（分析化学专业论文）自由基的测定及抗氧化剂的研究与应用.pdf

h y d ro x y l r a d i c a l i s a l a n d o f h y d ro x y l w h i c h h a s s t ro n g o xi d a t iv e a b il it y t o o xi d iz e o r g a n i c a n d i n o r g a n i c c o m p o u n d s re a d i 尔 i t is a ls o a i m p o r ta n t a ct i v e o x y g e n w h ic h a t t r ib u t e t o t h e o xi d a ti o n o f 如戏 s e pa r a t io n o f n u c le ic a c i d s , d e c o m p o s i t i o n o f a m y l o s e s a n d p ro t e in s . b e c a u s e o f 山 e i r a c ti v e re a c tiv e a b i lity , s h o rt l if e - s p a n a n d l o w c o n c ent r a t io n , t h e a n a ly ti c m e t h o d s o f h y d ro 动 r a d ic a l h a s i m p o r t a n t v a lu e i n m a n y fi e l d s s u 山 a s t h e r e s e a r c h o f t h e i r f u n c ti o n , d e te r m i n a ti o n a n d fi l t r a ti o n o f a n ti - h y d ro xyl r a d i c a l c o m p o u n d s . t h e n e w a n a ly t ic s y s t e m o f t r 如 h e n y 俪ent h a n e - h a n s i t io n e le m e n t - h 2 0 2 h a s b e en p u t f o r w a r d s f irs t t i m e a n d h a s b e e n a p p l i e d t o t h e d e te r m in a t io n o f e li m in a t io n o f h y d ro x y l ra d i c a ls . t h e a m o u n t o f h y d ro x y l r a d i c a ls c a n b e d e t e r m in a t e d 勿t h e m e th o d s o f s p e d ro p h o t o m e tr y a n d fl u o ro m e t r ic a n a ly s is . h a s b e en u s e d t o d e t e r m i n a t e t h e a n t i- o u d a t a n re a g e n t s 恤t h e a n ti s e p s is o f d 成 加飒 m e d i c i n e s a n d c os m e t ic s . t h e f u r t h e r r e s e a r c h a n d e x p l o r a ti o n o f c le a n r e a g e n t s o f h y d ro x y l r a d ic a l s s u 山a s v i t a m in c ,b e n z o ic a c i d t h o u r e s a n d 团ly 】 a l c o h o l h a s b e e n p r o c e e d 吐t h e p r a ct i c a l s 妙ifi c a n ce o f n e w a n a 蜘c s y s t e m h a s b e en re s e a r c h e d f r o m v a r i o u s a s p e ct s i n v o lv in g s p e c t ro p h o t o m e t r y ,fl u o ro m et r i c a n a ly s i s a n d e l e c tr o n s p in re s o n a n ce . e v e n t u 此尹 a r a p 峨 b a n 勿m e t h o d u s e d t o d et e r min a t e 山 e a m o u n t o f 如加动 r a d ic a l s 恤山 e d e li , m e d ic in e s a n d c o s m e t ic s b 出b e e n s e