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论文题目：氯过氧化物酶发酵条件的研究 学科专业：微生物学 学位申请人：孙凌燕 指导教师：陈军副教授 摘要 氯过氧化物酶( c p o ) 是一种应用非常广泛的亚铁血红素过氧化物酶，具有 很高的异构体选择性和普遍性。主要以氯化物、溴化物和碘化物作为专一性的底 物，在有合适的受体存在时就可以催化生成碳卤键。近年来，随着氯过氧化物酶 在工业、农业和医学方面应用研究的进展，氯过氧化物酶的需求量也日益增加。 但是目前国内尚无任何发酵生产的报道。 本文采用购自英国的一株海洋丝状真菌l e p t o x y p h i u m - f u m a g o ，通过对该菌 的形态特征、生理生化特性及抗菌性等生物学特性进行研究，了解其最适生长条 件，并以此为基础，研究实验室条件下l e p t o x y p h i u m f u m a g o 生产氯过氧化物酶 最优化的培养基组成、最适的环境条件和最优化的发酵条件，并且研究对发酵液 中发酵产物c p o 进行分离纯化的方法。 通过对丝状真菌l e p t o x y p h i u m f u m a g o 生物学特性的研究发现，该菌株能够 利用多种碳源和氮源等营养物质进行生长。其生长条件为中性偏酸性，在培养过 程中发现除枯草芽孢杆菌以外，该菌不易被污染，有良好的抗菌性。为优化 l e p t o x y p h i u m f u m a g o 的复合发酵条件，选择碳源、氮源和天然物提取液及环境 条件等为自变量，采用二次响应曲面通用旋转组合设计方法，研究各自变量及其 交互作用对c p o 产量的影响，利用m i n i t a b 软件和响应面分析相结合的方法， 模拟得到二次多项式回归方程的预测模型，并确定最佳发酵条件为：葡萄糖 1 8 4 8 8g l ，蔗糖1 5g l ，淀粉1 0g l ，n a n 0 32g l ，酵母粉7 l ，马铃薯浸 出液1 0 0 0m l l ，k c l3 2 5g l ，k h 2 p 0 42 5 5g l ， m g s 0 4 7 h 2 02 3 9g l ， f e s 0 4 7 h 2 0o 2 2g l ，p h7 0 ，温度为2 5 ，接种量为2c m 2 菌苔瓶，发酵液 装液量为5 0 m l 2 5 0 m l 三角瓶。在此条件下，酶活力预测值可以达到7 7 0 2 4 4 刑- m l 。经实际验证得到的酶活力为7 5 5 3 6 6 刑m l ，相对误差不到1 。 经研究得到的分离纯化方案为：发酵液固液分离去除菌体后制备粗酶液_ 超 滤_ 硫酸铵盐析_ d e a e 纤维素5 3 离子交换层析- * s e p h a d e xg 一1 0 0 凝胶层析。 采用该纯化方案，c p o 比活达到6 1 4 6 2 4 u m l ，比初始发酵液酶活提高了1 7 0 1 倍。对c p o 的酶学性质进行研究发现，该酶在室温下的k m 值为1 2l a m o l ( l 。m i n ) ； c p o 的最适反应p h 为2 7 5 ，最适反应温度为2 5 ，且实验发现酶反应速率受 反应温度影响较大。 关键词：l e p t o x y p h i u m f u m a g o ，生物学特性，发酵条件优化，分离纯化，二次响 应曲面通用旋转组合设计，酶学性质 论文类型：b 应用基础； a bs t r a c t c h l o r o p e r o x i d a s e ( c p o ) ，w h i c hh a sh i 曲s e l e c t i v i t yo f i s o m e r sa n du n i v e r s a l i t y , i saw i d e l yu s e dh e m e - p e r o x i d a s e i t ss p e c i f i cs u b s t r a t e sa r em a i n l yc h l o r i d e ，b r o m i d e a n di o d i d e v g h e nt h e r ea r ea p p r o p r i a t er e c e p t o r s ，i tc a nc a t a l y z et h ef o r m a t i o no f c a r b o n - h a l o g e nb o n d s w i t ht h ea p p l i c a t i o nd e v e l o p m e n to fc p oi ni n d u s t r y , a g r i c u l t u r ea n dm e d i c i n ei nr e c e n ty e a r s ，t h ed e m a n do fc p o i si n c r e a s i n g b u tt h e r e w a sn or e p o r to ni t sf e r m e n t a t i o na n dp r o