（作物遗传育种专业论文）水稻花器官发育关键基因PSD1的功能鉴定.pdf

独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是在指导教师的指导下，通过 我的努力敬得的成采，并且是自己撰写的。尽我所知除了文中作了杯注和 致滚中已箨了签潺豹蟪方静，论文串不包食其毡人发表或撰写避豹硬宠成 果。与我同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示 了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承携应有的责任。 学位c 毕业，论文作者亲笔躲何心、姆徘0 5 o g 秽i 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 沦文的规定， 帮学校奁粳送交论文豹复印耱，允诲论文搜查阕窝氆阕；学校霹戳公糍论文 的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 镶密，在年嚣瓣密可瀵爆本授投书。 口 不保密，本论文属于不保密。留 学位( 毕热) 论文终者亲键签名；彳司心翻圣只甥：蠼心、。0 指撒臁糕锄曩般嗍：d f 占- ，o 稀建农林大学鼹：l ：掌位论文 摘要 p s d l ( p i s t i l * s t a m e nd e g e n e r a t i o n ) 燕在台湾粳，圭6 3 0 杂交f l 茂糖壤莠 后代中发现的个水稻花器官发育的突变体。阳以植株营养生长究众藏常 与正常植株同步进入生殖发育，其颖花熊型比正常颗花明显膨大雄蕊原 蒸器鼗蕊骧蘩不分纯，产垒多重蠹羚器续均( 段远纛，2 0 0 1 ) ，撬溺p s d l 是控制水稻税器官分化和形成的一个关键基因。对这个基因进行克隆和功 能研究，对深入理解水稻稳器官发育的分子机制具有照要意义。 逶过辣缨定位，本硬究室邑获褥p s d i 候选基爨，毽必颂送一步攘疆 验证。本研究将来自p s d l 突变体的野生溅等基因系( 简称野生型) 的p s d l 候选基因分别转入p s d l 突变体和野生烈殿粳稻品种f = | 本晴中，进彳亍遗传互 彝适量表达实验，娃验谖p s d i 候选蘩嚣著研究其劝毙，探讨p s d t 基 因应用前景。主要结果如下： ( 1 ) 克隆tp s d i 候选撼因完整的o r f ，将其与组成型表达启动子 菱寒泛素癌麓孑( u b i 1 ) 连接+ 构建了p t c k 3 0 3 p s d t 双元表达载体。 ( 2 ) 利用戒杆菌介导。分别转化p s d l 突变体和野生型及日本暗，获得 1 2 株转基因槌株，经p c r 检测阳性率为5 8 3 。 f 3 ) h _ l ； 露l l 粒耱予巾鹣每一羧煮接分纯及对戏转化褥至g 的小绿堇超 过l o 株。其中一粒种予成熟胚的愈伤分化出的5 栋檬株全都是p s d l 突交 体表型，其对应抗性愈伤已经分化出2 3 株小绿苗和1 2 个绿点。大约7 月 # p 下秘可以褥到互 实验豹霸闻表型鉴定结果。进步的p c r 检测、 r t - p c r 检测、s o u t h e r n 、n o a h e m 检测将有助于p s d l 候选基因功能鉴定。 关键词 p s d l ； 飘朴实验； 过量表达：功能鉴定 福建农林大学硕： ：学位论文 a b s t r a c t p s d l ( p i s t i l s t a m e nd e g e n e r a t i o n ) i s am u t a n to ft h e k e yg e n et h a t c o n t r o l st h ed e v e l o p m e n to fs e x u a lo r g a n s ( p i s t i la n ds t a m e n ) i nr i e e ( o r y z a s a t i v al ) ，w h i c hw a sf o u n di nad o u b l eh a p l o i d ( d h ) p o p u l a rf r o mt h ec r o s s b e t w e e nt a i w a n j i n ga n dg u i 6 3 0d e r i v e db ya n t h e rc u l t u r e t h ep h e n o t y p eo f p s d lm u t a n tp l a n t ss e e m e dt ob en o r m a l h o w e v e r , t h es p i k e l e t so f p s d lw e r e l a r g e rt h a nt h en o r m a lo n e s ，a n di t ss t a m e n sa n dp i s t i l sw e r et o t a l l yd e g e n e r a t e d ， w i t hm a n yl a y so f g l u m e si n s t e a d f u n c t i o n a lc h