（法医学专业论文）线粒体基因复合扩增进行种属鉴定的研究.pdf

四川大学硕十学位论文方月琴 中文摘要 线粒体基因复合扩增进行 种属鉴定的研究 研究生方月琴导师侯一平教授 四川大学华西基础医学与法医学院 成都( 6 1 0 0 4 1 ) 目的生物性检材的种属鉴定是法医物证轳主要研究内容之一。本 课题针对线粒体d n a ( m i t o c h o n d r i a ld n a ，m t d n a ) 编码序列的保守区 和可变区在人与哺乳动物间的异同，设计并建立稳定可靠的种属鉴定 体系，探索一种适合法医学实践的，快速、灵敏、简便而实用的种属 鉴别方法，以解决当前种属鉴定中存在的不足。 方法针对本课题的研究目的，对m t d n a 的3 7 个基因进行研究， 制定目的基因筛选原则，遵循该原则筛选出合适的编码基因，根据建 立复合扩增体系的要求，建立稳定可靠的线粒体基因复合扩增反应体 系。复合扩增产物用 变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳( p a g e ) 、硝酸 银染色技术进行种属鉴定。为验证该系统的稳定性以及在法医学实践 中的可行性，进行了包括系统灵敏度检测、不同环境下样本的检测、 形成于不同基质上样本的检测和陈旧样本等的检测，从而对其法医学 应用价值进行评估。 四川大学硕十学位论文方月琴 结果根据m t d n a 两个编码基因设计e y tb 和n d 6 两对引物进行 复合扩增，p a g e 银染显色。结果显示为两条电泳条带者为人的样本， 两条带分别为e y tb 基因片段( 3 5 8 b p ) 和n d 6 基因片段( 1 8 1 b p ) ；显 示为一条电泳条带者为动物样本，对应为c y tb 基因片段( 3 5 8 b p ) 。本 方法最小检出d n a 模板量为0 2 5 p g ，远高于其他方法，因此尤其适合 于法医学上微量检材的检测。将本研究建立的e y tb n d 6 复合扩增体系 检测处于不同环境下的实验样本。结果显示，在4 、室温和3 7 环 境条件下，检材经过1 2 0 天后，本方法均可正确区分人和动物样本。 而将检材置于风干机内、室内和模拟的潮湿环境，结果显示经过9 0 天 后，对置于室内和风干机内的检材进行检测，本方法均可正确区分人 和动物样本；而在模拟的高度潮湿环境中，放置5 0 天的检材的p c r 产物电泳条带已略微弱于放置3 0 天的检材，而放置9 0 天的样本无可 见的条带。餐巾纸、棉签、塑料薄膜、塑料泡沫、水泥地面、白墙面、 泥土、窗帘布上的血痕，本方法均获得了正确的检测结果。对于陈旧 样本的检测，本方法能正确鉴别四川成都地区室温下放置7 年9 年 的血痕样本和存放1 0 年的骨骼样本。 结论初步建立了可运用于法医学上进行种属鉴定的线粒体基因 复合扩增体系，可以对法医学上常见生物性检材做出正确的种属判断。 本方法检测片段短、灵敏度高、可检测样本时限长，检测过程方便简 易，适合法医学实践中的微量、降解、陈旧检材的种属鉴定，为今后 法医学实际应用提供了更为方便而实用的技术方法基础。 关键词：种属鉴定，线粒体d n a ，e y tb 基因，n d 6 基因，法医学 婴型奎兰堡兰竺堡壅生旦量一 英文摘要 m u l t i p l e xa m p l i f i c a t i o no f m i t o c h o n d r i a ld n a f o rs p e c i e si d e n t i f i c a t i o n i nf o r e n s i cs c i e n c e 【a b s t r a c t l p o s t g r a d u a t e ：y u e q i nf a n g t u t o r ：, p r o f y i p i n gh o u s c h o o lo f p r e c l i n i c a la n df o r e n s i cm e d i c i n e ， s i c h u a nu n i v e r s i t y , c h e n g d u6 1 0 0 4 1 ，p r c h i n a o b j e c t i v e ：s p e c i e s i d e n t i f i c a t i o nf o rb i o l o g i c a ls p e c i m e ni so n eo ft h e m a i l lr e s e a r c hs u b j e c t si nf o r e n s i cb i o l o g y u pt on o w , t h e r ea r em a n y s h o r t c o m i n g s ，s u c h a sl o w - s e n s i t i v i t y , s h o r t - d u r a t i o n , t i m e - c o n s u m i n 舀 h i 曲嘲( p e n s e ，e r e i no r d e rt o s o l v et h e s ep r o b l e m s ，w