（分析化学专业论文）识别自由基的新型荧光探针研制及其用于单细胞成像和流动注射分析.pdf

独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得 ( 注：如没有其他需要特别声 明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 一魏谋彬面 翱箨气秒交 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权堂 查坠可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名 悄侈西 弓净1t 灰 导师签字： 9 签字日期：2 0 0 辟彭月乡日 签字日期：2 0 0 厂年6 月6 日 山东师范大学硕士学位论文 摘要 在生物代谢过程中不断产生各种自由基，如：超氧阴离子自幽基( 0 2 ) 、 羟自由基( h o ) 、双氧水( h 2 0 2 ) 、氧化氮( n o ) 和脂自由基( r 0 0 ) 等。其 中羟自由基( h o ) 是生命活动过程中产生的一种目前已知氧化性最强的自由基， 它能造成组织过氧化、蛋白质交联变性、核酸损伤和多糖分解等，是目前公认的 毒性最大的自由基。并且它产生的二级自由基会引起细胞，组织等不可逆转的损 伤。因此在生命科学、环境科学等领域，已对h o 展开了大量研究。 n o 是目前在体内发现的最小、最轻、最简单的生物信息分子，过去曾被称 为内皮细胞衍生舒张因子( e d r f , e n d o t h e l i u m d e r i v e dr e l a x i n gf a c t o r ) 、在1 9 世 纪8 0 年代，n o 被证明和e d r f 在产生的量和时间及生理功能具有同一性。体 内n o 是n o 合酶( n o s ) 催化氧化l 一精氨酸( l a r g ) 生成的，它的生理作用 与心血管系统、神经系统、泌尿系统、免疫系统和性兴奋都有密切的关系， f u r c h g o t t ，i g n a r r o 和m u r a d 因研究发现n o 是一i i , 血管系统中的信息分子而共同获 得1 9 9 8 年诺贝尔医学和生理学奖，此后各国都对n o 进行了广泛的生物学研究。 然而，由于生物体内活性自由基的寿命非常短，导致通常情况下稳态浓度极 低，而短寿命和低浓度意味着自由基的测定异常困难，特别是在生物活体内( i n v i v o ) 与直接原位( i ns i t u ) 的检测目前尚未有突破。另外生物体内还存在着预防自 由基损伤的内在抗氧化防护体系，因而至今为止人们尚无法直接动态观测到某些 器官中活性自由基的产生，对它们的生成机制，生理作用及其动态损伤生物机体 的过程都缺乏足够的认识和充分的实验证据，以至在临床上直接影响和限制了对 许多疾病的治疗效果。因此，针对动、植物生物活体内自由基开创新的分析与检 测技术是分析化学学科发展中具有挑战性的前沿课题之。 荧光法具有简单、易行、灵敏度高与选择性好等特点。流动注射分析法重现 性好，分析速度快，可以实现样品的实时、在线分析及分析过程的自动化。将流 动注射与高灵敏度的荧光法结合起来用于测定自由基，有望实现生物样品中自由 基的实时、在线、高通量分析，方法不仅具有很高的灵敏度和选择性，而且能够 实现分析过程的自动化。本论文基于一氧化氮自由基和羟自由基与荧光探针作用 后荧光光谱性质的改变，开展了以下几方面的工作。 一设计合成了用于一氧化氮自由基识别检测的荧光探针邻二氨基苯基吖 山东师范大学硕士学位论文 啶，用流动注射荧光法对一氧化氮自由基进行分析测定，讨论了反应机理及测定 条件，并将其应用于糖尿病人血清中一氧化氮含量的钡4 定。同时考察了该荧光探 针在小鼠腹腔巨噬细胞内一氧化氮自由基的生物成像。 二( 1 ) 利用联吡啶捕获羟自由基后荧光增强，用流动注射荧光法研究了新 鲜蔬菜水提取物对羟自由基的清除作用，为抗氧化剂的筛选提供了高通量的分析 方法。 ( 2 ) 利用苯骈戊三酮捕获羟自由基后荧光增强，用流动注射荧光法研究 了天然食物水提取物对羟自由基的清除作用，为抗氧化剂的筛选提供了高通量的 分析方法。 关键词：羟自由基，一氧化氮，细胞成像，抗氧化剂，流动注射荧光法，分析应 用 山东师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t n u m e r o u sf r e er a d i c a l sa r eg e n e r a t e di nt h ec o u r s eo fb i o l o g ym e t a b o l i s m ，s u c h a s ：s u p e r o x i d ea n i o nr a d i c a l s ( 0 2 。) ，h y d r o x y lr a d i c a l s ( h o ) ，h y d r o g e np e r o x i d e ( h 2 0 2 ) a n dr 0 0 t h eh y d r o x y lr a d