（生物化学与分子生物学专业论文）国产磁珠用于法医dna检验的研究.pdf

摘要 磁珠法实用范围广，可以用于血斑、唾液斑、精斑、汗斑等大多数生物样本的提取， 方法操作简单，不需要特殊的分离设备，同时也避免了大样品体系需要反复离心而造成 的d n a 损失。本实验利用一款国产磁珠，在d n a 回收纯化方面进行了一些探索。实 验证明，国产磁珠用于d n a 回收纯化具有高回收灵敏度、纯化效果好的特性，适合在 案件检验中应用。 首先，用国产磁珠法、硅珠法和i q 试剂盒分别对不同量的9 9 4 7 标准d n a 进行提 取，使用p o w e r p l e x l 6 试剂盒、a b l 9 7 0 0 型扩增仪进行p c r 复合扩增，扩增产物应用 a b i 31 0 0 型d n a 分析仪检测。实验表明，国产磁珠法在荧光定量p c r 方面要优于硅 珠法和i q 试剂盒。然后，用国产磁珠法、硅珠法和i q 试剂盒分别对稀释3 0 倍、6 0 倍 的血液样本进行提取，使用p o w e r p l e x l 6 试剂盒、a b l 9 7 0 0 型扩增仪进行p c r 复合扩增， 扩增产物应用a b i 3 1 0 0 型d n a 分析仪检测。结果表明，国产磁珠法在痕量d n a 提取 方面要优于硅珠法和i q 试剂盒。最后，用国产磁珠法分别对三种污染检材：带血迹玻 璃、衣领脱落细胞、牙刷进行提取，使用p o w e r p l e x l 6 试剂盒、a b l 9 7 0 0 型扩增仪进行 p c r 复合扩增，扩增产物应用a b i 31 0 0 型d n a 分析仪检测，1 6 个s t r 基因座均获得 了理想的d n a 分型。结论，国产磁珠法能够从含有染料、血红素、金属离子等污染成 分的样本中回收纯化d n a ，并适合复合s t r 扩增。 关键词：法医d n a 检验；国产磁珠法；回收纯化；复合扩增 a b s t r a c t m a g n e t i s mb e a dh a sb e e n u s e dw i d l y , w ec a nu s ei t t o e x t r a c td n af r o mm a n y b i o l o g i c a ls a m p l e ss u c ha sb l o o d 、s a l i v a 、s p e r m a t o z o o n 、p e r s p i r a t i o na n ds oo n i to p e r a t e s e a s i l ya n dd o e s n tn e e ds p e c i a ls e p a r a t ee q u i p m e n ta n dc a na v o i dl o s i n gd n a i nt h i ss t u d y w eu s ead o m e s t i cm a g n e t i s mb e a dt oe x p l o r et h ec a l l b a c ka n dp u r i f i c a t i o no fd n a t h e r e s u l t si n d i c a t et h a tt h ed o m e s t i cm a g n e t i s mb e a dh a v eh i g hr e c l a i ms e n s i t i v i t ya n dw e l l p u r i f i c a t i o n ，i ss u i t a b l et oa p p l y i nl e g a lm e d i c a ld e t e c t i o n a tf i r s t ，w eu s ed o m e s t i cm a g n e t i s mb e a d 、s i l i c o nb e a d sa n di qk i tt oe x t r a c td i f f e r e