（无机化学专业论文）人类神经生长抑制因子的结构、性质与功能.pdf

中文摘要 人类神经生长抑制因子( h u m a nn e u r o n a lg r o w t hi n h i b i t o r yf a c t o r , h g i f ) 属于 金属硫蛋白家族，又称金属硫蛋白一3 ( m e t a l l o t h i o n e i n 一3 ，m t 3 ) 。它由6 8 个氨基 酸组成，包含2 0 个保守的半胱氨酸。和其它金属硫蛋白成员一样，h g i f 能结合 7 份二价d ”金属离子诸如z n ”、c d “，形成两个相对独立的结构域，每个结构 域分别包裹着一个金属硫簇，结构域之间由一段3 个氨基酸组成的l i n k e r 联接， 整个分子呈哑铃形状。h g i f 主要在中枢神经系统表达，有研究显示大脑皮层拥 有大量富含游离锌的神经元，h g i f 的分布同这些神经元的分布基本一致，暗示 h g i f 可能参与游离z n 2 + 的细胞内传递与调控。老年痴呆症是一种神经退行性疾 病，病人脑提取液中h g i f 的表达水平明显低于正常人，这导致神经元不受约束 的生长，过度消耗了营养，最终使神经元调亡：此外，对动物模型的研究显示， 当大脑受到损伤后h g i f 的表达量出现明显变化。这些研究说明h g i f 可能与神 经元的生长调控和修复有关。尽管关于h g i f 抑制神经元生长的机理以及它的靶 分子尚且不清楚，种种迹象表明多种因素共同参与调节其生理活性。 本实验室已有多年研究金属硫蛋白的历史，曾经在大肠杆菌中构建了金属硫 蛋白的高效表达体系，并且优化了纯化步骤，获得很高的蛋白产量；通过基因工 程技术，本实验室还曾经构建了系列h g i f 的突变体，并且详细研究了结构与 蛋白稳定性、反应性之问的关系。在此基础上，为进一步阐明h g i f 结构、性质 和功能之间的关系，我们全面而系统的考察了h g i f 一系列位点上的突变对神经 元生长抑制活性的影响。这些突变体包括：1 ) 针对肽链n 端1 3 结构域( 1 - 3 0 ) 保守的t h r 5 设计的突变体( a t 5 、t 5 a 、t 5 s ) ；2 ) 针对肽链n 端1 3 结构域保守 的c p c p 序列的突变( p 7 s p 9 a ) 3 ) 围绕保守的g l u 4 位点的突变( e 4 w 、a e 4 、 p 3 s e 4 r ) ；4 ) n o 反应的酸碱催化位点的突变( e 2 3 k ) ；5 ) 围绕肽链c 端结 构域( 3 4 6 8 ) 的e a a e a e 插入段设计的突变体( a 5 5 6 0 、e 5 8 k 、e 5 5 5 8 6 0 q 、 g 5 3 5 4 a ) ：6 ) 对l i n k e r 进行改造( a 3 1 - 3 4 、a 3 2 3 3 、k k s s p ) ；7 ) 结构域间的 转换杂合( a 3 4 3 6 、1 3 m t 3 1 3 m t 3 、1 3 m t 3 a m t l ) ；8 ) 单结构域( 3 - d o m a i n 、 d d o m a i n ) 等。 活性测试研究表明，1 ) 1 3 结构域对h g i f 的神经元抑制活性是必须的，其中 h g i f 独有的保守t ( 5 ) c p c p ( 9 ) 序列尤其重要。2 ) 我们还发现，t h r 5 侧链上的 羟基基团同生理活性密切相关，人为地除去羟基将导致突变体生物活性严重丧 失。参考突变体蛋白结构和反应性的结果，我们认为一方面1 1 1 r 5 的羟基可能通 过形成分子内氢键帮助稳定h g i f 的结构，另一方面t h r 5 也是一个潜在地磷酸化 位点。3 ) 再次，虽然保留了t c p c p 序列，但是e 2 3 k 突变体完全失去了神经元 生长抑制功能。以往的研究指出，e 2 3 k 除了金属硫簇的暴露程度提高，其光谱 学性质和反应性均和野生型h g i f 相似。尽管e 2 3 k 丧失生理活性的原因有待进 一步研究，我们的结果说明除了t c p c p 序列，1 3 结构域中的其它残基也可以影 响h g i f 执行其功能。4 ) 我们还发现，在d 结构域中，改变e ( 5 5 ) a a e a e ( 6 0 ) 插 入段的电荷分布，或者增加它形成d 螺旋的倾向，并不太多地影响整个突变体蛋 白的生物活性。然而，e a a e a e 插入段缺失干扰了蛋白的正常活性。对氆结构 域的结构解析表明，e a a e a e 插入段在h g i f 蛋白中是一段非常松散、不受约束 的无规卷曲，它使得q 结构域的动力学性质更加活泼。进一步，结构域也通过 结构域问的相互作用，影响到d 结构域，间接的改变了p 结构域的动力学性质和 ： 其它相关性质，从而干扰了h g i f 蛋白的生理活性。5 ) 最后，在h g i f 中l i n k e r 的部分或完全缺失对活性没有太大的影响，可是，当用s p ( 甲壳纲动物m t 的 l i n k e r ) 取代k k s ( 哺乳动物m t 的l i n k e r ) 作为l i n k e r 时，突变体k k s s p 的 生物活性就基本丧失了。从进化的角度看，这也是自然界为什么选用保守的k k s 作为l i n e r 的一个原因。 有研究指出，在酵母双杂交实验中h g i f 能与r a b 3 a 蛋白相互作用，并且h g i f 和g d p 瓜a b 3 a 的结合具有特异性( k d = 2 6 州) 。r a b 3 a 属于r a s 家族，能够 结合g t p ，并具有g t p 水解酶活性。当r a b 3 a 与g t p 结合时，g t p r a b 3 a 形 成具有活性的蛋白构象，通过和下游蛋白相互作用引发一系列过程，调节神经元 突触囊泡的运输；当r a b 3 a 将结合的g t p 水解成g d p 后，g d p r a b 3 a 结构的 构象发生变化，蛋白失去活性。