i c a l s ，t h es t r o n g e s to x i d a n t st ob ew e l lk n o w n ，a r e t h o u g h tb eg e n e r a t e dw i t h i nc e l l sa n dt i s s u e s ，w h e r ei t c a na t t a c kp r o t e i n s ，l i p i d sa n d d n a m o r ei m p o r t a n t ，i tc a ni n i t i a t es e c o n d a r yr a d i c a l st h a tc a l lp r o d u c ei r r e p a r a b l e d a m a g e s t h e r e f o r e ，h y d r o x y lr a d i c a l sh a v eb e e ns u g g e s t e dt op l a yac r i t i c a lr o l ei n m a n yp a t h o l o g i c a lp r o c e s s e s n i t r i co x i d ew a sf o u n dt ob es m a l l e s t ，l i g h t e s t ，s i m p l e s tb i o l o g i c a li n f o r m a t i o n m o l e c u l ei nt h eb o d y , w h i c hw a sn a m e de n d o t h e l i u r n d e r i v e dr e l a x i n gf a c t o r ( e d r f ) i nt h ep a s t i n19 8 0 s ，i tw a sp r o v e dt h a tn i t r i co x i d ef u n c t i o na se n d o t h e l i u m d e r i v e d r e l a x i n gf a c t o ri nt h eb o d y n i t r i co x i d ew a ss y n t h e s i z e dt h r o u g hl - a r g i n i n ec a t a l y z e d b yn i t r i co x i d es y n t h a s e ( n o s ) i nt h ec e l l ，w h o s ep h y s i o l o g ya c t i o nh a sa l li n t i m a t e r e l a t i o nw i t hc a r d i o v a s c u l a rs y s t e m ，n e r v o u ss y s t e m ，u r i n a t i o ns y s t e m ，i m m u n e s y s t e ma n dv e n e r e a le x c i t a t i o n f u r c h g o t t ，i g n a r r o a n da n dm u r a d ，w h of o u n dt h a t n i t r i co x i d ew a sa ni n f o m a a i o nm o l e c u l ei nt h ec a r d i o v a s c u l a rs y s t e m w a sa w a r d n o b e lp r i z ei np h y s i o l o g yo rm e d i c i n ei n1 9 9 8 t h e r e f o r e ，b i o l o g i c a lr e s e a r c ho n n i t r i co x i d ew a sp e r f o r m e di nm a n yc o t m t r i e s i ti sw e l lk n o w nt h a th y d r o x y lr a d i c a la n dn i t r i co x i d eh a v ed a m a g e so n o r g a n i s m sa n dh a v eg o t t e ng r e a ta t t e n t i o ni nt h e2 0 t hc e n t u r y , b u tt h es h o r tl i v e sa n d l o wc o n c e n t r a t i o no ff r e er a d i c a l sm e a nt ot h ed e t e r m i n a t i o nd i f f i c u l t ，e s p e c i a l l yt h e d e t e r m i n a t i o ni nv i v oa n di n s i t uh