（动物学专业论文）人e2f3基因的克隆与表达研究.pdf

西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻 读学位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被 查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学 位论文。同时，本人保证，毕业后结合学位论文研究课题再撰写的文 章一律注明作者单位为西北大学。 霎裹蓑妻蓑：薹霎? 整指导教师签名：绁 学位论文作者签名： 砼叠! 二指导教师签名：! 薤垦筮 3 e 以辱毛窍, - e t 勘蜓年0rl ￥黾 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 学位论文作者签名： 袜新、 妒够年f 月“日 人e 2 f 3 基因的克隆与表达研究 摘要 目的：e 2 f 转录因子是细胞周期中g 1 期进入s 期的重要调控因子。同时， e 2 f 因子与肿瘤的发生和细胞凋亡有着紧密的关系。为了研究人e 2 f 3 ( e 2 f 家 族成员) 转录因子的结构和功能，了解其与肿瘤发生的联系，从人组织中克隆 e 2 f 3 基因，构建其原核表达载体和真核表达载体，实现其原核表达和真核表达， 从而为进一步的研究奠定基础。 方法：通过t d z o l 法抽提人肝癌细胞的总r n a ，然后逆转录制备e d n a 。 以e d n a 为模板通过巢式p c r 和桥联p c r 的方法克隆e 2 f 3 基因，构建了四种 e 2 f 3 基因的原核表达载体p e t 2 8 a - e 2 f 3 、p e t 3 2 a e 2 f 3 、p q e 3 0 - e 2 f 3 和 p g e x 4 t - e 2 f 3 和一种真核表达载体p e g f p - n 1 e 2 f 3 。原核表达载体转化b l 2 1 工程菌进行诱导，用w e s t e r nb l o t 检测重组蛋白。真核表达载体转染t 2 4 细胞观 察克隆的e 2 f 3 基因在真核细胞中有无表达活性。 结果：成功克隆出e 2 f 3 全长基因，通过更换不同的表达载体实现了对e 2 f 3 基因的原核表达并且对表达的重组蛋白用w e s t e r n 方法进行了检测。另外还构建 了e 2 f 3 基因的真核表达载体，通过转染t 2 4 细胞表明构建的e 2 f 3 真核表达载 体具有表达活性，这为以后的细胞学实验做好了前期的准各。 结论：e 2 f 3 基因近5 端一段富含g c 的序列会严重影响e 2 f 3 基因的p c r 扩增，我们推测这段序列可能是e 2 f 3 基因的一个内部调控区，它可能会通过形 成二级发夹结构来调控e 2 f 3 基因的表达。另外发现e 2 f 3 基因在不同的原核表 达载体中存在表达差异，融合有g s t 的e 2 f 3 基因较易实现原核表达，这可能是 因为表达载体功能元件的差异和e 2 f 3 基因本身的一些特点所致。 关键词：e 2 f 3 ；t r i z o l ；p c r ；克隆；表达； w e s t e r nb l o t t h eg e n e c l o n i n ga n de x p r e s s i o no fh u m a n e 2 f 3 a u t h o r ：l i nl i a n g d i r e c t e db y ：m e n gs h i j i e a b s t r a c t o b j e c t i v e ：e 2 ff a m i l yo ft r a n s c r i p t i o nf a c t o r sa r ek e yr e g u l a t o r sf r o ms t a g eo f g 1t osi nt h ec e l lc y c l e m e a n w h i l e e 2 ff a c t o r sh a v et i g h t l yr e l a t i o n s h i pw i t ht h e o c c u r r e n c eo ft u m o ra n da p o p t o s i s i no r d e rt os t u d yt h e i rs t r u c t u r e s ，f u n c t i o n sa n d t h e i rr e l a t i o n s h i pw i t ht h eo c c u r r a n c co ft u m o r , w eh a sc l o n e de 2 f 3g e n ef r o mh u m a n t i s s u e ，c o n s t r u c t i n gp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e q 、t o ra n de u k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r a n dr e a l i z e di t sp m k a r y o t i ce x p r e s s i o na n de u k a r y o t i ce x p r e s s i o n ，s ow eh a v em a d e f i r mb a s i sf o rf u r t h e rr e s e a r c h m e t h o d s ：w ee x t r a c t e dt o t a lr l g ao ft u m o rc e l lf r o mh u m a nl i v e rb yt r i z o l m e t h o d ，t h e nr e v e r s et r a n s c r i b e dr n at oe d n a e 2 f 3g e n ew a sc l o n e db y n e s t e d - p c ra n do v e r l a p - p c ru s i n ge d