（分析化学专业论文）苹果多酚的高效液相色谱检测方法的建立.pdf

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- p e r f o r m a n c e1 i q u i dc h r o m a t o g r a p h yi n t h i sp a p e r a c c o r d i n gt ot h ed i v e r s i t yb e t w e e nt h en e u t r a lp h e n o l i c c o m p o u n d sa n dt h ea c i dp o l y p h e n o l s ，t h e ya r es e p a r a t e dw i t hd i f f e r e n t m o b i l ep h a s e ，a td i f f e r e n tc o l u m nt e m p e r a t u r ea n dd i f f e r e n tw a v e l e n g t h o fd e t e c t o r a f t e ro p t i m i z i n gt h ec h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n so ft h e p h e n o l i cs t a n d a r d s ( n a m e l ys e v e nn e u t r a lp h e n o l i cc o m p o u n d sa n dt w o p h e n o li ca c i d s ) ，t h ec h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o nw a sc a r r i e do u tu s i n g m o b i l ep h a s em e t h a n o la ss o l v e n taa n d2 m mp h o s p h o r i ca c i da ss o l v e n tb o nc l 。c o l u m n t h ea p p l e sw e r ed i v i d e di n t ot h r e ep a r t so ft h es k i n ，p u l p a n dc o r ea c c o r d i n gt ot h eh u m a ne d i b l eh a b i t i no r d e rt oa v o i de x t r a c t i n g t h ec a r b o h y d r a t ei na p p l e s ，p o l y p h e n o l si na p p l es a m p l e sw e r ee x t r a c t e d b ye t h y l a c e t a t e p h e n o l i ca c i d sw e r ee x t r a c t e da tp h22b ye t h y l a c e t a t e a n dn e u t r a lp h e n o l i cc o m p o u n d sw e r ee x t r a c t e da tp h = 7f r o mt h e i rs o l u t i o n t h ec o n t e n t so fp o l y p h e n o l si nf u j ia p p l e sa n di nx i a o g u o g u a n ga p p l e sw e r e d e t e r m i n e db yt h i sh p l cm e t h o d t h er e s u l tw i l lb eh e l p f u lt oe m p o l d e r t h ea p p l e s t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w i n g ： 1 f o rn e u t r a lp h e n 0 1 i c s 。