a sn ob r e a k t h r o u g h i na d d i t i o n ，t h e r ee x i s tt h e a n t i o x i d a t i o ns y s t e m sp r e v e n t i n gt h ed a m a g e so ff r e er a d i c a l si no r g a n i s m s u pt o d a t e ，i tc a n n o tb eo b s e r v e dt h ed y n a m i cg e n e r a t i o no fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e si ns o m e o r g a n s e n o u g hc o g n i t i o na n ds u f f i c i e n te x p e r i m e n t a le v i d e n c e so ft h e i rg e n e r a t i o n m e c h a n i s m ，p h y s i o l o g i c a la c t i o na n dd y n a m i cd a m a g e so no r g a n i s m sa r en o ta c q u i r e d t h e r e f o r e ，t h et h e r a p ye f f e c t so fm a n yd i s e a s e si nc l i n i ca r el i m i t e da n dt h e ya r em a i n o b s t a c l e st ot h ep l a n tc u l t i v a t i o ni na d v e r s i t y s oi ti so n eo fc h a l l e n g i n gs c i e n t i f i c r e s e a r c h e si na n a l y t i c a lc h e m i s t r y , i nw h i c hn o v e la n a l y s i s a n dd e t e r m i n a t i o n 3 山东师范大学硕士学位论文 t e c h n o l o g i e sc o m r a p o s i n gt or e a c t i v eo x y g e ns p e c i e si nv i v on e e dt ob ed e v e l o p e d c o m p a r e dw i t l lo t h e ra n a l y t i c a lm e t h o d s ，s p e c t r o f l u o r i m e t r y i sm o r es i m p l e ， s e n s i t i v ea n ds e l e c t i v e t h ef l o wi n j e c t i o n ( f i ) a n a l y s i sh a sb e u e rr e p r o d u c i b i l i t ya n d r a p i da n a l y s i s ，w h i c hc a na c h i e v er e a l t i m e ，o n l i n ea n da u t o m a t i ca n a l y s i so fs a m p l e s t h ec o m b i n a t i o no ff 1w i t hs p e c t r o f l u o r i m e t r yt od e t e r m i n eh o n o to n l yh a sh i g h s e n s i t i v i t yb u ta l s oc a r lm a k et h ea n a l y t i c a lo p e r a t i o na u t o m a t i c b a s e do nt h ec h a n g e si ns p e c t r u mc h a r a c t e r so ft h ef l u o r e s c e n tp r o b e sr e a c t i n g w i t hr a d i c a l ，w eh a v ec a r r i e do u tt w oa s p e c t so fi n v e s t i g a t i o n ： f i r s t ，t w of l u o r e s c e n tp r o b e so fv i c i n a ld i a m i n o b e n z o a c f i d i n e ( v d a b a ) w a s s y n t h e s i z e d i t sr e a c t i o nw i t hn i t r i co