a r a c t e r i z a t i o no f t h eg e n ep s d l ， w o u l db ev e r yh e l p f u lf o rd e e pu n d e r s t a n d i n go ft h em e c h a n i s m so ff l o r a l d e v e l o p m e n t i nr i c e ( o r y z as a t i v al ) p s d ic a n d i d a t eg e n ew a so b t a i n e db yf i n em a p p i n g ，b u ti tn e e d st oh a v ea f u r t h e rt e s t t h ew i l d t y p ei s o g e n i cl i n e so f p s d lc a n d i d a t eg e n e ( w i l dt y p e ) i s t r a n s f e r r e di n t oi t sm u t a n ta n dw i l d t y p ea n dn i p p o n b a r et op r e v i o u s l yi d e n t i f y i ta n di n v e s t i g a t ei t sf u n c t i o nb yg e n e t i cc o m p l e m e n t a r yt e s ta n do v e r e x p r e s s i o n ， a tt h es a m et i m e ，d i s c u s si t sa p p l i c a t i o np r o s p e c t s i nt h i ss t u d y , m a j o rr e s u l t s a r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) t h ec o m p l e t eo p e nr e a d i n gf r a m eo f p s d lc a n d i d a t eg e n ew a sc l o n e d ， a n dc o n n e c t e dw i t hm a i z eu b i q u i t i np r o m o t e ra n dc o n s t r u c t e do np l a n t b i n a r ye x p r e s s i o nv e c t o rp t c k 3 0 3 p s d l ( 2 ) m e d i a t e db ya g r o b a c t e r i u m ，p s d lw a si n t r o d u c e di n t op s d m u t a n t s a n dn o r m a lp l a n t sa n dn i p p o n b a r e ，r e s p e c t i v e l y a n dt h e nt w e l v et r a n s g e n i e r i c ep l a n t sw e r eo b t a i n e da n ds e v e nw e r ef u r t h e rd e t e r m i n e dt ob ep o s i t i v e t h r o u g h p c ra s s a y ( 5 8 3 ) ( 3 ) a n dn o w , t h e r ea r e m o r et h a nt e nr e g e n e r a t i o np l a n t st h r o u g h 2 桶建农林大学硕1 j ：学位论文 d l t t e r e n t i a t i o no rt r a n s f o r m a t i o nf r o me v e r yo fe l e v e nm a t u r ee m b r y o s f i v e r e g e n e r a t i o np l a n t sa l ea l lp s d jm u t a n t sd i f f e r e n t e df r o mt h es a m es e e do ft h e e l e v e nm a t u r ee m b r y o s a n dt w e n t y - t h r e et r a n s g e n i cp l a n t sa n dt w e l v e a n t i b i o t i c r e s i s t a n tc a l l iw e r eo b t a i n e df r o mi t sc o u n t e rt r a n s f o r m a t i o nc a l l i a n dt h e i rp h e n o t y p e sw i l lb eo b s e r v e di nt h em i d d l eo fj u l y i tw i l