t 即. e le ct r o n s p i n re s o n a n ce , f i i g h p e r f o r m a n ce 匆山 由 m -t o g r a p h y , c h e m f u m in e s c ence a n d s o o n , a re t h e u s u a l w a y s t o d et e rmi n a t e t h e h y d ro x y l r a d ic a ls t o d a y , b u t 也 即a r e d iff ic u l t t o a d o p t 协u s u a l l a b s f o r t h o s e re a s o n s o f s p e a a l i n s t r u m e n t c o m p l e x o p e r a t io n a n d e x p e n d r e a g e n t s ht h e s e p a p e r , i t i s f o u n d t h a t b e s id e s叱t h e re。 m o re m e ta l iro n s s u c h a s c o l , c r3 ,s e,w,c u r c a n r e a c t w it h 11 2% a n d p ro d u c t o ht h e b a s e o f f e n to n s re a c tio n . t h e re s u lt s d is p la y t h a t t h e c o y , c 产h a v e 。 r a th e r h 妙 p r o d u c t i o n r a t e w h ic h h a s b e en p r o v e d勿 e l e ct ro n s p in re s o n a n c e . wh en h y d ro x y l r a d ic a ls a r e d e t e r m ia t e d勿 t h e m e t h o d s o f s p e c t ro p h o t o m e t r y o r fl u o ro m e t r ic a n a b ys i s w it h t h e t r ip h e n y h n e n i h a n e a s t h e d e v e l o p e r , i t h a s b e e n f o u n d t h a t s u c h m e t h o d is a e ff e c t u a l w a y s i n t h e d iv id e d , l a r g e m a s s f ilt r a t i o n o f a n ti - o x i d a t io n m e d ic i n e s b e c a u s e o f it s h a n d y o p e r a t io n , r a p i d r e a ct i o n , g o o d s e l e c t i v i t y , h i g h s e n s i ti v i t y , l o w c o n ce n t r a ti o n a n d l e s s w o r k a n d l o w c o s t k e y w o r d ; h y d ro x y l r a 山 c a l t r a n a i f i n n e l e m-t 前言 自 由 基又称游离基， 就是具有未配对电 子的 原子或原子团， 其 最基 本 的 特征是具有未配对的电子。 许多化学反应都发生共价键的 均裂， 产生自 由 基。 列如， 汽油燃烧、 油漆变 千、 油脂变坏的 过 程中， 就有自 由 基生成。 自 由 基的 性 质活泼， 很易进一步反应变为 稳定的 分子 ， 大多数寿翁弱k 短， 因 此， 多数只能作为反应中间物存在， 检钡和分离都较困 难。 近年来，自 由 基在生物体系中的 作用已 成为 许多 科学 感兴趣的 研究课题， 并已 发展成 为一门 新学科一自由 基生物学。 经自由 基是一种氧化能力很强的自 由 基， 能很容易地氧化各种有机物 和无机物， 是造成生物组织脂质过氧化， 核酸断裂， 蛋白 质和多糖分解的 重要活性氧。因而对经自由基的研究和探讨v;渴 示生物体的生命过程及有 毒 有机污染物控制和x 引 r 体抗衰老， 肿 瘤等 形成的了 解， 寻 找清除 经自 由 基及降解有毒物质具有十分重要的意义。因 此， 对经自 由 基的 研究在生命 科学 及环境科学等领域中 引 起了 广泛的 兴 趣。 由 于经自 由 基的 反应活 性大， 寿命短， 存在浓度低， 所以在有关经自 由 基的 研究中， 其分析检验方法对 于 经自 由 基的 作用研究有重大意义， 特 别是在测定 及筛选 抗经自 由 基物 质 的方面具有重要价值。 