（植物学专业论文）用mpcr检测闽江流域表面水体中病原性大肠杆菌的毒素基因.pdf

摘要 摘要 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l l ) 是人和温血动物肠内普遍存在的细菌，可分为病 原性大肠杆菌和非病原性大肠杆菌。本文在文献综述中介绍了大肠杆菌毒素基因检 测的研究进展以及多重p c r ( m u l t i p l e xp c r ) 技术的发展和应用。本研究以闽江流 域表体水面中分离出的大肠杆菌为材料，经膜过滤法( m e m b r a n ef i l t r a t i o nm e t h o d ) 结合m f c - - b c i g 培养基的方法来分离粪大肠杆菌，并使用乳糖发酵培养基和磷酸 盐葡萄糖胨水培养基来对其进行生化检测，最终确定单位体积水样中粪大肠杆菌的 数量，然后将粪大肠杆菌菌株制成p c r 模板同时甘油保存。 研究结果表明：对闽江流域从上游到下游7 个断面进行了大肠杆菌的分离、鉴 定和1 2 种毒素基因的多重p c r 检测。在鉴定的1 2 3 1 株粪大肠杆菌中检出1 0 种毒 素基因，其中具有扩散性黏附素( a i d a j ) 毒素基因的大肠杆菌占总数的1 2 9 9 ， 热不稳定肠毒素( e l t ) 和热稳定肠毒素( a s t a ) 数量次之( 分别占总数的5 8 和5 4 ) ， 还检测出了少数高危菌株的主要致病因子，例如志贺氏毒素( s t x 2 e ) 和耐药性因子 ( s e p a ) 等。 分别于不同季节在闽江流域福州过境段的洪山桥和解放大桥断面采取水样，进 行大肠杆菌的分离、鉴定。用多重p c r 方法对不同季节分离的大肠杆菌毒素基因的 时空分布进行定性与定量分析。从分离的2 0 1 5 株粪大肠杆菌中发现8 4 0 株潜在的致 病性大肠杆菌，分别属于肠出血性大肠杆菌( e h e c ) 、肠聚集性大肠杆菌( e a e c ) 、肠 致病性大肠杆菌( e p e c ) 和肠产毒性大肠杆菌( e t e c ) 。检出的1 0 种毒素基因中， 以 扩散性黏附素基因( a i d a j ) 、热稳定性肠毒素基因( a s t a ) 和耐药性因子( s e p a ) 为最多；细菌总量、大肠杆菌总数和致病性大肠杆菌总数在冬季较低，春季较多， 夏秋季节达到全年数量的高峰；潜在的致病性大肠杆菌的毒素基因的种类和数量也 是在冬季最少，春夏季上升，秋季最多。 使用多重p c r ( m u l t i p l e xp c r ) 的方法对粪大肠杆菌菌株中的毒素基因 ( v i r u l e n c eg e n e ) 进行检测，为闽江河的污染现状和风险评估提供科学依据和技术 支撑。 关键词：闽江流域；大肠杆菌；毒素基因；多重p c r 中文文摘 中文文摘 本研究以闽江流域表体自上游至下游水面中分离出的大肠杆菌为材料，使用膜 过滤法分离出了粪大肠杆菌，并对其1 2 种毒素基因使用多重p c r 的方法进行检测。 在水体粪大肠杆菌的分离、富集和生化鉴定中，1 3 葡萄糖醛酸酶是大肠杆菌产 生的一种特异性酶，研究发现，9 4 - - 9 6 的大肠杆菌均表达1 3 葡萄糖醛酸酶，而 其它肠道细菌表达1 3 葡萄糖醛酸酶的比例明显低于大肠杆菌。它可水解不同的底物 生成有色或发光物质，从而完成对大肠杆菌的快速检测。用于检测1 3 一葡萄糖醛酸酶 的底物有很多种，如4 甲基伞形酮一1 3 一d 葡萄糖醛酸苷( m u g ) ，5 一溴4 氯3 吲哚基 1 3 d 葡萄糖醛酸苷( b c i g ) 。本实验采用的底物为b c i g ，是将b c i g 添加到m f c 基 础培养基中。m f c 基础培养基中蛋白胨作为碳、氮源及维生素矿物质来源，其中牛 胆盐能够抑制革兰氏阳性细菌的生长。在m f c b c i g 培养基上，具有1 3 葡萄糖醛酸 酶活性的微生物将在培养基上产生可见的蓝色菌落。挑取蓝色的菌落接种于l b 固 体培养基上，3 7 培养2 4h 后，接入l b 液体培养基中，再在3 7 下的培养箱中 培养2 4h 。 取培养的菌液，接种于乳糖发酵培养基，3 7 培养2 4h 后，观察产酸，培养 基中添加了溴酚紫作为指示剂，若有产酸，培养基则由紫色变为黄色，即培养基呈 黄色的为阳性，颜色不变呈紫色的则为阴性；接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基，3 7 培养2 4h 后，加入1 0 l 甲基红溶液，轻轻摇动，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试 剂本色为阴性。一般2 4h 即可出现阳性结果。吲哚是色氨酸的组成成分，大肠杆菌 能够产生色氨酸酶分解色氨酸以提供营养需要，色氨酸分解为吲哚后，可与甲基红 溶液中的对二甲基氨基苯甲醛反应，生成玫瑰吲哚，呈玫瑰红色。 双重检测后，将分离物保存于终浓度为1 5 的甘油中，放置一7 0 的超低温冰 箱中待用。甘油保存的大肠杆菌可以2 的体积分别接种到含1 0 0p ll b 培养液的 9 6 孔细胞培养板中，3 7 过夜培养，在2 5 0 0r p m 的条件下离心2 5m i n ，然后去上 清，并将残余的培养液晾干。