同时，r a b 3 a 和g d p 或g t p 的这种结合也受到 多种蛋白的调控，包括g e p s ( g u a n i n en u c l e o t i d ee x c h a n g ep r o t e i n s ) 、g a p s ( g t p a s e a c t i v a t i n gp r o t e i n s ) 和g d i s ( g d pd i s s o c i a t i o ni n h i b i t o r s ) 等。目前为 止，对r a b 3 a 和h g i f 之间关系的了解还非常少。为了探索它们之间的相互作用， 我们运用分子克隆构建了g s t - r a b 3 a 融合蛋白表达系统质粒，蛋白在大肠杆菌 中表达，纯化后蛋白分子量经m s 验证正确无误。随后，我们对h g i f 和r a b 3 a 的相互作用进行了初步的研究。 g i f ( 即m t 3 ) 和金属硫蛋白1 和i v ( m t l ，m t 4 ) 都属于金属硫蛋白家族， 它们的一级序列具有很高的同源性，可是，只有g i f 表现出神经生长抑制活性。 g i f 的这种生理活性是否同它金属硫簇的结构、性质有关呢? 为此，我们考察了 h g i f 金属硫簇的结构、性质，并同人类m t l g ( h m t l g ) 、小鼠m t 4 ( m m t 4 ) 进行了比较。结果表明，h m t l g 和m m t 4 的金属硫簇具有相似的结构和稳定性， 而相比之下，h g i f 金属硫簇结构有所差异，且稳定性降低；其次，h g i f 和h m t l g 、 m m t 4 之间金属硫簇结构和稳定性的差异，导致其和巯基试剂的反应性也受到影 响；最后，不同蛋白传递金属离子至e d t a 的能力依次为h g i f h m t l g m m t 4 。 总体来看，h g i f 在溶液中结构比h m t l g 和m m t 4 更加松散。我们认为，h g i f 的这种性质是几个因素共同作用的结果：h g i f 相对较多的负电荷，e a a e a e 插 入段，c p c p 保守序列，以及结构域之间的相互作用等，都可能对h g i f 的金属 硫簇结构和性质产生影响，并进一步影响其功能。 总之，通过构建突变体蛋白、神经元培养和活性考察、结构性质研究等一系 列手段，我们研究了可能影响h g i f 神经元生长抑制活性的各结构基元和特定的 氨基酸残基，认为h g i f 的生理活性受到多种因素调控，包括t r h 5 羟基基团、 c p c p 保守序列、结构域间的相互作用、l i n k e r 影响、金属硫簇的结构性质等等。 关键字：人类神经生长抑制因子；金属硫蛋白；神经元生长抑制活性i 结构；生 化性质 中图分类号：0 6 1 4 a b s t r a c t h u m a nn e u r o n a l g r o w t hi n h i b i t o r y f a c t o r ( h g i f ) ，a l s o n a m e da s m e t a l l o t h i o n e i n 一3 ( m t 3 ) ，i sam e m b e ro fm e t a l l o t h i o n e i n ( m t ) f a m i l y t h i sp r o t e i n c o n s i s t so f 6 8a m i n oa c i dr e s i d u e s ，i n c l u d i n g2 0c o n s e r v e dc y s t e i n er e s i d u e ss i m i l a r t ot h eo t h e rm e m b e r so fm t f a m i l y m o r e o v e r , h u m a ng i fc a nb i n d7d i v a l e n tm e t a l i o n ss u c ha sz n 2 + a n dc d ”，a n df o r m st w or e l a t i v e l yi n d e p e n d e n td o m a i n s ，e a c h w r a p p i n ga r o u n dam e t a l t h i o l a t ec l u s t e r t h e r e i sa3 - a m i n o a c i dl i n k e rb e t w e e n t h e s et w od o m a i n s ，a n dt h ew h o l em o l e c u l ep r e s e n t sad u m b b e l l l i k es h a p e h u m a n g i fi sm a i n l y e x p r e s s e di n t h ec e n t r a ln e r v e ss y s t e m i nt h eb r a i nc o r t e 墨t h e d i s t r i b u t i o no fz i n c r i c hn e u r o n si si na c c o r d a n c ew i t ht h a to fh u m a ng i fp r o t e i n ， s u g g e s t i n gt h a th u m a ng i fm a yp a r t i c i p a t ei nt r a n s p o r ta n dh o m e o s t a s i so fc e l l u l a r z i n ci o n s a l z h e i m e r sd i s e a s e ( a d ) i