目 前， 国内 外对经自 由 基的 测定 方法进 行了 多方面的 研究， 取得了 一 定的 成 果， 如1 9 4 5 年 发 展 起 来的电 子自 旋 共 振法 ( e s r ) 1 ， 是 现 阶 段 测 定 经自 由 基的 最 直 接 方法。 g a m o h 等 人 用高 效 液 相色 谱法( h p l c ) 测 定了 f e n t o n 反 应中 产 生的 o h 2 1 ， 陈 秀 武 等 人 用 酵 母 扩 增， 化 学 发 光法 测 定 抗 坏 血 酸 u 2 + - h 2 。体系 产 生的 o h ， 吴 忠 等 4 1用电 位 滴 定 法 测 定了 竣 基 自 由 基 和 酚自 由 基， 徐向 荣 等 1用 荧 光 法 测 定c e 的 荧 光 强 度 变 化 来间 接 测 定9自 由 基的 产生量等。 这些方法 或 仪器 特 殊， 或试 割昂 贵， 或 操作复 杂， 一般试验室难以 采用， 有待于 进 甲步 提高。 本试验在原有f e n t o n 反应产生 o h的基础上， 发现了f e n t o n 反应 中f 矛 十 以 外还有 其他的 金属离子可与h 2 氏反应产生 o h的 现象， 并用 e s r 法 及 用紫 夕 卜河见 分 光光 度 法和 荧 光 法 进 行 测定和 证 实。 此 法 简 单 易 行，反应速度快， 选择性好， 灵敏度高， 检测限 低， 工作量大大减 少， 降 低了 成本， 对于 离体大面积筛 选 抗氧 化 药物 具有重要意义， 是可以 推广的 一种新型的测定经自由 基的有效方法。 中 洲 片 习 吮 学 an 士 毕 习 七 t e z t 第一章绪论 1 .1 引 言 生 物 化 学 家 6 狱为 ，导 致 细 胞 老 化 的 原 因 之 一 是 活 性 氧 ( o z , o h和 h 2 0 2 ) ， 能使正常细胞的生理化学性质发生深刻的 变化. 其中 经自 由 基 ( h o ) 是 一 种 氧 化 能 力 才 良 搔 的自 由 基， 实 验 研 究 表 明 它 是 造 成 生 物 组 织 脂质过氧化， 核酸断 裂， 蛋白 质和多糖分 解的 重要活 性氧， 并且越 来越多 的 研究证实经自 由 基在促使人 体衰 老方面的 特 殊作用。因 此对经自 由 基的 研 究在生 命 科学以 及环境科学等领域引 起了 广泛的 兴 趣， 特 拐 鱿 是 在 测定及 筛选抗经自 由 基的物质方面。 但是， 由 于经自由 基的 反应活性大， 寿命短， 存 在 浓 度低， 用 现有 方 法 检 侧则存 在 仪 器昂 贵 或 是 灵 敏 度 低或 是准 确度 不 高 等 方面的 缺陷。 所以 在 有 关经自 由 基的 研究中 ， 其 分 析检 验 方 法 对 于 经 自 由 基的 作用研究有重大意义， 特别是在 测定及筛选 抗经自 由 基 物质的 方 面具 有重要价值。 早 在 十 九 世 纪未 期， f e n t o n m 新 发 现玩伍产 生 经自 由 基的 体 系。 一 直 到 二十 世纪六十年代， 人们才逐渐 认识 到经自 由 基a f 主 命体的 危害。 八十 年代， 经自 由 基在 生物 体内 产生和 危害的 机理得到深 人的 研究。 已 有文献 报道， 经自 由 基能使糖与磷酸盐结合的 链断裂， 使碱基从核昔、 核昔酸中 接 离出 来。 j o v a n o v ic 8 和s im ie 9 1将 胸 腺 啥 陡 和 尿 咯 吮 与 经自 由 基 作 用， 结 果发0匈 腺喀陡 可产生三种自 由 基物质， 尿啥吮 可 产生二 种自 由 基物质， 这里均是经自 由 基与分子 中的氢结合成水而 产生另一种自 由 基物质， 再经 自 由 基 重 排 而 导 致 小 分 子的 离出 。 d iz d a r o g lu t i 总 结 了 大 量 的 事 实 得 出 : 经自 由 基能 进攻芳香环产生经基化 合物。 因 此建 立一种实验 条件宽容、 灵敏度高、 操作简 易 且对仪器 要求不 高的 测定经自由 基的 新体系， 并通过对实验结果的分析及x t r t 氧化剂的 探 讨得到提高州门 生活质量的新启示。 1 . 2 热自由 甚的 产生il l ) 自 由 基最 基 本的 特征是具 有未0 寸 的电 子， 其产生的 原因 主 要有以 下 几种; ( l ) 在紫 夕 滋作用下， 许多物质可以 分解而产生自 由 基; ( 2 ) 电 离 自 由j 的刹 城比翻比暇化 制 的月 开 究 二 应 用 中 洲 片 ia 学 49 士 毕 习 七 今 仑 x 辐射可以 使人和 动物产生放射病， 其原发机制 就涉 及自 由 基的 作用; ( 3 ) 可见光也可以引发一些自由基反应。 在生 化研究中， 产生经自 由 基的 方法大 致可分为四 种: 1 . f e n t o n 反应 型 产 生的 经自 由 基12 1 ( f e n to n 反 应 体 系 是h 2 0 2 - f e ( 1 1 ) ) ; 2 在一 定 的 催 化 剂 作用 下， 氏q发 生 非f e n t o n 型 反 应而 产 生 经自 由 基13 1 ; 3.在 一 定的 条件下， 一些含琉基的有机物质发生自 身氧化还原反应而产生经自由基 11 4 1 ; 4 h 2 0 2 的 紫 外 光 解 体系 产 生 经自 由 基151 。 