ee m p l o y e d t h e s e q u 锄c 嚣o fa p p r o p r i a t eg e n e si l lm i t o c h o n d r i a ld n a t od e v e l o pr e l i a b l e s y s t e mf o rs p e c i e si d e n t i f i c a t i o n m e t h o d s ：t w og e n e sw e r cc h o s na n dp r i m e r sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt o t h e i rs e q u e n c e s t h em u l t i p l e xa m p l i f i c a t i o ns y s t e mo fm i t o c h o n d r i a l d n af o rs p e c i e si d e n t i f i c a t i o nw a ge s t a b l i s h e du s i n gt w os e t so fp r l m e t s ， o n ew 蹈l l i l i v e r s a l ， a n da n o t h e rw a sh u m a n s p e c i f i c f o l l o w i n g t h e 3 一 四川大学硕十学位论文方月琴 a m p l i f i c a t i o ns t e p ，a m p l i c o u sw e r ea n a l y z e db yh o r i z o n t a ln o n - d e n a t u r i n g p o l y a e r y l a m i d eg e le l e e t r o p h o r e s i s ( p a g e ) w i t hd i s c o n t i n u o u sb u f f e r s y s t e ma n dv i s u a l i z e db ys i l v e rs t a i n i n g t ov a l i d a t ei ti nf o r e n s i cm e d i c i n e ， s e v e r a lt e s t sw e r ee m p l o y e di n c l u d i n gs e n s i t i v i t y , s a m p l e si nv a r i o u s e n v i r o n m e n t s ，b l o o d s t a i n s0 1 1d i f f e r e n tm a t e r i a l sa n dd a t e ds a m p l e s r e s u l t s ：t h em u l t i p l e xa m p l i f i c a t i o ns y s t e mo fm r o c h o n d r i a ld n af o r s p e c i e si d e n t i f i c a t i o nw a se s t a b l i s h e du s i n gt w os e t so fp r i m e r s ，o n ew a s u n i v e r s a l ，t h a tw a sc y t o c h r o m eb ( c y tb ) g e n e ，a n da n o t h e rw a s h u m a n s p e c i f i c , t h a tw a sn a d hd e h y d r o g e n a s es u b u n i t6f n d 6 ) g e n e t h ep r e s e n c eo fo n l yo n eb a n d ，w h i c hw a sa b o u t3 5 8b a s ep a i r ( b p ) ， s h o w e dt h a tt h es a m p l ew a sn o th u m a n , w h i l et h ep r e s e n c eo ft w ob a n d s ， o n ew a sa b o u t3 5 8 b p ，a n o t h e rw a s1 8 1 b pi n d i c a t e dah u m a no r i g i l l a st o s e n s i t i v i t yd e t e c t i n g , t h es y s t e me s t a b l i s h e dc o u l dd e t e c ts a m p l e sw i t h 0 2 5 p gm t d n a a sf o rt e i i l p e r a m r e ，t h em u l t i p l e xa m p l i f i c a t i o ns y s t e m w o u l dg