san e u r o nd e g e n e r a t i v ed i s e a s e i tw a sr e p o r t e d t h a tt h el e v e lo fh u m a ng i fi nt h eb r a i ne x t r a c to fp a t i e n t sw i t ha di ss i g n i f i c a n t l y l o w e rt h a nt h a to f h e a l t h yp e o p l e ，w h i c hc a ns t i m u l a t eo v e r g r o w t ho f n e u r o nc e l l sa n d f i n a l l yl e a dt on e u r o nd e a t hb e c a u s eo fe x h a u s t i o no fn e u r o t r o p h i cf a c t o r m o r e o v e r , a n i m a lm o d e l ss h o wt h a tt h ee x p r e s s i o nl e v e lo fg i fo b v i o u s l ya l t e r sa f t e rb r a i n i n j u r y , i n d i c a t i n gt h a th u m a ng i fm a yt a k ep a r ti nt h ep r o c e s so fn e u r o ng r o w t ha n d r e g e n e r a t i o n a l t h o u g ht h em e c h a n i s mo fn e u r o ni n h i b i t o r ya c t i v i t yo fh u m a ng i fi s u n c l e a ra n dt h et a r g e to fh u m a ng i fi su n c e r t a i n ，m o r ea n dm o r ee v i d e n c e si n d i c a t e t h a tt h eb i o a c t i v i t yo f h u m a n g i fi sr e g u l a t e db ys e v e r a lf a c t o r sc o o p e r a t i v e l y t h i sl a bh a ss t u d i e dt h es t r u c t u r a l f u n c t i o n a lr e l a t i o n s h i po fm t sf o rm a n yy e a r s ： a nm te x p r e s s i o ns y s t e mi nec o l iw i t hh i g hy i e l dh a sb e e ne s t a b l i s h e d ，a n dt h e p u r i f i c a t i o np r o c e s sh a sb e e no p t i m i z e d ；as e r i e so fh u m a ng i fm u t a n t sw a s g e n e r a t e db ym o l e c u l a rb i o l o g ym e t h o d ，a n dt h e i rs t r u c t u r e ，s t a b i l i t ya n dr e a c t i v i t y w e r ei n v e s t i g a t e di nd e t a i l t of u r t h e rc l a r i f yt h ec o n n e c t i o n sb e t w e e np r o t e i n s t r u c t u r e ，b i o c h e m i c a lp r o p e r t i e sa n db i o a c t i v i t y , w eh a v ec o n d u c t e das y s t e m a t i c a l s t u d yo nt h ee f f e c t so fm u t a t i o n sa td i f f e r e n ts i t e so fh u m a ng i fo ut h ei n h i b i t o r y a c t i v i t yt o w a r dn e u r o n s t h e s em u t a n t si n c l u d e ：1 ) t h r 5 i n s e r tm u t a n t si nt h e 1 3 - d o m a i n ，i e a t 5 ，t 5 s ，t 5 a ；2 ) m u t a n tf o c u s e so nt h ec o n s e r v e dc p c pm o t i fi nt h e b d o m a i n ，i e p 7 s p 9 a ；3 ) g l u 4m u t a n t si nt h ei - d o m a i n ，i n c l u d i n ge 4w a e 4a n d p 3 s e 4 r ；4 ) m u t a n tf o c u s e so f f t h ea c i d b a s ec a t a l y t i cs i t eo fn i t r o s y l a t i o ni nt h e 1 3 - d o m a i n ，i e e 2 3 k ；5 ) t h eh e x a p e p t i d ei n s e r tm