（发育生物学专业论文）三角梅核糖体失活蛋白的基因克隆和表达研究.pdf

摘要 核糖体失活蛋e i ( r i b o s o m e i n a c t i v a t i n gp r o t e i n ，r i 一，是一类具有抗病毒活性的蛋白， 通过直接作用于核糖体来抑制蛋白质的合成。r i p 根据结构的不同可分为2 种类型：i 型和i i 型。b o u g a n i n 是从三角梅中分离出来的一种i 型核糖体失活蛋白，是目前所发 现的毒性最低的一种r i p 。 根据已报道的b o u g a n i ne d n a 序列，设计合成两条引物，在两条引物上分别添加 n o ti 酶切位点， 蚺终止密码子和x h oi 酶切位点，从厦门本地的光叶三角梅基因组 d n a 里克隆出了一种新的核糖体失活蛋白基因。将获得的b o u g a n i n 基因连接到 p m d l 8 一t 载体后，进行了测序分析。结果表明长度为7 5 0 b p ，与已报道的b o u g a n i n 基 因同源性为8 3 ，但推导出的氨基酸序列里，第2 2 9 氨基酸处出现了一个终止子。 p m d - 1 8 t - b o u g a n i n 用n o tl 和x h oi 酶切后，与经同样酶切的p e t 2 8 a 质粒连接， 构建了表达载体p e t - 2 8 a - - b o u g a n i n 。含重组子p e t - 2 8 a - b o u g a n i n 的大肠杆菌b l 2 1 经 i p t g 诱导表达，菌液及菌体超声破菌后沉淀和上清1 2 s d s p a g e 电泳，经诱导菌液 泳道及超声沉淀泳道均可见一分子量约为2 9k d a 的蛋白条带，与b o u g a n i n 的分子量吻 合，而未诱导菌液与超声上清无相应条带，这说明b o u g a n i n 以包含体形式正确表达。 对诱导条件进行了摸索，在2 8 下诱导6 小时条件下b o u g a n i n 蛋白表达量最高。m t t 法进行毒性检测，检测了重组b o u g a n i n 蛋白对h e p g 2 癌细胞的毒性作用，表明获得的 重组b o u g a n i n 蛋白具有一定的细胞毒性。 本研究从具有厦门特色的光叶三角梅( b o u g a i n v i l l e ag l a b r a ) 中的艳紫三角梅品种 ( s a n d e r i a n a ) q b ，利用基因工程方法克隆具有自主知识产权的三角梅失活蛋白的基因，构 建其原核表达系统，并获得有活性的蛋白质。b o u g a n i n 基因的成功克隆和表达为 b o u g a n i n 结构和功能的研究奠定了基础，也为农业抗病虫害和医学上抗肿瘤的应用提 供了依据。 关键词：三角梅；核糖体失活蛋白；b o u g a n i n ；克隆：表达 a b s t r a c t m a n yp l a n t sc o n t a i np r o t e i n s 、砘t ha n t i v i r a la c t i v i t y s o m eo f t h e s ep r o t e i n sb e l o n gt ot h e f a m i l yo fr i b o s o m e i n a c t i v a t i n gp r o t e i n s ( r i p s ) ，w h i c hd i r e c l yi n h i b i tt h ep r o t e i ns y n t h e s i so f r i b o s o m e s r i p sc a nb ed i v i d e di nt w og r o u so nt h eb a s i so ft h e i rs t r u c t u r e ，t y p e ir i p sa n d t y p e - i ir i p s b o u g a n i ni sat y p e ir i pt h a tp u r i f i e df r o mb o u g a i n v i l l e ds p e c t a b i l i sw i l l d ，i t w a sf o u n dt h a tb o u g a n i ni st h el e a s tt o x i cr i pk n o w n t h eb o u g a n i ns e q u e n c ew i k qc l o n e df r o mt h el e a v e so fs e e d so f b o u g a i n v i l l e ag l a b r ab y p c r n o tis i t ew a si n t r o d u c e da tt h eu p s t r e a mp r i m e rw h e r e a sas t o pc o d o na n dx h ois i t e w e r ea d d e da tt h ed o w n s t r e a m t h en u c l e o t i d es e q u e n c e so ft h et a r g e td