t h eg r a d i e n ti sas e q u e n c eo fl i n e a ri n c r e m e n t s ： s t a r t i n gw i t h 一2 m e t h a n o lt or e a c h6 0 i n6 0m i n u t e s a n d2 m mp h o s p h o r i c a c i dw a sc h a n g e df r o m9 8 t o4 0 a na d d i t i o n a lf l o wr a t eg r a d i e n tw a s i n c l u d e dt oa c h i e v et h eb e t t e rs e p a r a t i o ne f f e c t s aw a v e l e n g t ho f 入 = 2 8 0 n mw a su s e df o rt h ed e t e c t o r 2 p h e n o l i ca c i d sw e r ea n a l y s e di ni s o c r a t i cm o d e ，a ti o m l m i n ，u s i n g 7 0 m e t h a n o la n d3 0 2 m mp h o s p h o r i ca c i da st h em o b i l ep h a s e t h ec o l u m n t e m p e r a t u r ew a s2 5 c ，p h e n o l i ca c i d sw e r eq u a n t i f i e da t3 2 0 n m r e s o l u t i o n w a s2 5 3 t h ed e t e c t i o nl i m i tw e r e0 0 2 2 一o 0 7 2ug ，t h er e c o v e r yr a t ew e r ea l i 3 山东大学硕士学位论文 a b o v e9 0 ，t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o nw e r e1 1 一2 4 ，w h i c h s u g g e s t e dt h a tt h em e t h o disa c c u r a t e 4 t h ek i n do fa p p l ep o l y p h e n o l si nf u j ia p p l ei sd i f f e r e n tf r o mt h a to f x i a o g u o g u a n g t h ec o n t e n t so f e a c h k i n do fa p p l ep o l y p h e n o l sa r e d i f f e r e n t t h e r ea r e ( 一) 一e p i c a t e c h i n ，( + ) 一c a t e c h i n ，p r o c y a n i d i nb ， p h l o r i d z i n ，c h l o r o g e n i ca c i d ，p - c o u m a r i ca c i da n dp h l o r e t i ni nt h ep u l p a n dt h ec o r e t h ec o n t e n t so fn e u t r a lp h e n o l i cc o m p o u n d si ns k i na r e m o r et h a nt h a ti np u l p sa n dc o r e b u tt h ec o n t e n t so fp h e n o li ca c i d s i nc o r ea r em o r et h a nt h a ti ns k i na n dp u l p r u t i na n dq u e r c e t r i nw e r e n o td e t e c t e di nt h ep u l pa n dt h ec o r eo ft h ex i a o g u o g u a n ga p p l e t h e c o n t e n to fn e u t r a lp h e n o l i cc o m p o u n d si st h el a r g e s ti ns k i ni nf u j i a p p l ea n dt h ec o n t e n to fp h e n o l i ca c i d si st h em o s ti nc o r e r u t i nw a s n o td e t e c t e di nt h ec o r e ，r u t i na n dq u e r c e t r i nw e