e tc o r r e c ts p e c i e si d e n t i d i c a t i o nf o rb l o o d s t a i n ss t o r e di n4 0 、r o o m t e m p e r a t u r ea n d3 7 cf o rm o r et h a n1 2 0d a y s f o rh u m i d i t yt h es y s t e m w o u l di d e n t i f yb l o o d s t a i n ss t o r e di nr o o ma n dd r yf o rm o r et h a n9 0d a y s ， a n di nh i g h h u m i d i t yf o rm o r et h a n5 0c l a y s ，b u tc o u l dn u td e t e c t b l o o d s t a i n ss t o r e di nh i g h h u m i d i t yf o r9 0d a y s o u rs y s t e ma l s og o t c o r r e c ti d e n t i f i c a t i o nt ob l o o d s t a i n so nv a r i o u sm a t e r i a l s ，s u c ha ss o i l p a p e r , c l o t h , w a l l ，e t c i nt h ee n d , w ee m p l o y e dt h es y s t e mt od i s c r i m i n a t e t h es p e c i e so fd a t e d e x a m p l e s ，i n c l u d i n gb l o o d s t a i n ss t o r e di nr o o mf o r7 t o9y e a r s ，a n db o n es a m p l e ss t o r e df o rn e a r l y1 0y e a r s ，w h i c hb o t hg o t s a t i s f a c t o r yr e s u l t s - 4 婴坐查堂壁兰生堡苎查旦至 一 c o n c l u s i o n ：w eh a v ee s t a b l i s h e dam e t h o dc o m b i n i n gi nas i n g t e r o u n d p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) a m p l i f i c a t i o no f b o t hc y t bg e n ea n dn d 6 g c f i et od i f f e r e n t i a t eh u m a no r i g i nf r o mc o m m o n a n i m a l s b e c a u s eo fi t s h i g h - s e n s i t i v i t y , t i m e - s a v i n g , l o w - e x p e n s ea n ds a t i s f y i n g - r e s o l v i n gp o w e r , t h em u l t i p l e xa m p l i f i c a t i o ns y s t e mw ee s t a b l i s h e df o rs p e c i e si d e n t i f i c a t i o n w o u l db ean e wa n dm o r ea t t r a c t i n gc h o i c ei nf o r e n s i ca p p l i c a t i o n k e y w o r d s ：s p e c i e si d e n t i f i c a t i o n ，m i t o c h o n d r i a ld n a ，e y t bg e n e ，n d 6 g e n e ，f o r e n s i cs c i e n c e - 5 四川大学硕- i = 学位论文方月琴 本文所用缩写中英文对照 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 s t rs h o r tt a n d e mr e p e a t短串联重复序列 d n a d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 脱氧核糖核酸 m t d n am i t o c h o n d r i a ld e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 线粒体脱氧核糖核酸 c y tbc y t o c h r o m ebg e n e细胞色素b 基因 n d 6n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i u n c l e o t i d eh y d r o g e n 还原型烟酰胺嘌 岭二核苷酸脱氢酶6 p a g e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 四川大学硕七学位论文 方月琴 1 前言 种属鉴定在法医学上有非常重要的意义，其任务主要是鉴定生物 性检材的种属来源，明确检材是来自人类还是动物【“。