最后加入1 0 0 9 l 的无菌水，轻轻震荡至菌体重新悬浮， 作为p c r 反应的模板，2 0 保存备用。 本研究采用多重p c r 的方法，把引物分为3 组，每组四对引物，对闽江流域自 上游至下游表面水体中大肠杆菌的毒素基因的种类及数量，并对毒素基因的种类进 v 福建师范大学黄文文硕士学位论文 行分型。并采用同样的方法，对闽江流域福州过境段洪山桥和解放大桥两处表面水 体进行5 次采样且对水体中大肠杆菌的毒素基因进行检测并对其中原因进行分析。 实验结果表明：闽江流域从上游到下游7 个断面中，鉴定的1 2 3 1 株粪大肠杆菌 中检出1 0 种毒素基因，其中具有扩散性黏附素( a i d a 1 ) 毒素基因的大肠杆菌占总 数的1 2 9 9 ，热不稳定肠毒素( e l t ) 和热稳定肠毒素( a s t a ) 的数量次之( 分别占 总数5 8 和5 4 ) ，还检测出了少数高危菌株的主要致病因子，例如志贺氏毒素 ( s t x 2 e ) 和耐药性因子( s e p a ) 等，这1 0 种毒素基因分属于肠出血性大肠杆菌 ( e h e c ) 、肠产毒大肠杆菌性( e t e c ) ，肠致病性大肠杆菌( e p e c ) ，肠聚集性大肠杆 菌( b 垣c ) 四个亚群。从上游劲下游致病性大肠杆菌毒性类型和毒素基因数量呈上 升趋势。从处于闽江上游三大支流建溪、富屯溪和沙溪会合处的南平市毒性类型和 毒素基因数量明显高于上游。这可能与上游的污染物排放和南平市人口密集，畜禽 养殖业和生活污水排放量大有关。福州过境段致病性大肠杆菌毒性类型和毒素基因 数量较高除了本地污染物排放外，也可能部分归因于上中游水体的污染。 福州过境段检出的1 0 种毒素基因中，以扩散性黏附素基因( a i d a j ) 、热稳定 性肠毒素基因( a s t a ) 和耐药性因子( s e p a ) 为最多；细菌总量、大肠杆菌总数和 致病性大肠杆菌总数在冬季较低，春季较多，夏秋季节达到全年数量的高峰；潜在 的致病性大肠杆菌的毒素基因的种类和数量也是在冬季最少，春夏季上升，秋季最 多。福州位于闽江下游，上游支流和干流各种污染物流经洪山桥和解放大桥后注入 台湾海峡，福州又是闽江流域排污量最大的城市，这与闽江沿岸和福州地区养殖业 和生活污水的排放不无关系。大肠杆菌种类、数量在春夏秋季逐渐增多，肠道病毒 性疾病在夏秋季是发病高峰。原因可能是较之春冬季节，大肠杆菌在夏秋季节的温 度下存活时间更长。 a b s t r a c t a b s t r a c t e s c h e r i c h i ac o l i ( e c o a ) ，ak i n do fc o m m o nb a c t e r i ai nt h ei n t e s t i n eo fh u m a n b e i n g sa n de n d o t h e r m i tc a nb ed i v i d e di n t ot w ot y p e s ：p a t h o g e n i ca n dn o n p a t h o g e n i c e s c h e r i c h i ac o h i nt h i st h e s i s ，t h er e s e a r c hp r o g r e s so ft h ed e t e c t i o no fv i r o g e n e si nt h e p a t h o g e n i ce s c h e r i c h i ac o l ia n dt h ed e v e l o p m e n ta n da p p l i c a t i o no fm - p c rt e c h n o l o g y w e r ei n t r o d u c e di nt h el i t e r a t u r er e v i e w t h em a t e r i a lo ft h i ss t u d yw a st h ee s c h e r i c h i a c o l i t h a to r i g i n a t e df r o mm i n j i a n gr i v e r t h ee s c h e r i c h i ac o l iw a sd i v i d e dw i t h m e m b r a n ef i l t r a t i o nm e t h o da n dt h eu s i n go fm f cb r o t h t h eb i o c h e m i s t r yc h a r a c t e ro f t h ep a t h o g e n i ce s c h e r i c h i ac o l iw a sd e t e c t e db yl a c t o s ef e r m e n t a t i o nb r o t ha n d t r y p t o n eb r o t h t h e nt h en u m b e ro ft h ee s c h e r i c h i ac o l iw a sa s c e r t a i n e d t h er e s e a r c hr e s u l t sr e v