d u c t i o ni nc h i n a w eb o u g h tl e p t o x y p h i u mf u m a g of r o mir k w es t u d i e dt h eo p t i m u mg r o w i n g c o n d i t i o n sa n db i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，s u c ha sm o r p h o l o g i c a l ，p h y s i o l o g i c a la n d b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n da n t i b a c t e r i a l o nt h i sb a s i s ，w es t u d i e dt h eo p t i m i z e d c o m p o s i t i o no fm e d i u m ，e n v i r o n m e n ta n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n si nl a b o r a t o r y , a n d d e v e l o p e das i m p l e ，r a p i d ，h i 曲y i e l di s o l a t i o n a n dp u r i f i c a t i o np r o c e d u r ef o r c h l o r o p e r o x i d a s ei s o l a t i o n t h er e s u l t ss h o wt h a tl e p t o x y p h i u mf u m a g oc a ng r o wo nt h em e d i u m c o n t a i n i n gd i f f e r e n tc a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c e s i nn e u t r a la n da c i d i c ，i t c a ng r o w w e l l i na d d i t i o n ，w ef o u n dt h a ti th a sag o o da n t i - b a c t e r i a le f f e c t ，s ot h a ti tc a nn o tb e e a s i l yc o n t a m i n a t e d ，e x c e p tb a c i l l u ss u b t i l i s i no r d e rt oo p t i m i z et h ef e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s ，t h ec a r b o n ，n i t r o g e n ，n a t u r a le x t r a c t sa n de n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n sw e r e v a r i e da c c o r d i n gt ot h eq u a d r a t i cr e s p o n s es u r f a c ec o m m o nr o t a r yc o m b i n a t i o nd e s i g n w i t ht h ea i mo fa s s e s s i n gt h ee f f e c t so ft h e s ev a r i a b l e sa n dt h e i ri n t e r a c t i o n so nt h e c p oo f p r o d u c t t h ep r e d i c t i v ep o l y n o m i a lq u a d r a t i ce q u a t i o n sm o d e lw a sd e v e l o p e d b ym i n i t a bs o f t w a r e t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r ef e r m e n t e df o r6 - 7d a t t h et e m p e r a t u r eo f2 5 ，p h7 0 t h ec o m p o s i t i o no ft h em e d i u mi sg l u c o s e18 4 8 8 g l ，s u c r o s e15g t ，s t a r c h10g t ，n a n 0 32g l ，y e a s te x t r a c t7e j l ，t h ep o t a t o e x t r a c t1 0 0 0m l l ，k c