n t q u a n t i t ys t a n d a r dd n a ( 9 9 4 7 a ) ，a n da m p l i f yt h e mb yp o w e rp l e x16k i t ( a b i ) ，9 7 0 0 ( a b i ) ， d e t e c tt h ea m p l i f yp r o d u c t i o nb y310 0a n a l y z i n gi n s t r u m e n t ( a b i ) t h er e s u l t ss h o wt h a t m a g n e t i s mb e a dc a ne x t r a c td n a m o r ee f f e c t i v e l yt h a ns i l i c o nb e a d sa n di qk i ta tp c ro f f l u o r e s c e n c er a t i o n t h e n ，w eu s ed o m e s t i cm a g n e t i s mb e a d 、s i l i c o nb e a d sa n di qk i tt o e x t r a c tt h eb l o o dw h i c hh a sb e e nd i l u t e d3 0 ，6 0t i m e s ，a n da l s oa m p l i f yt h e mb yp o w e r p l e xl6 k i t ( a m )a n d9 7 0 0 ( a b i ) ，d e t e c t t h e p r o d u c t i o nb y 310 0 a n a l y z i n g i n s t r u m e n t ( a b i ) t h er e s u l t ss h o wt h a tm a g n e t i s mb e a dc a ne x t r a c td n am o r ee f f e c t i v e l y f r o ms a m l e st h a ns i l i c o nb e a d sa n di qk i ta tt r a c ea m o u n to fd n a e v e n t u a l l y , w eu s e m a g n e t i s mb e a dt oe x t r a c td n a f r o mt h r e ek i n d so fs a m p l e s ：g l a s sw i t hb l o o d s t a i n 、c e l l s f r o mc o l l a r 、t o o t h b r u s h ，a n da m p l i f yt h e mb yp o w e rp l e x l 6k i t ( a b i ) ，9 7 0 0 ( a b i ) ，d e t e c tt h e p r o d u c t i o nb y3 10 0a n a l y z i n gi n s t n m a e n t ( a b i ) ，a l lt h e16 s t rl o c ag e tt h ee x p e c t a b l er e s u l t s c o l l e c t i v e l y , d n af r o mp o l l u t e ds a m p l e sc a nb eb a c ka n dp u r i f i c a t i o nb yd o m e s t i c m a g n e t i s mb e a d ，w h i c hr e c y c l ed n a f r o md y e s t u f f , h a e m a c h r o m e ，m e t a li o n sa n dt h ed n a s a m p l e