e a l e dt h a t12 3le s c h e r i c h i ac o l ii s o l a t e sf r o ms e v e n s a m p l i n gs i t e sc o v e t i n gu p s t r e a mt od o w n s t r e a mo fm i n j i a n gr i v e rw a t e r s h e dw e r e i n v e s t i g a t e du s i n gm u l t i p l e x p c rw i t h 12p a i r so fp r i m e r so fv i r u l e n c eg e n e s 10 v i r u l e n c eg e n e sw e r ef o u n di nt h ee c o l ii s o l a t e st e s t e d 1 2 9 9 i s o l a t e sc a r r i e dt h e a i d a - 1g e n e ，5 8 i s o l a t e sp o s s e s s e dt h ee l tg e n ea n d5 4 i s o l a t e sh a r b o r e dt h ea s t a g e n e t h e10v e r og e n e sf o u n di nt h i ss t u d yw e r eg r o u p e dt oe h e c ( e n t e r o h e m o r r h a g i c ec o l o ，e t e c ( e n t e r o t o x i g e n i cec o t i ) ，e p e c ( e n t e r o p a t h o g e n i cec o l i ) a n de a e c ( e n t e r o a g g r e g a t i v ee c o l i ) t h ed i s t r i b u t i o no ft h eg e n o t y p e sa n dq u a n t i t ya ts e v e n s a m p l i n g l o c a t i o n sw e r ed i f f e r e n tw i t hh i g h e s tl e v e l si nt h es i t en e a rn a n p i n gc i t y f o l l o w e db yf u z h o ua r e aw h e r es t x 2 eg e n ew i t ht h eh i g h e s tr i s kw e r ed e t e c t a b l e i n t o t a l l y , o n es t r a i nw h i c hc a r r i e sf o u rv e r og e n e s ，2 7s t r a i ni s o l a t e sw h i c hp o s s e s st h r e e v e r og e n e s ，a n d81s t r a i ni s o l a t e sw h i c hh a r b o rt w ov e r og e n e sw a sf o u n di nm i n j i a n g r i v e l q u a l i f i c a t i o n ，q u a n t i f i c a t i o na n ds e a s o n a lc h a n g e so f t h et o x i cg e n e so f p o t e n t i a l p a t h o g e n i ce c o l ii s o l a t e sr e c o v e r e df r o mf u z h o ur e g i o no fm i n r i v e rw a t e r s h e dw e r e c a r r i e do u ta n da n a l y z e du s i n gm u l t i p l e x - p c r 8 4 0o u to f2 015e c o l ii s o l a t e sw e r e i d e n t i f i e dt ob ep o t e n t i a lp a t h o g e n i ce c o l ii s o l a t e sw h i c h w e r ec l a s s i f i e dt oe h e c ，e a e c ， e p e ca n de t e cg r o u p s 10v e r u l e n c eg e n e sw e r ed e t e c t e d ，w i t ha i d a - 1 ，a s t aa n ds e p a a sd o m i n a n tg e n e s t h et o t a ln u m b e r so fb a c t e r i a li s o l a t e s ，e c o l ii s o l a t