（分析化学专业论文）适配体au、cdte纳米粒子功能化修饰及凝血酶电化学传感研究.pdf

中文摘要 核酸适配体( a p t a m e r s ) 是人工合成的单链寡核苷酸片段_ d n a 或r n a ，是从含大量自由序列的随机寡核苷酸文库中通过体外筛选 分离出来的，它能以高的亲和力及特异性结合各种靶分子( 蛋白质、 小分子、金属离子、d n a ，甚至整个细胞) 。由于核酸适体合成简 易、稳定性好且易于保存，而且对配体具有强的亲和力和高的结合特 异性，在生化分析领域，已被视为一种富有应用前景的探针，可与抗 体相媲美，甚至比传统的抗体更具有优势，受到越来越多的重视。凝 血酶核酸适体是最早被筛选出来的，它有两条不同的碱基序列，能与 凝血酶不同位点发生特异性结合，形成g 四重体结构。本论文以凝 血酶适体为模型，发展了一系列凝血酶检测的新方法。主要内容如 下： ( 1 ) 建立结合f e 3 0 以u 磁分离和c d t e 纳米粒子核酸适体探针的 电化学凝血酶检测新方法。水相法合成了f e 3 0 以u 磁性复合微粒以 及l 半胱氨酸修饰的c d t e 纳米粒子，以前者作为d n a 的固定和分 离材料，修饰了凝血酶适体( 1 5 m e r ) 的c d t e 纳米粒子作为检测探 针。首先将巯基修饰的适体互补链通过金硫键固定在f e 3 0 4 a u 磁性 复合微粒上，再让c d t e 纳米粒子修饰的适体链与固定探针杂交即完 成了凝血酶传感器的制备。凝血酶的存在使c d t e 纳米粒子修饰的适 体探针从磁性复合微粒上脱落，利用外加磁场分离，通过差分脉冲伏 安法检测上清液中c d 2 + 的量即可达到定量检测凝血酶的目的。该方法 简便，灵敏度高，选择性好，成本低，无有害物质，在蛋白质检测中 有很大的应用前景。 ( 2 ) 以亚甲基蓝作为检测探针结合z r 0 2 a u n p s 构建凝血酶电化 学生物传感器。利用亚甲基蓝与d n a 分子的特殊性作用，让它作为 检测探针，结合z r 0 2 a u n p s 膜修饰电极对检测信号的放大作用，构 建一种简单灵敏的电化学生物传感器，用于凝血酶的检测。将巯基化 的适体互补链固定到修饰电极表面作为固定探针，然后让凝血酶适体 ( 2 9 m e t ) 与其杂交，再让亚甲基蓝插入到双链d n a 中或与鸟嘌呤 特异性结合，制成凝血酶适体传感器。当电极浸入到凝血酶溶液中， 适体即与凝血酶特异性结合成g 四重体结构，从而使亚甲基蓝从电 极表面脱落，再检测电极表面亚甲基蓝峰电流的下降值( 其降低幅度 与凝血酶浓度成一定的比例关系) ，达到检测凝血酶的目的。本传感 器有较宽的线性范围和很低的检测限，并且选择性高，再生能力强， 可用于高灵敏检测蛋白质。 ( 3 ) 应用电化学阻抗法和杂交反应的增敏作用建立高灵敏检测凝 血酶的方法。利用凝血酶与它的两条适体形成一种“三明治 夹心结 构，以及d n a 对电极表面电荷传递能力的影响，采用交流阻抗法， 发展一种新的凝血酶的放大检测方法，实现对目标蛋白质的高灵敏检 测，有效提高检测的响应性能。 关键词：核酸适体；凝血酶；纳米粒子；d n a 杂交；差分脉冲伏安 法；交流阻抗 i i a b s t r a c t a p t a m e r sa r es y n t h e t i co l i g o n u c l e o t i d e sd n a o rr n a ，w h i c ha r e i s o l a t e df r o mr a n d o m s e q u e n c en u c l e i ca c i db i b r a r i e sb y “i nv i t r o s e l e c t i o n t h e yc a l lb i n dt om o l e c u l a rt a r g e t sw i t hh i g ha f f i n i t ya n d s e l e c t i v i t y ，s u c ha sp r o t e i n s ，s m a l lm o l e c u l e s ，m e t a li o n ，d n a ，e v e nt h e w h o l e c e l l s o w i n g t o a p t a r n e r s r e l a t i v ee a s eo fi s o l a t i o na n d m o d i f i c a t i o n ，g o o ds t a b i l i t y ，t h ee a s i e rs t o r a g e ，t h eh i g hb i n d i n ga f f i n i t y a n ds i m p l i c i t yo fi nv i t r os e l e c t i o n ，i th a v ea t t r a c t e dm o r ea n dm o r e a t t e n t i o n si nt h ea r e ao fb i o c h e m i c a la n a l y s i s t h r o m b i na p