这是一切法医 物证学实验室的常规工作。种属鉴定有多种方法，包括形态学方法、 血清学方法、细胞学方法、分子生物学方法及生物化学方法 2 - 1 。 目前种属鉴定的研究重点主要集中在m i t o c h o n d r i a l d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ( 线粒体脱氧核糖核酸，简称m t d n a ) ，因为在 每个细胞内含有多个线粒体，并且每个线粒体内有多个拷贝的m t d n a 基因组。因其拷贝数远高于核内d n a ，更能经受恶劣环境的影响，在 核d n a 已经降解的样品中仍有较大可能提取到m t d n a 。而法医学实 践中经常遇到腐败、陈旧以及微量的检材，正好可借助m t d n a 的这一 优点。m t d n a 在细胞内呈双链，外环为h 链，内环为l 链，两条链 都有编码功能，功能区长度为4 8 2 3 b p ，含有3 7 个基因。包括：1 2 sr r n a 和1 6 sr r n a 的基因，细胞色素c 氧化酶i 、i i 、亚基的基因( c o i 、i i i ) ，a t p 酶第6 和第8 亚基的基因( a t p 6 和a t p 8 ) ，细胞 色素b ( c y t b ) 基因，2 2 种不同的t r n a 基因和7 个呼吸链n a d h 脱 氧酶亚单位基斟1 2 1 。当前研究的种属鉴定方法主要有两大类，一是c ” b 基因和d 环h vi 区复合扩增l ”d 们。c y tb 基因是编码线粒体内膜上 细胞色素b 氧化酶的基因的一个亚基，该基因的编码序列区域进化缓 慢，相对保守，在所有哺乳动物中部存在，故选择该基因的保守区为 内对照，针对c y t b 基因保守区的序列设计引物，使之可扩增出所有人 和动物的样本。d 环h vi 区是m t d n a 非编码区碱基变异相对集中分 布的一个区段，根据h vl 区碱基序列设计人类特异引物。然后将上述 2 对引物进行复合扩增及电泳检测，得到2 条电泳条带者为人的样本， 四川大学硕士学竹论文方月琴 l 条电泳条带者为非人样本，即可根据h vi 区扩增片段有无及大小来 鉴别人与其他动物。但是m t d n a 的d - 环h vi 区是m t d n a 非编码区 碱基变异相对集中分布的一个区段，相对于编码区，控制区在个体间 存在较大差异，有许多单碱基取代与突变，因其碱基序列变异大，所 以根据其序列设计的引物可能不稳定，不能保证该引物能扩增所有的 人类样本，在种属鉴定过程中有可能得到假阴性的结果。二是扩增测 序m t d n a 的编码基斟1 7 之1 1 ，如1 6 sr r n a 基因、1 2 s r r n a 基因和c y t b 基因等进行种属鉴别。这些基因的编码序列区域进化缓慢，相对保 守，但是保守区中的可变区域进化快，不同种属间差异大，故可根据 其序列差异来进行种属的区分。然而单独运用这些基因进行种属鉴别 时缺乏必需的内对照，即监测所检测检材中是否存在可供检测的 d n a 。并且现有方法多将基因扩增测序，将其序列进行基因库中同源 性比对后才做出判断，虽然可能鉴别出检材究竟来自何种动物，但检 测过程烦琐，测序费用昂贵；而法医学实践中较为常见的种属鉴定只 需判别该生物性检材是否来自人类，并不需要明确到底来自何种动物。 所以应当寻求一种检测过程更为简便、费用低廉的技术。 复合扩增( m u l t i p l e xp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，又叫多重p c r ) 技 术是由c h a m b e r c i a n 于1 9 8 8 年首次提出自f j 2 2 - 2 4 。该技术的特点有： ( 1 ) 高效性，可在一个p c r 反应管中同时检出多种目的基因：( 2 ) 经济简便性，即多种目的基因在同一个反应管中同时检出，可大大节 省检材用量，节约时间，节省试剂耗材；同时又可提供更多更准确的 鉴定信息。这一优势在法医学实践中尤为突出，因为在法医学领域， 生物性检材通常是微量、不可再现的，同时检材也受环境和时间变化 的影响。 本研究拟针对目前种属鉴定中存在的不稳定性、费用昂贵、检测过 四川大学硕卜学位论文方月琴 程烦琐等不足，选择m t d n a 编码基因为目标片段，优化复合扩增体系， 建立稳定可靠的技术方案，以期为法医学种属鉴定提供更为实用的技 术方法。 四川大学硕十学位论文 方月琴 2 材料与方法 2 1 材料 2 1 1 样本 2 1 1 1 人类样本来自四川成都地区汉族群体，随机抽取1 3 名男性、 1 3 名女性共2 6 名无血缘关系个体的静脉血l m l ，e d t a 抗凝，2 0 保 存。 