e sa n dt h ee c o l i i s o l a t e sc a r r y i n gv i r u l e n c eg e n e si n c r e a s e di ns p r i n ga n ds u m m e r , p e a k e di nf a l lb u t i i i 福建师范大学黄文文硕士学位论文 d e c r e a s e di nw i n t e r am u l t i p l e xp c rp r o t o c o l ，w h i c hs u i t a b l ef o rm i n j i a n gr i v e rs i t u a t i o n ，w a s o p t i m i z e da n de s t a b l i s h e d ，p r o v i d i n gar a p i da n dm a s s i v ed e t e c t i o no fv i r o t y p i n go f p a t h o g e n i ce c o l ia n dat e c h n i q u es u p p o r tf o rr e a l t i m em o n i t o r i n ga n dr i s ka s s e s s m e n t o ft h ew a t e rq u a l i t y k e y w o r d s ：m i n j i a n gr i v e r ；e s c h e r i c h i ac o l i ；v i r u l e n c eg e n e s ；m u l t i p l e x - p c r i v 福建师范大学硕士学位论文独创性和使用授权声明 福建师范大学硕士学位论文独创性和使用授权声明 本人( 姓名)黄塞塞学号至q q 鱼q 鱼垒垒专业植物堂所 呈交的学位论文( 论文题目：用m - p c r 检测闽江流域水体中病原性大肠 杆菌的毒素基因) 是本人在导师指导下，独立进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除论文中已特别标明引用和致谢的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本论文 的研究工作做出贡献的个人或集体，均已在论文中作了明确说明并表示 谢意，由此产生的一切法律结果均由本人承担。 本人完全了解福建师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 福建师范大学有权保留学位论文( 含纸质版和电子版) ，并允许论文被 查阅和借阅；本人授权福建师范大学可以将本学位论文的全部或部分内 容采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文，并按国家 有关规定，向有关部门或机构( 如国家图书馆、中国科学技术信息研究 所等) 送交学位论文( 含纸质版和电子版) 。 ( 保密的学位论文在解密后亦遵守本声明) 学位论文作者签名：芬丸乏指导教师签名： 签字日期：h 1 年易月8 日 签字日期：年如月踮 绪论 绪论 一、研究背景 闽江是福建省第一大河流，流经3 8 个县市，是福建人民的母亲河，即闽江流域 一千多万人民生产生活用水的主要来源【l 】。改革开放以来，随着集约化畜禽养殖业 的迅速发展，闽江水环境问题日益突出。闽江流域的水体中大肠杆菌等项指标超标 问题受到公众的广泛关注。其中福州过境段位于闽江下游，是福州市区以及相邻地 区饮用、灌溉、养殖用水的水源。近年来，随着沿江地带经济的快速发展，闽江水 环境已受到严重污染，主要污染源为未经处理的生活污水、工农业生产的废水等【2 1 。 粪大肠杆菌是衡量水质的重要指标，具有广泛的卫生学意义。目前我国环保部 门在检测水中大肠菌群时多采用传统的多管发酵法。该法以最可能数来表示试验结 果，但未能区分大肠杆菌中致病性和非致病性的菌株，无法鉴定大肠杆菌携带的毒 素基因【3 胡。分子生物学技术的快速发展为大肠杆菌的检测提供了强大的工具。p c r 技术、d n a 探针、基因芯片、脉冲场电泳技术、e l i s a 等技术已先后被用于大肠杆 菌的检测与鉴定【5 羽。而具有高特异性、高敏感度、高效率、低成本特点的多元p c r 技术则更适合于大批量样品在分子水平的快速检测【_ 7 1 。该法是以8 种或1 1 种不同的基 因为目标进行3 4 个不同的多重p c r 反应。可同时检测大批量样品中大肠杆菌的不同 毒素基因，适宜于水环境生物性水质的评估和风险管理【7 9 1 。 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 在1 8 8 5 年由e s e h e r i c 发现，在很长一段时间，其被 认为是正常肠道菌群的组成部分。至2 0 世纪中叶，研究发现某些血清型的大肠杆菌 可引起人、畜不同症状的腹泻【l 们。至此，大肠杆菌分为病原性大肠杆菌和非病原性 大肠杆菌。根据致病性大肠杆菌中毒素因子引发的病症，可将其分为6 个病原型【7 】： 1 ) 肠致病性大肠杆菌( e n t e r o p a t h o g e n i ee p e c ) ，其主要的致病因素是细菌的附着因 子，使肠黏膜表皮细胞破坏，但不产生毒素。