lh e l pt o i d e n t i t yf u n c t i o no fp s d lc a n d i d a t eg e n et h r o u g hf u r t h e rp c ra s s a yo r r t p c ra s s a yo rs o u t h e r nb l o t t i n go rn o r t h e r nb l o t t i n ga n ds oo n k e yw o r d s ：p s d l ；c o m p l e m e n t a r y ；o v e r e x p r e s s i o n ；f u n c t i o ni d e n t i f i c a t i o n 3 祸建农林大学碳士举位论文 前言 花器官的发育是显花械物生殖生长期最明显的特祗，近年来受到人们 熬广泛关注黪戏为理 弋攮携分子生兹攀疆宠筑焦点之( t h e i s s e n 窝 s a e d l e r ，1 9 9 9 ：p r u i t t 等，2 0 0 3 , y a r n a g u c h i 等，2 0 0 4 ；j a c k ，2 0 0 4 ) 。 通过对模式植物拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 和= ；：鱼草( a n t i r r h y n u m 盟a j u s ) 的花器宫突变体的分子生物学研究，现己基本嘲明双予时撼物花器 窝发育懿遗佼控铡撬莲，莽秘步建立了程筏器富发蠢邋程串的阕深髯型基 因作用的a b c 模型( c o e n 等，1 9 9 1 ：b o w m a n 等，1 9 9 1 ；a m b r o s e ，2 0 0 0 ： f o r n a r a 等，2 0 0 3 ) ，这是 煎物花发育研究的一个里程碑，它以数字化的简 零语言凄甥了疆穆芯器富发蠢形成熬基零控裁模式。 相比之下，单子叶植物花发育机制选远落后于双子叶植物。采本科植 物水稻( o r y g as a t f v al ) 是单子叶植物发育分子生物学研究的理想模式 穗物( g o f f ，1 9 9 9 ；s b i m a m o 和k y o z u k a ，2 0 0 2 ) ，对水稻中同源纂嚣靛研 究表明，肇予时植物和双予盱植镪虽然调控开花的萋零过程裙司，毽其其 体的遗传调控机制却存在麓异( k y o z u k a 等，1 9 9 8 ) 。近年发现的一些水稻 花发育突变体基因( l i n 铎，2 0 0 0 ；y a n o 等，2 0 0 0 ：罗琼等，2 0 0 1 ；段远 豢等，2 0 0 3 a ；t a k a h i r o 窝y a r n a g u c h i 等，2 0 0 4 ) 送一步表鞠藐发襄调控穰 制的保守性和多样性。也许正是因为遮魑调控上的多样性决定了单子叶与 双子叶植物开花的不同。因此，对水稻花发育相关突变体的研究，不仅有 豢l 予对承稻的筏发育分子执铡的了鳃，l 掰量也将促进对单子时植物诧发育 分子生耱学鹣认识。 然而，网前对水稻丌税分子机制的研究，多是揍予同源基因的分离与 分析( k a n g 镰，1 9 9 5 ，1 9 9 8 ；k y o z u k a 等，1 9 9 8 ，2 0 0 0 ) ，通过搬水稻基 强缝文瘁或c d n a 文瘁孛耱逸与双子时攘貔兹器官鞠辩痘熬m a d s 愈整嚣， 已经得到近3 0 个类似m a d s 盒多基因家族的基因( s e n t o k u 等，1 9 9 9 ：m o o n 蹲，1 9 9 9 ；k y o z u k a 等，2 0 0 0 ；罗琼，2 0 0 1 ) ，其中大多数基因在水稻中的 镳龆功毖露缺乏与性状盼联系丽无法确定。显然，穗嚣富异常发窍驹突变 4 捅封l 敏林 学硕i ：学位论立 体获锝将有助于加快_ 歼展此项研究。蕊在突变体基因的克隆中，水稻的遗 簧转铯憝关穗，尽管这死年求稻农聿于蓠转纯体系日臻完善， 基对籀蹋静遗 传转化仍较困难，而且不同基因擞转化效率有较大差别，因此对农杆菌转 化体系的优化显得尤为重要。 p s d l ( p i s t i l - s t a m e nd e g e n e r a t i o n ) 是奉疆究室蘸台湾壤圭6 3 0 杂 交f 花粉培养后代中发现的一个受单隐性基因控制的水稻花器官发育受阻 突变体。p s d l 植株营养生长完全雁常，与f 常植株同步进入生殖发育，且 花序莘鞋花劳的分化完众难常，但英雄蕊原基和雌蕊原基不分他，产生多鬟 内乡 稃缀擒( 段远霖，2 0 0 1 ) 。因鼗，p s d t 基豳莛控铡承稻颥花中罐蕊翻 雄蕊原旗分化、花嚣官分化和形成的一个关键旗因，其发生突变完全改 变了水稻生殖发育的命运：性器官的形成被抑制，不能产尘雁常的种子。 迄今受隆，国悫势渴寒觅至对基爨p s d l 豹竞隧的榛关报遥，瓣该基困遵行 深入研究，对花发商的理论研究和生产实践都舆有十分重婺的意义。 目前，本研究室通过图位克隆方法，已经获得p s d l 的候选基因，但遥 必须迸一步加以验谖。