2 1 1 2 本实验共取了1 3 种常见动物，每种各2 个个体的样本。这1 3 种动物分别为：恒河猴，家猪，牛。羊，狗，兔，豚鼠，鸡，鸭，鲢 鱼，鳝鱼，大鼠，牛蛙。恒河猴，家猪，牛，羊，狗，兔和豚鼠取血 液约2 m l ，e d t a 抗凝，2 0 保存；其余动物取肌肉或肝脏组织，约 2 0 9 ，直接一2 0 c 冷冻保存；。 2 1 1 3 灵敏度检测所需样本取自本校法医病理学3 具送检解剖样本， 每例各取肌肉组织2 0 9 左右，直接- 2 0 1 2 冷冻保存。 2 1 1 4 陈旧样本取自本实验室历年检案检材，包括室温条件下放置了 7 年9 年的人类血痕样本和放了约1 0 年的人类骨骼样本。 2 1 2 试剂 引物( i n v i t r o g e n 公司合成) 、t a x i 酶( 天为时代公司，国产) 、d n t p ( 天为时代公司，国产) 、m a r k e ri ( 天为时代公司，国产) 、p r o t e a s e k ( p h a r m a c i a 公司，瑞典) 、丙烯酰胺( 分析纯，国产) 、甲叉丙烯酰 胺( f l u k a 公司，瑞士) 、t r i s ( p h a r m a c i a 公司，瑞典) 、硼酸( 分析纯， 国产) 、e d t a ( 分析纯，国产) ；其他的试剂均为国产分析纯。 四川大学硕士学位论文方月琴 2 1 3 仪器 p e 9 6 0 0 扩增仪( p e 公司，美国) 、高速离心机( e p p c n d o r f 公司， 德国) 、可调移液器( e p p e n d o r f 公司，德国) 、多功能电泳仪( p h a r m a c i a 公司，瑞典) 、d y y - i i l 2 8 6 型电泳槽( 北京六一仪器厂) 、x h - 8 9 旋涡 振荡器( 浙江乐清仪器厂) 、u v - 2 6 0 紫外分光光度计( 岛津公司，日 本) 、纯水体系( m i l l i p u r e 公司，法国) 、去离子水体系( e a s y p l l r er f 公司，美国) 等。 2 2 方法 2 2 1 引物设计 本课题选择了m t d n a 的两个基因片段，一个是c y t o c l l r o m ebg e n e ( 细胞色素b 基因，简称e y t b 基因) ，另一个是n i c o t i n a m i d e a d e n i n e d i u n c l e o t i d eh y d r o g e n (原型烟酰胺嘌岭二核苷酸脱氢酶6 ，简称n d 6 基因) ( 图1 ) 。 四川大学硕七学伊论文方月琴 6 图1 c ”b 基因和n d 6 基因在m t d n a 中的相对位置示意图 图中列出了线粒体基因组中这两个基因的相对位置位置。图中箭头指示两个基因 的位置分别为：c y tb 基因( n t l 47 4 8 n t l 58 8 2 ) ，n d 6 基因( n t l 41 5 0 n t l 4 6 1 5 ) 。c y tb 基因区域显示为灰白色，n d 6 基因区域为黑白相间。 c y tb 基因所选片段为人和哺乳动物所共有，设计的引物主要依据 t d k o c h e r 所提供的引物对筒l 。 c y t b 基因引物序列： f o r w a r dp r i m e r ：5 - c c c c t c a g a a t ga = 盯1 t g t c c t c a 3 r e v e r s ep r i m e r ：5 - c c j 虹c a a c a t c t c a g c a t g a t g a a a 3 人类特异性的基因片段从m t d n a 的所有3 7 个编码基因中筛选，主 要遵循如下原则： ( a ) 所选择的基因扩增片段小，长度在1 0 0 b p 2 0 0 b p ： ( b )引物结合区相对保守，能设计出人所特异的引物，并尽量 四川大学硕t 学付论文方月琴 选择突变率低的区域，能保证引物结合部位相对稳定性； ( c )所设计引物能满足引物设计的基本要求，即：引物与 模板的序列要紧密互补，引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或 发夹结构，引物不能在模板的非目的位置引发d n a 错配反应。 根据上述原则，本研究所采用的筛选步骤为： ( a ) 在m t d n a 的3 7 个基因中，任意选择一个基因，将动物的 该基因序列与人的标准序列进行两两比对，选出序列相差最大的区域； ( b ) 将该区域视作引物设计区，判断其是否符合引物设计的基 本要求，然后根据上述原则在该区域设计前引物或后引物，另一条引 物则设计在其上游或下游区域，并满足扩增片段长度在l o o b p 2 0 0 b p 。 m t d n a 的所有3 7 个基因中，将人类和动物基因进行序列比对以后 发现1 6 sr r n a 、1 2 sr r n a 和n d 6 等基因比较符合上述原则。这些基 因序列中均有一段8 0 b p 左右长的片段，其序列在人与动物中几乎没有 同源性。