束状菌毛( b t p ，b u n d l ef o r m i n gp i l i ) 介导细菌与细胞疏松黏附；细菌主动分泌的紧密素与宿主细胞膜上相应受体紧密结 合；细胞内肌动蛋白重排，微绒毛破坏，并干扰肠道对液体的吸收功能。该侵染症 常发生于年龄小于两岁的小孩，可导致婴儿严重腹泻。是婴幼儿腹泻的主要病原体， 因直接接触传染，有较高死亡率。2 ) 肠产毒性大肠杆菌( e n t e r t o x i g e n i ce t e c ) ，毒 力因子包括黏附素，肠毒素，水肿病毒素，内毒素，溶血素等。可分为两种肠毒素 福建师范大学黄文文硕士学位论文 ( e n t e r o t o x i n s ) ，对热不稳定( h e a t l a b i l e ：l t - i 和l t - i i ) 或对热稳定( h e a t s t a b l e ；s 哳口s t b ) 肠毒素。其中前者与霍乱毒素的核酸序列有8 0 的相似性且其作用位置与霍乱毒素 相同，常引起小孩和旅行者腹泻，传染途径为污染的水和食物，是人畜共患病原菌， 为引起仔猪腹泻的主要病原之一。3 ) 肠侵袭性大肠杆菌( e n t e r o i n v a s i v ee r e c ) ，其毒 素基因编码产生i p a a ，b ，c ，d4 种蛋白，其中i p ab ，c ，d 三种蛋白是细菌侵入上皮细胞 所必需的，其侵袭肠粘膜细胞。破坏结肠上皮细胞造成大便带血，引起类似痢疾 ( d y s e n t e r y - l i k e ) 的症状，粪便含血液和黏液，黏液中含有很多白血球。4 ) 肠出血性 大肠杆菌( e n t e r o h e m o r r h a g i ee h e c ) ，毒素基因编码产生志贺氏毒素i 和。基因产物 是一种吸附蛋白紧密素( i n t i m i n ) 为人畜共患病原菌。主要由水和食物污染引起， 特剧是受牛等排泄物污染【l 。人受感染后易并发溶血性尿毒症候群( h e m o l y t i cu r e m i c s y n d r o m e ；h u s ) ，十岁以下孩童以及免疫力差的老人易受感染。5 ) 肠聚集性大肠 杆菌( e n t e r o a g g r e g a t i v ee a g g e c ) ，具有与h e p 一2 细胞( 人喉上皮细胞癌细胞系) 粘附 的能力。该菌经由质粒介导集聚性黏附于上皮细胞质膜( p l a s m am e m b r a n e ) 上，损坏 并导致临近微茸毛细胞，使之丧失吸附特性而引起腹泻。 综上所述，对闽江流域表面水体大肠杆菌毒素基因进行检测并分型对政府以及 相关部门有指导性的意义。 二、文献综述 1 大肠杆菌的生物学特性 大肠杆菌分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。其不同菌株间d n a 相关性为 8 0 ，而与同科的志贺氏菌属的d n a 相关性可达8 0 8 7 。大肠杆菌是人和动物肠道 中的常居菌，一般不致病，在一定条件下可引起肠道外感染【1 2 】。 大肠杆菌大小为0 4 0 7 1 - 3 哪，无芽孢，大多菌株有动力。为革兰氏阴性菌， 有普通菌毛与性菌毛，有些菌株有糖类包膜。 大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良 好。最适生长温度是3 7 ，在4 2 4 4 条件下仍能生长，生长温度范围为1 5 4 6 。此菌兼性厌氧，在有氧条件下生长良好，最适生长p h 值为6 8 8 0 ，所有培养 基p h 值为7 0 7 5 ，若p h 值低于6 0 或高于8 0 则生长缓慢。 大肠杆菌的大部分菌株发酵乳糖产酸产气，并发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、 木胶糖、阿拉伯胶等，产酸产气。其抗原构造比较复杂，主要由菌体o 抗原、鞭毛h 抗原、荚膜k 抗原组成【1 3 】。 绪论 2 粪大肠杆菌的毒素基因 ( 1 ) e s t a 、e s t b 、e l t 、f a e g 、f a n a 、f a s a 、f e d a 基因 这5 种毒素基因皆属于肠产毒性大肠杆菌，群i e t e c 。其中e s m 和e s t b 两种毒素基 因编码产生热稳定肠毒素；础编码产生热不稳定肠毒素【1 4 j - 屈p g 编码f 4 k 8 8 菌毛亚 单位基因【1 5 】：屈剃编码k 9 9 f 5 菌毛亚单位基因【1 6 - t 7 ；f a s a 编码菌毛9 8 7 p 腰6 亚单位【1 8 】； f e d a 编码f 1 8 菌毛亚单位基因【1 9 】。e t e c 的毒力因子包括黏附素、肠毒素、水肿病毒 素、内毒素、溶血素等。热不稳定性肠毒素与霍乱毒素的核酸序列有8 0 相似且其 作用位置与霍乱毒素也相同。属于人畜共患病原菌，是引起仔猪腹泻的主要病原之 一，常引起小孩和旅行者腹泻，传染途径为污染的水和食物。 ( 2 ) 口鲥基因 属于肠致病性大肠杆菌，i l o e p e c 2 0 1 。