一 般以 前 三 种 方 法 居 多 ， 分 别介绍如下。 1 . 2 . 1 f e n t o n 反应型产生的经自 由 基11 6 1 在所有的 需氧 有机 体中， 总会 产生超氧自 由 基汤一 ， 它在s o d酶 作 用下产生h 2 0 2 ， 而h 2 0 2 初或 渡金属元素离子或 超氧化物阴 离子自 由 基还 原，可产生o h . 认一 + f e0 2 + f e f e + h 2 0 2 f e 3 + + o h + o h ( 1 - 1 ) ( 1 - 2 ) 0 2 + h 2 0 2一 一 fe i o h + o h - + 0 2 ( 1 - 3 ) h , o 2 + f e 2 + + 一. o h + h 2 o + f e ( f e n t o n 反 应) ( 1 - 4 ) h 2 0 2 + 0 2 + h -i . o h + h 2 o+ 0 2 ( h o b e r - w e i r : 反应) 就是因 为这几个反应的 存在， 所以 产生0 2 - 和h 2 0 2 的 体系 往往也是 产 生 o h 的 体 系。 h a lliw e ll l17 还 认 为 只 要 体内 存 在 足 够 浓 度 游 离 铁( 不 与 蛋白 质 及其它大分 子 键合) ， 则肯定 有显著的 o h由h 2 0 2 而生 成。 此外， 一定的 鳌 合试 剂会使 反应 发生， e d t a能使h a r b e r - w e ir s 反 应 进行 簇 衬 r 快。 1 . 2 . 2 h 2 0 2 的紫 外分 解体系 产 生经自 由 基1 8 1 水 受到电 离辐射和 过氧化氢受到紫夕 溅照射， 也会产 生 o h h 2 0 - - * e 二 一h . o h - , h 2 0 2 , h 2 , h + , - o h ( 1 - 5 ) 自由j 的钊 充 刀 日 比暇 化 制 的月 开 究 匀 .6 犯 用 中 洲 片 习 吮学, ; 目 创 七 门 卜a 匕 勺 仑 j 忆 e 二 一 + n 2 0 - 0 n z + o h - + .o h( 1 - 6 ) h z 口 2 十 加一 二 丝 竺 娜-o h( 1 - 乃 1 . 2. 3 t. h 2 0 2 就和 经自由基。 自由基: 非 f e n t o n 体系中 生成经自 由 基11 9 1 m. f l o re n e 2 0 1发现， 在 缺 氧 条 件 下， 只 要 有 合 适的 催化 剂 存 在， g s h( 谷耽甘肚过氧化物酶) 及其他的生物还原剂反应而产生 如配体n a d h在不同的 催化剂作用下，和姚仇反应可产生经 n a d h 十 2 h 2 0 2 + e 十 一 -卜n a d+2 h 2 0 + 2 o h ( 1 - 8 ) 而c u 叮 ) 的1 o- 一 菲 琳 配 合 物 能 有 效 地 催 化g s h - h 2 0 2 反 应 生 成 o h ， 且 发生这种反应根本不涉及到q 自 由 基和h a n b e r - w e i s s 反应。 1 . 2 . 4 含琉基的 有机物产生经自由 基 n o r i k o m o t o h a s h i l l等通过 水 杨酸的 经基化， 以 鉴定 各种 琉基化合 物在不同 体系中 产生经自 由 基的 情况 ，并观察了e p r 信号，结果发 现在一定 浓 度h y p - x o d - f e 3 + e d t a体 系 中 ，硫 酸如 半 胧 胺、 半 耽 氨 酬可 促 进 水 杨酸经基化，即加快经自由基的生成。 其中 研究最广泛的是f e n t o n 反应型体系，我们在此基础上发展了 过渡 金属 元素的 低价态 离 子催化玩伍产生 o h 。 这样的 金属被我 们证实有: c u + , c o t + . c r , 十 、 s n 2 半 、 7 , 3 等 ， 反 应 式 为: m + + h 2 0 2 一. o h + o h - + m + ( 1 - 9 ) ， . 3 翔自由 基的危害网 : 经自由基以及与之紧密相关的超氧阴离子自由基能够对人体及人们 的生活产生巨大危害。 当 它们与 生物体内 的 脂类作用时， 就很容易发 牛脂 质过 氧化反 应， 从 而影响细胞膜的功能， 如通透性增强、 线粒体膨胀、 溶酶体酶的 释放及酶 的失活等损伤。 自 由蕊 的 侧 充 之 几 出 七 月 氏 下 忆 -p i 的月 开 习 匕 匀 i 妞 j 月3 中 洲 甘 -4 1 学 石 口 士 门 卜 月 七 翻 e zl 忆 在脂质过氧化过 程中 还会产生其它有害的自 由 基和对 人体有毒的 醛类物质， 这些都会给 人体带来多方面的 病变。 产生的 脂质过氧 化物可以 破坏有关的 细胞， 使局部组织受损， 若这些物质逸出 细胞， 还可使血清过 氧 化脂质水平提高， 使末稍组织受害， 并通过 肢褐素的 生成使细 胞老 化， 引 起人体衰老、 肿瘤 形成。自 由 基还可使蛋白 质 受到 损害. 