（农药学专业论文）烟碱降解菌pseudomonas+putida+zb16a的分离筛选及降解特性研究.pdf

华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 烟碱降解菌p s e u d o m o n a s p u t i d az b 1 6 a 的分离筛选及 降解特性研究 摘要 烟碱( n i c o t i n e ，尼古丁) 是烟草类植物体内主要的天然生物碱。因其有害被列 为恶性环境污染物之一，我国是世界上最大的烟草生产国和消费国，开展高浓度烟 碱降解菌分离筛选及降解特性研究，为烟碱降解菌在烟草工业上的应用和烟碱环境 污染治理提供理论基础。 1 烟碱降解菌的分离与筛选 以o 1 5 烟碱作为唯一的碳氮源，以武汉卷烟厂废弃物和山东烟叶种植田( 淄 博市淄川区和淄博市沂源县) 土壤为材料，对5 8 份不同类型的样品进行了烟碱降解 菌的分离和筛选，结果表明：卷烟厂废弃物和烟叶种植田土壤中烟碱降解菌资源丰 富，在所采集的5 8 份样品中共分离出烟碱降解菌1 5 2 株，不同类型样品分离出的烟 碱降解菌存在较大差异，武汉卷烟厂2 7 份样品分离出烟碱降解菌2 2 株，山东淄博 市淄川区1 9 份样品分离出烟碱降解菌7 6 株，山东淄博市沂源县1 2 份样品分离出烟 碱降解菌5 4 株；两地区烟叶种植田土壤中所分离的烟碱降解菌资源均比卷烟厂废弃 物丰富：进一步筛选得到一株在烟碱浓度为4 0 0 0 m g l 时生长良好的烟碱降解菌分 离株z b 1 6 a 。 2 烟碱降解菌z b 1 6 a 的鉴定 烟碱降解菌z b 1 6 a 经常规形态学、生理生化特征、1 6 sr d n a 序列分析和系统 发育树研究表明，z b 一1 6 a 分离株属于恶臭假单胞菌，因此将该菌株命名为恶臭假单 胞菌z b 1 6 a ( p s e u d o m o n a s p u t i d a z b 1 6 a ) 。 3 烟碱降解菌p s e u d o m o n a s p u t i d az b 1 6 a 的降解特性研究 通过研究烟碱降解菌p p u t i d az b 1 6 a 的生长和烟碱降解特性，结果表明，菌 株z b 1 6 a 具有很强的代谢烟碱能力。在温度为1 0 。c 4 0 c 之间，p h 为7 0 ，3 0 0 0 m g l 的烟碱可降解菌被完全降解，降解菌代谢烟碱的最适温度为2 5 c ，该菌株具有较宽 的温度适应范围；降解菌z b 1 6 a 在温度为2 5 。c 、p h 6 5 7 5 的条件下具有较快的生 烟碱降解菌p s e u d o m o n a s p u t i d az b - 1 6 a 的分离筛选及降解特性研究 长和代谢烟碱速度；菌株z b 1 6 a 具有代谢高浓度烟碱的能力，当温度为2 5 。c 、 p h 7 0 ，烟碱浓度为6 0 0 0 m g l 时，4 8 h 内可被完全降解；当烟碱浓度为7 0 0 0 m g l 时， 该菌的生长和烟碱代谢都受到抑制。 关键词：烟碱；菌株分离：鉴定；恶臭假单胞菌z b 1 6 a ；生物降解；降解特性 i i 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 s t u d y o ni s o l a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fn i c o t i n e d e g r a d i n gb a c t e r m m s t r a i nr s e u d o m o n a sp utidal 一一 h oo z b 1 6 a a b s t r a c t n i c o t i n ei st h ep r i n c i p a la l k a l o i di nm o s to fn i c o t i n a n as p e c i e s i ti sr e g a r d e da so n e o f m a l i g n a n te n v i r o n m e n t a lp o l l u t a n t sb e c a u s eo fh a r m f u le f f e c t so nt h eh e a l t h yo fh u m a n b e i n g s c h i n ai s t h e b i g g e s tt o b a c c op r o d u c t i o n a n d c o n s u m p t i o nc o u n t r y t h e n i c o t i n e - d e g r a d a t i o nb a c t e r i ai s o l a t i o na n dn i c o t i n ed e g r a d a t i o ns t u d yp r o v i d et h e o r e t i c a l b a s i sf o rt h ea p p l i c a t i o no fb a c t e r i ao nt r e a t m e n