t a m e rh a st w o k i n d so fn u c l e i ca c i ds e q u e n c e ，w h i c hc a nb i n dt ot h r o m b i na td i f f e r e n t s i t e sw i t hb i n d i n ga f f i n i t yt of o r mg q u a r t e ts t r u c t u r e i nt h i s p a p e r ， t h r o m b i nu s e da sam o d e lp r o t e i nt od e v e l o pn e wt h r o m b i nd e t e c t i o n m e t h o d su s i n ga p t a m e r s t h em a i nw o r ki ss u m m a r i z e da sf o l l o w s ： ( 1 ) w ee s t a b l i s h e dan e wm e t h o df o re l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o no f t h r o m b i nc o m b i n i n gf e 3 0 d a um a g n e t i cs e p a r a t i o na n dc d t e a p t a m e r p r o b e 。f e 3 0 q m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sa n dl c y s t e i n em o d i f i e dc d t e n a n o p a r t i c l e sw e r es y n t h e s i z e d f e 3 0 d a um a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sw e r e u s e da sd n ai m m o b i l i z a t i o na n ds e p a r a t i o nm a t e r i a l ，w h i l ea p t a m e r m o d i f i e dc d t en a n o p a r t i c l e su s e da sd e t e c t i o np r o b e t h i o l a t e dm o d i f i e d c a p t u r ed n aw h i c hc o m p l e m e n t a r yw i t ht h r o m b i na p t a m e rw a sa n c h o r e d o n t ot h es u r f a c eo fa uc o a t e dm a g n e t i cb e a d sv i as u l f u r - g o l da f f i n i t y i i i c d t en a n o p a r t i c l e sm o d i f i e da p t a m e rp r o b eh y b r i d i z e dw i t hc a p t u r e d n as e q u e n c em o d i f i e do nm a g n e t i cb e a d sb yh y b r i d i z a t i o nr e a c t i o n ， a n dt h e nt h et h r o m b i - f la p t s e n s o rw a so b t a i n e d w h e nt h r o m b i na d d e dt o t h ed e t e c t i o ns o l u t i o n ，c d t en a n o p a r t i c l e sm o d i f i e da p t a m e rw a sf o r c e d t od i s s o c i a t ef r o mt h em a g n e t i cb e a d s t h et h r o m b i nw a sd e t e c t e d t h r o u g hc u r r e n tp e a ko fc d 2 + i ns u p e m a t eo fd i f f e r e n t i a lp u l s ea n o d i c s t r i p p i n gv o l t a m m e t r y ( d p v ) a f t e rs e p a r a t i o nw i t ha ne x t e r m a lm a g n e t i c f i e l d t h i sm e t h o di s s e n s i t i v e ，n oh a r m f u lr e a g e n t s ，r e q u i