x i d ew a si n v e s t i g a t e db yf l o wi n j e c t i o n s p e c t r o f l u o r i m e t r y t h er e a c t i o nm e c h a n i s mw a ss t u d i e da n dt h ep r o p o s e dm e t h o d s w e r ea p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fn i t r i co x i d ei nt h e p a t i e n t a tt h es a m et i m e ， v i c i n a ld i a m i n o b e n z o a c f i 由n ew a su s e dt op e r f o r mi m a g eo fn i t r i co x i d ei nt h ec e l i a c m a c r o p h a g e s e c o n d ，b a d e do n2 ，2 - b i p y r i d y lt r a p p i n gh o ，a na u t o m a t e ds p e c t r o f l u o f i m e t r y f o rd e t e r m i n i n gh o w i t hf l o wi n j e c t i o na n a l y s i sw a sd e v e l o p e d i tw a s a p p l i e dt ot h e a n t i o x i d a t i o nd e t e r m i n a t i o no fc o m m o nf r e s hv e g e t a b l e s t h em e t h o dc o u l db eu s e d t os i e v ea n t i o x i d a t i o nm e d i c i n e s t h i r d ，b a d e do nn i n h y d r i nt r a p p i n gh o ，a na u t o m a t e ds p e c t r o f l u o r i m e t r yf o r d e t e r m i n i n gh o w i t hf l o wi n j e c t i o na n a l y s i sw a sd e v e l o p e d i tw a sa p p l i e dt ot h e d e t e r m i n a t i o no ft h ea n t i o x i d a n tc a p a c i t yo fn a t u r ef o o d sa q u e o u se x t r a c t s t h e m e t h o dc o u l db eu s e dt os i e v ea n t i o x i d a t i o nm e d i c i n e s k e y w o r d s ：h y d r o x y lr a d i c a l s ( h o ) ，n i t r i co x i d e ( n o ) ，f l o wi n j e c t i o n s p e c t r o f l u o r i m e t r y , a n t i o x i d a n t a n t ，c e l li m a g i n g ，a n a l y t i c a la p p l i c a t i o n 4 山东师范大学硕士学位论文 第一章绪论 生物体内n o 的检测研究进展 n o 是目前在体内发现的最小、最轻、最简单的生物信息分子，在人们认 识它之前，曾被称为内皮细胞衍生舒张因子( e d r f , e n d o t h e l i u m d e r i v e d r e l a x i n g f a c t o r ) ，在1 9 世纪8 0 年代，n o 被证明和e d r f 在产生的量和时问及生理功能上 具有同一性。体内n o 是n o 合酶( n o s ) 催化氧化l 精氪酸( l a r g ) 生成的， 它的生理作用与心血管系统、神经系统、泌尿系统、免疫系统和性兴奋都有密切 的关系，各国都对n o 进行了广泛的生物学研究。在1 9 9 2 年，n o 成为( ( s c i e n c e ) ) 杂志的年度分子，而f u r c h g o t t ，i g n a r r o 和m u r a d 更因研究发现n o 是心衄管系统 中的信息分子而获得1 9 9 8 年诺贝尔医学和生理学奖。然而由于n o 的自由基性 质，它在生物体系中呈高活性，很不稳定，半衰期很短( t l a 5 秒) 。此外，n o 是一个亲脂的气体分子，能从产生地移动很远的距离，细胞膜根本不能阻挡它， 并且n o 在细胞中的浓度很低( r a m g m 水平) 。