to fn i c o t i n ep o l l u t i o n 1 i s o l a t i o na n ds c r e e n i n go fn i c o t i n e d e g r a d a t i n gb a c t e r i a 5 8s a m p l e sw e r ec o l l e c t e df r o ms o i l so ft o b a c c op l a n t i n gi na r e a sz ib oc i t y ( z ib o a r e aa n dy iy u a nv i l l a g e ，z ib oc i t y ) ，s h a nd o n g p r o v i n c ea n dw a s t ei nw u h a nt o b a c c o c o m p a n y at o t a lo f15 2p u r ei s o l a t e sw e r eo b t a i n e df r o mc o l l e c t i n gs a m p l e s t h e s e i s o l a t e sw e r ea l l a n a l y z e df o rt h e i rn i c o t i n e d e g r a d i n ga c t i v i t i e su s i n gam e d i u m c o n t a i n i n g0 15 n i c o t i n ea s t h es o l ec a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c e t h es t r a i n sh a v e d i f f e r e n tc a p a c i t yf o rn i c o t i n ed e g r a d a t i o n 2 2n i c o t i n e d e g r a d a t i o ns t r a i n sw e r eo b t a i n e d f r o m2 7s a m p l e sc o l l e c t e di nw u h a nt o b a c c oc o m p a n y 7 6n i c o t i n e - d e g r a d a t i o ns t r a i n s w e r eg o t t e nf r o m19s a m p l e st h a tc a m ef r o mz i b oa e r ai nz i b oc i t y , s h a n d o n gp r o v i n c e 12s a m p l e sc o l l e c t e df r o mz i b oc i t yy i y u a nv i l l a g es h a n d o n gp r o v i n c ec o n t a i n e d5 4 n i c o t i n e - d e g r a d a t i o ns t r a i n s t h et o b a c c op l a n t i n gs o i l ( z ib oa r e aa n dz ib oc i t yy iy u a n v i l l a g e ) c o n t a i n e dm o r en i c o t i n e d e g r a d a t i o ns t r a i n st h a nt h ew a s t ei nw u h a nt o b a c c o c o m p a n y a m o n gt h ei s o l a t e s ，o n ei s o l a t ez b 一16 as c r e e n e df r o mt o b a c c op l a n t i n gs o i l s ( z i b oc i t y , z i b oa r e a ，s h a n d o n gp r o v i n c e ) s h o w e dg o o dg r o w t hs t a t ew h e nt h en i c o t i n e c o n c e n t r a t i o nw a s4 0 0 0 m g l 2i d e n t i f i c a t i o no fn i c o t i n e - d e g r a d a t i o ni s o l a t ez b - 16 a b yt h em o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o n ，p h y s i o l o g i c a la n ds t r u c t u r a lc h a r a c t e r i s t i c s ， c o m p a r i s o no fi t s16 sr d n aa n dp h y l o g e n e s i st r e ea n a l y s i s ，t h es t r a