如 经自 由 基可 使蛋白 质分 子中的 肤 键， 蒲氨酸、 赖氨酸等 受到 影响。 经自 由 基还可 使许 多酶失活。 从而使人 体内 许多有机反应难于 进行。 另 外经自 由 基还可破坏 核酸， 产生 严重 后果。 如d n a的 变异就与 超氧阴 离 子自 由 基和 代 谢产 物 过氧化氢作用成的经自由基有关。 在神经系 统方面，由 于自 由 基的 作用， 发生脂 质过氧化， 生成过多 不饱和脂肪酸， 这是老年性痴呆症的 致病因 素。 帕金森氏 病症也是由 体内 代谢产物过氧 化氢反 应 所产生的 具 有才 e 搔 损伤作用的 经自 由 基， 从而引 起 神 经 元 受损而 导 致的 23 1 。 如图1 - 1 . w 图1 - 1 :自由 甚与人体病变 另 外 众人 所 惧泊 的 癌 症、 肿 瘤 均和 体内 活 性 氧自 由 基 r a t代 谢 平 衡 失 调有关 ( 见图1 - 2 ) . 自由蕊 的 侧 充 2 几 东 忆 权 1 七 剑 的月 开 究 二 s 匕 用a 中 洲 片 口 气 学 硕 创 七 门 卜 9 七 今 仑 j 忆 图1 一 体内自由基的产生途径 ， . 4 轻自由 基与衰老 衰老是一个正常而又十分复杂的生物学现象， 为了阐明其 本质， 揭示 其内 在的 规 律， 人 们已 进 行了 长 期的 研 究， 并 提出 了 种 种 学 说， i 1 2 t rll 3 ri i3 于1 9 5 6 年提出了 衰老的自 由 基学 说， 该学 说 认为 经自 由 基可以 促但 组 旨 褐素 的生成， 从而使细胞老化， 进而引 起人体衰老和肿瘤的 形成. 但体内自 由 基的御防 能力是随着年龄增长而逐渐减弱的，这样自由基的损害作用随年 龄增大而加剧。因此生物体内的自由 基反应是引起衰老的重要原因。 科学认为人的衰老与体内自 由 基对机体的损害、 脂质过氧化物的 形 成及免疫功能阳氏 等有关。自由 基作 为未形成大分子的小分子基团， 他有 极强的 参与 络合进人大分 子的 趋向。当自 由 基 在体内 积累 过剩且不 能被自 由 基清除系 统中 和清除时， 就育 团 秀 刻 旨 质过氧化等一系列损害机体的反应， 导致衰老及相关疾病的发生。 衰 老的自 由 基学说的提出， 立即引 起了 人们的 重视。 经过四十多年的 研究， 累积了大量资料， 越来越多的实验事实证明了 其科学性。 现已知，在正常情况下， 体内就经常产生超氧阴离子自由基反应。 关 . 由苍 的 浏 只 及 执 月 氏 唯 匕 翎 目 的 互 开 究 匀 6 匕 用5 中 洲 片目 悦学 , a 巨 创 七月 卜9 匕今 仑j 忆 于 这些自 由 基和自 由 基反应 与衰 老的 关系， 州门 进行了 很多 研究， 州门 发 现，随着年龄的 增长超氧化物阴离子自 由 基产生增多， 脂质过氧化自 由 基 反应增强， 超氧 化物 歧化酶、 谷肤甘肚过氧 化物酶活 性降低及 维 生素c . 维生素e 含量降低等， 这些实验都为衰老的自由 基学说提供了 依据。 脂褐素是可靠而又明 显的 衰老 标志， 因 为它在细 胞内 含 量随 年 龄增长 而增多， 二者呈函数关系， 实验表明， 脂褐素的生成涉及脂质过氧化反应， 而经自 由 基又是产生脂质过氧化反应的直接原因，因 而经自由 基是形成月 旨 褐素的重要原因。 由于实验条件和理论水平的限制， 人们尚不能完全揭示衰老的内 在规 律， 但是衰 老与自 由 基关系的 揭示是人 类在衰老问 题认识 上的巨 大进步， 它为 延缓人 类衰老提供了 新的 思路与 发展方向。 因 此， 对经自 由 基进行广 泛而又深入的研究是十分; l 要而又迫切的。 1 . 5 轻自由基的测定方法 由 于 o h的 反 应活性大， 寿 命短， 存在浓度低， 其 本身 很难单 独稳 定 存在， 只 能以 相 x 定论之，因 此， 其 冠 颇 1 方法 也 就受到 一定的 约 束。 所以 在有关 o h的 研究中， 其分析测试 方法显得特别重要， 主 要 方法如 下: 1 . 5 . 1 电 子自 旋共振法 电 子自 旋 共 振 法 (e s r ) 或 电 剥匝 磁 共 振 a n ( e p r ) 是1 9 4 5 年 发 展 起 来 的，可 用于 检测和 研究具有未成对电 子的 化合物。 e s r的主 要 研究对象是含 有未成对电子的自由基与过渡金属离子及其化合物。自 旋捕集 ( s p in t ra p p in g ) 技 术 的 建立 ， 为 化 学 反 应中 的自 由 基中 间 体 和 生 命 过 程中 的 短 寿 命自 由 基的e s r 检 测 开 辟了 新的 途 径 pq。 此 方 法 是 利 用 捕 集 剂 与 短 寿 命自 由 基结合生成相对 稳定的自 由 基， 即自 旋加合物， 然后 进行e s r 检 测，由 于自 旋加合物的 寿 命仍 然很短， 只有几分 钟或 者几十 分钟， 因 此必 须在 捕集自 由 基后立即 进行e s r 测量， 从而限 制了 许多 实验 研究。 从建 波 等 2 n 采 用 液 氮 ( 7 7k ) f* 存 o h和o s 与 捕 获 剂 形 成 的自 旋 加 和 物 ，延 长 了自 旋加 合物的 寿 命结果表明 ， 在低温下 储存 3 - 4天后泊旋加 合物的 浓度基 本 不变。 