l3 2 5g l ，k h 2 p 0 42 5 5g l ， m g s 0 4 7 h 2 02 3 9g l ， f e s 0 4 7 h 2 0o 2 2g l t h el i q u i dv o l u m eo fm e d i u mi s5 0 m l 2 5 0 m ls h a k ef l a s k ，a n d t h ei n o c u l u mi s2c m 2i naf l a s k i nt h i sc o n d i t i o n ，t h ee n z y m ea c t i v i t yc a nr e a c h 7 7 0 2 4 4i u m l i nv e r i f i c a t i o nt e s t ，t h ea c t u a la c t i v i t yi s7 5 5 3 6 6i u m l ，a n dt h e r e l a t i v ee r r o ri sl e s st h a n1 w ea l s od e v e l o p e dt h eb e s ti s o l a t i o na n d p u r i f i c a t i o np r o c e d u r e f i r s t l y , s e p a r a t e m y c e l i u mf r o mb r o t ht oo b t a i nc r u d ee n z y m es o l u t i o nf o ru l t r a f i l t r a t i o n t h e n ，a f t e r s a l t i n go u tp r o t e i nb ya m m o n i u ms u l f a t e ，t h ep r o t e i nw a sd o n ew i t hd e a e - c e l l u l o s e 5 3i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ya n ds e p h a d e xg - 10 0g e lc h r o m a t o g r a p h y i nt h i s w a y , t h ea c t i v i t yo fc p or e a c h e dt o6 1 4 6 2 4u m l ，w h i c hw a s1 7 0 1t i m e st h a nt h e c r u d ee n z y m es o l u t i o n w i t ht h es t u d i e so ne n z y m a t i cc h a r a c t e r i z a t i o n so fc p o ，w e f o u n dt h a ti t sk mi s1 2l x m o l ( l 。m i n ) ，t h eo p t i m u mr e a c t i o np hi s2 7 5a n dt h e o p t i m u mr e a c t i o nt e m p e r a t u r e i s2 5 t h er e a c t i o nr a t ew a si n f l u e n c e db y t e m p e r a t u r eo b v i o u s l y k e yw o r d s ：l e p t o x y p h i u mf u m a g o ，b i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n so p t i m i z i n g ，i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ，t h eq u a d r a t i cr e s p o n s es u r f a c e c o m m o nr o t a r yc o m b i n a t i o nd e s i g n ，e n z y m a t i cc h a r a c t e r i z a t i o n s 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 作者签名瑚、凌盎日期：妒7 订 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名掀新签羔：纸争期：彳。乡巧 上海师范大学硕士学位论文第一章绪论 1 氯过氧化物酶概述 1 1c p o 的发现 第一章绪论 氯过氧化物酶( c h l o r o p e r o x i d a s e ，c p o ，e c1 ，1 1 ，1 ，1 0 ) 是一种氧化还原酶， 是h a g e r 等人于1 9 6 1 年首次从海洋丝状真菌c a l d a r i o m y c e s f u m a g o 中分离出来 的一种用途非常广泛的胞外过氧化物酶【l 2 1 。 