本文综述了近年来一氧化氮分析 检测方法的进展i 。 1 电子自旋共振( e p r ) 光谱探针 n o 是一种气体自由基，具有未成对电子，是顺磁性物质，所以从理论上讲n o 可以直接用e p r 法测定，但由于n o 的单电子弛豫时间太短，不易检测，必须与另外 一种化合物相结合，产生一个比较稳定的配合物，才能用e p r 检测到n o i 。 1 1 亚铁血红蛋白 亚铁血红蛋白( h b ) 与n o 作用产生亚硝酰血红蛋白( n o h b ) 署n 高铁血红蛋 白( m e t h b ) ，在温度7 7 k 下n o h b 光谱有特征的三线态结构，而在其它的亚硝基化 合物存在下h b 并没有这种超精细结构 4 i 。g r e e n b e r g 等人 s j 用e p r 技术研究了 e d r f 的活性和n o 在大腿骨动脉中的含量检出限为1 0 n m o l l 。w e n n m a l m 等人 【6 谰这种技术测定了人体臂血中n 0 2 - 的含量，先用连二硫酸盐把n 0 2 还原成n o ， 再利用e p r 技术测定，测定范围为0 o 6 m m o l l 。 1 2 二硫代氨基甲酸盐类 二硫代氨基甲酸盐本身不能与n o 直接作用，它们首先与f e 2 + 形成二元配 合物，二元配合物再与n o 形成三元配合物，由于n o 具有未成对电子，所以这种三 元配合物也可用e p r 技术检测。y o s h i m u r a 等 j 报道了n ，n 二乙基二硫代氨基甲 山东师范大学硕士学位论文 酸盐( d e t c ) 、n 一甲基一d 一葡糖胺氮基甲酸盐( m o d ) 矛 in 一二硫代羧酸肌氨酸 ( d t c s ) 等与f e 2 + 的二元配合物( f e d e t c 、f e m g d 、f e d t c s ) 再与n o 形成多 元异配位的配合物( n 0 ，f e d e t c 、n o f e - m g d 、n o 。f e d t c s ) ，水溶性好且很稳 定。作为e p r 时间分辨探针检测生物活体中n o 的含量，并应用e p r 二维照相技 术来研究小白鼠心脏中n o 的产生，取得良好效果。n o f e d t c s 的e p r 光谱的 。 信噪比f 大于1 0 ) l k 其它n o f e 配合物好。然而，n o f e m g d 和n o f e d e t c 的 光谱信号的振幅比n o f e d t c s 小。n o f e d t c s 具有最好的水溶性，故应用于 生物活体中n o 的检测，结果令人满意。 1 3 咪唑类 赵洪涛等人 8 】设计合成出1 0 种咪唑类n o 自旋捕集探针，可测得5 p m o l l 的n o ，而且专一性强，不受超氧阴离子自由基和羟自由基的干扰，办不受介质p h 值和盐浓度的影响。这1 0 种探针与n o 反应可分成三类，不同类的反应速度相差 很大，灵敏度也与反应速度相一致。由实验可知，取代基与咪唑环是否形成共轭结 构及取代基的电子诱导效应均影响探针的性质。取代基与咪唑环不能形成共轭结 构，与n o 反应速度较慢，取代基与咪唑环能形成共轭结构，与n o 反应速度则较快， 说明取代基与昧唑环形成共轭结构有助反应速度的提高，同时取代基吸电子能力 越强，探针与n o 反应速度越快，灵敏度越高。捕捉n o 特异性强是这类探针的优 点。 1 4 氮氧自由基类 k h r a m t s v 9 1 研究小组合成出一系列氮氧自由基类( n i t r o n y l n i t r o x y l r a d i c n ，n n r ) ，它们与n o 反应，生成稳定的亚氨基硝基氧化物( i m i n o n i t r o x i d e ，i n r ) 用e p r 技术检测。他们合成的这一系列试剂与n o 的反应较快，是n o 的一种高 效的反应捕捉试剂。他们把这类试剂应用于测定小鼠的小脑中n o 合酶产生n o 的含量，同时也证明了在线检测生物样品中n o 的可能性。但n n r 和i n r 在生物 体内很快被还原，为了克服这个缺点他们用硫甘油作为还原剂，硫甘油比其它的还 原剂如4 - 羟基t e m p o 还原性要高。 1 5 环状化合物类 s u s t m a n n 小组 1 0 - 1 1 研究了n o 与环状化合物发生螫合反应形成环状的 n o 自由基，再用e p r 检测。他们称这种试剂为螯合捕集剂( n i t r i co x i d e 6 山东师范大学硕士学位论文 c h e l e t r o p i ct r a p s ，n o c t s ) 。真正的捕集试剂是由2 一茚酮或其衍生物光解得来。他 们首先利用的是n o t c l ( p r o t o t y p a lt e t r a m e t h y l ) ，由于n o t c 一1 在生理温度下存 在时间很短，而使捕集率低，后来扩大了共轭体系，又发展了 n o t c 4 ( t r i m e t h y l l i n d e n y l ) ，n o t c 一4 的稳定性比n o t c 一1 好。