r en o td e t e c t e di nt h e p u l pa n dt h es k i no ft h ef u j ia p p l e i nt h es k i n ，t h ec o n t e n t so fp o l y p h e n o l si nx i a o g u o g u a n ga r em o r et h a n t h a ti n f u j ia p p l e t h e c o n t e n t so f ( + ) 一c a t e c h i ni n p u l p o f x i a o g u o g u a n gi sl e s st h a nt h a ti nf u j i t h ec o n t e n t so fn e u t r a lp h e n o l i c c o m p o u n d si nc o r eo fx i a o g u a n g g u a n gi sa l m o s ta sm u c ha st h a ti nf u j i k e yw o r d s ：a p p l e ：p h e n o li cc o m p o u n d ：h p l c 4 山东火学硕士学位论文 1 引言 1 1 植物多酚概述 。 1 1 1 植物多酚的定义及在自然界中的分布 多酚类化合物是指具有苯环并结合有多个羟基的化合物的总称。多酚类 化合物有不同的分类方法。按照聚合度的不同，多酚可分为两大类，一类是多酚 的单体，即非聚合物，包括简单酚类化合物、各种黄酮类化合物、酚酸、羟基肉 桂酸等，也包括一些接有糖苷基的复合类多酚化合物，如芸香苷等。另一类则是 由单体聚合而成的低聚或多聚体，统称为单宁类物质，包括缩合型单宁中的花色 素原和加水分解型单宁中的没食子单宁等。其中黄酮类化合物又可分为黄酮类、 黄酮醇类、黄烷酮醇类、黄烷酮类、黄烷醇类、花色苷类、查耳酮类及其衍生物 等：按照酸碱性的不同，多酚又可分为酸性酚和中性酚“。 植物多酚是一大类广泛存在于植物体内的复杂的多元酚类化合物。许多水果 如苹果、葡萄、柑橘、樱桃、桃、李、杏、醋栗、草莓等都含有一定量的多酚物 质。其中，简单酚类物质含量较少，主要包括儿茶酚、对苯二酚、间苯二酚 等。酚酸类物质如对羟基苯甲酸等在水果中分布广泛。羟基肉桂酸类物质在各种 水果中也广泛存在，并且是含量最多的酚类物质之一，主要包括阿魏酸、芥子酸、 香豆酸和咖啡酸等”，但它们通常与奎尼酸、葡萄糖或酒石酸相结合，以酯的 形式存在”，例如水果中最重要的肉桂酸类衍生物绿原酸，即是由咖啡酸 与奎尼酸缩合形成的酯。其它重要的酚类衍生物还包括香豆酰酒石酸、咖啡酰酒 石酸等。黄酮类化合物是水果中分布最为广泛的多酚类物质，其中，分布较广、 含量较多的主要有黄烷醇类、黄酮醇类和花色苷类等“。 水果中多酚物质的组成十分复杂，各种多酚物质在不同种类水果中的分布与 含量存在着很大差异，每种水果在多酚的组成与含量上都具有各自的特征。 肉桂酸类是柑橘中主要的酚类组分；花色苷则是樱桃和红葡萄中主要的酚类 物质旧；梨中绿原酸和表儿茶素的含量较高“”；而李子、杏、桃子中则含有 大量的山奈素和槲皮素糖苷：黄烷酮和黄酮是柑橘中含量最多的黄酮类化合 物“，而在其它水果中却不太常见或含量很少。此外，许多水果中还含有自己 特征性的多酚物质，如酒石酸与肉桂酸形成的酯是葡萄的特征性物质：根皮苷是 苹果的特征性物质”“：桃中的杨梅酮和芹菜素葡糖苷等都是其它水果中所不存 山东大学硕士学位论文 在的。 同一种类的水果中，多酚物质的组成及含量也因品种、生长条件、成熟度及 贮藏条件和时间的不同而存在着较大差异。如红葡萄中的多酚含量( 以没食子酸 计，平均为5 6 3 1m g k g ) 比白葡萄中的多酚含量( 平均3 8 9 3m g k g ) 要高得多“， 红葡萄中含量最多的酚类物质是花色素类，而在白葡萄中却为黄酮醇类“”。同 为越橘属植物的果实，欧洲越橘，笃斯越橘和蔓越橘中主要的酚类物质为花色素 类，而牛浆果中则为黄酮醇类和原花青类。 关于水果中多酚物质在果实发育及贮藏过程中的变化己有较多的研究。在对 苹果和梨发育过程中儿茶素类和羟基肉桂酸衍生物的变化的研究中发现，这些物 质是在果实发育早期形成的，但在果实的快速生长过程中含量急剧下降，直至果 实成熟“。有研究结果证实在葡萄发育过程中也存在类似的变化“”。通过研 究发现随着果实的成熟，草莓、树莓中酚类物质含量也有很大变化“。 即使是同一水果，不同组织中多酚的组成和含量也不相同。在葡萄果实中， 大部分的酚类物质存在于果皮和种子中，红葡萄中的比例为6 3 和3 3 ，白葡萄中 为7 1 和2 3 ，果汁中大约为2 5 。