sc a nb eu s e dt oa m p l i f y k e yw o r d s ：l e g a lm e d i c a le x p e r tp r o v ed n a ；d o m e s t i cm a g n e t i s mb e a d s ； r e c y c l ea n dp u r i f i c a t i o n ；a m p l i f i c a t i o n 独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工作所 取得的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中作了明确的说明。本声明的法律结果由本人承担。 靴敝储虢隧隼日 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇 编本学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 日期： 学位论文作 工作单位： 通讯地址： 缝 指导教师签名： 日期： 东北师范大学硕士学位论文 1 引言 法医d n a 检验是法医个体识别鉴定基础，也是刑事技术中唯一能够通过对微量生 物物证进行检验直接认定罪犯的高新技术手段。 法医d n a 检验应用于所有涉及有细胞的物证案件中：如杀人案、强奸案、殴斗案、 盗窃案、抢劫案，以及碎尸案、灾难性事件、交通事故等等的尸源认定，带有可疑血痕、 组织或毛发等物证的交通事故案，拐卖儿童、移民、遗产继承等案涉及到的亲子鉴定等 等。目前全世界有1 0 0 多个国家和地区应用法医d n a 检验技术办案，每年有数以万计的 d n a 证据被法庭采用。d n a 技术已成为与犯罪作斗争及解决亲权纷争的有力武器。我 国法医d n a 分析研究经过二十多年的发展，在实际办案中发挥了巨大的作用。法医 d n a 分析特别是s t r - p c r 技术较为普遍应用的是p r o m e g a 公司的复合扩增检验系统 p o w e r p l e x l 6 ，包括1 6 个位点：d 3 s 1 3 5 8 、t h 0 1 、d 2 1 s 1 1 、d 1 8 s 5 1 、p e n t a e 、d 5 s 8 1 8 、 d 1 3 s 3 1 7 、d 7 s 8 2 0 、d 1 6 s 5 3 9 、c s f l p o 、p e n t a d 、a m e l 、v 7 a 、d 8 s 1 1 7 9 、t p o x 、f g a 。 1 1d n a 提取是法医d n a 检验的关键环节 人类基因组绝大部分的d n a 以染色质的形式存在于细胞核内，因此人体组织的有 核细胞均可提取到d n a 。各种现场物证检材，只要含有一定数量的有核细胞或破碎的 细胞核，均可提取到d n a 。但是，生物检材d n a 在受到各种理化因素的影响以及各种 酶的影响时，会发生降解。生物检材越陈旧，提取高分子d n a 的可能性越小。而法医 d n a 检验主要针对各类案件中犯罪现场遗留的物证进行检验分析，这些物证往往是陈 旧性、腐败性、污染性检材，往往含有大量酶抑制剂或d n a 已发生降解，给检验鉴定 工作带来相当的难度。这些检材又常常是侦查破案的唯一线索，d n a 的提取环节变得 尤为重要，成为法医d n a 检验的关键环节。 1 2 常用的d n a 提取方法及主要优缺点 1 2 1c h e l e x - - 1 0 0 法 ( 1 ) 原理 c h e l e x l 0 0 是一种螯合树脂，具有螯合基团作用，能够吸附金属离子。检材中含有 大量金属离子，在加热条件下，金属离子可以辅助酶降解d n a ，也可以抑制p c r 反应。 所以在提取d n a 时，加入c h e l e x l 0 0 ，螯合了金属离子，防止了d n a 降解，从而提高 了p c r 扩增成功率。 ( 2 ) 主要特点 c h e l e x - - 1 0 0 提取法广泛应用于微量血液、组织块、唾液斑、毛根等物证检材的d n a 1 东北师范大学硕士学位论文 提取，提取的d n a 很适合用作p c r 模板。c h e l e x - - 1 0 0 提取d n a 操作简单、快捷， 在同一管中进行，降低了d n a 的损失，已经成为d n a 提取的基本方法，也是各种提 纯方法的基础。 1 2 2 有机法 ( 1 ) 原理 有机法提取d n a 一般是指用平衡酚、氯仿等按不同比例混合，提取d n a 。d n a 易溶于水，不溶于有机溶剂。在有机溶剂存在的情况下，蛋白质变性沉淀，离心后，有 机溶剂于试管底层有机溶液中，d n a 存在于上层水中，蛋白质沉淀存在于两种液体之 间。用乙醇将d n a 从水中分离，沉淀，通过离心回收。 ( 2 ) 主要特点 有机法应用范围广，适合所有生物检材，对腐败、陈旧、污染检材及指甲、毛干等 无核细胞检材更有效。有机法缺点是应用有毒有机试剂，对人体有害，污染环境；多次 换管，容易引起检材污染。 1 2 3 二氧化硅法 ( 1 ) 原理 ( 异) 硫氰酸胍( g u s c n ) 是强烈蛋白变性剂，能够破坏细胞膜及核膜蛋白，使核酸酶 失活，d n a 释放。二氧化硅( s i 0 2 ) 可以特异性吸附d n a 。通过洗涤液洗涤，在仅留有 特异吸附d n a 的s i 0 2 中加入纯水，5 6 解离后，d n a 释放于水中。 ( 2 ) 主要特点 裂解液、s i 0 2 、水的加入量都与d n a 量有关，如d n a 量低，则相应减少加入量。 s i 0 2 法是一种很优秀d n a 提取方法，但对试剂配制要求很严格。目前已有商品化s i 0 2 的改良方法磁珠法等作为d n a 纯化的一种方法。 1 2 4n a o h 法 ( 1 ) 原理 通过强碱溶解、变性蛋白质，使细胞膜及核膜破坏，核酸酶变性，释放d n a 。 ( 2 ) 主要特点 n a o h 法提取d n a 的主要缺点是d n a 保存于碱中不稳定，4 放置2 4 h 后p c r 扩 增不易成功。主要原因是n a o h 未完全破坏d n a 酶，d n a 与蛋白质重新结合。 1 2 5 磁珠法 ( 1 ) 原理 该方法利用强烈变性剂在特定条件下裂解细胞，使细胞中d n a 释放到溶液中，再 利用磁性硅胶或树脂对d n a 的特异性吸附，在磁场作用下，磁性颗粒与液体分开，再 用纯水或t e ，洗脱吸附的d n a ，获得纯度较高的d n a 。 ( 2 ) 主要特点 此方法操作简单，不需要离心，而且在同一反应管内进行，减少样品的损失，更适 合于自动化操作。磁珠法与c h e l e x 1 0 0 提取法比较，回收率更高，即使是o 1 p l 血仍能 得到d n a 分型，而用c h e l e x 1 0 0 有时不能得到分型。 2 东北师范大学硕士学位论文 1 3 磁珠法在d n a 提取中的应用 磁珠法提取d n a 在经济发达国家已大范围应用，它不需离心，适用于微量检材， 不接触有毒试剂，操作简单方便，分离纯化d n a 只需3 0 m i n ，并很容易实现自动化操 作。国内主要应用于医学、生命科学以及法庭科学等领域。叶键等人在用磁珠法提取骨 骼d n a 研究时发现，应用磁珠法在纯化过程中不会大量损耗d n a ，具有更高的d n a 分离纯化效率。赵兴春等人联合运用c t a b 与磁珠提取陈旧性骨骼d n a ，所有基因座 均得到扩增分型，谱带峰值达到6 0 0 0 。 1 4 国产磁珠的现状及发展 目前国内只有几家公司在进行磁珠方面的开发研究，如中国生物工程公司等。他 们的试剂盒适用于血斑、组织、唾液斑、精斑、毛发、骨骼等多种法医检材。能够完成 微量检材、降解检材、污染检材、骨骼等疑难检材的d n a 提取和纯化。提取d n a 纯 度高，能够与两家以上进口或国产d n a 扩增试剂盒配套使用，操作简单快捷，仅需1 5 3 0 分钟。可见，国产磁珠d n a 提取试剂盒将会有巨大的市场潜力。 