r i n go n l ya s m a l ls a m p l ev o l u m ea n dh a sag r e a tp o t e n t i a lf o rp r o t e i n sd e t e c t i o n ( 2 ) an e wt h r o m b i ns e n s o rw a sd e v e l o p m e n tb yu s i n gm e t h y l e n eb l u e ( m b ) a se l e c t r o c h e m i c a lp r o b ea n dz f 0 2 a u n p sa ss i g n a la m p l i f i c a t i o n a n d m a g n e t i cs e p a r a t i o n m a t e r i a l m bi su s e da st h ee x t e m a l e l e c t r o a c t i v ei n d i c a t o ro w i n gt oi t ss p e c i a li n t e r a c t i o nw i t hd n a i nt h i s p a p e r , at h i o l a t e dc a p t u r e d n ai si m m o b i l i z e do nt h es u r f a c eo f m o d i f i e de l e c t r o d ea n dt h e nh y b r i d i z e dw i t ht h r o m b i na p t a m e r ( 2 9 一m e r ) mi n t e r c a l a t e si n t ot h ed o u b l e s t r a n d so fn u c l e i ca c i d sa n db i n d s s p e c i f i c a l l yt og u a n i n eb a s e s ，a f t e rw h i c ht h ea p t a s e n s o r sw e r eo b t a i n e d i nt h ep r e s e n c eo ft h r o m b i n ，t h r o m b i ni n t e r a c t e dw i t hi t sa p t a m e rt of o r m g q u a d r u p l e x ，w h i l em bd e s o r b e df r o me l e c t r o d es u r f a c e ，r e s u l t i n gi na d e c r e a s ei nc u r r e n t t h ed e c r e m e n to fc u r r e n ti s p r o p o r t i o n a l t ot h e a m o u n to ft h r o m b i n t h i sa p t a s e n s o rh a sw i d ec o n c e n t r a t i o nr a n g e ，l o w i v d e t e c t i o nl i m i t ，h i g h s e l e c t i v i t y a n d g o o dr e p r o d u c i b i l i t y a n dt h i s a p t a s e n s o rw a s a b l et os e n s i t i v e l yd e t e c tt h r o m b i n ( 3 ) ah i g h l y s e n s i t i v ed e t e c t i o nm e t h o dw a sd e v e l o p e db yu s i n g h y b r i d i z a t i o na m p l i f i c a t i o na n de l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c et e c h n i q u e s i n c eo n et h r o m b i nm o l e c u l eh a st w oa c t i v es i t e sf o ri t st w ok i n d so f a p t a m e r ，t h ee l e c t r o d e - a p t a m e ri t h r o m b i n a p t a m e ri i - a u n p ss a n d w i c h s t r u c t u r ew a sf a b r i c a t e da st h es e n s i n gp l a t f o r m h e r e ，w er e p o r t e da s i m p l e a n d h i g h l y s e n s i t i v el a b