在葡萄的果皮、果浆和种子中，多酚成分特 别是花色苷在三个区域差别很大，葡萄果皮中的多酚主要为花色素类、黄酮及白 黎芦醇等，种子中主要为儿茶素类、槲皮苷、原花青素、单宁等，而果汁中主要 为花色素和酚酸类“。 1 1 2 植物多酚的基本结构 植物多酚的基本结构最早是在5 0 年前由德国化学家g a i s m a n 和h i n l a i n a 提出 的。首先提出了黄烷的基本结构，见图l 中的( 1 ) 。其结构是由黄烷核( 吡喃环， 用“c ”表示) 为中心结合有二个苯环( 用“a ”、“b j ，表示) 所组成的。在a 环或b 环之一上，因结合有多个羟基，所以又称为酚类或多酚类。凡c 环2 ，3 位是单键的 为无色物，是双键的皆呈黄色。在c 环4 位上有酮基的称为酮，又因c 环2 ，3 位是双 键呈黄色，所以称黄酮，见图1 中的( 2 ) 。这种由c 6 - c 3 - c 6 基本构架所组成的 一类化合物，统称为黄酮类化合物。除花色素外，在c 环3 位上有羟基的，称为醇， 如黄酮醇，见图1 中的( 4 ) 、( 7 ) 、( 8 ) 等。根据各环上所结合的羟基数和结 合位置、b 环的结合位置、c 环中是否有双键及c 环是否闭合等情况可分为多种物 质，如黄酮、异黄酮、黄酮醇、异黄烷酮、黄烷醇、黄烷酮醇、查尔酮等，见图 6 山东火学硕士学位论文 1 。由于结构上的不同，它们的生物化学特性和生理功能也各不相同。 ：拶；嘴。啭啦妒嗨b ( 1 ) 黄烷( 2 ) 黄酮 ( t ) 黄烷醇 她国固啦罐 占 ( 】o ；花烷= 薛( 1 1 ) ：尔酮 图l黄酮类化合物的基本结构 1 1 3 植物多酚的生物活性及应用 1 1 3 1 植物多酚的生物活性 多酚类化合物是优良的氢或中子的给予体，对能引起生物组织膜因产生过氧 化作用而导致结构和功能损伤的超氧阴离子( o ! 一) 和羟基自由基( 0 h ) 等，有明显 的清除作用，从而起到对生物组织的保护作用“。因此多酚类物质是一种非常 好的天然抗氧化剂。 自由基被认为是引起人体衰老和引发某些慢性疾病的因素之一。当人体内的 自由基产生过多或清除过慢，就会转而攻击各种细胞器官并使之受到损伤，从而 加速机体的衰老过程并诱发各种疾病。多酚可提供碎灭各种活性氧自由基所需要 的氢( h ) ，从而清除自由基，抑制过氧化作用，保护各器官的细胞膜结构。 据荷兰研究工作者对7 个国家的免疫学调查，凡黄酮类化合物摄入量多的， 患冠状动脉疾病的人和死亡率均较低“。另据调查，尿中黄酮和异黄酮含量高 的，乳癌等癌症的死亡率较低。日本人因食用大豆较欧美多，因此日本人因患冠 状动脉疾病而死亡的人的比例较低“。因此，有专家建议对果蔬、豆类消费较 少，或以方便主食为主的人群，应适当摄食多酚类物质，以预防疾病的发生。 x旺 山东大学硕士学位论文 由于多酚类物质象维生素、无机盐等一样对人体有着重要的生理保健功能， 因而将其列在第六营养素膳食纤维之后，被称之为第七类营养素他”，而且 这类物质都来自于天然植物，基本上不存在毒副作用，因此越来越受到人们的重 视。 1 1 3 2 植物多酚的应用 1 1 3 2 1 抗氧化、清除自由基 自由基是由氧化反应而产生的对身体有害的物质。自由基会破坏健康的细 胞，侵害人体内的蛋白质、酶等物质，造成人体组织器官受到破坏，加速机体的 衰老进程并诱发癌症以及心脑血管等各种疾病。多酚作为一类氧化还原电位很低 的还原剂，具有很强的供氢能力，h + 与羟基自由基( o h ) 结合，能使之还原为 惰性化合物或较稳定的自由基，从而清除体内过多的有害自由基”“。 2 0 0 0 年，科研工作者比较系统地研究了苹果多酚的抗氧化性以及清除自由基 和超氧化自由基离子能力的性质。在对b 一胡萝h 素亚油酸的抗氧化实验中发 现原花青素类和槲皮苷配糖体的抗氧化活性最强，而根皮苷的活性最低。在对 d p p h ( n ，n 一二苯基三硝基苯肼) 自由基的清除能力对比试验中发现苹果多酚中除 了根皮苷外，所有多酚的清除能力皆高于v 。和v 。它们的活性顺序依次为槲皮 苷配糖体原花青素类 绿原酸类。3 一羟基根皮苷 根皮昔。超氧化自由 基清除实验中发现低聚原花青素( 表儿茶素、三聚体、四聚体) 的活性最强，并 且所有的苹果多酚的清除能力均高于v 。和v 。“。 1 1 3 2 2 对微生物的抑制作用 以单宁为主体的多酚对微生物具有广谱抗性( 包括对丝状真菌、酵母、细菌、 病毒的抑制) 。作为次生代谢产物，多酚不仅能抵御食草动物对植物体的损害， 同时也阻止了微生物的侵袭，包括提高对各种病原菌的耐受力和保护受伤部位。 除了抑制植物致病菌外，多酚对动物体内和其它环境中多种微生物的生长都能产 生明显的抑制作用“。