u t a n t si nt h ea - d o m a i no fh g l f , i n c l u d i n ga 5 5 - 6 0 ，e 5 8 k ，e 5 5 5 8 6 0 qa n dg 5 3 5 4 ae t c ；6 ) t h el i n k e rm u t a n t s ， i n c l u d i n ga 3 1 - 3 4 ，a 3 2 3 3a n dk k p - s p ；7 ) d o m a i nh y b r i d i z e dm u t a n t s ，i e a 3 4 3 6 ， 1 3 g t f 一1 3 g i f , a n db g i f a - m t l ；8 ) s i n g l ed o m a i n ，i e 1 3 - d o m a i na n da - d o m a i no f h u m a ng if r e s u l t so f t h en e u r o nc u l t u r ea s s a yp r o v e dt h a t1 ) t h e1 3 - d o m a i ni si n d i s p e n s a b l e f o rt h en e u r o n a li n h i b i t o r ya c t i v i t yo fh u m a ng i f , a n dt h ec o n s e r v e dc p c pm o t i fi n t h e3 - d o m a i ni sp a r t i c u l a r l yi m p o r t a n t 2 ) w ea l s of o u n do u tt h a tt h eh y d r o x y lg r o u p i nt h r 5i sc r i t i c a lf o rt h eb i o a c t i v i t y d e l e t i n gt h eh y d r o x y lg r o u pl e a d st oa l m o s t c o m p l e t e l yl o s so f b i o a c t i v i t yo f t h et 5 a m u t a n t b a s e do nt h es t r u c t u r ea n dr e a c t i v i t y i n f o r m a t i o n ，w ec o n c l u d et h a tt h eh y d r o x y lg r o u pi nt h r 5m a ys t a b i l i z et h es o l u t i o n s t r u c t u r eo f h u m a ng i fb yf o r m i n gi n t r a - m o l e c u l a rh y d r o g e nb o n d o nt h eo t h e rh a n d ， 1 1 l r 5c a na l s os e r v ea sap o t e n t i a lp h o s p h o r y l a t i o ns i t e 3 、t h em u t a n te 2 3 kl o s e si t s b i o a c t i v i t y , a l t h o u g hi tk e e p st h ec r i t i c a lt c p c pm o t i f i tw a sp o i n t e do u tt h a te x c e p t t h ei n c r e a s i n gs o l v e n ta c c e s s i b i l i t yo ft h em e t a l - t h i o l a t ec l u s t e r s ，t h es p e c t r o s c o p i c p r o p e r t i e sa n dt h er e a c t i v i t yo fe 2 3 ka r es i m i l a rt ot h o s eo fh u m a ng i f i tc a nb e i n f e r r e dt h a tb e s i d e st h et c p c pm o t i f , o t h e rr e s i d u e si nt h e1 3 - d o m a i na l s oc o n t r i b u t e t ot h eb i o a c t i v i t yo fh u m a ng i f 4 ) a sw eo b s e r v e d ，c h a n g i n gc h a r g ed i s t r i b u t i o no r i n c r e a s i n ga h e l i xi n c l i n a t i o no ft h ee a a e a ei n s e r ti nt h ea - d o m a i nh a sl i t t l ee f f e c t o nt h eb i o a c t i v i t yo fh u m a ng i f h o w e v e r , d e l e t i n gt h i sh e x a p e p t i d ew i l li m p a i r s e r i o u s l yt h eb i o a c t i v i t yo fh u m a ng i f s t r u c t u r a la n a l y s i so ft h e 一d o m a i no fh u m a n g i fr e v e a l st h a tt h ee a a e a ei n s