i nz b 16 aw a s i i i 烟碱降解菌p s e u d o m o n a s p u t i d az b - 1 6 a 的分离筛选及降解特性研究 i d e n t i f i e da sp s e u d o m o n a sp u t i d az b 一16 a 3s t u d yo nd e g r a d a t i o nc h a r a c t e r i s t i c so fp p u t i d az b - 16 a g r o w t hs t a t ea n dc h a r a c t e r i s t i c sw e r ed e t e c t e di nt h i sr e s e a r c h pp u t i d az b 。16 a s h o w e dv e r yh i 曲c a p a c i t yf o rn i c o t i n ed e g r a d a t i o n t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ef o rn i c o t i n e m e t a b o l i s mw a s2 5 c ，a l t h o u g ht h i ss t r a i nc o u l de x h a u s t3 0 0 0 m g ln i c o t i n ew h e n t e m p e r a t u r er a n g e d f r o mlo ct o4 0 c t h i sm e a n st h i ss t r a i n p o s s e s s e dg o o d t e m p e r a t u r ea d a p t a b i l i t y z b 一16 aa p p e a r e d r e l a t i v ef a s t c e l l g r o w t h a n dn i c o t i n e d e g r a d a t i o nw i 血t e m p e r a t u r eo f4 0 。ca n dp h6 5 7 5 z b 一1 6 ac o u l dt o l e r a t e6 0 0 0m g l n i c o t i n ea n da l lt h en i c o t i n ew a sc o n s u m e da f t e r4 8 hw h i l et h et e m p e r a t u r ea n di n i t i a lp h w a s3 0 ca n dp h7 0 ，r e s p e c t i v e l y z b - 1 6 ag r o w t ha n dn i c o t i n em e t a b o l i s mw a s i n h i b i t e di nn i c o t i n ec o n c e n t r a t i o n7 0 0 0 m g l k e yw o r d s ：n i c o t i n e ；i s o l a t e s ；i d e n t i f i c a t i o n ；户p u t i d az b 一16 a ；b i o d e g r a d a t i o n ； d e g r a d a t i o nc h a r a c t e r i s t i c s i v 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 茎罢蓑妻l 否 i 如需保密，解密时间1 年月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名： 时间：c i 名年il ，月il 日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存，使用学位论文的规定”，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版 和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传 播学位论文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 学位论文作者签名 锄鲐专雠锄鲐专莎俯 签名日期一年，。月，z 日签名日期：d 胡稻年明f 乙日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 第一章文献综述弟一早义陬综迎 烟碱( 尼古丁，n i c o t i n e ，c 1 0 h 1 4 n 2 ) 被证明广泛存在于多种植物中，是烟草类 植物体内主要的天然生物碱。最早发现于马铃薯、西红柿、绿辣椒和烟草等 s o l a n o c e o u s ( 茄科) 类植物中( d o o l i t t l e ，e ta 1 ，1 9 9 5 ) 。烟碱对人和动物具有较强的 三致作用( 致癌、致畸、致突变) ，是恶性环境污染物之一。