a s t a 基因编码产生热稳定肠毒素，其最主 要的致病因素是细菌的附着使肠粘膜表皮细胞受到破坏，但不具有侵犯性和不产生 毒素。常发生于年龄小于2 岁的小孩，可导致婴儿严重腹泻。其传染途径是因为直接 接触传染，常发生在医院和护理之家，有高死亡率【2 1 2 2 1 ( 3 ) p a a 和s e p a 基因 这两种毒素基因分属于肠聚集性大肠杆菌，即e a e c 。其中p a a 编码一种黏附与 消除相关蛋白【2 3 1 ，s e p a 是一种多耐药性基因，能编码一种使药物外流的蛋白【2 4 1 。二 者具多重耐药性，故对多种抗菌素不敏感。因细菌附着在肠细胞的质膜上，损坏并 导致临近微绒毛细胞丧失吸附特性而引起腹泻，对人畜的危害大，存在高风险。 ( 4 ) a i d a - 1 和s 白c 2 e 基因 二者属于肠出血性大肠杆菌，即e h e c 。a i d a j 基因编码扩散性附着的黏附素 【2 5 】s t x 2 e 编码产生志贺氏毒素，基因产物是一种吸附蛋白紧密素，属于人畜共患病 原菌，它们能够产生导致患者死亡或其他症状的细胞毒素，并增加其在人体肠道的 吸附能力。主要由水和食物污染引起，特别是受牛排泄物污染、感染后易并发溶血 性尿毒素综合症，l o 岁以下的孩童和免疫力差的老人易受感染，死亡率高【2 6 1 。 3 致病性大肠杆菌的分子检测技术研究进展 传统的分离培养、生化鉴定等检测方法对致病性大肠杆菌进行检测的特异性不 高、灵敏度低，且操作繁琐费时，不能实现有效的检测。因此，发展新的快速检测 与鉴定致病性大肠杆菌的方法是及时和有效控制和预防致病性大肠杆菌引起的疾病 的前提。 福建师范大学黄文文硕士学位论文 随着生物技术的发展和应用，研究人员已经创建不少快速、特异、敏感的致病性大 肠杆菌的检测方法。 a 免疫学检测方法 ( 1 ) 酶联免疫吸附实验( e l i s a ) 2 0 世纪8 0 年代p a d h y e 2 7 1 和p a r k 2 8 】分别用单克隆或多克隆抗体的e l i s a 检测大 肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 。e l i s a 方法是e n g v a l l 创建于1 9 7 1 年【2 9 1 。它以酶或者辅酶作为标 记物，标记抗原或者抗体，用酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应，并用聚 苯乙烯微量反应板吸附抗原或者抗体，使其固相化，从而进行免疫反应和酶促反应。 此法选择性好，结果判断准确，样品处理量大。弥补了经典化学方法和其他仪器测 试手段的不足。但由于e l i s a 对试剂的选择性高，很难同时分析多种成分，对分析 分子量小的化合物或不稳定的化合物时存在一定困难。 ( 2 ) 免疫磁性分离技术 即将特异性抗体偶联在磁性颗粒表面，与样品中被检致病菌发生特异性的结合， 载有致病菌的磁性颗粒在外加磁场的作用下，向磁极方向聚集，弃去检样混合液， 使致病菌不断得到分离浓缩【3 0 1 。在英国此法主要用于牛奶中大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 的监 测。在实际应用中，此法还可以与直接镜检技术、p c r 技术等相结合应用。 ( 3 ) 免疫胶体金技术 此法是2 0 世纪8 0 年代后发展起来的固相标记免疫检测技术，其基本原理是以 微孔滤膜为载体包被己知抗体抗原，加入待检标本后，经滤膜的毛细管作用或渗透 作用使标本中的抗原或者抗体与质膜上包被的抗体或抗原结合，再用胶体金结合物 标记而达到检测目的，其优点是简单快速、特特异敏感、不需任何仪器设备和试剂， 几分钟就可以用肉眼观察到颜色对比鲜明的试验结果。2 0 世纪9 0 年代，杨晋川【3 u 等用0 1 5 7 大肠杆菌免疫胶体金快速诊断卡，对腹泻患者粪便样品中的e c o l i0 1 5 7 进行初筛，然后再用免疫磁珠捕获，集菌的分离和鉴定于一体，减少了工作量。 b 分子生物学检测方法 ( 1 ) 基因芯片技术 基因芯片是指按照预定位置固定在固相载体上很小面积内的千万个核酸分子所 组成的微点阵列。其检测致病菌原理为选择细菌的共有基因，( 1 6 s r d n a 、2 3 r d n a 、 e i u c ) 作为靶基因，用一对通用引物进行扩增，再利用芯片上的探针检测不同细菌 在该共有基因上的独特碱基，从而区分不同的细菌。唐晓敏【3 2 1 等利用此法检测水中 绪论 常见致病菌，与传统方法鉴定结果一致性为9 5 。 ( 2 ) 多重p c r 检测技术 也就是本实验中要用到的方法。 a 多重p c r 的原理及特点 聚合酶链式反应( p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 是一种由引物介导的特异性 体外酶促d n a 扩增技术。该技术f l 了k a r ym u l l i s 等人于1 9 8 5 年首创【3 3 瑚】，其原理是将 待扩增的模板d n a j j i 热变性，由人工设计合成的两条特异性挂聚核苷酸引物与模板 d n a 中两条链特异性结合即复性，在适宜的温度条件下，t a qd n a 聚合酶催化d n t p 沿着寡聚核苷酸引物5 3 方向相向合成互补的两条新链。