本硬究主爨致力手克隆p s d l 候选基因竞整的o r f ， 通过中阍表运载俸p m d l 8 - t - p s d i 将它与缀成黧衰这窟动予玉米泛素 启动子u b i l 连接构建植物双戴袋达载体p t c k 3 0 3 一p s d l ，通过农杆菌介 导法分别转化p s d l 突变体和正常檬株，进行遗传互补与过量表达实验，以 初步磷谖p s d l 赣选蒸鑫共疆突萁凌戆，探落p s d l 基因数盛麓蘩景。 福建农林大学瑚士学位论文 文献综述 1 水稻花发育研究进展 麓豹发窍是显菝壤狻生蘸生长期羧甥显豹特蔹，芯器寒弱形残程彦剃 是植物的黧要遗传特征之一。因此，横物花的形态发育过程为研究基因调 控的分子机理提供了一个合适的系统。通过对模式撇物拟南芥和金鱼草的 花器官突变体的分子生物学研究，现憋基本阐明双子列植物花器官发育豹 遗传调控梳理，并建立藏在花器宫发商过程中鲍嗣潦异垂基因佟餍匏a b c 模型( c o e n 和m e y e r o w i t z ，1 9 9 1 ；s c h w a r z - s o m m e r 等，1 9 9 0 ；w e i g e l 和 m e y e r o w i t z ，1 9 9 4 ) 。 l 。l 芯嚣窘遗传控露l 模式a b c 模蒸 一个熟型的双子叶植物的花由同心排列的4 轮税器官组成，从外向内排 列，依次为花萼( s e p a l s ) 、花瓣( p e t a l s ) 、雄蕊( s t a m e n s ) 和雌蕊( p i s t i l s ) ( 图卜1 a ) 。 ab a p 3 + p i l 互j 正蛰 花萼花瓣雄蕊心皮 鹜1 - 1 投南芬敬藐( 矗) 琴拜壤鹚靛a b c 模麓( 动 ( b o w m a n 等，1 9 9 1 ；c o e n 和m e y e r o w i t z ，1 9 9 1 ) 花发育的最终表型是花的4 轮器官在新建立的花分生组织上有序地形成。通 过熬南芬鞠金鱼草豹网源异垄基因敬动能鲮失突变访熬遗传分撰，提出了 6 祸建农林大学硕i ：学位论文 花器官遗传控制模式a b c 模型( b o w m a n 等，1 9 9 1 ；c o e n 和m e y e r o w i t z ， 1 9 9 1 ) ( 图1 1 b ) 。这个模型认为，花器官特征陛是受a 、b 、c3 组主要基因 控制，每一组延伸到两个相邻轮( w e i g e l 和m e y e r o w i t z ，1 9 9 4 ：m a ，1 9 9 4 ： r i e c h m a n n 等，1 9 9 7 ) ：a 和c 功能基因分别特化花萼和心应，l n n 和b 、b 和c 的组合活性分别形成花瓣和雄蕊。a 和c 的活性是相互拮抗的。在a 功能基因 缺失突变体中，c 功能延伸至各轮，而在c 功能基因突变体中情况正好相反。 所有这些基因，除了爿脚h ，都编码一个称为m a d s 的转录因子。m a d s 盒基因 家族古老而进化上保守。因此，在花分生组织特化区域罩，器官特征性在 某种程度上是因为这些调节因子的转录水平不同而受到调控的。在拟南芥 中，a 功能由3 个不同的基因a p e t a l a i ( 彳用) 、ap e t a l a 2 ( j ，功和l e u n i g ( 磅 提供，b 功能由a p e t a l a l 3 ( 爿和p i s t i l l a t a ( 户刃提供，c 功能由a g a m o u s ( 爿6 ) 提供( i z w w a 乘l s h i m a m o t o ，1 9 9 6 ) 。在金鱼草中a 功能由s q u a m o u s ( 鲫蜊) 提供，b 功能由d e f i c i e n s ( 删、g l o b o s a ( 皿功提供，c 功能由p l e n a ( p l e ) 提供( s c h w a r z s o m m e r 等，1 9 9 0 ) 。 a p l 和a p 2 是具a 功能活性的基因，这两个基因只要有一个缺失，花 萼和花瓣就不能正常发育。虽然花发育早期a p i 的m r n a 在整个幼嫩的花序 原基中表达，但后来它定位于花萼和花瓣中，这与它的作用是决定这两个 器官的特征性相一致( m a n d e l 等，1 9 9 2 ) 。爿用的m r n a 在雄蕊和心皮中不 出现，这是由于c 功能基因刀口的负调控作用的结果。a p i 的转录具有调节 爿疗表达区域的作用，因此也属于a 功能基因。相应地，a p 2 的功能也是特 化靠外两轮器官的特征性。1 4 p 2 的m r n a 出现在所有4 轮花中，也出现在花 序分生组织和营养分生组织中( j o f u k u 等，1 9 9 4 ) 。因此，爿彤的转录后调 节被认为是a 组基因活性的原因。而且，不象其它花器官特征基因( 如 a p l 、a p 3 , p i 和a g ) ，预测a p 2 的蛋白不含m a d s - b o x ，它属于另一种类型 的转录因子，因为f 户2 具有的保守区近似于乙烯应答因子结合( 点m 劫蛋白 ( j o f u k u 等，1 9 9 4 ) 。因此，这类转录因子称为a p 2 e r e b p 转录因子。 b 组花器官特征基因是花瓣和雄蕊正常发育所必须的。