n aa m p l i f i c a t i o n f r a g m e n tw e r es e q u e n c e da f t e rt ac l o n i n g t h eb o u g a n i ng e n ei s7 5 0b pa n de n c o d e sa p r o t e i no f 2 5 0a m i n o a c i dr e s i d u e s i nc o m p a r i s o nw i t ht h er e p o r t e db o u g a n i ns e q u e n c ef r o m t h er s p e c t a b i l l i sw i l l d ，t h en u c l e o t i d es e q u e n c e o m o l o g yo ft h ec l o n e db o u g a n i ng e n ew a s 8 3 a n di nt h ep r o t e i nr e s i d u e st h e2 2 9 t ha m i n o - a c i di sa s t o pc o d o n t h ef r a g m e n t sd i g e s t e dw i t hr e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e sx h oia n dn o t1w e 把s u b s e q u e m l y c l o n e di n t ot h ev e c t o rp e t - 2 8 a ec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) t r a n s f o r m e dw i t ht h ee x p r e s s i o np l a s m i d w a sg r o w ni nl ba t3 t ct oa no p d c a ld e n s i t yo f0 6 e x p r e s s i o nw a si n d u c e db ya d d i n g i p t gt oaf i n a lc o n c e n t r a t i o no f0 5m m o l la n di n c u b a t i o n 谢t l is h a k i n ga t2 8 c f o r6l lt h i s i st h eb e s ti n d u c e dc o n d i t i o nf o rb o u g a n i ng e n ee x p r e s s i o n t h ep r o d u c tw a si d e n t i f i e db y 1 2 s d s p a g e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h er e c o m b i n a n tp r o d u c ti sa b o u t2 9k d aa n di t m a i n l ye x i s t e di ni n c l u s i o nb o d y t h er e c o m b i n a n tp r o t e i ni ni n c l u s i o nb o d yw a sd e n a t u r e d 、v i t i8 m o l ln r e aa n dw a sr e n a t u r e db yd i a l y s i s t h er e n a t u r e da n dp u r i f i e dp r o t e i n ss h o w e d as i n g l eb a n do n1 2 s d s - p a g e t h ec y t o t o x i c i t yo fb o u g a n i n 襁e v a l u a t e db yt h em t t a s s a yi nh e p g 2c e l l sf o l l o w i n gf l u i d - p h a s ee n d o e y t o s i s t h er e s u l t so fm t ta s s a ys h o w e d t h eb o u g a n i np o s s e s s e dt o x i c i t yt oh e p g 2c e l l s i nt h i sa r t i c l e ，w er e p o r tt h a tb o u g a n i ng e n eh a sb e e ns u c c e s s f u l l yc l o n e df r o mt h el e a f o fb o u g a i n v i l l e ag l a b r a ( s a n d e r i a n a ) f r o mx i a m e na n de x p r e s s e di nec o i lt h ed e e p l y r e s e a r c ho fb o u