e l f r e e i m p e d i m e t r i ca p t a s e n s o r f o r t h r o m b i nd e t e c t i o nb a s e do nt h eh y b r i d i z e ds i g n a la m p l i f i c a t i o n t h i s s t r a t e g yc o u l dn o to n l yi m p r o v et h ed e t e c t i o ns e n s i t i v i t yb u ta l s op r o v i d e as i m p l em o d e lf o rt h es i g n a la m p l i f i c a t i o no ft h ei m p e d i m e t r i cs e n s o r s m e a n w h i l e ，t h i sm e t h o de x h i b i t sg o o ds e l e c t i v i t y k e yw o r d s ：a p t a m e r ；t h r o m b i n ；n a n o p a r t i c l e s ；d n ah y b r i d i z a t i o n ； d p v ；e i s v 湖南师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的 研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人 完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：文身也雁 训。年厂月；) 日 湖南师范大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属湖南师范大学。 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在，年解密后适用本授权书。 2 、不保密 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：支黼日期：卅口年卵】日 导师签名： 敝 日期： 印秒年f 月 衫 日 7 5 适配体h u 、c d t e 纳米粒子功能化修饰及凝血酶电化学传感研究 第一章绪论 生物传感是一门多学科交叉技术，是在化学传感技术的基础上发 展起来的，一般由敏感膜，换能器和信号处理器三部分组成【1 1 。自1 9 6 2 年c l a r k 提出设想、1 9 6 7 年u p k i k e 和h i c k s 首次研制出生物传感器 以来，这一新技术已引起生物医学、环境检测、材料、食品及药物分 析等领域科学专家的重视，在国际上被广泛研究。根据固定的生物活 性材料的不同，生物传感器可以分为免疫传感器，酶传感器，核酸传 感器，细胞传感器等。 在生物体系中，蛋白质是一类重要的生物大分子，对它的检测十 分重要。近年来，常规的蛋白质检测方法是通过传统的抗原抗体之 间的免疫反应进行的，由于抗原抗体之间的特异性反应，免疫传感器 具有很好的选择性和专一性。随着9 0 年代初核酸适体( a p t a m e r ) 的 出现，基于适体的免疫传感器成为近年来研究的热点，适体传感器有 许多优点，如体外筛选简单，选择性高，亲和力强，以及靶物质范围 广等。因此，以适体作为识别元件的蛋白质检测技术越来越受到人们 的关注。 硕十学位论文 1 1 核酸适体简介 适体( a p t a m e r ) 一词来源于拉丁语a p t u s ，即t of i t ，适合的意思。 核酸适体是一类通过指数富集配体的系统进化技术( s e l e x ) 技术体 外筛选而获得的，对特定靶物质有很好的识别能力，其特异性和亲和 力可与抗原抗体相媲美，解离常数通常在纳摩尔到皮摩尔之剐2 1 ，强 于抗原抗体之间的作用力，具有很多优点。如稳定性、重现性高，容 易修饰等，可以按需要对序列中的核苷酸定点标记各种官能团和信号 基团，如荧光基团，电活性基团以及酶等，以便于适体的固定化和信 号的检测。 1 i 1s e l e x 技术的基本原理及技术流程 随着两项关键技术一指数富集配体的系统进化技术( s y s t e m a t i c e v o l u t i o no f l i g a n d sb ye x p o n e n t i a le n r i c h m e n t ，s e l e x ) 和聚合酶链式 反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 技术的发展和应用，近年来 对适体的研究有了长足的进步，已经筛选得到了一大批分别与各种靶 物质特异性结合的核酸适体分子。上个世纪九十年代，美国的g o l d 【3 1 、 s z o s t a k1 4 和j o y c e 【5 】三个研究小组分别报道t s e l e x 技术。