对细菌的最低抑制浓度范围一般在0 0 1 2 一l g l 之间， 对丝状真菌为0 5 - 2 0 9 l ，对酵母菌为2 5 1 2 5 9 l ”。除了对细菌、真菌有抑 制作用外，多酚对植物致病病毒如烟草花叶病毒、烟草坏死病毒、芜青皱叶病毒 等，动物和人的致病病毒如蛇毒、流感病毒、胞疹病毒、痘病毒、狂犬病毒等都 有一定的抑制作用。 山东大学硕：j 二学位论文 1 1 3 2 3 对酶的影响 多酚和生物大分子如蛋白质、多糖的结合特性以及与金属离子的络合特性等 化学性质使其具有多种生物活性，而这些生物活性最本质的方面体现在多酚对酶 的影响上。多酚对酶促反应的影响作用可能是几方面因素共同作用的结果“。 据报道多酚能抑制血管紧张转化酶( a c e ) 。用多酚及e g c g ( 表没食子儿茶 索没食子酸酯) 处理小白鼠，可抑制小白鼠皮肤线粒体脂氧合酶的活性和脂质过 氧化。对人工诱变致癌的研究表明，多酚还可抑制肿瘤细胞n a d p h 细胞色素还 原酶及细胞色素d 一4 5 0 活化系统的活性。以含多酚的饲料饲喂小鼠，可使肝脏 g s h s 一转换酶、s o d 超歧氧化物酸化酶以及全血中g s h p x 的活性增加幽1 。 1 1 3 2 4 抗衰老 衰老的自由基学说是d h a r m a n1 9 5 5 年提出的，在众多衰老理论中一直占 有重要位置。该学说认为，人的衰老和致病因子与机体活性氧自由基( o f r ) 有 直接关系，若这类自由基超过生理的局限，则对多聚不饱和脂肪酸、糖、蛋白质 和核酸等生物大分子产生损伤，导致细胞功能衰退及代谢紊乱，诱发多种疾病产 生。因此，过量自由基与衰老成因有直接关系”。多酚能提高人体内酶类自由 基清除剂s o d 、c a t 和g s h p x 等的活力，延缓衰老的进程。实验证实：服用多 酚的动物，平均寿命可以延长3 6 1 至4 9 9 ，多酚抗衰老效果较v 。高1 8 倍左 右。因此多酚可以用来开发抗衰老的医疗保健品。 1 1 3 2 5 抗突变及抗癌 多酚对食品或环境来源的苯并芘等致癌物的致癌性起抑制作用。最近，日本 学者进行了“苹果多酚化合物抗肿癌作用”的研究，该合作研究小组在用小鼠做 动物实验和细胞培养的验证试验中确认：苹果多酚化合物具有抑制癌细胞增殖的 有效作用。虽然，动物的细胞一旦癌化，就会不断增殖和引起各种不同脏器的疾 病，但是经移植皮肤癌细胞和乳腺癌细胞的小鼠喂食含l 苹果多酚化合物的水 溶液以后，其生存天数和肿瘤大小与不摄食苹果多酚物的对照组相比，都优于对 ， 照动物，说明了苹果多酚物具有抗癌效果”“。 1 1 3 2 6 抑制高血压、高血脂及心脑血管疾病 日本学者在研究苹果多酚对血管紧张转化酶( a c e ) 抑制活性的实验中发现： 苹果多酚中的缩合鞣质类约占总多酚的一半，且其对a c e 的抑制活性比茶多酚的 山东大学硕士学位论文 主要成分儿茶素和表儿茶素要高，可以作为有效的高血压、高血脂及心脑血管疾 病的抑制药剂“。 1 1 3 2 7 防龋齿作用 多酚具有很强的抑制龋齿菌转葡萄糖基酶的作用，从而防止牙垢的形成【33 1 。 因此，多酚对预防龋齿非常有效。苹果多酚对龋齿菌转葡萄糖基酶的抑制能力比 绿茶中的儿茶素高1 0 0 倍，其主要抗龋齿成分是苹果缩合单宁。因此可以将其作 为添加剂用于牙膏中，既有防龋齿作用又有洁齿作用。 1 1 3 2 8 治脱发作用 多酚对毛发作用方面的报道多见于日本，主要是基于它对毛囊细胞有增殖和 再生功能，有学者发现，1 的低聚原花青素类对刮过毛或毛发终止生长期的小鼠 的毛发有再生功能f 34 1 。日本协和发酵公司从苹果的提取物中制成促进头发生长 的药剂一药用毛活林p b ，对治疗脱发有特殊增殖效果，在这种物质中加入泛乙 醚及b 一甘草酸等物也有良好生发效果。 1 1 3 2 9 抑制鱼的腥臭昧，保持鱼的鲜度 鱼的腥臭味成分主要是三甲基胺。在抑臭试验中，把三甲基胺和苹果多酚混 合，用气相色谱仪测定其挥发性三甲基胺的量，结果随着苹果多酚浓度的增大， 其挥发性三甲基胺的量不断减少，当苹果多酚的含量为2 0 0ug m l 时，挥发性三 甲基胺的量减少5 0 。水产加工中，用水洗鱼时，加入2 5 0ug m l 苹果多酚，减 少约7 0 的挥发性三甲基胺【3 5 】。 1 1 3 2 1 0 抗皱作用 皱纹的产生是一个复杂的现象，从生理角度上看，主要涉及皮肤蛋白质和结 缔组织的交联和降解两类反应【3 6 l 。多酚的抗皱作用基于它能维护胶原的合成、抑 j 制弹性蛋白酶、协助机体保护胶原蛋白和改善皮肤弹性，从而避免或减少了皱纹 的产生。 