正常情况下它 们存在于花的第2 轮和第3 轮花器官中。彳昭和彤是2 个b 组基因，它们 对b 组功能活性是必要的( j a c k 等，1 9 9 2 ：g o t o 等，1 9 9 4 ) 。它们都是m a d s b o x 椭建农林大学硕士学位论文 基因，且其中之一发生突变都会导致花瓣转变为花萼和雄蕊变成心皮的同 潦筹形转换。鬓终，, 4 p 3 翻p i 静m r n a 在藏萼形袋翠絮蕊分垒三缀缓静繁2 轮 和第3 轮中累积，通j 建自调节，它们保持持续表达的方式( g o t o 等1 9 9 4 ) 。 诧外，8 功能活往要求形成奔声髟p i 筹源二浆体弗定位予核中( t r o b n e r 等， 1 9 9 2 ：r i e c h m a n n 等，1 9 9 6 ；m c g o n i g l e 等，1 9 9 6 ) 。 在拟南芥中，彳疗基因是雄蕊和心皮发育的必要和充分条件。这个基因 魄编码一个会m a d s - b o x 兹爨子。矗g 戆m r n a 载表达只谯花约第3 、4 两轮 中花器官原基中出现，暗示了一种转录调节( y a n o f s k y 等，1 9 9 0 ) 。另外， 菇8 英寿将a p 豹m r n a 献肉瑟掰轮菝器官孛箨 豫撵豹俸鲻( g u s t 8 f s o n 8 r o w n 等，1 9 9 4 ) 。a g 也是花原基决定所必须的，因为蹭突变体的花是无限生长 的，并鼠持续地增加新的器官轮数，产生“花中诧”静袭型。暗示, 4 g 的花 分生缎织特征姓( m i z u k a m i 和m a ，1 9 9 5 ) 。a b c 模型的一个爨要推测是a 和c 功能的拮抗特性。在拟南芥a p 2 突变体花中，a g 的表达向外扩展到花 熬潺有轮中( y a n o f s k y 等，1 9 9 0 ) 。实际上，c 缎基因黪健表达，在许多檀 物中都导致花的第l 轮形成心皮样结构和第2 轮产生雄蕊样结构，这f 如 a b c 模鍪掰颈测熬( t s u c h i m o t o 等，1 9 9 3 ；b r a d l e y 等，1 9 9 3 ：k e m p i n 等， 1 9 9 3 ) 。因此，a b c 模型似乎适用于许多开花植物。虽然a b c 模型简单而且 迷人，毽随着新静基疆阔褶豆 蕈用数据靛增加，a b c 模鳖氇不断在修改受 掰( p r u i t t 等，2 0 0 3 ) ( 图1 - 2 ) 。 l ，t 产：炙n ；l i 竺产p 2 ，= = 墨a 占 s p t 2 3 s e一， 丐tc a 圈卜2 拟南芥花器官发育的遗传调控模型( 2 0 0 3 ) 藕建表棒大学袋士学往论文 1 2 水稻花器官的发育：i 敷传 l + 2 。i 以窳獾巍我表兹攀子砖擅勃弱双子砖植物髯瓣 单子叶植物和双予叶植物早在1 2 一1 8 亿年以前就己分化( w o l f e 等， 1 9 8 9 ) 单子叶植物的花和花分生组织发育的许多特征与双子叶横物明显不 问。虽然擞南芥和金鱼革是亲缘关系技远的两个戳子时植物，缎它们指导 花形态发象豹调控橇潮楚十分近钕戆( c o e n 窝m e y e r o w i t z ，1 9 9 1 ) 。这秘 近似性表明，至少在双予叶植物中有个共同的花发育程序，爆管它们在 基因组成和表达模式方面可能存在不同( m a 和d e p a m p h i l i s ，2 0 0 0 ； l a w t o n r a u h 等，2 0 0 0 ) 。毽是，对予等掇褰芬亲缘关系更运，稳结 鸯差异 更大的单予时植物来说，开花诱导和耱发育是否翼有与上述拟南芥类似的 调控途径，是一个令人们感兴趣的问题。 单予时植物包括最黧要靛粮食童筝物，其花的发育是形成粮食的基础。 汞本辩穰物承稻不仅楚徽赛上最莺蘩静粮食作虢之，也是零予雏獯耪靛 理想模式。与其他单予叶植物相比，水稻具有以下踅要优点( i z w w a 等， 1 9 9 9 ) ：在已知单子叶椴物中它的基因组是最小的，约含4 0 0 m b ( 百万碱基 对) ，分奄在1 2 条染魏髂上，援为羧鬻莽1 2 0 m b 鹃4 镑、玉米2 5 0 0 m b 靛六 分之一、大麦5 3 0 删b 的十三分之一；水稻基因组与采谷类其他作物基因组 具有共线性，遗传转化的易操作性和较强的再生能力；已建成饱和的遗传 图谱；分布范围鞍大，从 氍海拔到海拔2 0 0 0 米都露种植：品种较多，类型 变琵耀菠较大；它的釜嚣期较短，一般必9 0 - 1 6 0 天：承箍静静震爨滚丰塞， 全世界已髓记入库的资源已超过1 2 0 ，0 0 0 份( h a r u s h i m a 等，1 9 9 8 ) 值得 注意的是水稻的花在单子叶植物花器官中也具有代袋性。( k y o z u k a ，2 0 0 0 ) 尽罄露承载芯发赛翡分子生貔学骚究方粥骥拜媲，分子玺甥学技零帮基毽 组方法学的快速发展及其在植物发育研究中的广泛应用，已使永稻花发育 的研究深入到分子水平，业已取得不少进展， 1 2 2 水粼与双子冲攘糖诧器宫绩稳熬比较 草零褴物的花称必小花，不因数稿的小花聚会成小穗，一个，j 、穗中含 有小花的数目具有物种特异性。