s e l e x 技 术是指数富集配体系统进化( s y s t e m a t i ce v o l u t i o no fl i g a n d sb y e x p o n e n t i a le n r i c h m e n t ) 的简称，由体外筛选( i nv i t r os e l e c t i o n ) 和扩 增( a m p l i f i c a t i o n ) 技术组成，其基本思想是通过体外化学合成一个 单链寡核苷酸文库，然后让目标靶分子与其相互作用，形成靶物质 适体的复合物，经过洗脱，将未结合的寡核苷酸链分离，从而筛选出 与靶物质结合力强、具有特定序列的寡核苷酸文库，并以此核酸分子 2 适配体a u 、c d t e 纳米粒子功能化修饰及凝血酶电化学传感研究 为模板进行p c r ：t f 增，得到下轮筛选的次级文库，再将其与靶分子作 用。经过数次反复筛选和扩增，即可得到与靶分子具有高特异性、高 亲和力的核酸适体。 ? s e l e x - c y c l e “。p 。、唧m r i 口f 影诲0 茅 核酸文库来源于化学合成，可分为r n a 文库、d n a 文库和含有 修饰核苷酸的文库。图1 - 1 为s e l e x 筛选技术的流程图。预先设 计并合成的文库一般由5 、3 端的固定序列和中间一定长度的随机序 列构成。两端固定序列长度一般为2 0 2 5 个碱基，以增加文库的稳 定性并与p c r 扩增引物序列匹配。随机区的每一个核苷酸位置都存 在四种可能性，若随机序列长度为n ，则随机序列的多样性有4 ”种， 印文库中有4 0 种寡核苷酸序列，因此，典型的文库至少有1 0 ”1 0 “ 个独立序y o f t , q 。由于核酸识体筛选最重要的一条是如何保证核酸文 3 硕十学位论文 库的多样性，所以起始文库的库容量必须很大，才能增加获得“活性” 适体的可能性。二般来说，自由核酸的长度越大，库容就越大，但一 般与蛋白或其他分子相互作用的核酸序列多集中于1 5 4 5 个核苷 ( n u c l i o t i d e ，n t ) 之间。将文库和靶分子在特定条件下( 通常为3 7 ) 孵育，最初几个循环中只有少数的序列与靶分子作用，通过亲和色谱、 纤维膜过滤等分离技术将未结合的序列与结合复合物分开；以分离得 到的序列作为模板再扩增产生次级文库，用于下一轮筛选，一般经过 8 2 0 轮的循环筛选富集，即可完成筛选过程。对于r n a 文库，扩增 步骤还包括r n a 序列的反转录，得到的双链d n a 文库再转录生成 次级r n a 文库。核酸文库经过数轮的筛选富集，当分离得到的随机 序列与靶物质亲和力不再提高达到饱和时，即可对筛选获得的寡核苷 酸进行功能研究。随着s e l e x 过程的进行，得到的核酸适体的亲和 力增i n ( 即解离常数凰降低) ，凰一般达洲到p m ( 1 0 。9 l o 1 2 m o l m l ) 级0 1 ，有的甚至达到t m 【1 1 1 ( 1 0 小m o l m l ) 。现代分子生物学技术 为多靶物质分离提供了强有力的工具，使分离率基本达到期望值。通 过s e l e x 过程，甚至可以得到存在于组织中的靶物质，既可是单一 靶物质，也可是混台靶物质。由于单链r n a 比单链d n a 在二级空 间构象上更丰富，更容易与靶物质形成靶物质适体的复合物，从而 更容易筛到特异性强、亲和力高的适体。但相比之下d n a 适体l l r n a 适体更稳定，不易降解，因此有许多物质都会同时存在d n a 及r n a 适体( 如表1 1 ) j 4 适配体a u 、c d t e 纳米粒子功能化修饰及凝血酶电化学传感研究 t a b l e1 - 1s o m ea p t a m e r sa n dt h e i rt a r g e t s 注：单链脱氧核糖核酸( s i n g l es t r a n dd e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，s s d n a ) 。 随着各种技术的发展以及核酸适体研究的日渐深入与广泛， s e l e x 技术也日臻成熟，许多新型的s e l e x 改造技术的出现，也为 该技术的发展提供了良好的前景。g o l d e n 等人【2 0 1 在传统的s e l e x 基 础上，发展了光化学s e l e x 技术，并且研究了一种检测系统，可以 同时对多个分析物进行定量检测。与传统的基于亲和性筛选的 s e l e x 技术不同，该光化学s e l e x 技术是基于光致共价交联进行筛 选的，具有更优异的特异性和灵敏度。此外，针对于筛选的操作较繁 琐、周期较长，s e l e x 筛选技术同时也致力于自动化方向发展 2 1 , 2 2 。 “自动化s e l e x 技术不仅降低了人为因素的干扰，而且能有效缩短 适体的筛选过程。例如，s e l e x 技术与毛细管电泳技术的联用，数 天时间就可以筛选出对靶物质具有高亲和力与特异性的核酸适体【2 3 1 。 总之，相对于典型的以细胞为基础产生单克隆抗体及其纯化过 程，s e l e x 过程所花时间要少得多。随机寡核苷酸文库，特别是随 机的r n a 文库，作用的靶分子范围广泛，筛选所需周期短，且筛选 出的适体与靶物质的结合能力强于天然配体。