欧盟已将烟碱含量超过 5 0 0 m g k g 烟草废弃物列入有毒有害物质清单。我国是世界上最大的烟草生产国和消 费国，占全世界2 0 的人口消费世界上3 0 的卷烟( h o l d e n ，2 0 0 1 ) ，每年产生的烟 草废弃物约1 3 0 1 7 0 吨，每千克干废弃物的平均烟碱含量高达1 8 9 ，是严重威胁我国 乃至全球人类和动物健康的烟碱污染源。 1 烟碱及其理化性质 1 1 烟碱的化学结构 烟草生物碱是一个类群，含有近5 0 种物质，存在于约6 0 多个不同种的烟草中( 阎 克玉，2 0 0 2 ) 。烟草生物碱根据分子结构可分为两类：一类是吡啶与氢化吡咯相结合 的化合物，以烟碱为代表；另一类是吡啶与吡啶或氢化吡啶环相结合的化合物，如 假木贼碱、新烟草碱等。在烟草生物碱中以烟碱最为重要，它是烟草中的主要生物 碱，占烟草生物碱总量的9 5 以上f 张槐苓，1 9 9 4 ) 。 1 8 2 5 年，瑞士化学家a p i k e t e 首次从烟草中分离出烟碱。烟碱的化学名称：1 甲 基2 ( 3 吡啶) 吡咯烷，分子式为c i o h l 4 n 2 ，分子量为1 6 2 2 4 。 结构式： 1 2 烟碱的理化性质 烟碱在室温下是一种难闻、味苦、无色透明或淡黄色的油状液体。具有较强的 烟碱降解菌p s e u d o m o n a s p u t i d az b - 1 6 a 的分离筛选及降解特性研究 挥发性，强烈的刺激性，味辛辣，在空气中极易氧化成棕黄色，且在阳光下易分解， 颜色变深，有特殊的烟臭味，其沸点为2 4 7 * ( 2 ，比重1 0 0 9 ( 2 0 ) ，具有左旋性。烟 碱具有潮解性，6 0 。c 条件下能与水以任何比例互溶，随水蒸汽挥发而不分解的特殊 性质，因此可以用水蒸汽蒸馏法从碱性溶液中蒸出烟碱( s p e a k e te ta 1 ，1 9 6 4 ) 。烟 碱不仅易溶于水，还可以溶于许多有机溶剂，如四氯化碳、氯仿、乙醚、苯、煤油、 三氯乙烯和三氯乙烷等。 烟碱是由两个氮杂环构成的化合物，其中一个是吡啶环，此环中的氮原子由于 芳香化的结果，与芳胺的碱性相近，它的碱性很弱。而烟碱分子中的另一氮杂环， 属于吡咯环，此环中的氮原子还连接着一个甲基，其属叔胺，由于此环没有芳香化， 其碱性与脂肪族叔胺碱性相近。即烟碱中含有两个碱性相差很大的碱性基团，不过 与强无机碱相比，它们都是弱碱，在强碱作用下很容易被分离出来。烟碱可和酸反 应生成盐( 肖协忠，1 9 9 7 ) ，如形成硫酸烟碱和硅钨酸盐等。 烟碱分子中，吡啶环由于芳香化的作用，比较稳定，反应活性比较低，而吡咯 环由于没有芳香化，比较不稳定，易发生反应，当受紫外光照射或浓硝酸作用时， 易被氧化。因此，烟碱的降解在多数情况下先打开吡咯环。 由于烟碱结构中的吡啶环和氢化吡咯环均呈碱性，所以烟碱为碱性化合物，能 与多种无机酸和有机酸反应生成盐，这些盐大多易溶于水和有机溶剂。烟草植株中 大部分的烟碱与草酸、苹果酸、柠檬酸、芳香族酸结合生成相应的盐类。烟碱也能 和无机酸结合生成盐，因此可以用盐酸或硫酸吸收烟碱( p a i l e rm ，1 9 9 4 ) 。 2 烟碱对人的危害及环境污染 2 1 烟碱对人的危害 烟碱有剧烈毒性，一支香烟所含的烟碱可毒死一只小白鼠，2 0 支香烟中的烟碱 可毒死一头牛，一滴烟碱可杀死三匹马，人的致死量是5 0 7 0 m g ，相当于2 0 2 5 9 烟 丝的烟碱含量，如果将一支雪茄烟或3 支香烟的烟碱注入人的静脉内3 - 5 m i n 即可死亡 ( h t t p ：z h i d a o b a i d u c o r n q u e s t i o n 2 5 6117 6 8 h t m l ) 。 烟碱可经过口、鼻、支气管粘膜被机体吸收，不仅可以通过鼻腔和口腔的嗅觉 神经带给吸烟者强烈的生理感受，同时作用于中枢神经系统，使人感到兴奋的刺激。 2 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 适度地吸烟具有兴奋、松弛和抵御厌烦情绪的心理作用。 烟碱是一种中枢神经兴奋剂，可使人产生心理和生理上的依赖性，是使人吸烟 成瘾的物质。中等剂量的烟碱可刺激肾上腺释放肾上腺素和去甲肾上腺素，兴奋中 枢神经和交感神经，使心跳加快，血压升高，心排血量减少，心电传导系统功能失 常，增加心脏的负担。大量的烟碱则抑制中枢神经系统，甚至使心脏麻痹而导致死 亡。尼占丁还可增加血液粘稠度，使血流减慢，心脏供血量减少，发生心绞痛，严 重时会引起心脏病突发而死亡。 烟碱在人体内会破坏人体吸收的维生素c ，从而削弱人体的免疫功能。吸烟越 多越能增加身体和心理对烟碱的依赖性。研究发现人们长期吸烟会使小血管产生收 缩，引起心血管病变；削弱心脏的收缩力和损害脑细胞，降低机体的活力；从而造 成多种器官受累的综合病变。长期吸烟的人患肺癌的几率远大于不吸烟的人，过量 吸烟则会抑制中枢神经，麻痹心脏，甚至有致命的危险。有人认为烟碱是烟草和主 流烟气中的n 亚硝胺( ( t s n a ) 的前体，而该物质是致癌的主要物质( 肖协忠，1 9 9 7 ) 。 2 2 烟草生产及废弃物污染 自上世纪5 0 年代以来，烟草已逐步成为我国乃至世界支柱产业之一。