氯过氧化物酶( c p o ) 通常以单体的形式存在于中性溶液中，其分子量约为 4 2 ，0 0 0 d a 3 1 。它是一种血红素糖蛋白质，含有大约2 5 一3 0 的糖类化合物，氨 基酸水解产物层析色谱显示其中以氨基葡萄糖和阿拉伯糖为主，还含有3 2 1 个主 要为酸性氨基酸的蛋白质，其等电点p i 大约为3 2 4 o 【4 】。在氨基酸组成成分上以 a s p 、g l u 、s e r 和p r o 残基为主，约占氨基酸总量的4 5 【5 】，如表1 1 所示。根 据表1 1 中所列的氨基酸组成计算出来的c p o 的分子量大约为2 8 ，6 4 0d a ，但是 实际上c p o 的最小分子量也比这个结果重约4 0 ，并且通过l o w r y 方法测定也 认为大约有2 5 3 5 的成分为非蛋白质。 表1 1 氯过氧化物酶的氨基酸组成 a m i n ol c j da n a l y s i sw i l l se t r r i e do u ti t sd t n r i h e du n d e r 。矗曩e t h o d sa n dm t e r i k _ 反磊忑丽i 五磊磊i 磊r 五aperformieadd-oxidized s a m p l e e 厦r - p d 协d o _ 帅t i m e ，- 酬谢n 丘伟 o r d e rd c c - ， 注：图表来源于m i c h a e la p i c k a r d 第一章绪论上海师范大学硕士学位论文 研究已经发现c p o 有两种可分离的同工酶，c p o a 和c p o b ，但是对其进 一步的研究还没有报道。 天然的c p o 在4 0 0 ，5 1 6 ，5 4 4 ，6 5 2 n m 处分别有最大光吸收。如图l 一1 所示： 客 毫 刍 ： w a v e l e n g i h 一掣 图1 1 氯过氧化物酶及其衍生物的吸收光谱 天然蛋白光谱( h ) ；p h5 4 ，o 1m 柠檬酸磷酸盐缓冲液中测定的亚硫酸钠还原形式的c p o 光谱( ) ；含有 p h4 2 ，o 1m 柠檬酸磷酸盐缓冲液和0 5 6m 叠氮化钠溶液中测定的叠氮衍生物光谱( 一一) ；p h5 4 ，o 1 m 柠檬酸磷酸盐缓冲液和0 0 6m 氰化钾溶液中测定的氰化物的光谱( ) f i g 1 - 1a b s o r p t i o ns p e c t r ao f c h l o p e r o x i d a s ea n di t sd e r i v a t i v e s t h es p e c t r ao f t h en a t i v e ( 一) a n dd i t h i o n i t e r e d u c e d ( 一) f o r m so f c h l o r o p e r o x i d a s ew e r em e a s u r e di no 1 mc i t r a t e - p h o s p h a t eb u f f e r , p h5 4 t h es p e c t r u mo f t h ea z i d ed e r i v a t i v e ( 一- ) w a sm e a s u r e di no 1m c i t r a t e p h o s p h a t eb u f f e r , p h4 2 ，a n d0 5 6ms o d i u ma z i d e t h es p e c t r u mo f t h ec y a n i d ec o m p l e x ( ) w a s s c a n n e di n0 1m c i t r a t e - p h o s p h a t eb u f f e r , p h5 4 ，a n do 0 6mp o t a s s i u mc y a n i d e 注：图表来源于m i c h a e la p i c k a r d 1 2 氯过氧化物酶的分子结构特点 在一般过氧化物酶中，酶活辅基是高铁血红素，它也是咪唑第5 铁配合 体，与过氧化物酶类中的其它成员相似，c p o 的辅基也是高铁( ) 原卟啉 6 1 ，是 首选的亚铁血红素过氧化物酶，然而，大量研究表明，c p o 在结构和催化活性 上与普通的血红素过氧化物酶有较大差别。c p o 分子中是由半胱氨酸烃硫基金 属代替咪唑配体作为亚铁血红素的第五轴向配体 7 1 。而且是以谷氨酸而不是组氨 酸来做远端酸碱催化成分，c p o 中血红素“远端 的氨基酸残基为g l u 1 8 3 ，而 其他过氧化物酶类似的位置氨基酸残基为h i s 。并且与其它过氧化物酶中的铁的 配基是h i s 不同，c p o 在结构上较为特殊的一点就是血红素中铁的“近端”配基 是c y s ，这与p 4 5 0 相似而与其它过氧化物酶不同。不过，无论是p 4 5 0 还是过 2 上海师范大学硕士学位论文第一章绪论 氧化物酶都需要通过一种血红素的氧化物- 化合物作为中间体对底物进行氧化嗍。 c p o 独特的活性位点结构在已知的血红素过氧化物酶中是应用范围最广的生物 催化剂。 