虽然s e l e x 技术的研 5 硕十学何论文 究和应用还有待于不断推进和发展，但其在生物学、临床诊断、基础 医学、治疗试剂的研制以及药物筛选等的研究方面已经显示出广阔的 应用前景和发展空间。 1 1 2 核酸适体与靶物质的相互作用 核酸适体与其不同的配体之间的相互作用通常存在以下共同点： 核酸适体上富含嘌呤的环常作为外来靶序列的结合位点，常为嘌呤一 嘌呤排列( 包括碱基错配、碱基三聚体和碱基平台) 2 4 1 ，这些错配在 环与正常的双螺旋碱基对之间的堆积处产生一个转折点，常导致环的 关闭。在核酸适体与其配体结合时，通常会形成一些稳定的二级结构， 如发卡( h a i r p i n ) 、茎- 环( s t e m - l o o p ) 、假结( p s e u d o k n o t ) 、g 四 重体( g q u a r t e t ) 、凸环( b u l g e ) 等等，决定这些结构的碱基往往是 与配体结合的重要位点。这些结构一般通过范德华力、氢键作用、静 电作用或形状匹配等相互作用力，对特定物质表现出高特异性识别。 如凝血酶其中一条适体就是通过g 四重体空间结构与凝血酶形成凝 血酶适体复合物( 如图1 2 所示) 【2 5 】。该核酸适体主要由2 9 个碱基 组成，能够折叠成含有两个四元g 平面的特殊三维结构，通过凝血 酶侧链上带正电荷的a r 9 1 2 6 、l y s 2 3 6 、l y s 2 4 0 、a r 9 9 3 与该四元g 一 平面之间的静电作用力，特异性识别凝血酶分子。 6 适配体a u 、c d t e 纳米粒于功能化修饰及凝血酶电化学传感研究 藤 f i g1 - 2 l e f t ：s p a t i a ls i r u c t u r eo f s s d n a a p t a m e m t o t h r o m b i n ( n u c l e o t i d e so f t h e m a j o rm o t i f o f t h et w og - q u a r t e t sa r en u r a b e r e d ) r i g h t ：s p a t i a ls l r u e t u r ea s s u m e df o r t h e c o m p l e xo f t h r o m b i n 、】v i t h t h e2 9 一i l ta p t a m e r l 2 5 1 11 3 核酸适体的特点及优势 11 31 与靶序列作用的广泛性 核苷酸文库中随机序列的多样性与复杂性使人们能够筛选出与 自然界中众多种类的物质分子发生特异性结合的核酸适体。目前，用 s e l e x 技术所筛选出来的核酸适体能结合的靶分子不仅包括蛋白质 与核酸，还能作用于酶、生长因子、抗体、基因调节因子、细胞粘附 因子、植物凝集索、完整的病毒颗粒、病原菌 2 6 , 2 1 等。此外，适体也 可用于小分子物质的检测，比如有机染料、金属离子j 药物、氨基酸、 抗生素、辅因子、核酸碱基类似物、核苷酸和肽 1 3 , 2 8 埤，甚至还能作 用于完整的细胞、病毒、细菌2 9 1 等。理论上来说，只要筛选的核苷酸 文库库容量足够大，就可以通过s e l e x 技术筛选出针对任何靶分子 的适体，因此，基于适体的生物传感器可在更多领域得以应用。 7 硕士学位论文 1 1 3 2 严格的识别能力和反应的特异性 核酸适体序列是经多次筛选而选定的，故其与靶物质问的结合有 严格的特异性，适体能够感知配体方面及其细微的变化，能分辨不同 配体上一个甲基、一个羟基、一个基因的差别，甚至能识别同一蛋白 分子的不同构象、不同功能状态。例如茶碱在分子结构上只比咖啡因 少一个甲基，用常规的免疫法检测二者时存在交叉反应，而核酸适体 只特异性结合茶碱，且其与茶碱的亲和力比咖啡因高出1 0 0 0 0 倍【3 0 l 。 适体的高度识别能力，几乎可以完全避免非特异性结合。此外，还能 用于手性药物的分离，因为适体能特异性识别同一物质的镜像体。 m i c h a u d 等将特异结合d 2 精氨酸升压素的d n a 型适体固定在层析 支持物上，可以成功滞留流经柱子的d 2 肽而将其与l 2 肽分开【3 1 1 。 1 1 3 3 适体的可修饰性 已制备的单抗如在试验中证明其反应条件或参数不满意，一般只 能另行筛选，而适体却可以加以修饰，以适应测定条件的要求。目前 适体的化学修饰主要包括57 位嘧啶核糖用i 、b r 、c i 、n h 3 和n 3 的修饰， c - 5 位胸腺嘧啶的取代，以及用n h 3 和f 或o c h 3 取代r n a 嘧啶核糖上 的27 羟基，嘌呤核苷酸27 烷氧基的修饰，37 和57 硫代磷酸化等等 3 2 - 3 4 】。 此外，还可以对适体进行确定条件下的再次选择，即进行偏倚文库生 成的适体优化( a p t a m e ro p t i m a z a t i a nt h r o u g h b i a s e d l i b r a r y g e n e r a t i o n ) ，也可大大地提高适体的特异性和亲和力。