g a n i ng e n ec a ng e n e r a t e sa p r o s p e c tf o rt h ea p p l i c a t i o ni na g r i c u l t u r ea n dt h e e x p l o i t a t i o no f m e d i c i n e k e yw o r d s ：b o u g a i n v i l l e a g l a b r a ；b o u g a n i n ；r i b o s o m e - i n a c t i v a t i n gp r o t e i n ；c l o n i n g ； e x p r e s s i o n ； 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在 文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文产生的权利 和责任。 声明人签名：盔孙细丫 b c 年宫月l ，日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦 门大学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸 质版和电子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允 许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关 数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密 的学位论文在解密后适用本规定。 本学位论文属于 1 、保密() ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密辽 ( 请在以上相应括号内打“”) 啤阱 月 月 c o q 年 午0 出 沙 讼 期 期 、匿 丫v口可 秽 ，h 够3 ，胁寸孙郦 名 名 签 签 者 师 作 导 三角梅核糖体失活蛋白的基因克隆和表选研究 1 核糖体失活蛋白的研究概况 前言 1 1 核糖体失活蛋白的一般性质 核糖体失活蛋i 刍( r i b o s o m e - i n a c t i v a t i n gp r o t e i n s ，r i p s ) 的发现历史应该追溯到 1 8 8 7 年，d i x o n 首先提出蓖麻子的毒性应该归因于某种蛋白质。随着 s f i l l m a r k ( 1 8 8 8 ) 发现了蓖麻毒蛋白( r i c i n ) 和h e l l i n ( 1 8 8 9 ) 发现了相思子毒蛋白 ( a b r i n ) 及其凝集素活性，e h r l i e h ( 1 8 9 1 ) 用r i c i n 和a b r i n 对兔子进行了免疫学 试验获得了相应的抗体。1 9 6 0 年，l i n 等发现这些毒素对腹水癌细胞的毒性比对 正常细胞的大，人们对之又投入了更多的兴趣，并发现了它们能使核糖体失活、 抑制蛋白质生物合成的特性。我国科学家发现，被失活的核糖体在无细胞体系中 的蛋白质翻译活力可以被硼氢化钠或者氨基酸部分地恢复。 核糖体失活蛋白是一类专门作用于真核细胞抑制核糖体功能的毒蛋白。它们 来自于细菌、真菌和高等植物。现有的r i p 习惯上分为以d e i n a 链为代表的r n a n 糖苷酶型和以a - s a r c i n 为代表的r n a 水解酶两种类型，分别通过专一脱去2 8 s r r n aa 4 3 2 4 位点的腺嘌呤和专切割g 4 3 2 5 位点3 侧的磷酸二酯键而中止核糖 体的蛋白质生物合成功能。 植物r i p 按其结构的不同可分为两种类型：i 型和型。i 型r i p 由一条多 肽链组成，在植物界中分布比较广泛，目前已在3 0 多种植物中鉴定纯化出i 型 r i p ，如天花粉毒蛋白( t r i c h o s a n t h i n ，t c s ) ，美洲商路毒蛋i 白( p o k e w e e da n t i v i r a l p r o t e i n ，p a p ) 等。i i 型r i p 由a 链和b 链组成，两条链通过二硫键相连接，如 r i c i n 、a b r i n 。a 链和i 型r i p 一样具有r n an 糖苷酶活力，可以使核糖体失活。 b 链具有凝集素功能，可以与细胞表面以d 一半乳糖为末端的糖蛋白或糖脂结 合，并帮助a 链穿膜进入细胞。 r i p 的研究具有重要的理论与实践意义。理论上，r i p 对核糖体的作用可以 作为研究蛋白质与核酸相互作用的模型；实践上，以r i p 为弹头的免疫毒素在肿 瘤及自身免疫疾病的治疗研究中已取得了很好的结果，同时r i p 在动、植物抗病 毒等方面也有潜在的应用前景。随着对r i p 研究的深入，又发现美洲商陆毒蛋白 ( p a p ) ，天花粉蛋白( t c s ) 等r i p 能够抑制h i v - i 病毒在急慢性感染的淋巴细 三角梅核糖体失活蛋白的基囡克隆和表达研究 胞、单核巨噬细胞中的复制，而对正常细胞没有毒性。这一结果引起了人们的极 大关注，也为r i p 的研究开拓了一个新的方向。 