但总的来说，该方法 反应速度太慢，只有6 的捕集效率，故在实际应用中受到很大限制。 2 电分析化学中分子探针 2 1 金属卟啉类络合物 金属卟啉类配合物在电化学中的应用主要是金属卟啉类配合物膜修饰微 电极，这类电极是基于配合物对n o 的催化氧化，产生氧化电流。m a l i n s k i 和t a h a ( 1 2 1 用n i t m h p p 和n a t i o n 修饰碳纤维工作电极，在电位0 6 3 v 检测到n o 阳极峰电 流，超过n o 浓度2 0 倍的n 0 2 也不影响n o 的测定，灵敏度高，检出限达1 0 r t m o l l 响应时间快( 1 0m s ) ，已用于平滑肌细胞释放n o 的测定。k i t a j i m a 等人比较会 属卟啉和n a t i o n 修饰的玻璃电极，利用不同的电化学检测方法，结果显示用铁四 ( 五氟苯) h i - 啉修饰的电极，结合安培法检测n o 的灵敏度和选择性最好，检出限达 1 0 a m o l l 。目前金属卟啉类配合物膜修饰微电极发展很快，卟啉配合不同的金属 离子的电极，适用于不同的样品测量，已应用于单细胞内n o 的测定，而且已商品 化。 2 2 席夫碱金属络合物 金利通和莫金桓等合成了一系列席夫碱金属配合物，制做膜修饰电极，如聚 n ，n 双水杨醛乙二胺合铁1 钉、聚 n n ”( 1 ，3 一n - - , x 甲基) 双( 1 ，2 苯二氨 基) n ，n7 ，n “，n 合镍和n , n 2 , 6 一二乙酰吡啶缩苯双苯胺合钻【1 7 1 。这些化合 物制得的电极对n o 都具有催化氧化作用，而且这些电极具有良好的化学和电化 学稳定性，抗干扰能力强，如抗坏血酸、精氨酸及亚硝酸根都不干扰测定。在这 几种化合物中聚n ，n - 双水杨醛乙二胺合铁膜修饰的电极灵敏度最高，检出限为2 1 0 一m o l l 。 。 2 3 其它 m a r i l y n 等人【1 8 】用邻二氨基苯修饰的碳纤维具有最好的灵敏度和选择性， 同金属卟啉和n a t i o n 修饰的电极相比，检出限达3 5 7 n m o l l 。r a v e h 等人比 较不同的金属一酞菁配合物微电极对n o 的催化反应活性，n i 酞菁络合物膜反应活 山东师范大学硕士学位论文 性最高。p o n f i e 等人【珈制作镍，四磺酸酞菁m i t s p c ) ! n 1 邻二氨基苯修饰的碳纤维 微电极，并比较它们分析干扰物的渗透性，如l 精氨酸，亚硝酸根等。 微透析技术在n o 检测中的应用随着检测n o 技术的发展，微透析技术愈来 愈受到重视。该技术主要是将微透析探针插入脑组织中，收集脑组织细胞外液。 常用的微透析探针直径约2 0 0 3 0 0u m ，双腔长约3 m m ，透析膜为纤维素膜精除去 分子量5 0 0 0 5 0 0 0 0 ( 5 k d - - 5 0 k d ) 的物质。微透析过程如下：将动物麻醉后，在3 7 5 下保温，将微透析探针插入到海马区或大脑纹状体，探针用微量调节注射器灌流 r i n g e r s 液或k r e b s 缓冲液或f l a n k 。s 缓冲液，灌流液预先用超声波或超滤除气，灌 流速度依需要而定，经过一段时间平衡后，收集透析液。由于n o 在有氧环境中极 不稳定，因此，可用重氮化反应法【2 1 1 检测其代谢产物n 0 2 n o 3 。，间接反映n o 的水 平。血红蛋白是一个非常有效的n o 自由基捕捉剂，它对n o 的亲和力比氧气要 高5 6 个数量级( 捌，捕捉了n o 以后，亚铁血红蛋白迅速变成高铁血红蛋白。因此， 用高铁血红蛋白法来检测n o 比重氮化反应法更具有特异性。若采用此方法，则 应该用氧合血红蛋白来灌注，使n o 优先与血红蛋白结合，减少氧对n o 的破坏， 所选用的微透析探针应有所不同，可采用单腔探针。 微透析技术对在体脑组织的n o 测定具有较高的精确度和很好的重复性，所 需的样品量很少。另外，微透析技术还有以下三个优点：是通过透析可除去一些 大分子，减少了测定时的干扰，省去了除蛋白的繁琐步骤；二是可以用来比较组织 不同区域的n o 水平；三是可以了解一氧化氮合酶( n o s ) 的活性分布及n o 合成的 时相。 3 紫外可见分子探针 3 1 亚铁氧合血红蛋白 还原型的亚铁氧合血红蛋白 h b ( f e 2 + ) 0 2 被n o 快速氧化为高铁血红蛋白， 高铁血红蛋白特征的s o r e t 吸收峰的位置从4 3 3 n m 移到4 0 6 n m ，利用时间分辨双 光束光度仪，= - 1 - 钡0 出n o 的含量。这种方法的检出限达1 0 n _ m o l l 23 1 ，同时这种方法 可以避免样品酸度和高铁血红蛋白稳定性的影响。k o s t i e 等人拉4 1 用这种方法证明 由于n o 产量的增加，局部心肌缺血运动力增强。也有人用此方法证明了在小白 鼠的心脏中因注入了亚硝基血管扩张剂，可使血液中h b - n o 的含量增；t i l 25 1 。 