并且，适体 经过适当的化学修饰后，可延长半衰期，提高稳定性，这也便于长期 保存并在常温下运输，对实验诊断试剂或临床治疗方面都非常有利。 8 适配体a u 、c d t e 纳米粒子功能化修饰及凝血酶电化学传感研究 1 1 3 4 用于诊断试验的普遍性 适体与靶分子的结合类似于抗原与抗体之间的作用，其结合信号 可以通过多种方式表现，如荧光标记，电化学标记，酶标记，生物素 标记与放射性标记等，这些功能团可接合在适体的特定位置，也可解 离用于检测，通过标记物间接检测结合信号。另外适体还可用于分子 信标、传感器、荧光偏振、分子灯塔、流式细胞技术、毛细管电泳以 及质谱分析技术 3 5 , 3 6 1 等检测手段，其应用的广泛性远胜过抗体。 1 2 核酸探针在基体表面的固定方法 在d n a 传感器或适体传感器的构建中，其中关键步骤是核酸探 针的固定化，它将直接影响传感器的响应性能。为了获得理想的传感 界面，人们通常借助物理或化学方法将核酸探针有效地固定在一定的 界面上。单链d n a 的固定方法有很多，目前大致有如下四大类： 1 2 1 吸附法 d n a 探针在基体表面的吸附可以通过物理吸附、化学吸附等来 实现。即将d n a 直接滴涂到基体表面，通过静电吸附或其他分子间 的作用力来实现d n a 探针在界面的固定。这种吸附固定法操作简单， 条件温和，固定化速度快，并且不需要特殊的试剂，也不需要对核酸 探针进行额外修饰；但是d n a 探针与基体的结合力度和方向性较差， 且固定化密度小，因此核酸探针容易结构扭曲或从电极表面脱落，使 杂交效率不高。 9 硕十学位论文 1 2 2 自组装法 自组装法是基于分子的自组装作用，实验中常以金电极或有金表 面的纳米颗粒( 如f e 3 0 以札纳米粒子) 作为基体，利用巯基基团( s h ) 与a u 之间的强作用力，在基体表面形成高度有序的巯基修饰的核酸 探针单分子层。用该方法制备的d n a 探针结合作用力强，表面结构 有序，且稳定性好，易于发生杂交反应；但不足之处是它对巯基修饰 过程要求较高【3 7 1 ，一般组装后需进行封闭，否则将出现较大的非特异 性吸附。h a s h i m o t o 等通过该技术将修饰了巯基基团的核酸探针直接 固定在金电极表面上，构建了检测目标d n a 分子的传感界面3 羽。 1 2 3 共价键合法 共价键合法是通过化学试剂利用共价键( 例如，酣键、酞胺键、 醚键等) 的作用将核酸探针固定于基体表面的一种固定方法。首先对 电极表面进行处理，如引入活性基团( 羧基、氨基、羟基等) ，然后 用偶联活化剂或双官能团试剂，例如戊二醛等，将核酸探针分子联结 到电极表面。l i n d n e r 等将( 3 氨基丙烷基) 三甲氧基硅烷修饰在玻 璃表面，在n a b h 3 c n 作用下，以戊二醛作为交联剂，将氨基修饰的 i g e 适体分子固定到玻璃基底上1 3 9 。这种固定方法可以有效提高基体 表面核酸探针的稳定性与耐用性，从而提高检测的灵敏度和重现性。 1 2 4 亲和交联法 生物素( 又称为辅酶或维生素h ) 是一种环状有如尿素的化学物 质，是生物体内广泛存在的各种羧化酶的辅酶，分子上的羧基可与抗 体、d n a 、酶、蛋白质等通过共价键相连。亲和素又称为生物素蛋白， 1 0 适配体a u 、c d t e 纳米粒子功能化修饰及凝血酶电化学传感研究 由四个相同的含1 2 8 个氨基酸的亚基组成，每一个亚基含有一个与生 物素结合的活性位点，因此，亲和素与生物素之间有极强的亲和力， 结合常数比抗原抗体复合物高出百万倍，具有高特异性和稳定性。 这种技术首先将亲和素共价偶联或静电吸附到基体表面，然后将连接 了生物素的核酸探针通过生物素亲和素之间的强亲和作用固定。该方 法简便，高效，条件温和，稳定性好，且不会干扰固定后生物分子的 活性。例如，c e n t i 等用亲和素修饰磁性微球，将生物素标记的凝血 酶适配体通过生物素与亲和素之间的特异性反应，固定到磁性微球 上，达到检测凝血酶的目的 4 0 l 。由于这种技术所具有的优势，在生物 传感器研究中得到越来越广泛的应用。 1 3 适体技术的应用 1 3 1 在分子信标( m o l e c u l a rb e a c o n s ) 中的应用 分子信标是近年发展起来的基于荧光共振能量转移现象的检测 技术，由t y a g i 和k r a m e r 在1 9 9 6 年首次设计合成【3 5 1 。分子信标是呈 发卡结构的单链核酸探针，其茎由特定核苷酸组成，其“环”的一端 结合上荧光，另一端结合上荧光猝灭剂。与目标分子作用之前，分子 信标由于茎部发生分子内杂交，形成发卡结构，荧光基团和猝灭基团 相互靠近，荧光被猝灭；当遇到目标分子时，环状部分会与目标物作 用，核酸探针构象改变，荧光基团和猝灭基团分开，荧光恢复。通过 检测反应前后荧光信号的变化对待测样品进行定性或定量分析。 随着核酸适体的出现及发展，分子信标技术在适体中的应用也随 之出现，应用范围明显扩展。如果将核酸适体两端分别修饰特定的荧 11 硕十学位沧文 光基团和猝灭基团，就可构建成与分子信标相类似的信号探针 ( a p t a m e rb e a c o n ) 。