n a 雒t e m p l a t e t h e nw ec o n s t r u c t e d4 p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r so fe 2 f 3g e n e ，w h i c ha r ep e t 2 8 a - e 2 f 3 ，p e t 3 2 a - e 2 f 3 p q e 3 0 - e 2 f 3 ，a n dp g e x 4 t - e 2 f 3 a n da e u k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r , p e g f p - n 1 - e 2 f 3 b l 2 1e n g i n e e r i n g b a c t e r i ai st r a n s f o r m e d b yp r o k a r y o t i c e x p r e s s i o nv e c t o ra n di n d u c e dt oe x p r e s st h er e c o m b i n a n te 2 f 3p r o t e i nm o r e o v e r , w e d e t e c t e dt h er e c o m b i n a n tp r o t e i nb yw e s t e r nb l o t t i n g w et r a n s f e c t e d i 2 4c e l lb y e u k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r , o b s e r v i n gw h e t h e ro rn o te 2 f 3g e n eh a sb e e ne x p r e s s e d i ne u k a r y o t i cc e l l r e s u l t s ：t h ef u l l - l e n g t ho fe 2 f 3g e n eh a sb e e ns u c c e s s f u l l yc l o n e d w eh a v e r e a l i z e dp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o no fe 2 f 3g e n eb yc h a n g i n ge x p r e s s i o nv e c t o r sa n d t e s t e dr e c o m b i n a n tp r o t e i ne x p r e s s e db yw e s t e r nb l o t t i n g i na d d i t i o n ，w ec o n s t r u c t e d e u k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o ro fe 2 f 3g e n e t r a n s f e c t i o no ft 2 4c e l ls h o w st h a te 2 f 3 g e n eh a se x p r e s s e di ne u k a r y o t i cc e l l t h i sr e s u l ts e t su paf o u n d a t i o nf o rf u r t h e r e x p e r i m e n t so fc y t o l o g y c o n c l u s i o n ：t h ep a r to fe 2 f 3g e n e ，w h i c hi sn e a r5 e n d ，i sg c - r i c h t h i sp a r t g r e a t l ya f f e c t sp c ra m p l i f i c a t i o no fe 2 f 3g e n e i ti ss u p p o s e dt h a tt h i ss e q u e n c ei sa n i n t e r n a l l ya d j u s t a b l e a r e ao fe 2 f 3 g e n e i tm a y b ef o r m sh a i r p i ns t r u c t u r e s t h a t r e g u l a t ee x p r e s s i o no fe 2 f 3g e n e i na d d i t i o n ，w eh a v ed i s c o v e r e dt h a tt h ee x p r e s s i o n o fe 2 f 3g e n ei sd i f f e r e n ti nd i f f e r e n tp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o ra n dt h ef u s i o no f g s ta n de 2 f 3g e n ei sm u c he a s i e rt or e a l i z ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n t h i sm a yb e 2 c a u s e db yd i f f e r e n c ei nf u n c t i o n a le l e m e n to fe x p r e s s i o nv e c t o ra n df e a t u r e so fe 2 f 3 g e n ei t s e l f k e yw o r d s ：e 2 f 3 ；t r i z o l ；p c r ；c l o n e ；e x p r e s s i o n ；w e s t e r nb l o t 3 第一部分前言 1 1 e 2 f 家族简介 目前研究表明多种细胞因子参与细胞周期调控，其中e 2 f ( e 2f a c t 0 0 转录因 子家族已被证明是重要的调控环节之- - ( s h e r rc j ，1 9 9 6 ) 。