3 2 辣根过氧化酶 毫 山东师范大学硕士学位论文 辣根过氧化酶( h r p ) 与n o 形成一种非常稳定的n o f e 一卟啉配合物，辣根 过氧化酶的吸收波长的s o r e t 峰从3 9 65 r i m 移到4 2 0 0 n m 用于测定n o 。其测定 原理同亚铁氧合血红蛋白测定n o 相似。这种方法操作简单，没有副反应的影响， 检出限为1 0 n m o l l 。 3 3g r i e s s 试剂 g r i e s s s 试剂是对氨基苯磺酰胺和n 一( 1 一萘) 7 , - - 胺，测定方法是稀磷酸介质 中，n q 。与对氨基苯磺酰胺反应生成重氮盐，再与n ( 1 一萘) 乙二胺偶联成红色染料 后，在 m a x5 4 3 n m 进行光度测定。该方法是测定生物样品中n o 的代谢产物亚 硝酸盐最常用的方法。这种方法一般用于环境和食品中n o 的测定不适合生物 样品的检测。后来，l a u r a 1 等人用g r i e s s 试齐 j 法检测血浆和牛奶中的n o 和n 0 3 1 检出限为1 u m o l l 。m u s c a r a 2 8 1 等人结合高效液相色谱( h p l c ) ，提高了它的灵敏度 和选择性。 4 化学发光探针 4 1 化学发光探针研究最多的是用l u m i n o l h 2 0 2 发光体系检测n o ，反应机理是 n o 与h 2 0 2 反应生成过氧亚硝酸( o n o o h ) ，过氧亚硝酸氧化l u m i n o l 产生化学发 光，这种方法氮的其它氧化物均不影响测定，且反应在水溶液中进行。1 9 9 3 年，k i k u c h i 2 9 1 首次利用这种方法测小白鼠肝赃中的n o ，检出限达1 0 p m o l 。周宜开 等人【3 0 1 优化了该实验条件，检出限可达1 7 1 0 15 m o l l ，并用该方法测定白鼠脑中 n o 合酶的活性【3 l 】。z h o u 等2 k 3 2 利用此方法制成光化学传感器，响应时间只有8 1 7 s 检测限为1 3 1 0 - 6 m o l l 。 4 2 臭氧( 0 3 ) 化学发光检测n o 目前最常用的也是经典的化学发光方法检测n o 的原理是：n o 与0 3 反应形 成激发态二氧化氮( n 0 2 + ) ，n 0 2 + 在返回基态时释放能量，部分能量以光子形式发 射出来： n o + 0 3 一n 0 2 n 0 2 + 一n 0 2 + h v n 0 2 + 发出的光的波长在6 6 0 9 0 0 n m 之间，可通过敏感的光电倍增管 山东师范大学硕士学位论文 ( p h o t o m u l t i p l i e rt u b e ，p m t ) 测定，其信号强度直接与n o 水平成正比。如果样品是 液体，可以在真空条件下充入惰性气体将n o 驱出液体而进入气相，这一过程叫 “气提”f s t r i p p i n g ) 。 5 荧光分析法 内源n o 的理想测定方法应能同时测定n o 在细胞内的产生，迁移和空间分 布，并且满足一定的选择性，灵敏度才能进一步了解n o 的众多生物学角色m ”j ，而荧光分析法正是满足这些要求的最佳方法之一。近年来，生物成像在活 细胞的生物分子检测上取得了巨大进展，而荧光探针由于具有高灵敏度，实时监 测等优点而成为生物成像最主要的工具 3 5 , 4 7 1 。 5 1d a n le e 2 ，3 二氨基萘( d a n ) 是测定n o 应用最早且最多的荧光探针【3 6 】，1 9 9 3 年， m i s c o 等利用荧光很弱的d a n 与n o 的代谢产物n 0 2 - 生成在碱性条件下具有强 荧光的2 ，3 - h _ 1 一萘三唑( n a t ) 来检测血液中n o 的含量。n a t 的荧光强度至少 是等摩尔的d a n 的9 0 1 0 0 倍，在k 虮m = 3 7 3 4 1 5 n r n 下，检测限达1 0n m 。这种 分析方法为检测生理条件下的n o 提供了一个有效的途径。n o 在细胞内0 2 存 在下转化为n 2 0 3 ( n o 转化为最终产物n 0 2 - 和n 0 3 一的中间产物) ，生理p h 下， n 2 0 3 和d a n 生成n a t 。 为了在生理条件下对细胞内n o 进行成像，k o j i m a 基于d a n 与n o 的选择 性反应，对不能成像的d a n 修饰上一个酯基，合成了具有脂渗透陛的荧光探针 d a n 一1 e e ”】。d a n 。l e e 进入细胞以后被胞液中的酯酶水解成水溶性的d a n l ，d a n 一1 再和胞液中产生的n o 结合，从而生成具有强荧光的产物n a t 。 d a n l e e 已成功地应用于主动脉平滑肌细胞受诱导释放出的n o 的生物成像。 5 2d c f h 还原型的d c f h 本无荧光，它被n o 氧化成氧化型的d c f ( 二氯荧光素) 后荧光恢复，d c f h 的荧光强度与n o 的量呈正比关系。i m r i c h 和k o b z i c 利用 d c f h 作为荧光探针测出了肺巨噬细胞中的i n o s 活力。