不同的真菌生产出来的c p o 结构上并不是完全相同的，因为它们各自编码 c p o 蛋白质的基因也不一致，但是其催化卤化作用的能力基本相同 9 - 1 1 】。 1 3 氯过氧化物酶的化学性质 c p o 的许多光谱学和化学特性都与细胞色素p 一4 5 0 高度相似，如具有很高 的异构体选择性和普遍性，尤其是在催化碳数 9 的顺式短链烯烃的环氧化中具 有很好的异构体选择性等。c p o 的电子效应，特别是电子的空间效应，对反应 的影响也是很剧烈的1 1 2 j6 】。 纯化后的氯过氧化物酶在4 ，p h3 - - 6 5 的条件下通常可以保存几天， 如 果p h 值过大，则会导致酶的不可逆的失活；但在缺少底物，温度低于4 0 ， p h 值约为3 5 5 的时候，c p o 可以保持一定的稳定性；而在有o 1m 氟化物存 在的条件下，p h 为1 5 时，其稳定状态仅仅能维持几小时。 在有合适的受体分子存在时，氯过氧化物酶就可以催化卤化反应，催化碳卤 键的生成。主要以氯化物、溴化物和碘化物作为专一性的底物【1 ”扪，但是氟化物 不是其底物，而是卤化反应的一种抑制剂，动态研究表明，它既可竞争过氧化氢 结合位点，又可竞争卤离子结合位点。除此之外，c p o 的催化活性还会被氰化 物所抑制【1 9 】，也可以被典型的血红素蛋白质抑制剂所抑制，但是却不会被叠氮化 合物所抑制。 1 4 氯过氧化物酶催化作用的价值 手性是自然界普遍存在的现象，手性异构体的物理和化学性质都相同。通过 高选择性催化合成反应来获得纯的单一结构的手性异构体被认为是目前最有发 展前途的生产技术之一。2 0 0 1 年，诺贝尔化学奖被授予研究不对称催化合成的 三位科学家，他们为合成具有新特性的分子和物质开创了一个全新的研究领域， 因此，手性药物的研究已成为国际新药研究的方向之一。 c p o 具有广泛的底物特异性和较高的异构体选择性 2 0 , 2 1 】，能催化广泛的底物 3 第一章绪论上海师范大学硕士学位论文 合成手性化合物，且有高的产率和高的对映选择率，最适合催化立体选择性反应。 尽管其活性与其它过氧化物酶相似，但是，c p o 的结构使底物更容易靠近酶活 性中心，使其有利于立体选择性地转移氧原子；尤其是c p o 还是一种脱卤过氧 化物酶【2 2 】，它对烯烃的卤化、环氧化、羟基化和有机硫化合物的磺化氧化所具有 的手性催化性更引起了广泛关注。对其应用的研究很广泛，从精细的化学合成到 环境生物催化方面应用都很广泛。 1 5 氯过氧化物酶的应用情况 氯过氧化物酶作为过氧化物酶家族中的一员，对多种有机底物表现出了广泛 的催化活性。自上世纪6 0 年代被发现以来，它在有机合成中的应用一直是一个 研究热点。 早在1 9 6 1 年，h a g e r t 2 3 】等就报道了c p o 能和b 酮酸发生卤化反应，后来又 发现在有合适的卤素受体存在时，c p o 能够利用卤素离子发生卤化反应。之后 又陆续发现了c p o 还可以催化各种芳香族化合物和脂肪族化合物发生氯化和溴 化反应【2 4 】。尤其是一些抗生素如：卡尔里霉素、万古霉素的生物合成 2 5 - 3 4 】。由于 c p o 的化合物i 是强氧化剂，可以和氯离子发生反应生成次氯酸。但是，c p o 催化的卤化反应大多数都缺乏立体选择性【3 5 1 ，这与无酶卤化反应是一致的，但具 体的细节仍有争论【3 6 7 】。而在没有卤素离子的情况下，c p o 还可以催化醇类化 合物氧化成醛或酸，可以催化苯甲基及其衍生物进行羟基化作用，并且c p o 能 够以很高的产率和对映选择率催化各种烯烃的不对称环氧化。 c p o 还是一种脱卤过氧化物酶，因其广泛的底物适应性和较高的异构体选 择性，其氧化能力备受瞩目，尤其是对烯烃的卤化、环氧化、羟基化和有机硫化 合物的磺化氧化所具有的手性催化活性更是引起了广泛的关注。 并且，c p o 可能在去除废水中的氯化物和苯酚类化合物的应用方面有很大 潜力【3 8 删。造纸工业是世界上六大污染工业之一，造纸工业中的制浆和漂白工序 是污染物产生的主要工序，传统的化学漂白法是采用多段的氯- - 氧化氯漂白及 碱提取来去掉木质素，在废水中会有大量含氯的致癌致畸的物质，如呋喃、二恶 英等，造成严重的环境污染和生态破坏。而氯过氧化物酶的催化特性，有可能在 去除污水中氯离子方面起到一定的作用。 4 上海师范大学硕士学位论文第一章绪论 另外，最新研究表明，c p o 还可以应用于电化学方面，利用c p o 的电化学 性质充当电极进行电子传递。 随着研究的深入，不断提高酶的产量、稳定性和对环境的适应能力，使其走 向商业化，必将给各个领域带来重大影响，给经济、环境和医药方面都带来很大 的效益。 2 氯过氧化物酶的生产研究现状 2 1 国外c p o 生产概况 2 1 1 生产菌种 m i c h a e l a p i c k a r d 4 1 l 研究了c f u m a g o 属的十个菌种( 如图1 2 所示) ，研究 采用的基本培养基是葡萄糖一麦芽浸膏培养基。所有的菌种在这种培养基中都能 够很好的生长，同时会产生大量的黑色色素，并且分泌出来的氯过氧化物酶的含 量差别很大。