目前全世 界吸烟人数约有1 2 亿以上，大约每分钟就会有一个人死于烟草和烟草有关的疾病， 世界卫生组织研究表明，目前全世界每年死于烟草人数达4 9 0 万，到2 0 2 5 年将增加 到1 0 0 0 万( a m e r i c a nc a n c e rs o c i t y ，2 0 0 4 ) 。2 0 0 8 年全球烤烟产量预计为4 1 8 4 7 亿 蚝，比2 0 0 7 年的估计产量3 8 7 1 9 亿k g 提高8 1 。所有烟叶出口国( 不包括中国) 2 0 0 8 年的产量预计为1 6 6 7 4 亿蝇，比2 0 0 7 年的1 7 0 5 亿k g 的产量下降了2 3 ， 2 0 0 8 年1 - 6 月，中国烟草行业累计实现工商税利2 4 3 3 0 亿元，同比增长1 7 6 7 ( h t t p ：w w w t o b a c c o c h i n a c o r n ) 。目前我国烟叶产量占世界烟叶产量的3 5 ，为世 界第一；卷烟产量占世界卷烟的3 2 ，居世界第一；中国拥有烟民3 5 亿多人，约 占全球烟民总数的1 5 ，同样位居世界第一。烟草效益对整个国民及世界有着相当重 要的作用，全国范围内的禁烟在我国是不可能完成的任务。 烟草在创造巨大的经济效益和满足人民需求的同时，烟草中含有烟碱等许多有 害物质而给人类健康及生态环境带来了巨大危害和威胁。烟碱存在于烟草中 ( s o l o w a y , 1 9 7 6 ；t o m i z a w aa n dc a s i d a , 2 0 0 3 ) ，是烟草的主要生物碱，同时也是衡 烟碱降解菌p s e u d o m o n a s p u t i d az b 一1 6 a 的分离筛选及降解特性研究 量烟草质量的重要指标。烟碱在香烟中的含量可达1 5 ，占烟草总烟碱含量的9 5 ( b e n o w i t z ，e t a l ，1 9 8 3 ；s c h m e l t z ，e t a l ，1 9 7 7 ) 。鼻烟和烟管中的烟碱含量与纸烟中 的相似，而雪茄与咀嚼烟草中的烟碱含量是纸烟中的一半( j a c o b ，e ta 1 ，1 9 9 9 ；l ua n d r a l a p a t i ，1 9 9 8 ；t i l a s h a l s k i ，e ta 1 ，1 9 9 4 ) 。每根香烟中平均含有1 0 1 4 m g 烟碱 ( k o z l o w s k i ，e l a l ，1 9 9 8 ) 。而有1 1 5 m g 烟碱在吸烟过程中被机体所吸收( b e n o w i t z a n dj a c o b ，1 9 8 4 ) 。 吸烟对人类健康有巨大的负面影响，而全球烟草使用量仍在持续增长中。大多 数烟草相关的疾病并不是由烟碱直接引起的( b a l f o u r ，2 0 0 2 ；b e n o w i t z ，1 9 9 9 ) 。烟 碱的致瘾性引起烟草产品的持续使用，导致人体暴露于烟草中的多种致癌物质和生 物活性物质，从而使吸食烟草者成为发展中国家过早死亡的主要原因之一( h e c h t ， 2 0 0 31p e t o ，e ta l ，1 9 9 2 ) 。吐烟之后，高浓度烟碱可在1 0 2 0 s 到达大脑，通过多巴 胺反馈系统迅速产生机体反应( b e n o w i t z , e la ，1 9 9 8 ) 。1 4 c n i c o t i n e 研究表明8 0 9 0 吸烟时吸入的烟碱被机体所吸收( a r m i t a g e ，e ta 1 ，1 9 7 5 ) 。不吸烟的女性从环境中摄 取烟碱的吸收率高达6 0 8 0 ( 1 w a s e ，e ta 1 ，1 9 9 1 ) ，在这种环境中，如此多的有害 物质对周围的人特别是儿童、孕妇和老年人造成巨大的危害。被动吸烟的主要致癌 机理是：产生活化氧的自由基损伤基因和细胞膜蛋白，促发疾病和肿瘤等，同时还 会减少血红蛋白携氧量，并使心肌利用氧的能力下降。因此，被动吸烟的危害较主 动吸烟者更为严重。 拥有大量吸烟者的中国，随着生活水平和生活质量的提高，人们对健康的关注 日益增强，人们对烟草产品的依赖转向低含量的卷烟，使得卷烟加工过程中产生了 大量的废弃物( n o v o t n ya n dz h a o ，1 9 9 9 ) 。然而烟碱是烟叶中主要的生物碱，高毒和 不易降解导致其长期存在于环境中，给人类的自然和生存环境带来了巨大的影响。 由于种植条件、地理环境和生产技术等因素影响，我国每年生产烟草废弃物1 3 0 1 7 0 万t ，其烟碱含量高达18 9 k g ，此含量是欧盟有毒有害烟草废弃物控制标准的3 6 倍， 严重污染卷烟企业周边环境和地下水( r u a n ，e ta 1 ，2 0 0 5 ) 。烟碱的结构性质决定了它 具有很好的水溶性，易造成水质的污染，威胁着我们的生存环境。 4 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 2 3 烟碱类农药对环境的污染 烟碱，生物碱类杀虫剂，1 6 9 0 年发现烟草萃取液可杀死梨花网蝽，1 8 2 9 年确定 其有效成分为烟碱，是一种具有触杀活性的高毒药剂，广泛应用于果树、蔬菜害虫 的防治( 王春，2 0 0 0 ) 。 