但是1 6 sr r n a 和1 2 sr r n a 的这段区域a t 含量高，回文序 列多，同时还有多个碱基容易与其他碱基错配，因而难以设计出令人 满意的引物。d n 6 基因嘶1 的2 8 8 b p 3 7 5 b p 区域的序列在人和动物中相 差也非常大，但是不存在上述影响引物设计的不足，可以设计出条件 较好的引物。本课题设计的后引物即位于该区域，前引物在这个区域 的下游，可特异扩增出人m t d n an d 6 基因的一个长度为1 8 1 b p 的片 段( 图2 ) 。 n d 6 基因引物序列： f o r w a r dp a l m e r ( 4 6 5b p ) ：5 - a a c c a c t a c t a a t c a a c g c c 一3 r e v e r s ep r i m e r ( 2 8 5b p ) ：5 - g t t a g c g a t g g a g g t a g g a t - 3 四川大学硕十学位论文疗月琴 图2 n d 6 基因在m t d n a 序列中的相对位置 图中列出了n d 6 基因在m t d n a 中的相对位置。n d 6 基因为m t d n a 轻链所编码，全 长5 2 6 b p 。从n t l 41 5 0 n t l 4 6 1 5 。将人与实验动物的n d 6 序列进行比对，发现图 中粗线所示n t l 44 3 8 n t l 45 2 5 序列与其他动物相差非常大，几乎无同源序列。 故将一条引物设计在n t l 44 2 8 n t l 45 3 5 区域，另一条引物设计在其上游或下 游，即可得到人类所特有的引物对( n d 6 基因序列见附录1 ) 。 2 2 2 实验操作 2 2 2 1模板d n a 的提取 ( a ) c h c l e x 1 0 0 法田捷取全血、肝脏组织，肌肉组织样本和陈 旧血痕的d n a ( 具体步骤参见附录2 ) 取一定量的e d t a 抗凝血、肝组织、肌肉组织和陈旧血痕样本到 1 5 m le p 管中，再加入合适的灭菌蒸馏水，剧烈振荡，充分混匀，室 温下放置1 5 r a i n ，之后离心，去除上清留沉淀；反复用无菌蒸馏水洗涤， 直至无色或血红蛋白很少；再加入一定量的5 c h e l c x 1 0 0 溶液，置 5 6 水浴3 0 m i n 6 0 m i n ( 肝脏和肌肉组织中加入1 0 0 m g m l p r o t e a s ek 5 6 c 保温过夜( 3 h ) ) 。取出后振荡，沸水煮8 r a i n 再振荡5 1 0 s ，离心 1 4 ， 四川大学硕士学位论文方月琴 2 m i n 3 m i n 2 0 保存，上清液可用于p c r 反应。 ( b ) 经典酚- 氯仿法提取样本中的d n a 进行定量分析( 具体步 骤参见附录3 ) 灵敏度检测所需样本取自本校法医病理学3 具送检解剖样本的肌 肉组织。取一定量的肌肉放入1 5 m le p 管中，加双蒸水充分混匀后离 心去上清；再加消化b u f f e r 、p r o t e a s ek 充分混匀，5 6 水浴5 h 以上； 加2 5 ：2 4 的酚：氯仿混合液，混匀，离心取上清；再加等量2 5 ：2 4 酚： 氯仿混合液，混匀后离心取上清，加2 倍体积的无水乙醇，轻摇混匀， 直到出现絮状沉淀，然后离心去上清，加7 0 乙醇，充分混匀，然后 离心去上清。晾干后加t e 溶解备用。 ( c ) c t a b ( 十六烷基三甲基溴化胺) 法提取陈旧骨骼样本的 m t d n a 骨骼样本的m t d n a 提取( 具体步骤参见附录4 ) 陈旧骨骼样本的提取用c t a b 法。先用流水冲洗骨骼1 2 天，接 着用无水乙醇( 或乙醚、或二者1 ：1 ) 脱脂l - 2 天，待乙醇、乙醚挥发 后，用锯条锯成薄片，去骨膜，加e d t a 脱钙液脱钙1 2 天；将已脱 钙的骨松质剪碎放到e p 管内，加入蛋白酶k 消化l - 2 天；用酚，氯仿 异戊醇混合液( 2 5 ：2 4 ：1 ) 抽提蛋白质2 次；吸取上清于另一支e p 管 中，用氯仿异戊醇混合液( 2 4 ：1 ) 抽提蛋白质1 次；吸取上清于另一 支e p 管中，加入冰乙醇和n a c i 溶液充分混匀，- 2 0 x 2 放置过夜；然后 离心弃上清，加入少许5 c h e l e x - 1 0 0 混匀后置沸水中煮8 m i n ，离心 后置于4 冰箱中备用。 2 2 2 2 紫外分光光度法测定d n a 纯度及含量( 详见附录5 ) 测定用经典酚氯仿法提取得到的d n a 的纯度以及含量。取3 m l 去离子水于比色杯中作空白对照，将待测d n a 溶液用紫外分光光度计 四川大学硕十学静论文方月琴 测量2 6 0 r i m 、2 8 0 n m 和3 3 0 r i m 处的o d 值，三管d n a 平均后依据如 下公式计算d n a 浓度和纯度：d n a 浓度( 1 ag m 1 ) = ( o d 2 6 0 - o d 3 3 0 1 5 0 0i ig m l 稀释倍数( 1 0 0 ) ，d n a 纯度= ( o d 2 6 0 - o d 3 3 0 ) ( o d 2 8 0 o d 3 3 0 ) 。 