然而，在活细胞中除了 n o 外还有许多其它形式的活性氧( r o s ) ，如超氧阴离子自由基( 0 2 ) ，羟自由 基( o h ) ，过氧亚硝基( o n o o 。) 等，它们都可以把d c f h 氧化成强荧光的d c h 。 如f o i s s n e r 用d c f h 2 d a 作为成像试剂，用共聚焦激光扫描显微镜观察植物表 1 0 山东师范大学硕士学位论文 皮细胞内总的自由基水平【3 8 】。因此，d c f h 用于n o 荧光成像的专一性较差，灵 敏度较低( 检出限为1 6 “m ) ，而不适合在生物体中n o 的分析。此外，w o l f 认 为d c f h 更适宜作o n o o 一的荧光检测试剂，它对o n o o 一检测灵敏度比作为n o 的荧光试剂的灵敏度更高3 9 1 。 5 3 d a f 一2 d a 尽管d a n - le e 可用作细胞内n o 荧光试剂，但在实际n o 成像中很少应 用，因为它在用于活细胞中存在很多缺陷，如对细胞有毒性，激发波长较短而有 很强的自荧光干扰，消光系数较小，在生理p h 中溶解度较低等。为了检测活细 胞中n o 的生理功能，k o j i m a 设计合成了基于荧光素的新荧光试剂d a f 2 4 0 1 ， d a f 一2 本身荧光极弱，它与n o 反应生成相应的d a f 一2 t ( d a f 一2 的三唑形式) ， d a f 2 t 具有很强的荧光( 十= o 9 2 ) ，再加上d a f 一2t 的激发和发射波长都处于可 见光区域，减少了对活细胞的损害，同时避免了生物样品中自荧光的干扰，因此 d a f 一2d a 荧光探针已广泛应用于活细胞内n o 成像和检测中4 0 书1 。 孙建和利用d a f 一2d a 对豚鼠耳蜗外毛细胞内的n o 进行检测和成像，证 明了豚鼠细胞耳蜗外毛细胞内存在n o 4 2 1 。g a r c 4 s 用d a f 一2d a 对拟南芥叶活 细胞中n o 进行实时成像，发现叶细胞中n o s 主要为i n o s ，叶细胞在受到机械 胁迫时，胞内n o 增加，且n o 主要存在于保卫细胞的叶绿体中。 5 4 d a f f m d a 尽管d a f 一2 对n o 的检测具有极高的选择性和灵敏度( 检测限为5 n m ) ， 但其在实际应用到生物体系时仍然遇到了些麻烦，即d a f 一2t 的荧光强度对 反应体系p h 比较敏感。在p h 5 8 条 件时荧光强度即可趋于稳定【”1 。i t o h 用d a f f md a 应用于大鼠海马薄片 ( h i p p o c a m p a ls l i c e s ) 产生n o 的生物成像，发现n o 主要存在于c a l 区中。他 山东师范大学硕士学位论文 们同时将其用于大鼠膀胱的平滑肌细胞中n o 的监测，可以实时观察细胞内n o 的产生，分布 4 5 】。 5 5 d a r 一4 m a m 尽管d a f 一2d a 和d a f f md a 在n o 的检测和生物成像中已得到广泛 应用【4 1 - 4 5 ，但它仍存在一些瑕疵。为了获得具有更高光稳定性，更长的激发光 波长和更广的p h 适用范围的n o 荧光探针，n a g a n o 合成了d a r - - 1e e - 和d a f 一2 ，d a f f m 一样，d a r 一1e e 酯解后也与n o 反应生成相对应的强荧光的三 唑结构。然而在把d a r 1 e e 应用到鼠主动脉平滑肌细胞受诱导而产生的n o 成 像时f 4 6 】，却发现d a r 1 e e 需较长的时间爿1 能进入细胞，且进入细胞后需花费 很长时间才能获得一稳定的荧光强度。 因此n a g a n o 对d a r l e e 结构改造成d a r 一4 ma m ，把d a r 一1e e 的乙酸 乙酯取代为乙酸甲酯以使探针更易渗透到细胞内，把原d a r 一1 e e 的四个乙基取 代为四个甲基以使探针进入到细胞中能均匀地分散在胞液内。实验表明d a r - 4 m a m 更适合活细胞中的n o 成像，它的量子产率为垆o 8 1 ，检测限是7 r i m ，是 d a r 一1e e 的2 倍。k o j i m a 用d a r _ 4 ma m 作为荧光成像探针，发现牛主动脉 内皮细胞经血管舒缓激肽的诱导，胞内c a 2 斗水平提高，激活了n o s ，从而使细 胞内n o 大量表达。 参考文献： 1 】张娴，王红，梁淑彩，张华山分笏群掌掌握2 0 0 2 ，1 8 ( 6 ) ：5 1 3 2 】朱勇飞，王友顺乒缚卫生殓爱象孝2 0 0 0 ，1 0 ( 3 ) ：3 7 2 口1 祭蓉四埘省卫生管理干部学院学报1 9 9 8 ，1 7n 1 ：1 5 3 【4 s s g r e e n b e r g ，d e w i l c o x ，g m r u b a n y i c i r cr e s ，1 9 9 0 ，6 7 ：1 4 4 6 【5 】yh e n r y ，c d u c r o c q ，j d r