s o l o w a y 等人19 7 8 年报道硝基亚甲基杂环化合物具有杀虫活性，农药工作者通 过对该类化合物官能团的变换进行新型杀虫剂的研制( s o l o w a y , 1 9 7 6 ) 。2 0 世纪8 0 年代中期，德国拜耳公司以烟碱为模板成功开发出第一个烟碱类杀虫剂吡虫啉，其 新颖的作用方式、选择毒性强、广谱、高效和对环境相容性好等特点使得烟碱类农 药成为许多世界著名农药公司研究的热点，并取得明显进展。 烟碱类杀虫剂的作用机制是通过选择性控制昆虫神经系统。烟碱乙酰胆碱酯酶 受体，阻断昆虫中枢神经系统的正常传导，导致害虫出现麻痹而死亡。由于该类杀 虫剂具有独特的作用机制，与常规杀虫剂没有交互抗性，其不仅具有高效、广谱、 良好内吸性、触杀和胃毒等特点，而且对哺乳动物毒性低，对环境友好。有效防治 同翅目、鞘翅目、双翅目和鳞翅目等害虫，对己产生抗药性的害虫同时具有良好活 性( 张国生，2 0 0 4 ) 。 随着科学的发展，烟碱类农药已成为我国的第四大类农药，其有效成分以烟碱 为主，国内外研究大都集中在此类农药对各类昆虫的毒理学领域。然而，随着烟碱 型农药的推广使用，+ 其对人类健康的影响、对环境的污染、及其对土壤肥力与微生 态结构的改变，已逐步成为我们不得不面对和应解决的问题。 3 烟碱的微生物降解 3 1 降解烟碱的微生物种类 早在二十世纪初，就有关于从烟草烟叶及土壤中分离到可代谢烟碱的微生物的 报道。1 9 4 8 年，f r a n k e n b u r g ( f r a n k e n b u r g ，1 9 4 8 ) 在( ( s c i e n c e ) ) 发表了他的重要研 究成果，提出在自然发酵过程中，雪茄烟叶中有相当数量的烟碱降解了，并开展了 多年的研究( f r a n k e n b u r g ，1 9 4 9 ；f r a n k e n b u r g ，1 9 5 2 ；f r a n k e n b u r g ，1 9 5 5 ；f r a n k e n b u r g ， 1 9 5 7 ；f r a n k e n b u r g ，1 9 5 8 ；) ，f r a n k e n b u r g 的实验结果由表l 可知，发现烟碱降解的 烟碱降解菌p s e u d o m o n a s p u t i d az b 一1 6 a 的分离筛选及降解特性研究 范围在6 9 4 ，平均降解了约5 0 。由此开始了烟碱微生物降解的研究领域，并 得到许多微生物学家的重视和积极参与，直至目前，国内外仍有一大批研究人员活 跃在此领域，现在已经分别从烟叶、烟草种子、土壤和卷烟厂废弃物中分离得到多 种烟碱代谢微生物。 表1 宾夕法尼亚州不同的雪茄烟叶发酵后烟碱含量的降低 t a b l e1d e c r e a s eo fn i c o t i n ec o n t e n t so fp e n n s y l v a n i ac i g a rt o b a c c of o rv a r i o u s c r o p sa f t e rf e r m e n t a t i o n 1 9 2 7 年b a t h a m 等( b a t h a m ，1 9 2 7 ) 发现在土壤中加入烟碱后，硝酸盐含量会 增加，由此开始了微生物降解烟碱的研究，他认为这是由于土壤中细菌的作用使生 物碱转化为硝酸盐，从而造成土壤中硝酸盐含量的增加；1 9 5 4 年w a d a 和y a m a s a k i 等( w a d aa n d y a m a s a k i ，1 9 5 4 ) 报道了一种被称为假单胞菌的微生物能降解烟碱， 1 9 5 4 年t a b u c h i 等( t a b u c h i ，e ta 1 ，1 9 5 4 ) 深入描述了这种假单胞菌和其他种属细菌 的特征，并把它们分类为p ，x a n t h o m o n a s ，a c h r o m o b a c t e r ，b a c i l l u s ；1 9 5 9 年h y l i n ( h y l i n ，1 9 5 9 ) 从烟草种子和土壤中筛选出5 株可以烟碱为唯一碳氮源生长微生物， 并得到了纯培养物，其中有两株以前文献未有报道，可能是a c h r o m o b a c t e r n i c o t i n o p h a g u m ns p 的变种，它们为严格需氧，不能运动，不产芽胞并需要v b l 2 才 能生长的革兰氏阴性菌，在降解烟碱过程中不产生可扩散的颜色物质；1 9 5 9 年 r i t t e n b e r g 等( h o c h s t e i n ，1 9 5 9 ) 从土壤里分离出一株革兰氏阳性杆菌p 3 4 ，后来 鉴定为氧化节杆菌( a r t h r o b a c t e ro x y d a n s ) 它能利用烟碱为唯一的碳氮源生长；1 9 7 6 年u c h i d a 等( u c h i d a ，1 9 7 6 ) 利用0 2 烟碱作为唯一碳源的培养基，从烟田土壤和 烟叶表面分离出能够降解烟碱的细菌，经鉴定这些细菌为争论产碱菌( c a l i g e n e s p a r a d o x u s ) 和球形节杆菌( a r t h r o b a c t e rg l o b i f o r m i l s ) ；19 8 3 年r u i z 等( r u i z ，e t a 1 ，1 9 8 3 ) 从干烟叶表面分离出一株能够降解烟碱菌株，经鉴定为阴沟肠杆菌 ( e n t e r o b a c t e rc l o a c a e ) e 1 5 0 ，该菌在含有烟碱的培养基中( 3 4 。