不断复述上述过程，使得 d n a 片段以几何级数方式扩增与积累，经过3 0 4 0 个循环，扩增产物增加百万倍，从 而可通过电泳加以检测。因此，p c r 技术具有敏感、特异、快速、简便和易于操作 等优点，目前已经广泛应用于生命科学的各个领域，使得原本诊断困难的疾病在分 子水平上得到确诊【3 5 】，随着p c r 技术的发展和应用，由基本的p c r 原理衍生出许多 新方法，譬如内标定量p c r 、实时荧光定量p c r 、多重p c r 等。 多重p c r 技术的原理与单基因p c r 相似，不过它是单基因p c r 的发展与完善， 即在同一p c r 反应体系中加入多对特异性引物，针对多个d n a 模板或者同一模板 的不同区域进行扩增的过程，可一次扩增多个靶基因，实现多个基因型鉴别或多种 病原体的同时检出【3 6 1 。多重p c r 技术同时扩增两条以上的靶基因片断，出现假阳性 的概率比常规p c r 小的多，有效地排除了假阳性现象。单基因p c r 技术一次只能 检测一种病原体或一个基因类型，基因分型或混合感染检测操作繁琐、费时费力成 本较高。而多重p c r 能有效地解决单基因p c r 技术中出现的问题，减少了漏诊率， 提高了检验效率。多重p c r 最大的优点就是省时省力，能够在和单基因p c r 相近 的时间内同时检测出多个目的的d n a 。因此，多重p c r 技术已经被成功地应用于 各类病原的检测与鉴别【3 7 】、遗传疾病诊断以及基因缺失【3 引、突变和多态性分析等方 面【3 9 】尤其是对混合感染的鉴别诊断与病原微生物的毒力基因检测更具有临床应用价 值【4 0 】。 b 多重p c r 技术检测大肠杆菌毒素基因的研究现状 e t e c 、e p e c 、e a e c 、e h e c 的致病作用并非由单一毒力因子因子引起，而是 多因子共同作用的结果，且毒素相关基因在不同菌株中的数量和种类存在差异。p c r 技术，尤其是多重p c r 技术目前已广泛应用于e t e c 、e p e c 、e a e c 、e h e c 一个 福建师范大学黄文文硕士学位论文 菌株中多个毒素基因的检测。 毒素基因与其致病性有着密切的关系，国内外已进行分子流行病学调查的相关 研究。肠毒素性大肠杆菌( e n t e r o t o t x i g e n i ee s c h e r i c h i ac o l i ，e t e c ) 是动物腹泻的重要 病原之一，肠毒素是其致病的重要毒力因子。e t e c 产生的主要外毒素有不耐热肠毒 素( h e a t l a b i l e1 ) 和耐热肠毒素( h e a t - - s t a b l es t ) 两种。l 1 7 有l ti 和l t i i 之分，i i 型 i 在自然界十分罕见，对其研究不多，通常所指的i 是i 型；s t 根据其生物学特性及 致病性可分为s ti ( s t a ) 和s t i i ( s t b ) 两类。s t i 溶于甲醇，引起乳鼠和乳猪肠腔积液； s t i i 不溶于甲醇，只能引起断乳猪肠腔积涮4 1 1 。检测肠毒素对大肠杆菌腹泻病的诊 断有着重要意义。目前检测e t e c 肠毒素的方法主要有动物实验、组织培养、免疫学 方法( r i a 、e l i s a ) 等等，这些方法费时费力，具有一定的局限性。张雪寒等【4 0 建立 了多重p c r 的方法来检；! 贝! e t e c 肠毒素基因，提高了检测的速率。 i 刍k a u f f m a n n 在半个世纪前建立大肠杆菌血清型分类系统以来，血清型一直被用 作致泻性大肠杆菌的鉴定依据及流行病学调查的标志。而大肠杆菌的致泻性主要取 决于是否携有相应的毒力因子。因此毒力因子的检测成为鉴别致泻性大肠杆菌的重 要依据【4 3 1 。肠出血性大肠杆菌( e n t e r o h e m o m m g i ce s c h e r i c h i ac o l i e h e c ) ，如e h e c 0 1 5 7 ：h 7 和0 1 5 7 ：h 一等引起人腹泻、出血性肠炎( h e m o 玎h a g i co o l i t i c h c ) ， 严重者可并发死亡率极高的溶血性尿毒综合征( h e m o l y t i cu r e m i cs y n d r o m e ，h u s ) 等， 曾在国外引起多次暴发流行，受到广泛重视。研究表明：e h e c 的主要毒力因子有志 贺毒素( s h i g a t o x i n ，s t x ) 、l e e ( l o c u so f e n t e r o e y t ee f f a c e m e n t ) 毒力岛、6 0 m d a 的大质 粒等，其致病性与这些毒力因子有关。s t x 以前称为v e r o 毒素或志贺样毒素，目前认 为该毒素作用于血管上皮细胞引发系统反应导致h u s 的产生：s t x 主要有二种，即 s t x l 和s t x 2 ，分别由噬菌体携带的s t x l 和s t x 2 基因编码：s t x 阳性的大肠杆菌又称为 s t e c ( s h i g at o x i n - p r o d u c i n ge c o l i ) 。