p o u 等 a l用紫 夕 哦照 射玩仇产 生 o h， o h 与c h ,c h ,o h 反应 后 产 生 自 由蕊 的 浏 大 及 李 七 月 氏 下 匕 去 日 的 月 开 口 匕 匀 石 匕 用6 中 洲 片 -4 . 叨城口d 七 月 卜 a 匕 今 仑 j 忆 c h 3c h - o h ， 再用a - ( 4 一 毗陡基一 1 一 氧化物) - n 一 叔丁基硝酸灵捕获c h 3c h - o h , e s r 测定自 旋加 合物。 该方法可用于 生物体内。 o h的 检 钡 业 。 该方法真实可靠准确， 是目 前唯一直接测定自 由 基的方法。 但所用 仪器复杂昂贵， 使之推广受到限制， 可用作验证实验。 1 . 5 . 2 高效液相色谱法 高 效液相色 谱法 ( h p l c ) 测定自 由 基， 在分离 检测前 需先用捕获 剂捕 集自 由 基，因此捕获剂不但能捕获所需测定的自 由 基， 反应产物具有一定 的 稳定性， 还要有利于h p l c 分离和检 钡 1 。 如用荧光检测时其灵敏度比 用紫 外可 见光 检测时 要高的 多， 但要求捕获自 由 基后的 生成物具 有荧光 性质。 r a 。 等(7 9 1用二甲 亚矾 ( d m s o ) 作捕获 剂， 与 o h作用生成甲 基亚 磺酸。 r a d i c a l - p a k c , 9 柱， % 5 甲 醇作流动相分离， 2 1 4 n m 检测。 检出 限为2 0 0 n g . 该法已用于新鲜肝血和冰冻心肌粉末中 o h的测定。 k a u r 等， ， ，用苯丙氨酸 捕获 o h生成酪 氨酸。 n u c l e o s i l c , 柱， 含1 0 % 甲 醇的 5 0 0 mmo l / l k h , p o h , p o , 缓冲液 ( p h为 3 ) 作流动相分离， 2 7 4 n m 检 钡 1 。 a l t e x l l l t r a s p e r e 131，采 用o d s 柱 ， 含 醋 酸 钠 和 柠 檬 酸 的 缓 冲 液 作 流 动 相， m o d e 1 4 6 0 电 化学检测仪， a g / a g c l 作参比 电 极， 在0 . 6 v 检测。 高效液相色谱电 化学检测法 ( l c e c ) ， 以 其特异性， 灵敏 度高， 方法 简 便， 现已 成 为 替 代e s r 检 钡 1 . o h 的 主 要 方 法 之 一。 但其 仪 器 较 贵， 普 及 率不高。 1 . 5 . 3 化学发光法 与电 子自 旋共振法和高效液相色谱法两 种方 法相比， 化学发光法操作 简 单， 不需昂 贵设备， 测定快速。 陈秀 武等132 1用 酵母扩增 ( 经自 由 基 攻击 酵 母， 从酵母壁中 获得电 子，同时 伴随 化 学发光) 化学发 光法 测定抗坏血 醛- 此自 由 基再将一个 氢 原子给 予另夕 卜 一 个自 由 基 ( l) 使之 又变为分子 ( l h ) ，同时， 生育酚的 自 由 基贝 j 变为生育醒。 也就是说， 维生素e 先与自 由 基作用生成中间 产物 a 一 生育酚自 由 基， 再继续与自 由 基作用 生成a 一 生育酿. 因 此， 在这个过 程中， 一个生育酚分子可以清除两个自 由基。另外，生育酚的自由 基又可 被琉基化合物还原; 尤其是能被谷胧甘肚 ( g s h ) 再还原为生育酚。 这样， 自 由 蕊 的 侧 州 匕 刀日比报 化 制 的 月 开 究 匀 石 匡 用 中 洲 片j 悦哪 ir 咬d 七 月 卜月 七今 仑岁 忆 则可使 生育酚 更有 效地发 挥其作用。 而还 原型 谷肤甘 肤 ( g s h ) 与过氧化 物、自 由 基等物 质反应后， 常形成氧化型 谷肤甘肤 ( g s s g ) 。 在谷肤甘肤 还原酶作可使氧化型谷肤甘肤 ( g s s g ) 变成还原型谷肤甘 肤 ( g s h )用 1 . 6 . 3 维生素c( 抗坏血酸) 维生素 c( 抗坏血酸) 也是一种很重要的自 由 基清除 剂。 其作用机制 与维生素e 的 清除 机理， 3 1_4似， 反应如下; lh ho ho 议 。 ho h o h h o h 抗 坏 血 酸 h 2 0h nao h (半 脱 氧 抗 坏 血 酸 ) h 2 0h 抗 坏 血 吸 自 由 基 llh 巨价。 g ssg 2g sh 脱 氢 抗 坏 血 酸 还 原 酶 脱 二 、 坏 血 ， ) h o h h 2 0h 图1 - 4维 生 素 c清 除 自由基 的机 理 维生素c还可使维生素e恢复其原型， 继续发挥清除作用。 而维 生素c则变为 维生素c自 由 基: 维生素c自 由 基 在酶的 作用 下， 又可依 赖 于n a d h的 氧 化 还 原 系 统 还 原 成 维 生 素c 。 白 令 君 等 4 4 】利 用自 旋 捕 捉 - e s r 方法研究医 用维生素c 注射液( v c ) 对经自 由 基的 清除作用时 发现， 当v c 浓度较高时出现非常复杂的谱图， 估计这是过氧化氢 将v c 氧化所至。 