1 5 立题依据 通常来讲，较理想的法医学d n a 提取方法和试剂应达到以下基本要求：1 、操作简 单快捷，适用于大多数检材；2 、能够获得d n a 浓度信息；3 、纯化效果好，可有效减 少和去除样品d n a 溶液中的扩增抑制物质，如金属离子、染料等；4 、自动化程度高， 减少人为因素影响，并提高工作效率；5 、价格低廉，便于广泛推广和大批量操作。但 是法医领域中通常采用的d n a 提取方法均存在一定的不足，如c h e l e x 1 0 0 法不能有效 去除抑制剂；有机法接触有毒试剂且步骤繁琐，用时较长；硅珠法提取效率低。面对各 种各样的检材，这些不足使得d n a 提取，尤其是疑难检材的d n a 提取存在明显差异。 磁珠法适用范围广，可以用于血斑、唾液斑、汗斑、精斑等大多数生物样本的提取， 操作方法简单，不需要特殊的分离设备，避免了反复离心而造成的d n a 损失。近年来， 国外的各大生物技术公司相继推出自己的磁珠试剂盒，如p r o m e g a 公司的d n a - i q 试 剂盒、q i a g e n 公司的m a g a t t r a c td n a 试剂盒等用于生物样本中d n a 的提取。但国外 公司的试剂往往价格昂贵，容易造成试验经费的紧张，国内自行研制的国产磁珠大大降 低了成本，很好的解决了这个问题。可使国内公安部门摆脱对国外进口d n a 提取试剂 及相关技术的依赖，极大地减少在d n a 提取方面投入的经费，减少人为污染，提高工 作效率，促进d n a 数据库建设。 东北9 币范大学硕士学位论文 2 材料和方法 2 1 实验材料 9 9 4 7 标准d n a ，痕量血迹，污染检材，超纯水；离心机；4 8 0 恒温箱；p o w e r p l e x l 6 试剂盒；a b i9 7 0 0 型扩增仪；a b i3 1 0 0 型测序仪。 2 2 实验方法 2 2 1 痕量d n a 提取方法的建立 分别取l n g 、2 n g 、3 n g 的9 9 4 7 标准d n a 样本置于o 5 m l 离心管中，加入1 5 0 u l 裂 解液，2 u l d t t ，2 u l 磁珠，震荡混匀，静置待磁珠吸附d n a 。5 分钟后震荡混匀，置于 磁力架上，使磁珠与溶液分离。吸弃上清，加入1 0 0 u l 洗涤液，漩涡震荡2 s ，置于磁力 架上分离磁珠与溶液。吸弃上清，重复洗涤一次。吸弃上清，离心管在磁力架上开盖静 置，待溶液挥发彻底。在离心管中加入l o u l 超纯水，震荡混匀，静置待d n a 释放至纯 水中。5 分钟后，将离心管置于磁力架上，使磁珠与溶液分离。吸取溶液置于另一新管 内，扩增备用。 分别取上述各份检材d n a 适量，使用p o w e r p l e x l 6 试剂盒、a b l 9 7 0 0 型扩增仪进 行p c r 复合扩增，扩增产物应用a b i 3 1 0 0 型d n a 分析仪检测，得到上述检材的基因 分型。 同时用i q 试剂盒、硅珠法提取等量的9 9 4 7 标准d n a 。 2 2 2 痕量血迹提取与扩增 取l u l 新鲜血液，分别加入2 9 u l 、5 9 u l 纯水，将其制备成稀释3 0 倍、6 0 倍样本， 将新制备样本分别取l u l 置于0 5 m l 离心管中，加入1 5 0 u l 裂解液，2 u l d t t ，2 u l 磁珠， 震荡混匀，静置待磁珠吸附d n a 。5 分钟后震荡混匀，置于磁力架上，使磁珠与溶液分 离。吸弃上清，加入1 0 0 u l 洗涤液，漩涡震荡2 s ，置于磁力架上分离磁珠与溶液。吸弃 上清，重复洗涤一次。吸弃上清，离心管在磁力架上开盖静置，待溶液挥发彻底。在离 心管中加入1 0 u l 超纯水，震荡混匀，静置待d n a 释放至纯水中。5 分钟后，将离心管 置于磁力架上，使磁珠与溶液分离。吸取溶液置于另一新管内，扩增备用。 