而单子叶植物的税的许多特征明显不同予 双子叶植物( k y o z u k a 釉t a k e s h i ，2 0 0 0 ) 在单子时植物中，禾本科植物的 母 福建农林大学颈士学位论文 花最具多样性，其中水稻的花器官在禾本科植物中更具代表性( k y o z u k a ， 2 0 0 0 ) 水稻一个小穗只含有一个小花，而玉米一个小穗含有2 朵小花。水 稻的小穗除含有一朵小花外在小花的两侧还有两个颖片，称为护颖。小 花从外到内依次为1 个外稃、1 个内稃，2 个浆片，6 枚雄蕊和1 个雌蕊。 显然，水稻及其它禾本科植物花的最内两轮器官都是雄蕊和雌蕊，这 与拟南芥等双子叶植物是相同的。水稻的浆片可能与双子叶植物的花瓣是 同源器官，这个观点已逐渐被证实( k a n g 等，1 9 9 8 ；a m b r o s e 等，2 0 0 0 ： k y o z u k a 和s h i m a m o t o ，2 0 0 2 ) ，但内外稃片与花萼是否为同源器官却仍存 在争议。越来越多的实验显示，内外稃可能不是同一器官( 罗琼和朱立煌， 2 0 0 2 ) 。首先，内稃和外稃在形态上存在差异，排列不同( 互生而非轮生) ； 其次。在大麦的y e a 咖一1 7 e m m a 突变体中外稃转变成了发育完全的小叶片。 而内稃和其他花器官却没有发生形态的改变( p o z z i 等，2 0 0 0 ) ：最后，在 水稻中发现了无内稃，有外稃的突变体( 罗琼等，2 0 0 2 ) 。这些实验都暗示 了内外稃形态及遗传控制的差异。因此，水稻内外稃的关系及其与双子叶 植物花萼的对应关系都尚待新的研究和发现来阐明。 1 _ 2 3 水稻花器官发育的遗传控制 当植物接受了决定开花的信号，茎尖分生组织转化为花序分生组织、 花分生组织后，最后一步也是最关键的一步就是：开什么样的花。简单地 说，花器官的发育就是花器官的大小、数目、类型及位置是如何决定的。 花器官的发育调控有别于花序、花分生组织，花器官的发育受到一系列花 器官特性基因的调控。在水稻中已克隆了近3 0 个与花发育相关的m a d s 框 基因，它们分属于不同亚族。 花器官的发育是显花植物生殖生长期最明显的特征，近年来受到人们 的广泛关注并成为现代分子生物学研究的焦点之一( t h e i s s e n 和s a e d l e r ， 1 9 9 9 ：p r u i t t 等，2 0 0 3 ) 。这不仅是因为花在植物的生眭发育中处于中心 位置，而且花器官的发育过程为研究基因的表达调控与形态发生之问的关 系提供了一个非常独特的系统。 许多研究表明，a b c 模型在双子叶植物中是广泛适用( m a 和 d e p a m p h i l i s ，2 0 0 0 ：l a w t o n r a u h 等，2 0 0 0 ) 。但是否也完全适用于禾谷 1 0 福建农林大学硕：t 学位论文 类作物尚无定论。水稻中一些基因虽然与拟南芥和或会鱼草中的对应基因 同源，但功能上可能出现了分歧( k y o z u k a 等，2 0 0 0 ) 。目前依据拟南芥和 其它双子叶植物花器官发育基因，已经在水稻中克隆了许多同源基因 ( c h u n g 等，1 9 9 4 ，1 9 9 5 ；k a n g 等，1 9 9 5 ，1 9 9 8 ：m o o n 等，1 9 9 9 a ；l o p e z d e e 等，1 9 9 9 ：k y o z u k a 等，2 0 0 0 ) 。 r a p l a 和r a p l b 是基于a 用纹删在水稻中克隆的a 功能同源基因。 r a p l a 编码的蛋白非常近似于玉米中的倒刀蛋白( m e n a 等，1 9 9 6 ) 。它在 小穗发育早期花分生组织的顶端区域表达，花发育后期则局限于内稃、外 稃和浆片中表达，而雄蕊和雌蕊原基中没有表达，这与月用在拟南芥中的 表达模式一致( k y o z u k a 等，2 0 0 0 ) ，表明r a p j a 在水稻花分生组织诱导中 起重要作用。虽然r f l 和r a p i a 分别是拟南芥产y 和a p l 的同源基因，但 它们的m r n a 积累模式却不同，这暗示了a p l 和l f y 在水稻中的直系同源基 因r f l 和r a p i a 的功能可能发生了变异( 罗琼和朱立煌，2 0 0 2 ) 。 水稻的弧自镏和o s m a d s 4 基因与b 功能家族基因能p i 有很高的同 源性( c h u n g 等，1 9 9 5 ) 。o s m a d s l 6 是通过酵母双杂交系统以o s m a d s 4 为钓 饵检测到的一个与a p 3 同源的基因( k a n g 等。1 9 9 5 ) 。o s m a d s 2 的m r n a 主 要出现在浆片和雄蕊中，而不出现在内、外稃和雌蕊中。在水稻中表达反 义o s m a d s 4 ，会使第2 轮和第3 轮花器官发生改变，即浆片变成类似于稃 片的器官，雄蕊变成心皮样结构。o s t m d s 6 也主要在第2 和第3 轮花器官 中表达( k a n g 等，1 9 9 5 ，1 9 9 8 ；m o o n 等，1 9 9 9 b ) 。这表明b 功能基因在 水稻中是保守的。