其中c f u m a g oa t c c1 6 3 7 3 和c m i8 9 3 6 2 是产酶最丰富的两个菌 株。 m a x i m u me h l o r o p e r o x i d a s el e v e l 。 f u n g a ls t r a i n e l i m l 图1 2 葡萄糖一麦精培养基培养真菌菌株生产氯过氧化物酶 t a b l e1 - 2 c h l o r o p e r o x i d a s ep r o d u c t i o nb yf u n g a ls t r a i n sg r o w no ng l u c o s e - m a l te x t r a c tm e d i u m 注：图表来源于m i c h a e la p i c k a r d 2 1 2 产酶培养基研究 m i c h a e la p i c k a r d 的研究中，菌种的生长和酶的生产都是在基础培养基上 5 第一章绪论上海师范大学硕士学位论文 进行的。对产酶最丰富的c f u m a g oa t c c1 6 3 7 3 和c m i8 9 3 6 2 两个菌株，分别 从碳源和氮源等营养条件方面对其进行了产酶最适培养基的研究。 在对碳源的利用情况进行研究时发现，在所选用的各种碳源中，只有以果 糖和其聚合物菊粉作为碳源的培养基可以促进高水平c p o 的产生，而以乳酸盐、 柠檬酸盐、琥珀酸盐和纤维素作为碳源的培养基中，只能产生少量的酶，甚至不 产酶，如表1 3 所示。但是，在以果糖为碳源的培养基中，色素的产量也是最高 的。 i n o e u l u mw i l l2 o f g l u e o - - m i u l t i i g r o w nf o r1 0d a y s g r o w t hs r l n b ：+ 1 i t t l ed e t e c t a b l e 1 l 掣t h ；+ + m o d e r a t e 嗣胁；+ + + o o di 晖o w t h t n a ta v a i l a b l e 表1 3c f u m a g o a t c c1 6 3 7 3 和c m i8 9 3 6 2 菌株在不同碳源培养基上的生长和c p o 生产 t a b l el 一3g r o w t ha n dc h l o r o p e r o x i d a s ep r o d u c t i o nb yc f u m a g os t r a i n sa t c c16 3 7 3a n dc m i 8 9 3 6 2o nd i f f e r e n tc a r b o ns o u r c e s * 注：图表来源于m i c h a e la p i c k a r d m i l t o nj 【4 2 1 等研究还发现葡萄糖会强烈抑制c p o 酶的m r n a 的产生和蛋白 质的翻译，而果糖则可诱导它们的产生。 m i l t o nj 把从c f u m a g o 中分离纯化的包含c p o 基因的多聚腺苷酸r n a 作 为底物，用2 9 m e t 作为引物克隆出其双链e d n a t 4 3 郴i ，并用常规方法将其克隆到 p b r 3 2 2 质粒中，研究过程中，尽可能保持m r n a 水平稳定，以使它们在翻译效 果和m r n a 的稳定性上没有差异。研究发现，真菌所利用的碳源能够强烈地调 节氯过氧化物酶及其专一的m r n a s ，葡萄糖可以强烈抑制氯过氧化物酶的 m r n a 水平，而果糖则可以极大的诱导它们的产生。 c f u m a g o 中果糖的代谢途径还不是很清楚，研究中发现cf u m a g o 可以广 6 上海师范大学硕士学位论文第一章绪论 泛地生长在熟透的水果上，或许这正表明c p o 的产生与水果中的果糖在生理上 有着重要的联系 4 6 1 。 对培养基中所需氮源的研究，则是在以各种氨基酸为单一氮源的基础上， 另外再加入n a n 0 3 的培养基中进行研究的。研究发现在培养基中加入硝酸钠对 c p o 的产量有很大影响。当氮源含量约为2 时，酶产量最高( 如图1 4 所示) 。 ns 棋i 能一n a n o ，ns 嗽s + n a n o ， l 噜s o t t r 一一 0 2 r ( 1 6 3 7 3c m i8 9 3 6 2 a t c c1 6 3 7 3c m l8 9 3 6 ： 图l 一4 不同氮源对c f u m a g os t r a i n sa t c c1 6 3 7 3 和c m i8 9 3 6 2 生长和c p o 生产的影响 t a b l e1 4 e f f e c to fa d d i t i o n a lo ra l t e r n a t i v en i t r o g e ns o u r c e so nc h l o r o p e r o x i d a s ep r o d u c t i o n “ ( r e l a t i v ec h l o r o p e r o x i d a s ep r o d u c t i o na sap e r c e n t a g eo fc o n t r 0 1 ) b yc f u m a g os t r a i n s a t c c16 3 7 3a n dc m i8 9 3 6 2g r o w no nf r u c t o s e - s a l t sm e d i u m 研究过程中同时也发现菌株c f u m a g oa t c c1 6 3 7 3 在培养2d 后就开始产 生少量的酶，培养至第7d 时，产酶量达到最大值，而且培养基中的色素含量也 较低，不到基本培养基中的1 0 。 