分别取上述各份检材d n a 适量，使用p o w e r p l e x l 6 试剂盒、a b l 9 7 0 0 型扩增仪进 行p c r 复合扩增，扩增产物应用a b i 3 1 0 0 型d n a 分析仪检测，得到上述检材的基因 分型。 2 2 3 污染检材d n a 纯化、回收与扩增 2 2 3 1 案例一 2 0 0 8 年某日，李某某驾驶吉c 7 x x x x 号捷达车与孙某某驾驶的蒙e 3 x x x x 号货 4 东北师范大学硕士学位论文 车及 亍入徐某某相撞，绦某某经抢救无效死亡。法医提取徐某某血样，吉c t x x x x 号 捷达车带血迹风挡玻璃碎片进行d n a 检验。 黪 峨雌圈耻幽删幽凹矗- 删 图2 - 1 用于d n a 检测的带血迹玻璃 棉笠提取风挡玻璃上血迹，放 l5 m le p p e n d o r f 管，加入磁珠裂解液2 0 0 h 1 ， 3 u l d t t 9 8 高温3 0 r a i n ，使细胞核打开，令d n a 释放出来。除去载体，墩上清液加 3 u 磁珠，震荡混匀，静置待d n a 吸附。5 分钟后震荡混匀，置于磁力架上，使磁珠与 溶液分离。吸弃上清，加入1 0 0 u l 洗涤液，漩涡震荡2 0 s ，置于磁力架上分离磁珠与溶 液。吸弃上清，重复洗涤次。吸弃上清，离心管在磁力梨上开盖静置待溶液挥发彻 底。在离心管中加入l o u l 超纯水，震荡混匀，静置待d n a 释放至纯水中。5 分钟后， 将离心管置r 磁力架上，使碰珠与溶液分离。吸取溶液簧于另一新管内，扩增备用。 取上进检材d n a 适量，使用p d w e r p e x | 6 试剂盒、a b l 9 7 0 0 型扩增仅进行p c r 复 合扩增，j r 增产物应用a b i 一3 1 0 0 型d n a 分析仪检测，得到上述检材的基因分型。 2 232 案例二 2 0 0 8 年某日，延吉市金某某、吴某某被人杀死，现场提取男式上衣一件。经调查排 除该e 衣为被害人所有，是否为嫌疑人所留? 该卜衣成为此案的重要线索。 叠 - 落| = i 霉! l 整錾 一 图2 - 2 用于d n a 检测的男式上衣 东北师范大学硕士学位论文 剪取上衣领口约i c m 1 c m 的载体，放入15 m le p p e n d o r f 管，加入磁珠裂解液 3 0 0 “i ，5 u l d t t ，9 8 高温3 0 r a i n ，使细胞核打开，令d n a 释放出来。除去载体，取上 清液加入5 u l 磁珠，震荡混匀，静置待d n a 吸附。5 分钟后震荡混匀，置于磁力架上， 使磁珠与溶液分离。吸弃上清，加入1 0 0 u l 洗涤液，漩涡震荡2 0 s ，置于磁力架上分离 磁珠与溶液。吸弃上清，重复洗涤一次。吸弃上清，离心管在磁力架上开盖静置，待溶 液挥发彻底。在离心管中加入1 0 u l 超纯水，震荡混匀，静置待d n a 释放至纯水中。5 分钟后，将离心管置于磁力架上，使磁珠与溶液分离。吸取溶液置于另一新管内扩增 各用。 取上述检材d n a 适量，使用p o w e r p l e x l 6 试剂盒、a b l 9 7 0 0 型扩增仪进行p c r 复 合扩增，扩增产物应用a b i - 3 1 0 0 型d n a 分析仪检测，得到上述检材的基因分型。 22 33 案例三 2 0 0 8 年某日，延吉市北山街金某某被发现死在自家卫生间内。调查人员通过从现场 情况的分析，判断该案极有可能为熟人所为。提取现场卫生问梳妆台上的牙刷，进行 d n a 检验。 蕊矽、钿_ 甓懋黑舞黑黑焉怒 图2 3 用于d n a 检测的现场牙刷 纱线擦拭牙刷刷毛部位，放入15 m le p p e n d o r f 管，加入磁珠裂解液1 0 0 _ 1 1 ， 2 u l d t t ，9 8 高温3 0 m i n ，使细胞核打开，令d n a 释放出来。除去载体，取上清液加入 2 u l 磁珠，震荡混匀，静置待d n a 吸附。5 分钟后震荡混匀，置于磁力架上，使磁珠与 溶液分离。吸弃e 清，加入1 0 0 u l 洗涤液，漩涡震荡2 0 s ，置于磁力架上分离磁珠与溶 液。