e r ti nt h ea - d o m a i nl i e so na ne x t r e m e l yf l e x i b l e l o o pw i t hn oc o n s t r a i n tb yt h em e t a l t h i o l a t ec l u s t e ll e a d i n gt oe n h a n c e m e n to f d y n a m i c si nt h e 一d o m a i no fh u m a ng i f t h ei n c r e a s e dd y n a m i c so ft h e 一d o m a i n w i l l a f f e c tt h ep r o p e r t i e so ft h e3 - d o m a i nt h r o u g hi n t e r - d o m a i ni n t e r a c t i o n ，a n d t h e r e f o r et h eb i o a c t i v i t yo fh u m a ng i f1 3 - d o m a i ni sr e g u l a t e db yt h ea - d o m a i n 5 ) f i n a l l y , i ti so b s e r v e dt h a tt h ea b s e n c eo fl i n k e rb e t w e e nt w od o m a i n sd o e sn o t s i g n i f i c a n t l ya l t e rt h eb i o a c t i v i t yo fm u t a n t s ( i nt h ea 31 3 4a n da 3 2 3 3m u t a n t so f h g i f ) h o w e v e r , r e p l a c e m e n to fk k s ( m a m m a l i a nm tl i n k e r ) w i t hs p ( c r u s t a c e a n m tl i n k e r ) c a u s e st o t a ll o s so f t h eb i o a c t i v i t y t h em e c h a n i s mf o rt h i sp h e n o m e n o ni s n o ts u r e ，b u tf r o mt h ep o i n to f v i e wo fe v o l u t i o n ，t h i sm a yp r o v i d ear e a s o nf o rw h y m a m m a l i a nm 1 bc h o o s ek k sa st h el i n k e r i tw a sr e p o r t e dt h a th u m a ng i fc a ni n t e r a c tw i t hr a b 3 ai nt h et w o h y b r i d - y e a s t s c r e e n m o r e o v e r , h u m a ng i fb i n d st og d p r a b 3 as p e c i f i c a l l y ( k d = 2 6r t m ) r a b 3 ab e l o n g st or a sf a m i l y i tc a l lb i n dg t pa n dh a sg t ph y d r o l y z i n ga c t i v i t y w h e nr a b 3 af o r m sg t p r a b 3 a i tc a ni n t e r a c tw i t hd o w n w a r dt a r g e t st or e g u l a t e t r a f f i c k i n go fs y n a p t i cv e s i c l e a t t e rg t p i sh y d r o l y z e dt og d p , t h eg d p r a b 3 ai s i n a c t i v e t h eg d p g t pe x c h a n g er a t ei nr a b 3 ai sc o n t r o l l e db ys e v e r a lp r o t e i n s ， i n c l u d i n gg u a n i n en u c l e o t i d ee x c h a n g ep r o t e i n s ( g e p s ) ，g t p a s e a c t i v a t i n gp r o t e i n s ( g a p s ) ，a n dg d pd i s s o c i a t i o ni n h i b i t o r s ( g d i s ) t i l ln o wl i t t l ei sk n o w na b o u tt h e i n t e r a c t i o nb e t w e e nr a b 3 aa n dh u m a ng i f t os t u d yt h em e c h a n i s mo ft h e i r i n t e r a c t i o ni nv i t r o ，w ec l o n e dr a b 3 ae d n ai n t og s tf u s i o np r o t e i ne x p r e s s i o n p l a s m i d ，a n d t h eg s t - r a b 3 af u s i o n p r o t e i n w a s e x p r e s s