2 1 3 酶的生产工艺条件研究 1 菌体发酵 目前对c p o 的发酵生产主要采用分批发酵生产的方法，菌体的生长和酶的 生产都是在发酵罐中进行的 4 7 1 。c a r m i c h a e l f 4 8 j 采用真菌c a t d a r i o m y c e sf u n a g o 进 行发酵生产c p o 时，首先，以大约lc m 2 的菌丝体接入种子发酵罐进行种子发 酵，然后将含有直径约2 3i i l n l 菌球的发酵液接入发酵罐，调整培养温度约为2 2 ，并且不断进行搅拌，以保证菌体生长所需要的足够的氧气。当发酵液上清液 7 第一章绪论 上海师范大学硕士学位论文 中c p o 浓度达到大约8 0 1 0 0m g l 时即可停止发酵，发酵过程通常需要7 1 0d 。 在分批发酵过程中，c p o 产生后会被分泌到发酵液中，可以收集发酵液上 清液，弃去菌丝体进行分离。这种方法可能并不是最经济、最高效的，但却是现 在最快速的。目前对真菌连续培养产酶进行的研究还是很少的。 2 氯过氧化物酶的分离纯化 当发酵液中酶活力达到最大时，可以通过滤出菌丝体分离出含有可溶c p o 的发酵液，经过粗酶浓缩去除色素、乙醇分馏纯化和d e a e 纤维素层析柱层析 及硫酸铵沉淀一系列过程，最终获得含量较高的纯化的c p o ，如g o n z a l e a - v e r g a r a 的研究【4 9 1 。 ( 1 ) 粗酶浓缩 滤出菌丝体后的发酵液通常是黑色的，其中含有大分子量的黑色色素，通 常酶的分离过程会由于有这些色素的存在而变得比较复杂。这些色素的吸收光谱 很广，用p h5 5 ，2 0m m 的磷酸缓冲液稀释后，通常在5 7 5n r n 有最大光吸收【5 们。 去除色素的过程应该尽量不超过3h ，并且所有的步骤都应该在4 以下或 在冰浴中进行。如果这一过程操作不够成功，接下来的提纯过程就很难做得顺利。 并且以后的过程也要在4 的环境条件下或在冰浴中进行。浓缩后的发酵液是 黑褐色的溶液，在除去色素后，溶液呈透明的琥珀色。浓缩后的溶液可在4 c 保 存几个月，而酶活力不会有明显的降低。 ( 2 ) 乙醇分馏 将浓缩后浓度约为5m g m l 的粗酶溶液，用1 0m 预冷的k 2 h p 0 4 调节p h 至6 5 ，在4 的条件下以1 5 ，0 0 0r p m 离心1 5m i n ，待黑色粘性物质沉淀后，将 含有酶的上清液收集，弃去沉淀，在冰浴中冷却至0 ，再将预先冷却至- - 2 0 的乙醇缓慢加入，加入的同时用磁力搅拌器快速搅拌，以免酶溶液中局部乙醇浓 度过高【5 l 】而导致酶失活。乙醇完全加入后，要继续搅拌1 0m i n ，然后在一l o 以5 0 0 0r p m 离心1 0m i n 。弃去沉淀，收集上清液，加入4 0m m p h5 8 的磷酸缓 冲液( 最终体积应该是大约1 0m l 缓冲液中含5 0m gc p o ) ，混合后用2l ，4 0m l v l ， p h5 8 的磷酸缓冲液透析过夜，每6 8h 更换一次缓冲液。为了在这一过程中 能够获得较好的产量，从粗酶液p h 的调节到透析的操作过程都要保持在最短时 间。 8 上海师范大学硕士学位论文 第一章绪论 ( 3 ) 层析与硫酸铵沉淀 透析后的酶液用d e a e 一纤维素层析柱层析，d e a e 一纤维素层析柱要预先 用磷酸缓冲液平衡。层析时，在柱的顶部会有一条红褐色的c p o 吸收带，可以 用梯度磷酸缓冲液洗脱，收集r z 值( 4 0 3n n l 光吸收2 8 0n n l 光吸收) 大于1 2 5 的溶液。介于1 1 1 2 5 之间的酶液可以再用离子交换柱进行层析【4 9 】。收集的部分 用2 0m 预冷的磷酸缓冲液调节p h 至3 5 ，然后浓缩至酶浓度约为1 0m g m l 。 浓缩液调p h 为4 0 后，用饱和硫酸铵透析过夜沉淀c p o 。以2 0 ，0 0 0r p m 离 心1 0m i n ，弃去上清液，然后将沉淀溶于磷酸钾缓冲液。纯化得到的最终的c p o 溶液用牛血清蛋白标定【5 2 。3 1 ，酶浓度大约为5m g m l 。c p o 可以以这种方式保存 几个月而不会出现r z 值明显的降低或失去活性的现象。也可用硫酸铵液的形式 保存更长时间。采用冷冻保存的方法可以保存一年而酶的活力不会明显减小【4 9 1 。 