但是o s m a d s 6 在酵母中具有转录活性，能与相互作用， 而a p 3 在酵母中没有转录活性，而且不能与o s m a d s 4 互作( m o o n 等，1 9 9 9 b ) 。 所以o s m a d s l 6 和爿舟蛋白的功能存在差异，这暗示a p 3 家族在单子叶植物 和双子叶植物的分子进化过程中，其b 基因功能发生了变异( 罗琼和朱立 煌，2 0 0 2 ) 。 水稻中层前克隆到的c 功能基因有o s t , f i d s 3 和r a g ( r a n g 等，1 9 9 5 k y o z u k a 等，2 0 0 0 ) ，它们都与拟南芥的爿占基因高度同源，与玉米的捌卯 和金鱼草的p l e 在m a d s 结构域只有一个氨基酸不同。o s m a d s 3 和r a g 编码 的蛋白质序列除n 端r a 6 多出3 9 个氨基酸外，其余序y i j r 有一个氨基酸的 祸建农林大学硕j ：学位论义 差异，它们很可能是同个基因，其序列差异可能反映了它们在不同品种 间的多态性。o s m a d s 3 的m r n a 主要在雄蕊和雌蕊原基中积累，而不在浆片 和内、外稃中表达( k y o z u k a 等，2 0 0 0 ) 。 烟草的o s m a d s 3 转化植株花萼形态及颜色显示异常，但没有心皮样结 构产生，花瓣也只是转变成雄蕊样花瓣，没有完全转化为雄蕊结构( k a n g 等，1 9 9 5 ) 。o s m a d s 3 在水稻中过量表达要比在烟草中的效应大得多，可使 与花瓣相对应的浆片完全向雄蕊转化：但内外稃却不似烟草的花萼那样， 没有任何表型变化( k y o z u k a 和s h i m a m o t o ，2 0 0 2 ) 。究其原因有以下三种 推测： 一个可能的原因是，内、外稃并不与花萼相对应，不是受a 、b 、c 三 组基因控制的花器官，因此a b c 模型不适用于这些器官。但是，在水稻中 发现了一个推测为c 功能基因的突变体p s d l ，它表现为雌、雄蕊退化并出 现多重稃片( 段远霖，2 0 0 1 ) 。这暗示，调控雌、雄蕊发育的基因同时也影 响内、外稃的j 下常发育。由此看来关于内、外稃不受a b c 基因控制的假 设似乎并不成立。事实上，前面已提到a 功能基因r a p i a 只在内、外稃和 浆片中表达。 另一种可能的原因是，o s m a d s 3 与拟南芥的a g 功能不完全相同。 o s m a 聊只特化雄蕊，不决定心皮，而心皮由另外的基因控制。这有点类 似于玉米中的a g 直系同源基因力m 昭和捌叫的作用( m e n a 等，1 9 9 6 ：s c h m i d t 和a m b r o s e ，1 9 9 8 ) 。但这种假设也有些问题。o s m a d s 3 在烟草中多少还是 对花萼有些影响的，尽管没有心皮样结构产生。o s m a d s 3 在烟草中异位和 或过量表达不决定心皮可能有两种解释：o s m a d s 3 来自单子叶植物，在 双子叶中表达的效应可能较弱；o s m a d s 3 在烟草中只相当于使c 功能基 因过量表达，但并没有使a 功能基因突变丢失，因而 功能基因的拮抗作 用使o s m a d s 3 的效应减弱( 特别是在第一轮：第二轮效应较笫一轮强的原 因可能是存在b 功能基因的协同作用) 。相似地，水稻中o s m a d s 3 过量表达 不影响内、外稃也可能是由于a 功能基因的拮抗作用，而浆片的雄蕊化可 能是因为b 功能基因的协同作用较大引起的。 还有一种可能的原因是，在草本植物中，心皮的特化不单独由c 功能 捐建农林大学硕士学位论义 基因决定。因此，尽管别甜基因倾向于在心皮中表达，但别“突变并不 引起明显的心皮同源异形转换，而是仅仅影响花分生组织的决定( m e n a 等， 1 9 9 6 ) 。所以在草本植物中可能还存在其它基因决定心皮的形成( k y o z u k a 和s h i m a m o t o ，2 0 0 2 ) 。在水稻d - s u p ( p s d i o p f n g e a f - s u p e r m a n l ) 突变 体中，心皮被雄蕊取代( n a g a s a w a 等，2 0 0 3 ) 。因此，悦一s u p i 可能是水稻 中特化心皮的一个候选基因。 总之，水稻的开花及花发育研究才刚刚丌始，获得的数据还比较零散， 对水稻的花发育过程的遗传调控机制尚不能象拟南芥那样形成一个总体轮 廓。在过去的几年罩，对水稻开花及花发育的遗传研究主要是基于同源克 隆及与拟南芥比较的方法。可以预见，未来这仍是一种非常重要的研究方 法。然而，j 下如前面所叙述的，单单依赖于这种同源克隆的比较遗传学研 究，并不能完全阐明水稻开花及花发育的一些基本问题。随着水稻全基因 组测序的完成以及水稻突变体的大量发现，利用突变体的f 向遗传学研究 方法将在水稻花发育研究中发挥越来越重要的作用。 2 植物功能基因组学研究进展 植物功能基因组学( f u n c t i o n a lg e n o m i c si np l a n t s ) 是一个崭新的研究 领域，是植物后基因时代研究的核心内容，它强调发展和应用整体的( 基因 组水平或系统水平) 实验方法分析基因组序列信息、阐明基因功能。