e d i nec o l i a f t e r p u r i f i c a t i o nt h em o l e c u l a rw e i g h to fg s t - r a b 3 ai s v e r i f i e db ym a s ss p e c t r o s c o p y ， a n dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nh u m a ng i fa n dr a b 3 aw a si n v e s t i g a t e d g i f , m t l ，a n dm t 4 a l lb e l o n gt om tf a m i l y t h e ye x h i b i th i g hs e q u e n c ei d e n t i t y , w h i l eo n l yg i fh a st h eu n i q u en e u r o n a lg r o w t hi n h i b i t o r ya c t i v i t y i st h eb i o a c t i v i t y o fh u m a ng i fr e l a t e dt ot h e s t r u c t u r ea n dp r o p e r t i e so fi t sm e t a l t h i o l a t ec l u s t e r s ? t h e r e f o r ew ei n v e s t i g a t e dt h es t r u c t u r ea n dp r o p e r t i e so fm e t a l t h i o l a t ec l u s t e r si n h u m a ng i f , a n dc o m p a r e dw i t ht h o s eo f c l u s t e r si nh u m a nm t ia n dm o u s em t 4 t h e r e s u l t ss h o wt h a th u m a nm t la n dm o u s em t 4h a v es i m i l a rc l u s t e rs t r u c t u r ea n d s t a b i l i t y , w h i l et h ec l u s t e r si nh u m a ng i fh a v ed i f f e r e n ts t r u c t u r ea n dl o w e rs t a b i l i t y t h ea b i l i t yo f h u m a ng i fc l u s t e r st oi n t e r a c tw i t ht h i o lr e g e n t si sa l s oa f f e c t e db yt h e a l t e r a t i o no fc l u s t e rs t r u c t u r ea n ds t a b i l i t y f u r t h e r m o r e ，t h em e t a lt r a n s f e ra b i l i t yo f t h et h r e ep r o t e i n sf o l l o w sh u m a ng i f h u m a nm t i m o u s em t 4 t h e s er e s u l t s i n d i c a t et h a tt h es o l u t i o ns t r u c t u r eo fh u m a ng i fi sm u c hl o o s e rt h a nt h o s eo ft h e o t h e rt w om t s s e v e r a lc o o p e r a t i v ef a c t o r sm a yb ea t t r i b u t e dt ot h ee f f e c t ：t h eo v e r a l l m o r en e g a t i v ec h a r g eo fh u m a ng i f , t h ee a a e a ei n s e r t ，t h ec p c pm o t i f , a n dt h e i n t e r - d o m a i ni n t e r a c t i o ne ta 1 i ns u m m a r y , w eh a v es t u d i e dt h e s t r u c t u r e - r e a c t i v i t y f u n c t i o nr e l a t i o n s h i po f h u m a ng i fu s i n gc h e m i c a la n db i o l o g i c a l t o o l s ，i n c l u d i n gp r o t e i ne n g i n e e r i n g ， s p e c t r o s c o p i cc h a r a c t e r i z a t i o n ，a n dp r i m a r yn e u r o nc u l t u r ea s s a ya n ds oo n t h e n e u r o n a lg r o w t hi n h i b i t o r ya c t i v i t yo fh u m a ng i fi sr e g u l a t e db ym u l t i p l ef a c t o r s c o o p e r a t i v e l y ，i n c l u d i n gt h eh y d r o x y