c ，p h 7 0 ) 进行发 酵，降解烟碱的能力得到诱导；b r a n s c h 等( b r a n s c h ，1 9 8 7 ) 报道了土壤中的a 6 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 n i c o t i n o v o r a n s 能够以烟碱为唯一的碳氮源生长；1 9 9 6 年t a s h i r o 等( t a s h i r o ，e t a 1 ，1 9 9 6 ) 从4 4 个含有烟碱的土壤和废水样品中分离得到5 7 株细菌，分离菌呈短棒 状，可利用烟碱作为唯一碳氮源生长，在两周内能降解浓度为1 0 x 1 0 。3 9 r n l 的烟碱； 2 0 0 1 年m e s n a r d 等( m e s n a r d ，2 0 0 1 ) 在n i c o t i a n ap l u m b a g i n i f o l i a 细胞悬浮培养液 中加入等量d 烟碱和l 烟碱，通过g c 和h p l c 分析发现前者比后者更能被迅速降 解；2 0 0 1 年王革等( 王革，2 0 0 1 ) 从烟叶中分离获得3 株降解烟碱和蛋白质能力较 强的菌株；2 0 0 5 年袁勇军等( 袁勇军，2 0 0 5 ) 从福建三明地区的土壤中分离得到一 株能够高效降解烟碱的菌株，经常规形态、生理生化分析及1 6 sr d n a 序列同源性 分析，鉴定为o c h r o b a c 护u mi n t e r m e d i u m ，该菌在3 0 4 0 和p h 6 0 p h 9 0 范围内 具有高降解能力，其最适温度和p h 分别为3 0 和p h 6 5 ，该菌能够以烟碱为唯一 碳源生长，烟碱的耐受浓度在无机盐培养基中可达到4 0 0 0 m g l ；r u a n 等( r u a n ， e ta 1 ，2 0 0 5 ) 分离得到高效降解烟碱菌株尸s p h f 1 ，在烟碱浓度为1 0 0 0m g l 、培养 温度3 0 c 条件下，2 5 小时内9 2 2 9 9 6 的烟碱被降解。 表2 降解烟碱微生物 t a b l e2t h en i c o t i n e - d e g r a d i n gm i c r o o r g a n i s m s 烟碱降解菌p s e u d o m o n a s p u t i d a z b - 1 6 a 的分离筛选及降解特性研究 ( w r a d aa n dy a m a s a k ik ，1 9 5 4 ；w a d a ，1 9 5 7 ；t h a c k e r ，e ta 1 1 9 7 8 ；n e w t o n ， g fa 1 ，1 9 7 8 ；e d w a r d swb ，e ta 1 ，1 9 7 8 ：s g u r o spl ，1 9 5 5 ；c h e m a ，e ta 1 ，1 9 6 5 ；u c h i d a s ，e ta 1 ，1 9 8 3 ；f r e u d e n b e r gw ，e ta 1 ，1 9 8 8 ；d e c k e rka n db l e e gh ，1 9 6 5 ；b r a n d s c h ra n dd e c k e rk ，1 9 8 4 ；b r a n d s c hr ，e ta 1 ，1 9 8 6 ；k o d a m ay ，e ta 1 ，1 9 9 2 ；王革，2 0 0 1 ； g r a v e l y ，1 9 8 5 ；g u t i e r r e zr ，1 9 8 3 ：g i o v a n n o z z i ，1 9 4 7 ；m e s n a r df ，2 0 0 1 ；h y l i nj w ，1 9 5 9 ；e b e r h a r d t ，1 9 9 5 ；s i n d e l a rrd ，e ta 1 ，1 9 7 9 ；) 3 2 微生物代谢烟碱的主要途径 直至目前，多种代谢烟碱的微生物已经报道，微生物种类不同，代谢烟碱的途 径和降解产物也不同，但微生物代谢烟碱主要通过三种途径： 第一种途径以节杆菌为代表的吡啶途径( p y r i d i n ep a t h w a y ) ( 图1 ) 该途径从烟碱吡啶环6 位羟基化开始，然后吡咯被氧化脱氢并自发水解，接着 吡啶环通过羟基化被打开( h o c h s t e r i nlia n dd a l t o nbp ，1 9 6 7 ) 。 