1 2 核糖体失活蛋白的定义和分类 “核糖体失活蛋白”一词最初的定义是：能使动物核糖体失活，但结构和酶 活性未知的植物蛋白。在阐明了r j p 对核糖体的作用机理( e n d oc t a l ，1 9 8 7 ) 之后， 它专指含有r n a n 糖苷酶结构域的蛋白。这样，就使其与那些通过其它机制使 核糖体失活或损害的蛋白区分开来，如r n a 酶或蛋白酶( p e u m a me t a l 2 0 0 1 ) 。 r i p 可根据其分子结构的不同分为单链( i 型) 和双链( i i 型) 两种类型。i 型r i p ， 只有一条多肽链，如t c s 和p a p 等，相对分子量大多在2 0 3 0k d a 之间，具有 r n an 糖苷酶活性。但有些l 型r i p 的分子量较小，如从括楼籽中分离的8k d a 的s t r i c h o k i r i n ( 邰宁文等，2 0 0 0 ) 、从角瓜( l u f aa c u t a n g u l a ) d p 分离的5 6k d a 的 l u f a n g u l i nf w a n g e ta 1 ，2 0 0 2 ) 、从丝瓜( l u f ac y l i n d r i c a l ) 籽中分离的8k d a 的l u t i n s ( 熊长云等，1 9 9 8 ) 以及从苦瓜中分离的9 7k d a 的c h a r a n t i n 和y m o m o r c h a r i n ( p a r k a s he ta 1 ，2 0 0 2 ) 。i i 型r i p ，由两条多肽链组成，如r i c i n 和a b r i n 等，相对分子量大多为6 0k d a ，多肽链之间借助二硫键连接而成异源二聚体， 其中a 链与i 型r i p 的结构和功能相似，而b 链类似凝集素，可协助a 链进入细胞。 有的i i 型r i p 也存在四聚体形式。如f i c i n 由两个完全相同的异源二聚体通过非共 价键连接而成四聚体( 候法建等，2 0 0 0 ) 。 1 3 核糖体失活蛋白的分布 目前报道的r i p 大多分离自高等植物，少数来源于真菌和细菌。 1 , 3 1 细菌来源的r i p 细菌r i p 的报道很少，常见的有志贺菌( 勘泓l l ud y s e n t e r i a e1 ) 产生的志贺 毒素( s h i g at o x i n ) 以及大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 菌株产生的类志贺毒素( s h i g a - l i k e t o x i n w 魏明卉等，2 0 0 1 ) 。 1 3 2 真菌来源的r i p 目前真菌中报道的r i p 均为l 型，分子量一般小于2 0k d a ，大多数编码基因 尚未被克隆。已经从霉菌类( a s p e r g i l l u s ) 分至1 a - s a r c i n ，c l a v i n ，m i t o g i l l i n 和 r e s t r i c t o c i n 等r i p 。近年来，也报道了不少的r i p 来自食用菌，如v o l v a r i n ， 三角梅核糖体失活蛋白的摹因克隆和表达研究 f l a m m u l i n ，v e l u t i n ，p l e u t u r e g i n ，h y p s i n 和l y o p h y l l i n 。此外，一神土生真菌 ( t r i c h o d e r m av i r i d e ) d p 也报道有r i p 。 1 3 3 植物来源的r i p 1 3 3 1r i p 在不同科植物中的分布 迄今为止，人们分离到的r i p 大多为i 型。i 型r i p 主要分离自葫芦科、石竹 科、禾本科、商陆科、蓼科、百合科等植物；而i i 型r j p 仅在大戟科、蚕豆斗、 西番莲科、忍冬科、毛茛科、桑寄生科、鸢尾科和樟科的一些植物中报道过。 有些植物中同时存在有i 型和i i 型r i p ，如荷兰鸯尾( i r i sh o l l a n d i c a ) 至：少存在两 种i i 型r i p0 r i sa g g l u t i n i nb 和i r i sa g g l u t i n i nn 和一种i 型r i p ( h a oe ta l ，2 0 0 1 ) 。 1 3 3 2r i p 在植物组织器官和细胞中的分布 石竹类植物( d i a n t h u ss i n e n s i s ) 的花、时、根、以及茎杆中均有r i p 的分布， 其中以叶片中的含量最为丰富。辛纳毒蛋仨i ( c i n n a m o m i n ) r 存在于香樟种子中， 无法从叶片和成熟的果肉中分离到，多数情况下，同一植物不同组织，甚至同 一组织中同时存在有几种不同的r i p 。r i p 在美洲商陆( p h y t o l l a c aa m e r i c a n ) 春天 的叶( p a p ) 、夏天的叶( p a p - h ) 、种子( p a p s ) 以及根( p a p r ) 等组织中均有发现 ( t u r n e r e ta 1 ，1 9 9 7 ) 。