适体的构型因靶物质的结合而发生变化，从而 使荧光共振能量转移效率发生变化而产生信号。w a n g 4 1 1 等将凝血酶 适体的3 端延长，并使延长的序列能与靠5 端的碱基互补，将3 端用 荧光基团 b a ，这种逐渐增大分别是由实验中两个信 5 5 硕十学位论文 号放大步骤引起的。在该信号放大基础上，对凝血酶检测的浓度范围 在0 5p m 1 0n m 之间，其中线性范围为0 0 6 1 0n m ，这与文献1 1 2 1 报 道的十分接近( o 0 5 3 5n m ) 。线性回归方程为a r e t = 2 3 4 1 4 c + 9 4 6 3 9 ， 相关系数为0 9 9 51 ，根据3 倍信噪比与斜率的比值，得出检测限为0 2 2 p m ，这种基于信号放大的传感器的检测限比一般传感器要小很多( 2 n m ，o 0 2 n m ) 1 1 0 9 ，1 1 7 】。结果表明该适体传感器能超灵敏的检测凝血 酶。 4 3 5 特异性实验 为了研究该适体传感器的特异性，我们选择了另外三种蛋白质做 了对比实验。图4 - 5 a 显示了在相同条件下，电极 m e a p ti a u z r 0 2 g c e 分别浸泡在b s a 、h s a 、f i b r i n o g e n ( 浓度均 为5 山) 及凝血酶( 1n m ) 溶液中反应6 0m i n 后的a r 吼值。从图中我 们可以看出，凝血酶与其他几种蛋白质或空白相比，能引起阻抗增大 的幅度最大；此外，我们还考察- j a p t i i - a u n p s 以及s s d n a a u n p s 在未修饰凝血酶( b s a 代替) 电极上的非特异性吸附，如图4 5 b 所示。 比较图中c 、d 、e - - 条曲线，a p ti i a u n p s 及s s d n a a u n p s 在电极上 的非特异性吸附对尺吐值的变化并不明显，几乎可以忽略。这些对比实 验表明该传感器对凝血酶有很好的特异性和高的选择性。 5 6 适配体a u 、c d t e 纳米粒子功能化修饰及凝血酶电化学传感研究 a 。； 葛 f i g 4 - 5 ( a ) t h ec h a n g e so f t h ee l e c t r o n - t r a n s f e r r e s i s t a n c e ( 尺耽) o ft h e m e a p ti a u z r 0 2 g c ea f t e ri n c u b a t i o n 、j i ，i t l lt r i s h c ib u f f e r , 5p mh s a , 5r t m f i b r i n o g e n , 5 州b s a ，a n d 1n mt h r o m b i n , r e s p e c t i v e l y t h e 如o ft h e m e a p ti a u z r 0 2 g c ew a sc o n s i d e r e d 够t h eb a c k g r o u n d ( b ) e l e c t r o c h e m i c a l i m p e d a n c es p e c t r ao f ( a ) t h ea p ti a l t z r 0 2 g c e ，( b ) m e a p ti a r z r 0 2 g c e ，( c ) m e a p ti a u z r 0 2 g c et r e a t e dw i t hb s as o l u t i o n , ( d ) m e a p ti a u z r 0 2 g c e t r e a t e d 砸mb s aa n da p ti i - a u n p ss o l u t i o n ，( e ) m e a p ti a u z r 0 2 g c et r e a t e d 诵mb s a , a p t i - a u n p s ，a n dt h e n 丽t i lp a r t l yc o m p l e m e n t a r yd n ao fa p ti i m o d i f i e dw i t ha u n p s ( s s d n a - a u n p s ) o t h e rc o n d i t i o n sw e r et h es a m ea st h o s ei n f i g 4 1 4 4 小结 本实验采用交流阻抗法，研制了一种基于信号放大的高灵敏检测 凝血酶的适体电化学传感器。交流阻抗法不仅可以表征电极上修饰膜 的形成，同时还可以实时监测反应的进行过程，特别是对不具电活性 的物质，这一方法能够得到很好的响应信号。凝血酶与它的两条适体 链结合成一种“三明治的夹心结构，a p ti i 的互补链和a u n p s 脏3 1 x ， 使电化学的检测信号大大的增强，尺乱值的增大幅度( a r n ) 与凝血酶 5 7 硕士学位论文 的浓度在0 0 6 1 0n m 范围内存在线性关系，检测限为o 2 2p m 。该传 感器操作简便、选择性好、灵敏度高，对建立简易、快速检测凝血酶 方法