8 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 烟碱 h o o c ( c h 2 ) 3 n h c h 3 0 6 羟基烟碱 2 , 6 - 二羟基吡啶 6 羟基假氧 6 羟基3 琥珀酰吡 上 o h h o 2 , 3 ，6 三羟基毗啶 2 , 5 - 二羟基吡啶 蓝色素 o c o o h 马来酸 图1a t h r o b a c t e rs p 降解烟碱途径 f i g1p a t h w a yf o r t h em e t a b o l i s mo fn i c o t i n eb ya s p 第二种途径以假单胞菌为代表的吡咯途径( p y r r o l i d i n ep a t h w a y ) ( 图2 ) 啶 该途径从烟碱的吡咯烷被脱氢打开开始，然后通过羟基化打开吡啶环( w a d ae a n dy a m a s a k ik ，1 9 5 4 ) 。 9 烟碱降解菌p s e u d o m o n a s p u t i d az b - 1 6 a 的分离筛选及降解特性研究 烟碱 n 甲基麦斯明 假氧化烟碱 6 羟基3 琥珀酰吡啶3 琥珀酰吡啶 2 , 5 - 二羟基吡啶 图2 卫s p 降解烟碱途径 f i g2p a t h w a yf o r t h em e t a b o l i s mo fn i c o t i n eb y 旦s p 第三种途径为真菌中的脱甲基化途径( m ep a t h w a y ) 该途径从烟碱的吡咯烷脱甲基生成降烟碱( n o m i c o t i n e ) 开始( b r a n d s c h ，2 0 0 6 ) ， 微生物沿这些途径将烟碱转化为羧酸和氨基酸，为细胞的生物合成提供碳氮源能源， 因而它们具有降解烟草中盐碱含量和处理卷烟加工产生的有毒废物的潜力。 随着科学的发展，新的降解烟碱微生物相继被报道，新的降解途径以及新的酶 被发掘。微生物代谢烟碱的途径，是一个极其复杂的过程，至今仍有一些代谢途径 尚未阐明，有待科学工作者进一步深入的研究。 3 3 微生物代谢烟碱的酶学研究 烟碱降解微生物中涉及到的酶系主要围绕细菌展开，根据目前报道微生物降解 烟碱途径而知，微生物代谢烟碱的酶学研究主要集中在节杆菌属细菌，节杆菌属细 1 0 。 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 菌代谢烟碱的研究主要围绕a n i c o t i n o v o r a n s 展开( b r a n d s c h ，2 0 0 6 ) ；假单胞茵属 代谢烟碱的酶系只有初步报道( h o n g z h it a n g ，e ta 1 ，2 0 0 8 ) 而关于真菌方面的研究 还未见报道。 节杆菌属代谢烟碱过程主要有6 个反应步骤，涉及6 个关键酶均已被克隆和纯 化，6 个关键酶分别为： ( 1 ) 烟碱脱氢酶( n i c o t i n ed e h y d r o g e n a s e ，n d h ) ，催化第一步反应，该酶没有 光学选择性( d e c k e r a n db l e e g ，1 9 6 5 ) ，由3 个亚基组成，分子量分别为3 0 0 1 1 d a 、 1 4 9 2 4 d a 和8 7 6 7 7 d a ( g r e t h e r b e c k ，e t a l 1 9 9 4 ) 。 ( 2 ) l - 6 - 羟基烟碱氧化酶( l 6 一h y d r o x y n i c o t i n e o x i d a s e ，6 h l n o ) 和d - 6 一羟基 烟碱氧化酶( l 6 h y d r o x y n i c o t i n e o x i d a s e ，6 h d n o ) ，分别催化第二步和第三步反应 ( d e c k e ra n db l e e g ，1 9 6 5 ) ，该酶具有严格光学特异性的酶，分别作用于l 一6 - 羟基 烟碱和d 6 羟基烟碱，l 6 羟基烟碱氧化酶为1 个同源二聚体，分子量为9 3 k d a ( d a i ， 甜a ，1 9 6 8 ；d e c k e ra n dd a i ，1 9 6 7 ) ，d 6 羟基烟碱氧化酶是一个分子量为5 3 k d a 并 仅由1 个多肽链组成的单体酶( b r u h m u l l e r ，e ta 1 ，1 9 7 2 ) 。 ( 3 ) 酮脱氢酶( k e t o n ed e h y d r o g e n a s e ，k d h ) ，催化第四步反应，该酶为异源 三聚体，3 个亚基大小分别为8 9 0 2 1 7 1 d a 、2 6 7 7 8 6 5 d a 和1 7 6 3 8 8 8 d a ( b a i t s c h ，e t a 1 ，2 0 01 ；s c h e n ka n dd e c k e r ，19 9 9 ) 。 ( 4 ) 二羟基假氧化烟碱水解酶( d h p o n h ) ，催化2 , 6 羟基假氧化烟碱水解为 2 , 6 一羟基吡啶和7 - n - 氨基丁酸的反应，在溶液中以单体的形式存在，分子量为4 3 k d a ( s a c h e l a r u ，e ta 1 ，2 0 0 5 ) 。