t c s 和t a p 2 9f t r i c h o s a n t h e sa n t i h i vp r o t e i n ) 分离自栝楼块 根，括楼素( t r i c h o k i r i n ，t c k ) 分离自栝楼籽。接骨木( s a m b u c u sn i g r a ) 的果实和 树皮中均含有好几种不同的r i p 。 应用生物信息学分析、免疫杂交和免疫电镜等技术，人们对r i p 在宿主细 胞水平上的分布已有了初步了解。紫茉莉抗病毒蛋i ! i ( m i r a b i l i sa n t i v i r a l p r o t e i n ， m a p ) 在液泡中累积( k a t a o k a e t a l ，1 9 9 1 ) 。p a p 存在于细胞壁与细胞膜之间的 基质中。离体培养的栝楼愈伤组织中，t c s 大多分布于细饱壁。西葫芦毒蛋白 ( p e p o e i n1 主要分布于果肉细胞间和叶片细胞间。缕丝花r i p 大量累积在叶片细 胞问，在液泡中也有分布( y o s h i n a r ie ta 1 ，1 9 9 6 ) 。b - 3 2 主要存在于玉米胚乳的 糊粉层以及盾片的腺细胞层( g u oe t a l ，1 9 9 9 ) 。r i c i n 在蓖麻种子胚乳的蛋白体 中累积( p e u m a n se ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 1 4 核糖体失活蛋白的酶活性 目前所发现的r i p ，酶活性主要是通过蛋白质体外翻译体系的抑制作用而确 三角梅核糖体失活蛋白的基凶克隆和表达研究 定的，在具体机制上，主要是对r r n a 的n 糖苷酶活性，少数为磷酸二酯酶活 性，另外还有个别表现为其他类型的酶活力。 1 4 1r n an 糖苷酶活性 e n d o 等首先发现r i p 作用于哺乳动物细胞核糖体的2 8 sr r n a ，使4 3 2 4 位 的腺嘌呤核苷酸脱嘌呤化，在苯胺作用下，磷酸二酯键断裂，核糖体r r n a 释放 出一个短的r n a 片断，能通过电泳检测。不同植物来源的r i p 对核糖体的作用 位点高度专一，但有极少数r i p 如s a p o r i n 例外，它们在浓度较高时能在r r n a 的多个位点脱嘌呤。e n d o 等比较了大量真核和原核细胞的核糖体后发现，r i p 的作用位点位于2 6 s 2 5 sr r n a 的一个茎环结构的区域，称之为“r s 区”，该区 由1 4 个核苷酸残基组成，其中最为保守的序列为g a g a 。以其他r r n a 如2 6 s r r n a 、2 5 sr r n a 、2 3 sr r n a 、1 6 sr r n a 为底物时，r i p 作用位点的保守区是 一致的。此外，人工合成的包含“r s 区”的寡聚核苷酸也可以作为r i p 的有效 底物。 交簋簋蛊 图1 1r i p 对核糖体的作用位点示意图 f i 9 1 1s t r u c t u s o f r n a ss u b s t r a t c f o r n - g l y c o s i d a s ea c t i v i t y o f r i p s 有人提出，r r n a 上r i p 作用的a 残基相当于一个“分子开关”，当它被修 饰或切除后，引起r r n a 的构象改变，进而引起核糖体蛋白的拓扑构象的大幅度 变化，最终影响延伸因子e f 一1 和e f - 2 g t p 复合物的结合，从而使肽链合成的 延伸受阻。因此，r i p 在研究蛋白质合成的动力学过程中成为十分有用的分子探 针。 4 角梅核糖体失活蛋白的基因克隆和表达研究 1 4 2 磷酸二酯酶活性 a - s a r e i n 是从帚曲霉菌( a s p e g i l l u s g i g a n t e u s ) 中分离的少数具有r n a 水解 酶活性的r i p 之一。它能够专一性切割2 8 sr r n a 的g 4 3 2 5 和a 4 3 2 6 之间的磷酸二 酯键，与具有n 一糖苷酶活力的r i p 作用位点紧密相邻。a - s a r c i n 作用于大肠杆菌 核糖体2 3 sr r n a 时，其酶切位点在g 2 6 6 l - g 2 6 6 2 ，作用于酵母2 6 sr r n a 时，其 酶切位点在g 3 0 2 5 一g 3 0 2 6 。a - s a r c i n 几乎作用于所有来源的核糖体，但切割位点均 位于大亚基高分子量r r n a 的s r 茎环的保守位点。这也从侧面说明，r r n a 的 构象在r i p 的识别过程中十分重要。 1 4 3 核糖体解聚酶活性 r e i n b o t h e 等报道了从大麦叶片中发现了种新酶学活性的r i p ，j p 一6 0 蛋 白。n 端序列分析发现它与i 型和i i 型r i p 具有4 5 相似率，( 特征序列共有率 为1 7 ) ，与i i 型r i p 相同，除开n 端结构域外，还具有b 链凝集素的第二个 结构域特征。