其特点 是采用高通量的实验方法结合大规模的数据统计计算方法进行研究。基本 策略是从研究单一慕因或蛋白质上升到从系统角度研究所有基因或蛋白 质。在植物功能基因组学的研究中，拟南芥和水稻是两种最常用的模式植 物。以下主要综述了目前植物功能基因组学研究中主要技术手段以及最新 的研究进展。 2 1 插入突变 在利用突变体进行功能基因的研究中，基因标记技术( g e n et a g g i n g ) 已证明是一种高效、快速鉴定和分离基因的手段。以转座子( t r a n s p o s o n ) 和t - d n a 作为植物基因标签技术的插入元件，在许多植物如拟南芥、金鱼 草和玉米等重要基因的分离研究中已取得成功的应用。 祸建农林太学硕士学位论文 2 1 1 转庶子系统 1 9 5 1 年b a r b a r a m c t i n t o c k 蓄炙在玉米孛发臻了控铡元搏，爱柬念名为 转录元件或转腹子( t r a n s p o s o n ) ，其是存谯于染色体d n a 上的一段可自我 簧话和位移靛淋a 净羁，霹敬逶过镯割、重薪整台等一系礤过程获基因 组的一个位置“跳跃”到另一个位麓。这一元件不仅可用于分析生物的遗 传进化，还为麓因工程和分子生物学研究提供了强有力的工鬃，可以在不 了解基鞠产物的生化性质翻表达模式的情况下，分离宠隆植物基因。转座 予标签( t r a n s p o s o nt a g g i n g ) 的原理是利用转座子的插入造成基因突变，以 转痉子黪穰为蒸懿，扶突变拣戆基强文露孛薅选出蒂衣此转壤予的毙隆， 宦必定禽有与转座予j 葶列相邻的突变基因的部分序列，再利用这部分序列 获野生羹基霞文瘁孛获褥完整酌萋毽( g i r d 霸s a e d l e r ，1 9 9 2 ) 。1 9 8 4 年， f e d o r o f f 等用转座子标签法首先从溢米中分离了b r o n z e 基因，该基因编码 蕊米花色素合成途径的关键酶u d p 一豢黄酮葡萄耱蘩转移酶。1 9 9 3 年， a a r t s 等人剥用转座予标签技术从拟南芥中发现个雄性不育基因( a a r t s ， 1 9 9 3 ) 。已往的研究表明，转座子的插入位点是随机的，由转座子插入引超 鹣表型变异菝率是i - - 5 。变异频率取决于裴选用豹练选方法，这点与 由农杆菌引起的卜d n a 捅入相似( a n d y ，2 0 0 2 ) 。在水稻中，t o s1 7 同源 恢复转癜子氇被应瑙予基嚣探溺( h i r o c h i k a ，1 9 9 7 ) 。 近年来，人们利用玉米和金鱼草的转座子作分子标签，融从玉米和金 照草突变种的染色体上克隆了2 0 余种新基因。隧着植物组织培养和遗传转 他技术的发蒙，人们可以将一零申撼犍中的转座予目l 入到异源植物体内，弗 诞明转座子在异源植物体内可发，圭转座，从而大大拓宽了转魔子标签法的 疵弱蔻爨( 张爨六，t 9 9 3 ) ，其已戏为接魏基毽鉴定、分离黪骞效方法。 2 1 2t - d n a 插入 土壤根癌农杆菌可将自身携带的t i 质粒上的一段t - d n a ，通过侵染禳 物褒日薅转移到植物基因缎中。t - d n a 的插入可引起植物基因突变，它常 魁通过阻断正常基因的表达而表现为敲除突变。通过对t - d n a 两侧基因序 捌终特箨扩趱等方法霹分褒到鹭璺三垄豹基因。遮转方法可在鞭先不如道基 因的产物和表达的情况下分离基因。常规的农杆菌介释的t - d n a 转移，在 福建农林大学硕l ：学位论文 大多数情况下都需经过植物组织培养，因而t d n a 插入引起的突变常与由 组织培养引起的无性变异相混淆而大大限制了它的应用。然而，在拟南芥 中由于可采用多种不需要植物组织培养的转化方法! i l 】真空渗透法，花j 浸渍法等转化方法而表现了很低的非靶基因突变因而，应用较广。同时， t - d n a 插入突变的检出有赖于精确的遗传分析和对转化材料的分子检测。 目前利用t - d n a 插入引起突变已在拟南芥上分离、鉴定出若干基因( a n d y ， 2 0 0 2 ：m a t h u r ，1 9 9 8 ) 。对于t - d n a 突变的分子生物学分析认为：t - d n a 可插入到一个基因的任何部位，既可发生在内含子部位也可发生在启动子 部位( a z p i r o z l e e h a n ，1 9 9 7 ) 。而且t - d n a 可随机地插入染色体上的任何 部位。除拟南芥外t - d n a 插入突变同样也可应用在水稻等其它作物上。诱 导t _ d n a 插入突变具体研究策略为：将n p t i i ，g u s 等标记基因克隆到 t - d n a 区段上。根据实验目的不同可分别设计不同的载体，然后用这些载 体转化植物，分析转基因后代的遗传表现，从而发现新的基因或获得生物 体基因的多种信息。 对水稻而言，t - d n a 的插入热点大多集中在基因组的活跃转录或具有 转录潜力的区域，是理想的基因标记工具( k o n c z ，1 9 8 9 ，1 9 9 2 ；h e r m a n ， 1 9 9 0 ) 。j e o n 等( 2 0 0 0 ) 利用卜d n a 插入法建立了近3 0 ，0 0 0 个水稻转 基因株系，通过