2 2 2 3p c r 扩增( 具体参数见附录6 ) 本研究采用的p c r 扩增总体积为3 7 5i il ，分为普通p c r 扩增体 系和复合扩增体系。普通p c r 扩增体系中，加入一对引物，其用量为 5 0 i i m ，0 3 l l l 。复合扩增体系中，加入2 对引物，其用量分别是c y t b 引物为5 0 l l m ，0 2 5 u l ，n d 6 引物为5 0 u m ，o 3 l i l 。 在普通p c r 反应中，5 u ult a q 酶用量为常规用量0 3ul ，复合 扩增体系中为o 3 5 i il 。 在p c r 扩增时设立阴性对照和阳性对照。阴性对照为p c r 反应体 系中加入与样本量等体积的纯水，不加样本d n a 。阳性对照为p c r 反应体系中加入等体积的已知人的m t d n a 样本。 将上述反应体系在p e 9 6 0 0 热循环仪上进行扩增，先进行9 4 预变 性3 m i n ；然后运行3 0 次p c r 循环，退火温度定为5 2 ；最后7 2 c 延 伸7 r a i n 。p c r 扩增产物4 保存。 2 2 2 4 p a g e 银染显色 2 s l ( 详见附录7 ) 将2 2 2 3 所得p c r 产物用6 非变性聚丙烯酰胺凝胶连续缓冲系 统进行垂直电泳，2ul 上样。电泳条件为恒压6 0 0 v 电泳6 0 m i n ，硝酸 银染技术进行显色。 硼川大学颂七学位论文方月琴 2 2 3 种属鉴定方法建立 2 2 3 1 p c r 扩增体系中单独用c y tb 引物 在p c r 扩增体系中单独用c y t b 引物，针对1 3 种动物2 6 个样本和 2 6 个男女个体的d n a 样本进行扩增，以判断该引物是否都能扩出相 应的条带。根据本研究的设计，c y tb 片段是作为内对照的，只要样本 中有可检测量的m t d n a ，则经p c r 扩增、电泳后都应该有可检测到 的p c r 产物。 同时根据c y tb 引物序列，本实验选择了5 0 1 2 、5 2 、5 4 。c 及5 6 这4 个温度作为p c r 扩增体系的退火温度，以判断该引物的最佳退 火温度和复合扩增中可供选择的适合温度。 2 2 3 2p c r 反应体系中单独用n d 6 引物 p c r 反应体系中单独用n d 6 引物对1 3 种动物2 6 个样本和2 6 个 男女个体的m t d n a 样本进行扩增，以判断该引物是否只是对人的样本 才能特异扩增，而非人样本则无。 同样也选择了5 0 。c 、5 2 、5 4 和5 6 c 温度作为p c r 扩增体系的 退火温度，以判断这对引物的最佳退火温度，以及在复合扩增中可供 选择的适合温度。 2 2 3 3 复合扩增体系的建立及优化 p c r 扩增体系中将c y tb 和n d 6 两对引物进行复合扩增，以判断 该系统在种属鉴定时是否稳定可靠。采用2 2 2 3 的操作，在3 7 5pl 复合扩增反应体系中，c y tb 和n d 6 两对引物首先以同浓度参与反应， 然后根据两者条带在动物与人类样本中的浓淡来做相应的调整。并选 择复合扩增体系适合的反应退火温度和循环次数。 阴川大学硕士学付论文方月琴 2 2 3 4 男女样本检测 复合扩增体系建立之后，为判断该方案在判断男女人群的种属时 是否有差异，选择了1 3 名男性和1 3 名女性的m t d n a 样本来作比对。 2 2 3 5 灵敏度测定 将用经典酚- 氯仿法提取的m t d n a 在紫外分光光度计上进行浓度 以及纯度的测定后，再将d n a 进行稀释。最终反应体系中加入d n a 模板量分别为：2 p g 、l p g 、0 5 p g 、0 2 5 p g 、0 2 p g 。 2 2 4 可行性验证实验 2 2 4 1 环境影响的检测 因为法医学实践中常见检材可能在自然环境中经过了很长的一段 时间，环境因素会对检材造成一定的影响。为评估本方法的可行性及 稳定性，将血痕样本置于不同的环境中，以检测不同环境下的检出时 限。本实验模拟的环境有： ( a ) 不同温度条件的影响分析 取3 份人的静脉血，在棉签上制成9 份血痕样本，分别于4 c 、室 温和3 7 c 环境条件下，放置0 天、7 天、1 5 天，3 0 天、5 0 天、9 0 天、 1 2 0 天后，c h e l e x 一1 0 0 法提取m t d n a ，然后扩增进行检测。 ( b ) 不同湿度环境的影响分析 取3 份人的血液检材，用医用棉签制成血痕，分成9 组，分别置 于风干机内、室内和模拟的潮湿环境。模拟的潮湿环境为：盛有小半 瓶水的透明玻璃瓶中，瓶口用塑料皮密封，放置在室内。检材分别于 0 天、7 天、1 5 天、3 0 天、5 0 天、9 0 天后，用c h e l c x - 1 0 0 法提取d n a ， 然后p c r 扩增进行检测。 其中室内环境均为四川成都地区2 0 0 5 年1 1 月2 0 0 6 年2 月的气 四川大学硕士学位论文方月琴 候条件下。 