但是分析它对核糖体和体外翻译系统的抑制活性时发现，这种新型 r i p 不作用于经典的2 8 sr r n as r 结构域，而具有独特的失活核糖体特性：( 1 ) 攻击位点为核糖体大小亚基结合区域，底物不是8 0 s 核糖体而是多聚核糖体。( 2 ) j i p - 6 0 的表达时受到病虫害和逆境条件所诱导，而在正常细胞中没有分布。( 3 ) 除了能作用于外源核糖体外，还具有对自体细胞的选择攻击作用，专一作用于受 侵害等影响而“标记”属于细胞凋亡的那一部分自体细胞核糖体。( 4 ) 这种r i p 的表达受到植物内源和外源小分子信号的调控，其基因序列中具有特定的上游信 号识别框序列。 1 4 4 核糖体失活蛋白的其他酶学活性 b a r b i c r i 发现，一些r i p 在浓度较高时，从核糖体上脱腺嘌呤碱基的数目不 只一个，如s a p o r i n 、t r i c h i k i r i n 、和p a p - r 等。s a p o r i n 的这种活性没有专一性， 作用程度与时间呈线性关系，至少可以从核糖体上脱去3 0 个腺嘌呤，更令人吃 惊的底物不仅限于r r n a ，其他形式的r n a ( m r n a ，t r n a ，病毒r n a ) 甚至d n a 也都可作为s a p o r i n 的底物。显然s a p o r i n 对底物序列的要求不是g a g a ，可能对 序列并没有特定的要求。 因此，有关r i p 识别底物的专一性受到了挑战，b a r b i e r i 等对收集到的5 2 三角梅校糖体失活蛋白的基因克隆和表达研究 种植物r i p 进行了研究，得出了令人感兴趣的发现，他发现5 2 种r i p 普遍具有 对d n a 的脱嘌呤作用，并且其中一些r i p 对几乎所有含腺嘌呤的d n a 、r n a 底物都具有脱嘌呤作用。在这些实验基础上，他们提出，对于过去称之为核糖体 失活蛋白的这一大类植物蛋白，可能以一种新的归类定义更为准确，即多核苷酸 腺苷糖苷酶( p o l y n u c l e o f i d e a d e n o s i n eg l y c o s i d a s e ) 。 1 5 核糖体失活蛋白的结构和功能 1 5 1 一级结构与功能 1 5 1 1 氨基酸组成特点和重要残基 己分离的8 个葫芦科r i p 的a s x 和g l x 残基含量较高，n 一末端氨基酸残基为 a s p ( n ge t a l ，1 9 9 2 ) 。从丝瓜中分离的1 9 k d a r i p n 端封闭，9 k d a 砌p 中的a r g 和g l u 的含量非常丰富( w a t a n a b ee ta 1 ，1 9 9 0 ) 。t c s 的c 一末端是不均一的，为 m e t 或a l a 。栝楼蛋白( 啊c h o b i t a c i n ) 的n 端3 8 个氨基酸与t c s 仅有一个差异，它们 的氨基酸组成很相似，不含c y s ，但有些氨基酸如m e t 、s e r 和i l e 等的含量差别很 大( 汪猷，2 0 0 0 ) 。r i c i n a 链中l y s 的含量极低，这样可使其从内质网腔转移到细 胞质的过程中受遍在蛋i 刍( u b i q u i t i n a t i o n ) 降解的风险降低( d e e k se ta 1 ，2 0 0 2 ) a 多 花白树抗h i v 蛋1 ；t 3 1 ( g e l o n i u mm u u i f o r u ma n t i h i vp r o t e i n ，3 1 k d a ，g a p 3 1 ) 的 k 1 0 - k 4 2 目t r , n 端的七氨基酸序列( k g a t y i t ) ，是其结合d n a 和r n a 功能的关键， 而c 端的九氨基酸序列( s h g i p s l r k ) ，对核糖体失活有重要意义。这两个区域 均与抗h 活性有关。而第3 5 位的h i s 对g a p 3 1 的所有活性都是至关重要的。p a p 与r i c i na 链在1 7 0 1 8 3 区段高度同源，而中间的7 7 9 区段和1 4 1 1 6 9 区段以及c 端的1 5 个氨基酸残基很少同源( 曾宗浩等，1 9 9 8 ) 。 1 5 1 2 二硫键 大多数i 型r i p 不含二硫键，只有少数几个例外。从丝瓜中分离的1 9 k d ar i p 含有3 个分子内二硫键( w a t a n a b e e t a l ，1 9 9 0 ) 。m a p 在体外菲常稳定是由于有一 分子内二硫键( h a b u k a e t a l ，1 9 9 1 ) 。p a p 含有2 个分子内二硫键，分别连接c y s 3 4 和c y s 2 5 8 ，c v s 8 4 和c y s 1 0 5 ，一个把紧跟ol 螺旋后的一段环套和c 末端连接起 来，另一个连接a2 螺旋和1 35 折叠( 曾宗浩等，1 9 9 8 ) 。 i i 型r i p c y s 的含量和分布大致相同。辛纳毒蛋白中含有1 0 个c y s ，共形成 三角梅核糖体失活蛋白的基因克隆和表达研究 5 个二硫键，其中1 个连接a 、b 链，另外4 个为链内二硫键( y a n ge ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 1 5 1 3 糖基 砌p 大多是糖蛋白，含糖量一般在1 - 7 左右。