研究，捕捉到该氧化过程中产生的多种自由 自 由 蕊 的 刹 充 2 几 立 允 匀 氏 下 匕 刻 的 月 开 兜 ju a 匕 j 目 中 洲 片 a 学喊咬 t 七 月 卜 9 匕 今 仑 j 忆 基。 特异性清除剂是指那些对某一种自 由 基有清除 作用， 对其他自 由 基 的清除作用则相对较弱或无清除作用。 如d 一 甘露醇和苯甲 酸对轻自 由 基有 清除作用， 而对其他氧自 由基贝 抚清除作用， 这常被用来证明经自 由 基的 存在。 1 . . 4来源于食 用植物的自 由 基清除 剂 我们日 常生活中某些食品对自由基也有清除作用。如核桃、黄豆、生 姜、 大 蒜、 黑芝麻、 辣椒等等。中 医中 所用的 食物疗法， 其作用机理就由 此可以 得到 很好的 证明。 这也是 食品 工业加工食疗食品的 科学依据。 具有抗氧化作用的物质举不胜举， 人类生活的周围， 包括自 身， 都存 在 着自 由 基及自 由 基抑制剂， 通常 其反应达到 一种动态 平衡。 一旦平衡 遭 道破坏， 人将生病、 食物将易变质、 物质将 被氧化。因 此， 建立一个自由 基的良 性平衡可提高人们的生活水平与质量。 随 着研究的 深人， 州门 已 经发现了 许许多多清除轻自 由 基的 抗氧化剂。 典型的 有维生素e( 生育酚) ， 它能够清除 超氧化物阴离子自 由 基， 单线态 分子 氧， 脂质 过氧自 由 基及其它自 由 基; 而 维生素c 则可使维生素e 恢复 其 原型， 继续发 挥清除自 由 基的 作用。 它 们的 作用规律者 畴到了 深刻揭 示， 连同 其他许许 多多 抗氧化化剂一起， 将对 卫 生保 健医 疗事 业作出巨 大的 贡 献。 ， . 7 1 . 7 . 1 抗妞化荆研究 食物变质与氧化的 关系a s h 食品、 药物在贮存、 生产期间 所发生的 化学变化比 较复杂， 其中以 氧 化作用最为广泛，氧化是导致食品 变质的重要因 素之甲， 特别提 岁 寸 于油脂 或 含油 较 多的 食品 来 说 更是如 此。 油 脂 是 人 类 膳 食中 的 基 础营 养 之 ， 不 论是食用油脂还 是含油脂食 物， 在其生 产， 加工、 贮藏和使用过程中 都会 以 各种方式发生反应而逐渐被破坏变 质， 从而 影响 其营养 价值 及口 感、 风 味， 甚至产生有害健康的 物质。 氧化除了 可使食品中 油 脂酸败外， 还会使 食品 发生褪色、 褐变、 维生素破坏从而 降 低食品 质量和营 养价 值， 甚至还 能产生某些有害物质，引起食物中毒。 自 由月 的 刹 洲 匕 2 几 鱿 暇 化 刻 自 勺 月 牙 兜 j 百 月 u 明 中京 大 学 硕 t 卜 毖 七 今 仑 j 忆 一，户 油脂在 通常的 环境下会自 动发生水解和氧化反应而逐渐破坏 变质， 尤 其以氧化为甚。氧化首先发生在甘三脂的双键和。 碳位， 脂肪酸基团的 。 碳失去氢离子而形 绷旨 肪自 由 基r ， 此自 由 基是甘油脂的不稳定形式， 对氧化反应活跃， 很容易生成过氧化物自由 基r o o和氢过氧化物， 从而 迅速分解成 短 链的 有机化合物， 最终氧化成引 起油 脂失去 原有风 殊和营 养 价值， 引 起变色， 造成难以 接受的 气味和口 感， 甚至产生 有毒物质， 此自 氧化 过程能为热和 光 及某 些金属离 子所催 化加速，因 此win 储存过程 应尽 量避免高温、 光照及杂质的渗人。 1 . 7 . 2 氧化与抗氧化机理 1 . 7 . 2 . 1 氧化过程 食品的氧化变质主要是含油食品中的 脂肪、 油脂受到空气中 氧的作 用， 其反 应可 分 为 三 个阶 段， 属 于 游 离 基 链反 应 r46 1 引发r h+ 0 2 能皿 ( 光 r- + 口万 ( 游肉基) ( 1 - 1 0 ) 链传播r. + 0 2 -r o 2 ( 1 一 1 1 ) 1)2) /.、了矛、 r 0 , . ( 3 ) 链终止r02 . + r h - r o o h + r ( 1 一 1 2 ) + r 0 , .- r o o r + o , ( 1 一 1 3 ) r 0 2 .+ r.- r o o r ( 1 一 1 4 ) r .+ r .- r - 获 ( 1 一 1 5 ) r h 为油脂中 不饱和脂肪酸， h 为不饱和双键亚甲 基中 最活泼的 氢原子。 事 实表明， 若有 光、 热、 水、 过度金属离子等因 素存在时， 可 加速 此过程的 发生和发展。 通 过能量和机理分析及实验 研究 认为 过度金属离子引发tu里 ， ，如 下 r h + 1v 1 3 +- 一 一 卜r 十 h + + m 2 + ( 1 一 1 6 ) 自 由j 的 制 充 2 几 拿 忆 取 化 制 的 月 开 究 与 消 匕 用 中 洲 片 目 悦哪, r , 峨 d 七 月 卜 习 七 和 仑 j 忆 r o o h + m2 +r o 十 o h 十 m3 + ( 1 一 1 7 ) r o o h + m3 + r o o 十 十 耐+( 1 - 1 8 ) m 表示过度金属离子。随着氧化反应的 进行， 过氧化物不断生成， 又 不断产生 新的 游离基， 过氧化物自 由 基r o o 使不 饱和 键- c = c 一 变成 更活 泼的 一 c o - c o - ， 从而又促使其他不饱和键氧 化。 