吸弃上清，重复洗涤一次。吸弃上清，离心管在磁力架上开盖静置，待溶液挥发彻 底。在离心管中加入1 0 u l 超纯水，震荡混匀，静置待d n a 释放至纯水中。5 分钟后， 将离心管置于磁力架上，使磁珠与溶液分离。吸取溶液置于另一新管内，扩增备用。 取上述检材d n a 适量，使用p o w e r p l e x l 6 试剂盒、a b l 9 7 0 0 型扩增仪进行p c r 复 合扩增，扩增产物应用a b i 一3 1 0 0 型d n a 分析仪检测，得到上述检材的基因分型。 东北师范大学硕士学位论文 3 结果和讨论 31 痕量d n a 提取方法的建立 h 州- 。磁珠法分别从台i n g 、2 n 8 、3 n g 标堆d n a ( 9 9 4 7 a ) 的1 5 0 u l 溶液提取d n a ， 并与9 9 4 7 a 参照样本图谱做比对。结果表明，在d 3 s 1 3 5 8 、t h 0 1 、d 2 1 s 1 1 等1 6 个s t r 坫园胯均挟得了i 啊自的分弘。榆测旧嘴如下 _ l 1 卜l 土1 j = 图3 - 19 9 4 7 a 参照样本s t r 基因座的扩增分犁 i 遵h 卜一 酗 j 铲亩铲分案 一o o 斗j 图3 - 21 n g 溶液s t r 基因座的扩增分型 一 b f 一磐 卜 ，固 =丁| 咖忡 、凡日 东北师范大学硕士学位论文 图3 - 32 n g 溶液s t r 基因库的扩增分型 + 叶 前一备山目 _ h - 自 - r l 卞一： 图3 - 43 n g 溶液s t r 基因座的扩增分型 32 痕量血迹d n a 的提取与扩增 用创j ”磁珠法分别从1 u l 址液、稀释3 0 倍、6 0 倍样本溶液中提取d n a 。结果表明， 与术稀释样本图谱比较，稀释3 0 倍、6 0 倍样本在d 3 s 1 3 5 8 、t h 0 1 、d 2 1 s 1 1 等1 6 个 s t r 基因库均获得了正确的分弘，基因座间扩增比较均衡( 满足以r 二点可称为扩增均 衡：】、苹因库间峰值高度差不超过7 0 。2 、大片段基因座与小j l 段基因座峰面秘茺不 超过5 0 。3 、译个峰刘称性较高。) 。检测阁谱如下： 一一 东北师范丈学硕士学位论文 = 卜喵一古谶1 广_ 堵飞咕旨古皓 由 * 灶o “l 母j 薹 图3 5 痕量血迹稀释前s t r 基因座的扩增分型 一嚏f 1 啬_ 呻前一 4 畚* 一咕十 一卜一 一舌卜卜 锆p p l 嘈一 图3 - 6 稀释3 0 倍与稀释6 0 倍溶液s t r 基因库的扩增分型 一 一 东北师范大学硕士学位论又 33 污染检材d n a 纯化、回收与扩增 3 3 1 案例一 用崮产磁珠法从胍捎玻璃上血迹中提取d n a 。结果表明，在d 3 s 13 5 8 、t h 0 1 、d 2 1 s 等1 6 个s t r 基冈座r 均获得了j r 硫的分型。检测h 谱如下： 以十也一署 j 1 名 名 1 斟自占一一女占 矗确 占 甜船l。， 匿 吒毽琶 。 气 圈37 玻璃上血迹的s t r 基因座的扩增分型 3 32 案例二 用幽”磁珠法从衣领【 处脱落细胞中提取d n a 。，结果表明，在d 3 s l3 5 8 、t h 0 1 、 d 2 1s 1 1 等】6 个s t r 塾阅胜r 均状得了正确的分型，丛凶胯间打增比较均衡，取得了 理想的效果。枪测剧潜如下： _ 卜f 甘土刊 斗* 斗j = 至! ! 堕蔓查主翌主兰堡堡塞 - * d w h l 广扩一喑扣j ： 刊_ 铲中牛叫_ 奇_ j 哿 由 一 。 斗扯 l 卜j 基 图3 - 8 衣领上脱落细胞的s t r 基因座的扩增分型 3 3 3 案例三 用崮，“碰珠法从牙刷刷毛部化脱落细胞巾提取d n a 。结粜表明，在d 3 s 1 3 5 8 、t h 0 d 2 1 s 1 l 等1 6 个s t r 基冈鹰卜均获得了正确的分型。检测图谱如r ： 一一1 ， l ，_ r _ * 啦扛卜f a j 【。 ! j f 。