a - l u f i n 上的2 8 ，3 3 ，7 7 ，8 4 ， 2 0 6 和2 2 7 位点发生糖基化，每个位点都只连接一个n 乙酞d 葡糖胺( g i c n a c ) ， b 1 u f i n 上的2 、7 8 和8 5 位点，以及p a p - s 上的l o 、4 4 和2 5 5 位点也发生糖基化。 除t c s # b ，已发现的8 个葫芦科r i p 均为糖蛋白。 辛纳毒蛋白a 链含糖量为0 3 ，b 链为4 3 ( y a n ge ta 1 ，2 0 0 2 ) 。从矮接骨 木( s a m b u c u se b u l u s ) 叶片中分离的型r i pc b u i h al ，其b 链可结合d 一半乳糖， 接骨木树皮中分离到的两种i i 型r i ps n a i 和s n a i 都能结合n 一乙酰一半乳糖， 另一种新的型r i p 的b 链含有两个功能失活的糖结合位点( v a nd o m m ee ta 1 ， 19 9 7 ) 。a g g _ l u t i n i nb 和a g g l u t i n i nr 不仅能结合n 一乙酰一氨基半乳糖苷，而且可与 甘露糖结合，这是首次报道p 上有甘露糖结合位点( h a oe ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 糖链在r i p 中的功能目前还不十分清楚，据推测可能与它们在植物中的溶解 度以及与靶细胞位点的结合有关( 魏明卉等，2 0 0 1 ) 。糖基化与否并不影响r i p 的 r n a n - 糖苷酶活性的发挥( e c ke ta 1 ，1 9 9 91 。 1 5 2 空间结构与功能 目前至少己有7 种l 型r i p 和3 种型r i p 的晶体结构被测定。不同r i p 的空间结 构非常相似，在折叠方式、关键活性残基的位置和活性缝隙等方面高度类似。 主要的差异发生在c 一末端区域和表面环套结构上，从而造成不同r i p 在活性和 底物特异性上的差剐( p e u m a n se ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 t c s 晶体结构于1 9 8 5 年被测定，是国际上第一个建立了分子模型的i 型 p a p ( 熊国样，1 9 9 9 ) 。它可分为2 个结构域，大的结构域从n 端开始到p m 1 8 l ，它 包含一个由6 条b 链所组成的大的b 折叠层，6 段a 螺旋和一个反平行的1 3 折叠 结构，在这个结构域中，二级结构十分丰富。小的结构域从s e r - 1 8 2 到c 端，共 有“个氨基酸残基，它包含了一段有转折的n7 螺旋，一段短的a3 螺旋和一个反 平行的b 折叠。两个结构域之间除了通过b3 和b1 3 的平行b 折叠联系之外，还 有一些氢键和疏水残基问的接触。因此，两个结构域间形成比较紧密的结构。 n 螺旋相对集中在蛋白分子的中央，由1 3 条b 链所构成的4 个1 3 折叠层则分布在 蛋白分子表面，这是t c s 空问结构的显著特点( 汪猷等，2 0 0 0 ) 。 三角梅核糖体失活蛋白的基因克隆和表达研究 p a p 具有三个明显不同的结构域：1 6 9 区段构成n 端结构域，7 0 1 7 9 区段形 成中央结构域，二者相当于t c s 的大结构域，1 8 0 - 2 6 2 区段为c 端结构域，相当 于t c s 的小结构域。中央结构域包含了所有活性残基( t y r - 7 2 、t y r 1 2 3 、g l u 1 7 6 和a 学1 7 9 ) ，其中t y 卜7 2 和i 了r 1 2 3 可熊夹着底物r r n a 的腺嘌岭环，而a r g 一1 7 9 和g l u - 1 7 6 直接参与对a - s a r c i r d r i c i n 环套的脱嘌呤作用。中央结构域和c 端结构域 问的接触面上有一活性裂缝，可容纳底物r r n a 分子。在活性残基附近，高度保 守的残基、带电残基、以及活性缝上的极性残基对p a p 的脱rr n a 腺嘌呤作用也 是很重要的( p e u m a l l se ta 1 ，2 0 0 1 ) 。p a p 分子表面6 4 为疏水表面，3 6 为亲水 表面，大小结构域的接触面则有3 4 疏水残基。n5 螺旋的大部分埋藏在分子内部， 连续地分布着6 个疏水残基。连接1 3s 与n2 的环套区( 9 0 - 9 4 ) ，正位于分子表面活 性缝出口的台阶上。脱嘌呤作用所需的质子供体残基就在这一环套区上，从序 列上看，这是序列的多变区，可能因此导致不同p a p s ( p a p - s 、p a p 和q p a p ) 活性的差异f 曾宗浩等，1 9 9 8 ) 。 r i c i na 链可分成三个区域。区域1 由n 末端1 1 4 个氨基酸残基构成，主要为 平行的1 3 片层结构，其中包含了f i c i n 唯一伸展的b 片层，该区域还含有两个a - 螺旋。区域2 由残基1 1 5 2 1 0 构成，几乎全部是螺旋结构，含有5 个a - 螺旋。区域1 和2 相当于t c s 的大结构域。区域3 由残基2 11 2 6 7 构成，近似圆筒状，与区域2 和b 链相连。