链终止 后生成的 产物主 要为 氢过氧化物， 其次为氧化物， 二者并无异味。 氧 化 产物进一步分解产生醛、 酮和 其他小分 子化合物， 从而 产生不愉快 气味的 气体。 1 . 7 . 2 . 2 苹 氧 化 机 理 48 1 抗氧 化剂的 作用就是提供个氢 原子 结合自 由 基形成稳定结 构， 代替 了 作为 供氢 体的 油脂分子， 抗氧化剂也同 样能 结 束油脂分 子自 身氧 化的 连 锁反 应， 所以 推迟了 油脂的 氧化酸 败， 直 至抗氧 化剂能提供的氢原 子消 耗 殆尽为 止。 一般常用的 抗氧化剂为 酚类物质。 r oo- r - - - rooh + 厂 , 、一， r 一n k 一u l -ui , . c 一 r 0.|、 生成的抗氧化剂自由 基由 于可形成 酉 il 式 结构， 通过分子内 部的电 子 共振而重新刹 例 。 呈现比 较稳定的 新构型。 酉 t 式 自 由 基不具 有夺取油脂中 氢原子的 能 力， 系 稳定 产物。 此类供氢原 子的 抗氧 化 剂并不能起到抗氧化 的 作用， 而 且也不能使已 酸败的 油 a m 复原 状，因 此必须 是在油 脂未发 生 氧化或刚开始氧化时加人才有效。 1 . 7 . 3 抗氧化剂种类 理想的抗氧化剂必须是无毒或毒性小， 不影响食品的色香味，微量 即 有抗氧化作用， 性质稳定， 对热稳定， 无挥发性， 溶解性好， 并容易制 得的 物 质。 抗氧化剂 按来源可将其分为 天然的 抗氧 化 剂和 人工合成的 抗氧 化剂: 按溶解性可分为 油溶性的 抗氧化剂和 水溶 性的 抗氧化剂。 油溶性的抗氧化剂能均匀地分布于油脂中， 对油脂或含油月 旨 的食物可 以 t穿 的发挥其抗氧化作用。 我国 允宝 拍 吏 用的油 溶性抗氧化剂有人 工合成 自 由月 的钊 31 匕 刀 口 比从化 刻 的 r 开 习 匕 匀 应 用i s 申 洲 片 -k . 攀, ; 咬7 七内 卜月 七 今 仑另 七 品， 如特丁基 户 卜 经基茵香醚 ( b h a ) , 2 , 6 - 二特丁基对甲 酚 ( b h t ) 、 没 食子酸丙a r ( p g ) 、 叔丁基对苯 三酸( t b h q ) , 2 , 4 , 三9基 苯丁 酮( t h b p ) 等， 还有天然的 油溶性抗氧化剂， 如愈疮树脂、生育酚混合浓缩物。 水溶性 抗氧化剂是能 溶于 水的 一类抗氧化剂物质， 多用于 保护 食品的 颜色，防止氧f ib 退 色以 及防 止因 氧化二降低食品的风味和质量， 如抗坏血 酸及钠盐。 1 . 7 . 4 抗氧化剂测定方法 由 于 抗氧 化剂种 类较多， 且各种 抗氧化剂的 性 质不同，因 此测定的 方法也不同， 现介绍几种抗氧化剂的测定方法如下: ( 1 ) b h a 与b h t 的 分 离 测 定 ， 9 ;样品 经 石 油醚 提 取 后， 通 过 硅 胶柱 层 使b h a与b h t 分离。 b h a与2 , 6 . 二氯 酿抓亚 胺. 硼 砂溶液 生成一 种稳定 的 兰色化 合物。 b h t与a , a 联毗陡 抓 化铁溶液 生成 橘红色 物质， 分 别进 行比色测定。 ( 2 )没 食 子 酸 丙 脂( p g ) 的 测 定 方 法 5 0 ;样 品 经 石 油 醚 溶 解， 用乙 酸 钱水溶液提取后， 没食子酸丙脂 ( p g ) 与亚铁酒石酸盐 起颜色反应， 可在 波长5 4 0 n m处测定吸 光度。 ( 3 )维生 素e的 测 定方 法 ， q ; 维 生素e 正己 烷 溶液 在2 9 5 n m激发， 在3 2 0 n m发出 荧光， 测定其 荧光 强度， 与标准 维生素e 荧光 强度对照， 可 求得维生素的含量。 ( 4 )山 梨 酸 、 苯甲 酸 的 测 定 15 2 1 ;用乙 醚 提 取 浓 缩 后， 用 富 氢 火 焰 离 子 化检测器的气相色 h 义 进 行分离测定。 ( 5 )抗 坏 血 酸( 维 生 素c ) 的 测 澎5 3 1 ; 用 酸 处 理 过的 活 性 炭 把 还 原 型 抗 坏血酸氧化为脱氢型抗坏血酸， 再继续氧化为二酮古乐糖酸。 二酮古乐糖 酸与 2 , 4 ， 二硝基脐 偶联生成红色的 膝。 其呈色的 强度与 二酮古 乐糖 酸浓 度成正比， 从而进行比 色测 定， 此夕 随有许多间 接测 定等。 虽然 各种抗氧 化 剂的 测定方法有很多， 但由 于 各 抗氧化剂的 种类不 同 且溶解的性质也不同， 如b h a , b h t , p g 、 维生素e 在水中 与在油中 的 测定方法不同导致了 各种抗氧化 剂测定的复杂性。 我们在研究中 发现导 致食品、 药 物氧 化的 主 要原因 是自 由 基的 作用，由 此提出 通过 对自 由 基的 测定及抗氧化剂抑制自 由 基的测定来达到测定抗氧化剂的目 的。 实验表明， 此法有简便、 .阳麦 、 对仪器要求低且 水溶液和油溶液均适合。 采用通常的 自 由j 的 铡 充 1 几 李 允 暇 化 剑 的 月 牙 国 匕 iv i y j 月 中 洲 片 吮.举 气 区 创 七 月 卜习 七