊精) 的混合物。外切淀粉酶是从淀粉分子外围的非还原性末端开始，产生低聚糖 的淀粉分子外围的非还原性末端开始，每间隔一个糖苷键进行水解，生成产物为麦芽 糖。如果底物是直链淀粉，水解产物几乎都是麦芽糖；如果底物是支链淀粉，水解产 物为麦芽糖和多分支糊精( b 极限糊精) 6 0 1 。 淀粉酶家族中有一大类群的工业酶大约占有2 5 的酶市场份额 5 7 , 6 1 】。而具有高凝 固点( 1 0 0 - 1 1 0 0 c ) 和液化温度( 8 0 9 0 0 c ) 下有效进行酶作用的旺淀粉酶是市场所需求的， 所以具有嗜热的和热稳定的d a m y l a s e s 更具有应用价值1 5 7 1 。随着耐热酶的出现，工业上 的生产也出现了一些新的特点1 6 2 1 。在淀粉处理工业中淀粉酶作为耐热酶的应用最为广 泛【6 3 - 6 s 。耐热淀粉酶的许多其它应用也正经历着不同程度的发展。喜温生物由于其固 有的热稳定性，而从中分离得到的耐热酶已经发现有许多商业应用价值【3 8 1 。淀粉酶的 型谱，拓展了其在其在临床上，医学上和分析化学上等领域的应用；同时淀粉酶的糖 化作用在纺织、食品、发酵、造纸、酿造、蒸馏等工业上也有着广泛的应用5 8 1 。 a - a m y l a s e