1 1 3 2 11 防晒、美白作用 芬兰大学学者曾从细胞学角度，通过紫外能源照射皮肤细胞的体外实验发 现，当人的皮肤组织暴露在紫外能源中仅3 0 m i n ，阳光杀死细胞大约5 0 ，随着 低聚原花青素的加入，大约有8 0 的皮肤细胞免受损坏，且与v 。相比具有较好的 、 紫外线吸收作用。1 9 8 8 年，美国专利6 8 1 7 2 9 9 开发了含有6 0 低聚原花青素提取 山东大学硕士学位论文 物的防晒霜口”。 1 1 3 2 12 收敛和保湿作用 多酚的收敛作用，使得含多酚的化妆品有很好的附着能力，并且可使粗大的 毛孔收缩；多酚的保湿作用是基于多酚的分子中含有亲水性的酚羟基结构，此结 构不仅在空气中易i 吸潮，而且能够与多糖、蛋白质、氨基酸、多肽等大分子形成 复合物，也可以起到保湿作用【3 8 1 。 1 2 苹果多酚概述 苹果多酚是苹果中所含多元酚类化合物的总称。苹果中除含有丰富的植物 纤维、糖、矿物质、维生素等营养成分外，还含有一定量的酚类物质。对苹果多 酚的研究最早开始于对褐变的控制研究。苹果多酚是褐变反应的底物之一，并且 与新鲜苹果及其制品( 如苹果洲、苹果酒) 的感官品质密切相关”，因此人们 对苹果中多酚类物质的组成、苹果多酚与褐变的关系、多酚物质与苹果汁的稳定 性及颜色变化之间的关系等进行了大量的研究。随着对多酚生物活性及应用研 究的深入发展，人们看到了这类天然产物的广阔应用前景。近年来随着苹果业的 迅速发展，人们对有关苹果多酚的分离提取、生物活性及应用的研究越来越多。 随着对苹果多酚研究的深入发展，苹果多酚已应用到多个领域。 1 2 1 苹果中多酚类物质的种类和含量 苹果中的多酚主要包括酸性酚类和黄酮类化合物，主要的酸性酚有绿原酸、 咖啡酸、d 一香豆酸等：黄酮类化合物有儿茶素、表儿茶素、原花青素等黄烷醇， 和黄酮醇、异黄酮等【40 1 。其中酸性酚类占总酚的l 3 ，而黄酮类化合物则占总酚 的2 3 。根据此种分类方法，在苹果多酚的提取过程中可以对酸性酚和中性酚分 别提取，高效液相色谱测定时也采用不同的色谱条件。 苹果中多酚的主要成分及含量因品种、成熟度以及组织部位的不同而不同， 在一些酿酒苹果品种中苹果多酚的含量高达7 9 k g f w ( 鲜重计) h l l , 普通的鲜食 品种中苹果多酚含量范围在0 5 2g k g f w f 4 2 1 。通过实验检测到在金冠苹果幼 果果皮中绿原酸的含量为1 9 0 0 4 4 0 0 m g k gd m ( 干重计) ，幼果果肉中绿原酸的 含量为5 7 0 0 2 0 7 0 0m g k go m ，幼果果核中绿原酸的含量为1 0 5 0 0 2 4 9 0 0m g k g d m 43 1 。有结果表明金冠苹果果肉中含有槲皮苷，而嘎拉果肉中没有检测到。嘎 拉果皮中含有花青素一山越橘苷，而金冠中没有【4 ”。 i j 东大学硕士学位论文 1 2 2 苹果中主要多酚物质的分子结构 苹果中的多酚物质主要包括羟基肉桂酸类、儿茶素类及其聚合物、黄酮醇类、 二氢查耳酮类等，各种多酚物质的结构如图2 所示。 “0 楷+ o 硎h 6 h 南 r i = h r 2 = o h , r a - h ：( i 儿茶棠 r t - o h ，r 2 - h r 3 - h ：( - ) 表儿荣壤礤x o i o o x ： 蝽止单元ir j - h p j = o h ：c + 卜儿薰量单元 r i - o h r a - h ：( ) - 裹儿茶素单元 ( + ) 儿茶素和( 一) 表儿茶素原花青素 迅佣= c l l 叫c = 、；“ 绿原酸 薅仲 单元 终l b 单元 素 根皮苷 根皮素和根皮苷 “啦o 溉hk 爹o l - i j h 图2 苹果中主要多酚化合物的分子结构 1 3 多酚的提取及测定方法 1 3 1 多酚的提取 从植物材料中提取酚类化合物的目的就是将这些化合物从它们所存在的液 泡结构中释放出来。可以通过破碎植物组织或者扩散过程来实现。前一种情况一 o 。勰帅 山东大学颇| ：学位论文 溶剂萃取法主要用于分离可溶性酚类化合物，利用溶剂使酚类物质从植物组 织中扩散出来。影响溶剂萃取法效率的因素包括：溶剂的种类、p h 值、温度、 提取次数与溶剂体积、样品颗粒大小等。 提取酚类物质应用最多的溶剂是甲醇以及甲醇水的混合物。丙酮是另一种 广泛使用的溶剂。曾有研究比较了丙酮和甲醇的提取效率。在多酚物质的提取过 程中，丙酮和甲醇似乎有截然不同的特性。研究表明，甲醇是提取儿茶素的最佳 溶剂，而7 0 的丙酮更有利于原花青素的提取。研究表明，含水甲醇由于其极性 的增加，萃取与极性纤维性基质结合在一起的多酚更有效，而丙酮水的混合物 提取蛋白质基质中的多酚更有效，它们能够降解多酚与蛋白质的复合体【46 1 。 