l e e 编码一系列与致肠上皮细胞粘附和抹平 ( a t t a c h i n ga n de f f a c i n g ，a e ) 效应有关的蛋白质，其中e a e a 基因编码一种称为紧密素 ( i n t i m i n ) 的菌膜蛋白，介导细菌与肠上皮细胞膜的紧密粘附。肠致病性大肠埃希菌 ( e p e c ) 亦有l e e 毒力岛，也可引起的肠上皮细胞的a e 效应。序列分析表明，e h e c 和e p e c 的e a e a 基因的5 端前22 0 0 碱基序列高度同源( 9 7 ) ，而3 端同源性仅为5 9 畔】可根据二者的不同设计相应引物，以p c r 鉴另u e h e c 和e p e c 的e a e a 基因。为此， 潘劲草等建立了检测e 眦c 和e p e c 毒素基因的多重p c r 方法【4 5 】。 三、本研究的目的和意义 绪论 本研究通过对闽江流域七个取样点和闽江流域福州段的解放大桥和洪山桥水域 不同季节粪大肠杆菌毒素基因的检测以及毒素基因的分型，分析闽江流域自上游至 下游1 2 种毒素基因的数量与分布状况，建立适合本省实际对闽江流域含毒素基因大 肠杆菌大批量和快速的检测方法，为闽江流域病原性大肠杆菌的实地监测和风险评 估提供技术支撑。 四、本研究的技术路线 2 0 毫升水样通过0 2 2 微米滤膜过滤，再将滤膜置 于m f c 培养基上，4 4 5 恒温箱中培养1 2h l 挑取蓝色单菌藩，接种到n f c 培养基上， l4 4 5 匣温箱中培养1 2h 挑取蓝色单菌藩，接种到l b 固体培养基 上，3 7 恒温箱中培养1 2h 挑取单菌落，接种到盛有1 0 0 微升l b 液 体摇弈基的9 6 孔细胞培养板中，3 7 叵 温箱中培养1 2 h 用枪头吸取2 微升菌 液接入盛有1 0 0 微升 乳糖发酵培养基的9 6 孔细胞培养板中，3 7 恒温箱中培养1 2 h 用枪头吸取2 微升菌 液接八盛有1 0 0 微升 磷酸盐葡萄糖胨水培 养基的9 6 孔细胞培 养板中，3 7 恒温箱 中培养1 2h 福建师范大学黄文文硕士学位论文 用枪头吸取2 微升菌；璐入盛有1 0 0 微升 乳糖发酵培养基的9 6 孔细胞培养板中， 3 7 l 匣温箱中培养1 2h 8 第一章水体中粪大肠杆菌的分离、富集及生化分析 第一章水体中粪大肠杆菌的分离、富集及生化分析 1 1 前言 水体中粪大肠杆菌的分离主要是根据选择性b c i g i n f c 培养基来进行初步分 离，在此选择性培养基上产生蓝色菌落的初步判定为粪大肠杆菌。然后再使用乳糖 发酵培养基和磷酸盐葡萄糖胨水培养基相结合的方法进行双重检测。经过乳糖发酵 培养基和磷酸盐葡萄糖胨水培养基鉴定均为阳性的菌株即确定为粪大肠杆菌。 1 2 实验材料 1 2 1 水样以及水体中的大肠杆菌 粪大肠杆菌( e c o l i ) 于2 0 0 7 - - 2 0 0 8 年间采自闽江流域建阳、顺昌、沙县、南 平、闽清、洪山、解放七个过境段的水样中分离所得。 1 2 2 培养基以及常规试剂 1 2 2 1 分离粪大肠杆菌用的m f c 培养基 m f c 粉末 3 9 5g 5 溴一4 - 氯一3 一吲哚基p d 葡萄糖醛酸苷( b c i g ) o 0 1g 加蒸馏水至1 0 0m l ，然后将搅拌子放入盛有培养液的三角瓶，再将三角瓶放在 7 8 1 磁力加热搅拌器上进行搅拌至溶液完全溶解，再将其放入微波炉加热至溶液纯 清状，在水中冷却至常温即可倒平板。 1 2 2 2 培养粪大肠杆菌用的l b 液体培养基， 蛋白胨 1 0g 酵母5g 氯化钠 1 0 9 p i - i 7 0 7 2 加水至1 0 0 0m l ，1 2 1 灭菌1 5m i n 。 1 2 2 3 培养分大肠杆菌用的l b 固体培养基 在1 2 2 2 的配方中加入1 5 也的营养琼脂，加水至1 0 0 0m l ，1 2 1 灭菌1 5 - - , 2 0 m i n 。 福建师范大学黄文文硕士学位论文 1 2 2 4 对粪大肠杆菌进行生化鉴定的乳糖发酵培养基 蛋白胨 1 0g 酵母提取物 3g 氯化钠 5g 乳糖 1 0g 溴甲酚紫 o 0 2g p h 6 6 7 0 加水至1 0 0 0m l ，1 2 1 灭菌1 5m i n 。 1 2 2 5 对粪大肠杆菌进行生化鉴定的磷酸盐葡萄糖胨水培养基 蛋白胨 7g 磷酸氢二钾 5g 葡萄糖 5g p h 6 7 - z l 加水至1 0 0 0m l ，1 2 1 灭菌1 5m i n 。 1 2 2 6 甲基红溶液 甲基红 o 1g 9 5 乙醇3 0 0 m l 加水至5 0 0m l ，放入搅拌子，在7 8 1 磁力加热搅拌器上搅拌至溶质完全溶解。实 验用水为灭菌超纯水。 1 2 3 主要仪器 1 ，砂心过滤器：是由无油真空泵和过滤瓶设备而组成的，整体分为漏斗式过滤 杯、中间砂心过滤头( 烧结滤头) 、三角集液瓶以及不锈钢制固定夹。过滤采用的滤 膜为孔径o 2 2l a r n 的微孔滤膜，水中的颗粒物质和微生物的直径都大于0 2 2l a i n ，经 过滤后留在滤膜上。 2 ，取样瓶； 3 ，冷冻离心机：5 4 1 5 r 型，e p p e n d o r f i 4 ，电子精密天平：p b 3 0 3 一e ； 5 ，p h 计：p h s ( p h s 2 5 a 型) ； 6 ，微量