2 1 4 存在的问题 由于色素含量较高和酶活力的不稳定性，在发酵和分离纯化及应用时存在 着一些难以解决的问题。 l 、基质利用问题 m i l t o nj 等m 研究发现葡萄糖会抑制c p o 酶生物合成，而果糖则可诱导它 们的产生；以各种氨基酸为单一氮源与加入n a n 0 3 相比较发现硝酸钠对酶产量 提高有很大影响，其中的代谢调控机制不甚明了。再者，在现有报道中c p o 的 发酵生产大多停留在实验室规模水平，对发酵过程动力学特征的研究未见报道， 更未见有工业化生产的记录。 2 、色素干扰 m i c h a e la p i c k a r d 3 对c f u m a g o 的1 0 个菌株进行产酶条件研究时，发现 菌株在不同培养基中尽管生长良好，但会产生大量的色素，影响c p o 的合成能 力；这也使分离纯化工作变得更加复杂。如果通过分级分离的方法将c p o 完全 从色素溶液中分离出来，这一过程大约需要4w 的时间，操作持续的时间太长而 且分离过程中酶的损失量很大。 3 、酶活不稳定，易失活 c p o 作为生物催化剂能催化广泛的底物合成手性化合物，且具有高的产率 9 第一章绪论 上海师范大学硕士学位论文 和高的对映选择率。此外，催化反应条件温和，无环境污染，因此在现代合成化 学和医药工业中具有很大的应用潜力，并且，c p o 可能对于除去废水中的氯化 物和苯酚类化合物的应用也有很大的潜力【5 4 5 1 ，但是其商业应用还并未得到发展 0 6 。原因是因为它的成本很高；在室温下不稳定；当h 2 0 2 氧化剂浓度高时，容 易失活；尽管通过滴加或是连续加入氧化剂以保持较低的过氧化氢浓度对提高 c p o 的稳定性有帮助，但目前为止并未得到满意的改善；大多数有机底物水溶 性差。 近年来已经研究了一些方法来改善这些不利因素，例如：在水介质中加入聚 乙二醇可以增加有机底物的溶解性，并且能更长时间的保持c p o 的活性；把c p o 装入微胶囊里，作为能重复使用的催化剂；c p o 与硅胶共价结合或固定在云母 和中孔性材料里；或以离子性液体作为溶剂，发现可以增强c p o 的活性和稳定 性；还有把c p o 和葡萄糖氧化酶共同固定在聚氨酯泡沫塑料里，反应的氧化剂 来自于g o x 在氧化葡萄糖时生成的h 2 0 2 。这两个偶联反应提高了c p o 的稳定 性，避免了加入h 2 0 2 导致的酶失活问题。a y a l a 等首次报道了c p o 的交联晶体， 与可溶性的酶相比较，虽然活性有所降低，但耐热性明显增加。用c p o 电解酶 催化合成手性化合物的方法，直接用电化学还原法把氧气变成了h 2 0 2 ，避免了 体积增加和副产物等不利因素。将c p o 和聚苯乙烯结合形成一种类似表面活性 剂结构的物质，它能集合在水和油的界面之间。这种方法可以抑制产物的水解， 增加了酶的稳定性和底物的溶解度。c p o 稳定技术主要采用将酶固定在特定材 料上的固定化技术、用基因操纵技术高度专一性地改变蛋白质以提高有目的改变 酶性能的可能性和以离子液体作为有机合成反应的介质【5 7 1 。 因此，进一步对c p o 进行修饰、改进和用它来合成一些具有手性的药物分 子将是今后发展的重要方向。c p o 的出现为众多手性分子的合成带来了新的曙 光。随着研究的不断深入，相信在不久的将来c p o 必将走向商品化，成为现代 合成化学和医药工业中重要的手性催化剂。 1 0 上海师范大学硕士学位论文第一章绪论 2 2 国内对氯过氧化物酶的研究及关注 2 2 1 国内生产研究状况 综观国内生产研究领域，目前所发表的报道中，除综述外都是对c p o 的稳 定性及其应用进行研究。尚未发现有对c p o 的发酵生产进行的研究，而国内对 c p o 的需求量却逐渐增加。随着c p o 应用的广泛研究，对其进行生产研究也变 得更有意义。 2 2 2 氯过氧化物酶的应用研究现况 经了解，目前国内对c p o 的应用主要是作为生物催化剂。由于其广泛的底 物选择性和较高的异构体选择性，在一些抗生素，如万古霉素等的手性有机合成 中发挥很大的作用。卢桂宁【5 8 1 等研究了c p o 对有机磷农药的反应活性与考查的 量化学参数之间的关系。张红霞1 5 9 l 的研究借鉴了生物传感器制作中的酶固定化方 法将c p o 溶液与n a t i o n 分散的单壁碳纳米管分散液混合后直接滴涂到玻碳电极 表面制得修饰电极固定到电极上，利用该修饰电极能催化1 ，1 二甲基一4 氯3 ，5 环己二酮( m c d ) 氯化为1 ，1 一二甲基4 ，4 二氯3 ，5 环己二酮( m c d ) ，无需添 加过氧化氢作为反应启动剂。 2 2 3 国内对氯过氧化物酶生产的需求和存在的困难 近年来，在国内c p o 的需求量也在不断增加，而c p o 的来源一直依赖进口， 价格十分昂贵，目前售价约为8 0 0 美元1 0 0 0 0i u ，因此开发规模化生产c p o 技 术，提高c p o 的使用稳定性是解决当前c p o 需求量与资源紧缺之间矛盾的重要 途径。其中提高c p o 的生产能力是解决问题的关键。 3 课题选题依据及研究内容 3 1 选题意义 氯过氧化物酶近年来正逐渐被应用到现代合成化学和医药生产中作为手性 第