f 每 暂百铲r 魄_ 曾一 删 j - 图3 9 牙刷上脱落细胞的s t r 基因座的扩增分型 3 4 国产磁珠法与其他方法的提取效果比较 将国产磁球法与p r o m e g a 公司的d n a i q 试f f f j f zl ；t 7 1 带；n 的辟珠法提i 及d n a 的结 泉进 r 比较c 结果如表1 ，从表11 ，呵以看出，使用l 习产磁珠法能够从溶液一| j 有效i u 收 i 3 r i g 的9 9 4 7 打、准d n a ，p o w e r p l e x1 6s y s t e m 的1 6 个摧吲库均获得了满意分型：价】利 用d n a j q 试剂j 川收i n g9 9 4 7 标准d n a 仪成功检验l 8 个基冈座3 n g9 9 4 7 、准 d n a 爿获缁争部1 6 个驻陶肛的d n a 分型晓刚瑚产磷珠泣在提取d n a 山面其自更，i 的灵敏度。但是使刖硅珠法进行d n a 提取时1 n g 和3 n 9 9 9 4 7 标准d n a 均术柃出分，“ 东北师范大学硕士学位论文 谱带，说明硅珠法在回收痕量d n a 时灵敏度明显不够。 表1 国产磁珠法与两种常用d n a 回收方法的比较结果 起始d n a 量( 9 9 4 7 a ) l n g3 n g 国产磁珠法检出1 6 个位点检出1 6 个位点 d n a i q检出8 个位点 检出1 6 个位点 硅珠法 未检出 未检出 因此，国产磁珠提取痕量血迹d n a 时，针对不同d n a 含量的检材，需要调节所 用磁珠量和洗脱d n a 时超纯水的用量。检材d n a 含量低时，应减少磁珠用量以及洗 脱超纯水用量，防止在扩增时由于体系过大造成d n a 纯度降低。国产磁珠吸附d n a 时间不宜过长，以5 分钟左右为宜，时间过长可导致d n a 洗脱困难。 1 2 东北师范大学硕士学位论文 4 结论 4 1 国产磁珠法能够从l u l 稀释6 0 倍的血液中高效提取d n a ，1 6 个s t r 基因座 均获得了正确的分型，基因座间扩增比较均衡。 4 2 国产磁珠法回收率高，纯度较高，不含有色素、蛋白质等杂质，有较好的纯 化作用。 4 3 将国产磁珠法与p r o m e g a 公司的d n a i q 试剂盒以及常用的硅珠法提取d n a 的结果进行比较，使用国产磁珠法能够从溶液中有效回收痕量d n a ，p o w e r p l e x1 6 s y s t e m 的1 6 个基因座扩增均获得了成功分型，说明国产磁珠法在提取d n a 方面具有 更高的灵敏度。 1 3 东北师范大学硕士学位论文 参考文献 1 】郭景元，李伯龄主编中国刑事科学技术大全法医物证学北京：中国人民公安大学出版社，2 0 0 2 2 】杨庆恩d n a 在法庭科学中的应用北京：中国人民公安大学出版社，1 9 9 4 【3 】刘开会，李宗亮实用法医d n a 检验学西安出版社，2 0 0 0 【4 】郭景元主编法医物证学北京：中国人民公安大学出版社，1 9 9 7 5 】郑秀芬法医d n a 分析北京：中国人民公安大学出版社，2 0 0 2 6 】6 裴黎主编现代d n a 分析技术理论与方法北京：中国人民公安大学出版社，2 0 0 2 7 】吴梅筠法医物证学( 第一版) 北京：人民卫生出版社，1 9 9 8 【8 】朱玉贤，李毅编著现代分子生物学北京：高等教育出版社，1 9 9 7 9 】贺林主编解码生命北京：科学出版社，2 0 0 0 1 0 】王海云，冯北元译使用生物化学原理和技术北京：科学出版社，1 9 7 9 1 1 】侯一平法医d n a 分析的科学证据意义中国法医学杂志，2 0 0 1 ，1 6 ( 2 ) ：1 1 8 一1 2 0 【1 2 】刘开会，常彩琴c h e l e x 及有机法联合使用提取d n a 的比较研究冲国法医学杂志2 0 0 1 1 6 ( 2 ) ：8 4 - 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