蛋白表面6 个非极性基团有5 个来自区域3 ，构成a 链的主要疏水区。 区域3 相当于t c s 的小结构域。b 链包含两个近似球型的区域，a 链紧靠在b 链两 个区域的连接处f 孙志贤等，1 9 9 5 ) 。 2 核糖体失活蛋白的应用 2 1 核糖体失活蛋白的抗病毒应用 2 1 1r i p 抗植物病毒 人们很早就发现美洲商陆的叶片抽提液与烟草花叶病毒( t o b a c o om o s a i c v i r u ，t m v ) 作用后，可以阻止t m v 对其他植株的感染。后来人们从美洲商陆 中分离出抗病毒成分，并确定该种成分为蛋白质，命名为美洲商陆抗病毒蛋白 f a n t i - v i r u sp r o t e i np a p ) 以后的实验发现，几乎所有的r i p ，包括i 型和i i 型r i p 都具有不同程度的抑制t m v 感染的活性。 三角梅核糖体失活蛋白的基因克隆和表达研究 r i p 抗植物病毒的机理还不清楚，但r i p 似乎并不作用于病毒本身，因为将 1 m v 与p a p 混合后，离心收集病毒颗粒，病毒仍具有感染能力；而且病毒r n a 中没有r i p 识别的结构域。 r i p 的抗病毒活性可能与失活植物细胞核糖体有关，y a m a i z u m i 和f e r n a n d e z 等认为，病毒感染会引起植物细胞膜通透性改变，这使得正常情况下不能进入植 物细胞的分子如r i p 此时能够穿膜进入细胞，入胞后的r j p 能够失活植物细胞 的核糖体而无法翻译病毒复制所需的蛋白。 2 1 2r i p 抗动物病毒 1 9 9 1 年，m c g r a t h 等报道t c s 在急性感染的t 淋巴细胞和慢性感染的巨噬 细胞中能强烈抑制h i v - i 病毒的复制，这一发现引起学术界的极大兴趣。他将感 染了h w 的病人血清用t c s 处理3 小时，发现h i v 的复制至少在5 天内被抑制。 z h a o 等的进一步研究结果表明，细胞内的趋化因子和趋化因子受体在h i v 病毒 的感染过程中起着重要作用，t c s 能够增强趋化因子刺激趋化性和g 蛋白活化 的能力，而这种作用受至4t c s 与趋化因子受体之问相互作用的调节。 随着对r i p 研究的深入，人们发现许多r i p 都可以抑制h i v 病毒对细胞的 感染。a u 等研究了几种r i p 如a g r o s t i n 、s a p o r i n 、l u f f m 、t r i c h o s a n t h i n 、1 3 一 m o m o r c h a r i n 等在体外抑制h i v - 1 病毒复制的机理，发现在1 0 0 n m o l l 的浓度下， 这些r i p 都能略微增强c d 4 g p l 2 0 之间的作用，对h i v - i 逆转录酶、h i v - i 蛋白 酶的抑制作用比较弱，但对h i v - i 整合酶却有强烈的抑制作用，其中s a p o r i n 和 l u f f m 能够抑制h i v - 1 整合酶的活性达9 0 。进一步的研究表明，s a p o r i n 和l u t t i n 能够h i v 整合酶的3 端链处理和链转移活性。现在t c s 等r i p 制剂已进入临床 应用阶段。 2 2 核糖体失活蛋白的抗肿瘤应用 2 2 。1 免疫毒素 双功能交联剂将r i p 与抗体偶联，就能构成免疫毒素( i m m u n o t o x i n ) ，它可 以专一性的杀伤抗体针对的靶细胞。目前，免疫毒素已被用于肿瘤治疗及移植物 抗宿主疾病( c r a f t v e r s u s h o s td i s e a s eg v h d ) 等疾病的治疗研究。 不少r i p 对肿瘤细胞有抑制和杀伤作用，如香樟( c i n n a m o m u mc a m p h o r a ) 种 9 三角梅核糖体失活蛋白的基因克隆和表达研究 子中分离的i 型r i p 克木毒蛋i ! t ( e a m p h o r i n ) 和i i 型r i p 辛纳毒蛋白( c i n n a m o m i n ) 对 人肝癌细胞7 7 2 1 和黑色素瘤缨胞m 2 1 有明显的抑制和杀伤效应，而对正常的小鼠 上皮培养细胞( s m c - 1 3 ) ；3 f ：抑制作f ( l i n ge ta 1 ，1 9 9 6 ) 。r i p 对肿瘤细胞的作用可能 与细胞凋亡有关，如r i c i n 能诱导肝细胞凋亡，a - s a r c i n 通过内吞作用进入肿瘤细 胞后，诱导其发生凋亡f 董巨莹等，2 0 0 0 ) 。 i 型和i i 型r p 都可以用来制备兔疫毒素。其中最常用的是r i e i n a 链。最初 制各免疫毒素采用完整的r i e i n ，但完整r i c i n 的b 链具有半乳糖结合能力，而几 乎所有哺乳动物细胞表面都有半乳糖残基，会造成非专一性的杀伤，采用r i c i na 链可以避免这种菲专一性杀伤，但b 链除有细胞结合能力外，还髓够帮助a 链 跨膜进入细胞，因而缺失r i c i nb 链又带来进入细胞的效率降低的问题。一些实 验室试图解决这个问题，采用盼措旎有：游离的或与抗体偶联的b 链与免疫毒 素共同作用；将完整r i c i nb