虽然甲醇和丙酮提取多酚的效率较高，但由于它们的毒性而使其应用受到了 限制，因此乙醇被认为是一种经济、安全的提取溶剂。 高温有助于提高萃取效率。这是由于加热提高了细胞壁的通透性，增加了被 提取物的溶解度和扩散系数，降低了溶剂的粘度，因而便于提取物通过固体物质 以及随后的扩散过程( 过滤与沉淀) 。然而，过高的温度可能降解酚类化合物， 因而一般提取使用温度不超过2 5 。 随着提取次数的增加，提取效率提高。比如，用5 0 m l 溶剂提取4 次比用2 0 0 m l 提取一次更有效。对植物材料进行连续3 5 次的提取才能得到较高的产量。均质 有助于提取过程的进行，并且有利于提取过程中与提取溶剂紧密接触。 通常要加入抗氧化剂( t b h q 、b h t 、抗坏血酸、亚硫酸盐) 防止酚类物质 的氧化。然而，对于花色素来说，在提取溶剂中添加抗坏血酸是不合适的，因为 这种抗氧化剂能使花青素发生降解。另外，在黄烷醇的提取过程中添加抗坏血酸 可能对原花青素造成相当程度的降解破坏【4 7 】。 1 3 1 2 固相萃取( s p e ) 酚类化合物可以通过固相萃取的方法分成中性酚和酸性酚，而且由于近年来 更注重提高纯度，因此用柱色谱法提取苹果多酚己得到越来越广泛的应用。 c i s 柱固相萃取被广泛应用于从红葡萄酒、柑桔汁、蔓越橘、葡萄汁、苹果 汁及苹果酒中选择i t 提取酚酸和类黄酮。国外p i c i n e l l ia 等人采用e x t r a - - s e p c l 8 柱通过调节样品的不同p h 值将苹果多酚分为中性酚和酸性酚【4 8 】。 1 3 1 3 超临界流体萃取h 叫( s f e ) 山东大学硕士学位论文 超i 临界流体萃取发展于2 0 世纪6 0 年代，近几年被应用于从植物材料中提取 多酚。超i 临界流体萃取的优点是结合了气体和液体的萃取特性。超临界流体的低 黏度使其具有很高的扩散能力，从而更易接近与细胞壁结合在一起的酚类化合 物。而且相对高的密度使其具有较高的溶解能力，从而使提取更容易。另外，氧 化或异构化( 如自然发生的顺反异构) 在其它更传统的提取技术中可能发生，但 超临界流体萃取可以使任何可能发生的降解过程降至最低。这是因为超临界流体 萃取技术缩短了提取时间，并且提取过程是在没有空气和光照的条件下进行的。 超临界二氧化碳是最普遍使用的萃取溶剂，它具有惰性、低毒、不产生污染 的优点，超临界二氧化碳萃取技术与传统提取、浓缩技术相结合，可以制各高纯 度的苹果多酚，它具有有机溶剂用量少、安全性好、污染少、得率高的优点。 1 3 2 酚类物质的测定方法 测定植物多酚的方法很多，最常用的方法有分光光度法( 如f o li n 一酚法、金 属络合法、香草醛一盐酸法和正丁醇一盐酸法) 和h p l c 方法等。分光光度法是利 用不同的多酚化合物和不同的显色剂作用、显色，在最大波长处测其吸光度从而 计算其含量的方法。由于显色反应的限制，利用该方法只能测出少数几种多酚的 含量或以此计算出总酚的含量。而h p l c 法则可以同时测出许多种多酚的含量， 检测速度快，灵敏度高，最低检测限低，因而受到越来越多的关注。 1 3 2 1 总酚含量测定( f d 法) 1 3 2 1 1f d 试剂的制备 5 0 1 称取l o o g 钨酸钠、2 0 9 磷铝酸和5 0 m l8 5 的磷酸溶于7 5 0 m l 蒸馏水中，加 热煮沸回流两小时，冷却并稀释至1 l 。 1 3 2 1 2 测定 将2 5 m l f d 试剂加入盛有5 m l 稀释至合适浓度的样品溶液的具塞试管中，然后 加入7 5 9 l 碳酸钠溶液2 m l ，塞上塞子于5 0 c 恒温水浴中保持5 分钟，取出冷却， 然后用分光光度计测定7 6 0 h m 处的吸光度。用绿原酸作标样于同样条件下绘制标 准曲线，根据标准曲线计算苹果多酚提取液中总酚含量。 1 3 2 2 绿原酸的测定方法引l 将2 m l5 铝酸钠的5 0 9 6 7 , 醇溶液加入8 m l 稀释至合适浓度的乙醇提取液中，振 荡混匀，将l o m l 上述混合液与2 m l5 0 7 , 醇溶液混合均匀，测定混合液在3 7 0 n m 山东大学硕士学位论文 的吸光度。根据同时绘制的绿原酸标准曲线计算苹果多酚提取液中的绿原酸含 量。 1 3 2 3 黄烷醇的测定方法 黄烷醇类含量用香草醛一盐酸法( 何照范等，1 9 9 8 ) 测定。取样品溶液0 5 m l 加入装有i m l9 5 7 , 醇的具塞刻度试管中摇匀，然后向其中加入1 香草醛一盐酸 溶液5 m l ，加塞摇匀后现出红色。放置4 0 分钟后，用分光光度计测定5 0 0 n m 处的吸 光度。同时以儿茶素为标样绘制标准曲线，根据标准曲线计算苹果多酚提取液中 黄烷醇的含量。