2 2 4 2 基质影响的检测 取3 份已知的人血液在以下基质上制成血痕：餐巾纸、棉签、塑 料薄膜、塑料泡沫、水泥地面、白墙面、泥土、窗帘布。2 0 0 6 年2 月 室内干燥过夜，第二天用c h e l e x 1 0 0 法提取d n a ，然后进行扩增检测。 2 2 4 3 陈旧样本的检测 陈旧样本取自本实验室历年送检检材，包括在四川成都地区室温 下放置7 年9 年的血痕样本和约l o 年的骨骼样本。用c h e l e x 1 0 0 法 提取d n a ，然后进行检测。 四川大学颂t 学位论文方月琴 3 结果 3 1 种属鉴定方法的建立 3 1 i c y tb 引物扩增人和动物的样本 在p c r 扩增体系中单独采用c y t b 引物，针对1 3 种动物2 6 个样本 和2 6 个男女个体的d n a 样本进行扩增，结果显示动物样本和人均检 出一条带，m a r k e r 比对为3 5 8 b p 左右。因为本研究选择c y tb 基因片段 作为内对照，只要样本中有可检测量的m t d n a ，经p c r 扩增、电泳 后都应该有可见的p c r 产物( 图3 ) 。 图3 c y tb 引物扩增人和动物m t d n a 样本的电泳图 图示为单用c y tb 引物扩增人和动物d n a 样本所得的电泳图。图左侧数字为 分子量m a r k e r 的大小，图上方数字l 1 2 为样本编号。 m ：m a r k e ri ( 1 0 0 b p 6 0 0 b p ) ； l ：阴性对照；2 ：人；3 ：猴：4 ：羊；5 ： 狗；6 ：猪；7 ：牛；8 ：兔；9 ：豚鼠；1 0 ：娃；1 1 ：鱼；1 2 ：鸡。 图上方为阴极，下方为阳极。 这个图表明：c y tb 引物可扩增人和动物的m t d n a ，p c r 产物位置为3 5 0 b p 左右；并且在所有样本中部可得到产物，因此可以作为内对照。 2 0 - 四川大学硕十学付论文方月琴 3 1 2n d 6 引物对扩增人和动物的样本 p c r 反应体系中单独用n d 6 引物对1 3 种动物2 6 个样本和2 6 个 男女个体的d n a 样本进行扩增，结果显示，动物样本的p c r 产物经 电泳后，泳道清晰，无任何条带；人检出一条带，m a r k e r 比对在1 8 0 b p 附近，为n d 6 引物扩增产物，条带清晰。因为本研究将n d 6 引物设 计为具有人类特异性，只能扩增出人类样本，实验结果表明了这一点 ( 图4 ) 。 图4 n d 6 引物对扩增人和动物样本的电泳图 图示为单用n d 6 引物扩增人和动物的m t d n a 样本所得的电泳图。图左侧数字 为分子量m a r k e r 的大小，图上方数字l 1 0 为样本编号。 m ：m a r k e ri ( 1 0 0 b p 6 0 0 b p ) ；1 ：人；2 ：猴；3 ：羊；4 ：狗；5 ：猪；6 ： 牛；7 ：兔；8 ：鸡；9 ：鱼：1 0 ：阴性对照。 图上方为阴极，下方为阳极。 这个图表明：n d 6 引物只能扩增出人的m t l ) n a ，所扩增片段在1 8 0 b p 左右： 而不能扩增出动物样本的m t d n a ，可据此推定n d 6 引物具有种属特异性。 2 1 四川大学硕十学位论文方月琴 3 1 3 c y tb 引物和n d 6 引物复合扩增体系的建立 p c r 扩增体系中将c y tb 和n d 6 两对引物进行复合扩增，在3 7 5 ul 复合扩增反应体系中，若c ”b 和n d 6 两对引物以相同的浓度5 0 pm ，0 3ul 参与反应的话，经电泳银染显色，c y tb 基因片段的条带 明显浓于n d 6 基因。因此根据两者条带在动物与人类样本中的浓淡， 相应减少反应体系中c y tb 引物至5 0 l im ，0 2 5 u l ，而n d 6 引物用量 不变，使两者p c r 产物相当。 本系统检测结果为：动物样本检出一条带；人的样本检出两条带， 这表明本研究建立的复合扩增体系能成功区分人和动物的种属( 图5 ) 。 图5 e y tb 引物和n d 6 引物对扩增人和动物样本的电泳图 图示为用2 对引物复合扩增人和动物样本所得的电泳图。图左侧数字为分子量 m a r k e r 的大小，图上方数字l 9 为样本编号。 m ：m a r k e ri ( 1 0 0 b p 6 0 0 b p ) ；l ：阴性对照；2 ：人：3 ：猴；4 ：羊：5 ：狗； 6 ：猪；7 ：牛；8 ：兔；9 ：鱼。 图上方为阴极，下方为阳极。 这个图表明：e y tb n d 6 复合扩增体系能区别人和动物。p a g e 一银染显示2 条带 为人的样本；显示1 条带的为动物样本。 四川大学硕七学位论文方月琴 3 1 4 男女样本检测 复合扩增体系建立之后，选择了1 3 名男性和1 3 名女性的d n a 样 本进行检测，结果显示无差异。男性样本和女性样本均检出两条带， 一条在3 5 8 b p 附近，另一条在1 8 0 b p 附近( 图6 ) 。 图6 c y tb 引物和n d 6 引物对扩增男性和女性样本的电泳图 图示为用2 对引物复合扩增男性和女性的样本所得的电泳图。图左侧数字为分子 量m a r k e r 的大小，图上方数字1 1 0 为样本