lg r o u pi nt h r 5 t h ec o n s e r v a t i v ec p c pm o t i f , t h e i n t e r - d o m a i ni n t e r a c t i o n t h el i n k e r a n dt h em e t a l t h i o l a t ec l u s t e r se t c k e yw o r d s ：h u m a nn e u r o n a lg r o w t hi n h i b i t o r yf a c t o r ( h g i f ) ；m e t a l l o t h i o n e i n ( m d ； n e u r o ng r o w t hi n h i b i t o r ya c t i v i t y ；s t r u c t u r e ；b i o c h e m i c a lp r o p e r t i e s n a t i o n a ll i b r a r yc l a s s i f i c a t i o nn o ：0 6 1 4 第一章序论：人类神经生长抑制因子简介 第一章序论：人类神经生长抑制因子简介 金属硫蛋白( m e t a l l o t h i o n e i n s ，m t ) 属于金属结合蛋白，几乎在所有生物中 都能发现它的身影。根据定义，金属硫蛋白是一类低分子量( 7 0 0 0d a ) ，富含 保守半胱氨酸( 1 8 2 3 个) ，无芳香性氨基酸和组氨酸，以及高金属含量( z n 、 c u 、c d ) 的蛋白质。因为它与众不同的结构和性质，这些生物分子吸引了众多 生物学家和化学家的目光。 金属硫蛋白的生理功能至今仍然是一个谜，但是随着研究的深入，人们认为 在生物体不同部位、不同组织器官中金属硫蛋白具有不同的功能。这并不令人意 外，因为金属硫蛋白独特的结构性质同时赋予它金属结合能力和氧化还原能力， 而绝大多数生化过程都涉及这两者。对比较低等的生命形式而言，金属硫蛋白的 重要角色是螯合有毒的重金属离子( 比如c d ”或h g ”) ，或者捕获必须的金属 元素( 比如z n 、c u ) 。例如，蚯蚓的w m t - 2 能够专一结合c d ”，软体动物和蓝 蟹的m t 可以储存血蓝蛋白被降解后余下的c u ”。【1 ，2 】对哺乳动物金属硫蛋白 的研究揭示了其多种重要功能。当面对外界压力时，比如有毒金属、炎症、感染、 锌缺乏等情况，金属硫蛋白是维持生命所必须的。近年来，神经生长抑制因子 ( n e u r o n a lg r o w t hi n h i b i t o r yf a c t o r , g i f ) 的发现掀起了金属硫蛋白研究的又一个 高潮。g i f 也是金属硫蛋白家族成员之一，尽管其基本生理功能还有待确定，它 却是唯一能够抑制神经元过度生长的金属硫蛋白。因此，在详细介绍g i f 的研 究进展前，有必要先全面了解一下金属硫蛋白家族。 第一节神经生长因子与金属硫蛋白家族 1 1 1 金属硫蛋白的定义和分类 m a r g o s h e s 和v a l l e e 于19 5 7 年在分离马肾中镉结合蛋白时首次发现了金属硫 蛋白。【3 】它的主要特征包括：1 ) 低分子量( 6 0 0 0 7 0 0 0 d a ) ；2 ) 高金属含量； 3 ) 具有特定的氨基酸组成( 高半胱氨酸含量，无芳香性氨基酸和组氨酸) ；4 ) 第一章序论：人类神经生长抑制因子简介 具有特定的氨基酸序列( 如c x c 或c x x c 这样的半胱氨酸特征序列) ；5 ) 具有 典型的金属硫簇结构；6 ) 在光谱中具有金属硫键的特征吸收。【4 ，5 根据序列相似性和系统发育关系，金属硫蛋白被分为1 5 大类：脊椎动物m t s ( v e r t e b r a t em t s ) 、软体动物m t s ( m o l l u s km t s ) 、甲壳纲动物m t s ( c r u s t a c e a n m t s ) 、棘皮动物m t s ( e c h i n o d e r m a t am t s ) 、双翅目动物m t s ( d i p t e r am t s ) 、 线虫类m t s ( n e m a t o d em t s ) 、纤毛纲m t s ( c i l i a t em t s ) 、真菌im t s ( f u n g m m t s ) 、真菌i im t s ( f u n g i - i im t s ) 、真菌i i im t s ( f u n g i - i i im t s ) 、真菌i vm t s ( f u n g i i vm t s ) 、真菌vm t s ( f u n g i vm t s ) 、真菌v im t s ( f u n g i v im t s ) 、 原核生物m t s ( p r o k a r y o t am t s ) 以及植物m t s ( p l a n t am t s ) 。【6 1 譬湛黧一蕤 ”? x 奄* 爨：瓣 鬃鑫雾嚣熏 霎i 嚣褪二瓣茹三蘧i 嚣黧= 三蘧溪暴茹i ：i i ：蠹盖塞懑兰 哺乳动物动物金属硫蛋白有四个亚型，从m t l 到m t 4 。 8 】在大鼠的第8 号染色体上有一段长5 0k b 的区域，负责编码m t l 到m t 4 蛋白。 9 】在人类1 6 号染色体上，1 7 个m t 基因中有l o 个被表达，其中7 个属于m t l ，其余分别是 m t 2 a 、m t 3 与m t 4 ( f i g u r e1 1 ) 。 1 0 1 3 】各亚型在不同的组织器官中有不同的 表达水平以及降解速度。虽然绝大多数m t 具有相似的生化性质，它们的生物学 功能不尽相同。在人体内表达最广泛的是m t l 和m t 2 a ，在同一组织中，m t 2 a 2