苹果果肉中黄烷醇的含量以儿茶素计。 1 3 2 4 原花色素的测定方法 原花色素的测定用正丁醇一盐酸法。取苹果多酚乙醇提取 液i m l 自n 入具塞刻度试管中，然后向其中加入6 m l 正丁醇盐酸( 体积比为9 5 5 ) 溶 液及0 2 m l 硫酸亚铁溶液( 2 4 1 克硫酸亚铁溶于水，定容至1 0 0 0 m l ) ，摇匀后加塞， 于沸水浴中加热4 0 m i n 后取出迅速冷却，以试剂空白作参比，用分光光度计测定 5 4 6 n m 处吸光值。 1 3 2 5 苹果多酚的h p l c 方法 已有文献报道苹果酒中的多酚物质的h p l c 的测定方法【5 2 】。先将苹果酒中的 多酚提取出来，然后用甲醇和甲酸水溶液为流动相，采用浓度梯度洗脱，测定了 酸性酚和中性酚的含量。目前的h p l c 法大部分采用甲醇和水、甲醇和甲酸水溶 液、冰醋酸和乙腈等为流动相，本文以磷酸水溶液和甲醇为流动相，分别探讨了 不同色谱条件下中性酚和酸性酚的检测条件，建立了苹果中多酚物质的快速的 h p l c 的检测方法。 1 4 本课题研究的意义和目的 苹果是一种深受人们喜爱的水果之一，苹果是我国种植面积最大的果树树 种，我们山东省许多地区的农业都是以种植果树尤其是以种植= = 果为主。近年来 随着种植技术的改进，苹果的产量快速提高，然而却出现了苹果积压滞销、卖果 难的情况，苹果价格下跌、果农收入下降。造成这种相对过剩、严重积压的问题 关键就是苹果加工业的严重滞后、加工能力的严重不足。苹果除了人们可以直接 食用外，目前主要的深加工产品就是榨苹果汁和生产苹果酒。产品结构单一，严 山东大学硕士学位论文 重影响着我国苹果加工业的发展，难以满足苹果生产快速发展的要求。因此，研 究开发新的苹果深加工产品，改善我国苹果加工企业产品结构、提高企业经济效 益己成为当务之急。这不仅可以极大地促进苹果加工业的快速发展，而且对于提 高苹果产业的整体效益、增加农民收入和促进农业结构的调整都具有十分重要的 意义。 苹果多酚作为一类具有生物活性的天然化合物越来越得到人们的重视。然 而，目前我国对苹果多酚的开发和利用还处于起步阶段，具有很大的发展空间。 因此，深入开展苹果多酚的提取及其生物活性的研究，开发出能预防衰老，抗肿 瘤、抗心脑血管等疾病的一系列具有医疗和保健作用的食品、饮料和化妆品，既 可以为人类健康作贡献，又可以创造出更大的经济效益，解决果农的后顾之忧。 而要进行这一系列的工作，都离不开对苹果多酚的检测分析。而且对于榨汁后的 苹果渣，以前都是丢弃，但通过检测发现苹果渣中仍含有一定量的多酚物质，可 以废物利用，变废为宝。 测定苹果多酚以前多采用分光光度法，只能粗略测出总酚的含量，不能确定 苹果中所含多酚的种类以及各自的含量。本文即是在对我国苹果多酚资源和现有 苹果多酚测定方法进行初步调查研究的基础上，对苹果中多酚物质高效液相测定 方法进行了研究和探讨，并准确分析了苹果果皮、果肉、果心中多酚物质的种类 和含量，以期为苹果多酚测定方法的改进和苹果多酚的开发利用提供基础资料和 参考依据。 生查查兰型! ! 兰些堡；i ! ! ： 2 材料与方法 2 1 实验材料 红富士苹果、小国光苹果 2 2 标准品 绿原酸 p 一香豆酸 ( + ) 一儿茶素 ( ) 一表儿茶素 芦丁 根皮素 原花青素b 2 槲皮素 根皮苷 2 3 化学试剂 甲醇( 色谱纯) 磷酸( 分析纯) 乙酸乙酯( 分析纯) 盐酸( 分析纯) 氢氧化钠( 分析纯) 烟大市场 中国药品生物制品检定所 德国s i g m a 公司 中国药品生物制品检定所 中国药品生物制品检定所 中国药品生物制品检定所 德国s i g m a 公司 德国s i g m a 公司 中国药品生物制品检定所 天津尖峰天然产物研究开发有限公司 天津协和吴鹏色谱科技有限公司 天津市西化特种试剂厂 天津市西化特种试剂厂 天津市西化特种试剂厂 天津市西化特种试剂厂 2 4 主要仪器及设备 a g i l e n t11 0 0 高效液相色谱分析仪 安捷伦科技有限公司 a g i l e n t1 1 0 0v w d 可变波长检测器 安捷伦科技有限公司 z o r b a xs b c l 8 柱( 1 5 0 m m x 4 6 m m ，中5pm ) 安捷伦科技有限公司 冷冻干燥机 江苏大地自动化仪器厂 f k 1 3 多用植物粉碎机 江苏大地自动化仪器厂 r e 5 2 c s 旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂 真空包装机 郑州科贸有限公司 山东大学硕士学位论文 s b h i i l 循环水式多用真空泵 溶剂过滤器