它们通过调节控制细 胞d n a 合成及与细胞增殖有关的基因表达而起作用，同对其本身的活性又受另 一些在细胞周期进程中有重要作用的蛋白所调控( h e i k om u l l e r ，2 0 0 0 ) 。因此调节 e 2 f 转录因子的蛋白，e 2 f 转录因子及它们调节的靶基因就形成了一条对细胞增 殖有调节作用的途径。 e 2 f 转录因子最初作为腺病毒e 2 启动子的活化剂被发现( r o v e s d iie ta l ， 1 9 8 6 ) ，目前已发现7 个不同的e 2 f 家族成员，从e 2 f 1 到e 2 f 7 。另外e 2 f 家族 还包括了d p ( d r t f l - p o l y p c p t i d e ) 家族蛋白( g i r l i n gr ，1 9 9 3 ) ，目前已经分离到了 两个d p 基因，即d p i 和d p 2 。研究证明，d p 家族蛋白自己本身并没有生物学 意义活性，但是它们对e 2 f 的活性是必不可少的，e 2 f 蛋白通过与d p 基因家族 编码的蛋白形成异源二聚体，来调节靶基因的转录，d p 和e 2 f 的结合大大提高 了e 2 f 和d n a 的结合能力和其转录活性，所有这些e 2 f 成员都具有几个高度同 源区，包括d n a 结合区、d p 二聚体形成区和p r b ( r e t i n o b l a s t m a ，r b ) 家族蛋白 结合区。d p 蛋白除d n a 结合区和二聚体形成区外与e 2 f 是没有同源性的( z h a n g ye ta l ，1 9 9 5 ) 。e 2 f 本身在与激活蛋白结合时也显示出高度特异性。其中e 2 f 1 、 e 2 f 2 和e 2 f 3 只与p r b 结合，而e 2 f 4 和e 2 f 5 却与p r b 相关蛋白p 1 0 7 或p 1 3 0 结合( h i j m a n se m e ta l 。1 9 9 5 ) 。目前高等生物为何有多种e 2 f 转录因子存在还不 清楚。推测可能的原因是，虽然它们具有e 2 f 的共同序列，但它们在与靶基因 d n a 结合的特异性上却有细微差别。因此它们可以调控不同的靶基 天| ( d e g r e g o r i j ， 2 0 0 2 ) 。 1 2e 2 f 调节的靶基因 作为转录因子，e 2 f 蛋白通过结合到靶基因的启动子中特殊的d n a 序列上 来调节基因表达。e 2 f 因子的靶基因大致可以分为两类：第一类编码着d n a 合 成起始、延长阶段的“开关因子”，如二氢叶酸还原酶、核糖核苷酸还原酶、d n a 聚合酶a 等；另一类则编码着细胞周期的调控因子，如c y d i ne 、c y c l i na 、 c d k 2 ( c y c l i n - d e p e n d e n tk i n a s e2 ) 等( h u r f o r dr k j rc ta l ，1 9 9 7 ) 。还有研究表明e 2 f 4 因子还参与了调控一些d n a 修复和重组修复所需因子的表达，如m s h 2 ( m u t s h o m o l o g2 ) ，m l h l ( m u t lh o m o l o g1 ) 等( r e nb e ta l ，2 0 0 2 ) 。s l a n s k yje 等( 1 9 9 6 ) 。 研究表明e 2 f 与靶基因启动子的5 - t t t s s c g c 3 ( s = c 或g ) 序列结合，并且许 多细胞基因在它们的启动子中都含有这个序列。e 2 f d p 异源二聚体和靶蛋白的 结合作用、磷酸化作用、细胞内定位和靶基因的表达水平等都受e 2 印p 异源二 聚体的活性调节，并且同时都受到d p 蛋白的活性影响( h i t c h e n sm r e ta l ，2 0 0 3 ) 。 e 2 f 转录因子不仅调节靶基因的表达水平，而且能以细胞周期依赖方式确保 靶基因最大程度地被转录。因此e 2 f 的异常不仅能改变靶基因的表达水平，而 且能通过细胞周期依赖表达方式的改变而使靶基因表达的方式改变，并可能对肿 瘤发生起一定作用。 1 3e 2 f 转录因子对靶基因的调节 通过靶基因启动子的e 2 f 结合位点突变实验证明，e 2 f 因子既能作为靶基因 的活化剂，又能作为靶基因的抑制剂。例如，在癌基因e - m y e ( m y e l o e y t o m a t o s i s ) 启动子中e 2 f 结合位点缺失导致基因转录抑制，表明e 2 f 蛋自是c - m y e 基因的 转录活化剂( m o b e r gk h e t a l ，1 9 9 2 ) 。而在b m y b ( m y e l o b l a s t o s i s ) 启动子中e 2 f 结合位点的突变却引起这个基因转录的增加，表明e 2 f 蛋白作为b m y b 基因抑 制剂起作用( t a me w e ta l ，1 9 9 3 ) 。这说明一些靶基因可被e 2 f 活化，而另一些 靶基因却被e 2 f 所抑制。目前认为e 2 f 活化或抑制靶基因转录是按照两种不同 的方式来进行的。 ( 1 ) 靶基因转录被e 2 f 转录因子活化的方式( 图1 1 ) ：在细胞周期g 1 的早到中 期和g o 期细胞中，e 2 f 蛋白与成视网膜母细胞瘤抑制基因家族蛋白( p r b ，p 1 0 7 和p 1 3 结合。e 2 f 蛋白与这些蛋白的结合抑制了靶基因的活化。要活化靶基因， e 2 f 必须要从与p r b 等的结合中释放出来。当细胞接近细胞周期的g 1 末期时， p r b 家族蛋白被细胞周期蛋i ! t ( c y e l i n s ) 与周期蛋白依赖激酶( c d k s ) 构成的复合物 磷酸化。从而引起与其结合的e 2 f 释放，游离的e 2 f 通过结合到靶基因启动子 上来刺激靶基因转录。在细胞周期的s 中期e 2 f 活化靶基因后，e 2 肋p 复合物 发生磷酸化，使e 2 f 活性被抑制。另外，当细胞通过m 期并进入到下一个细胞 周期时，p r b 去磷酸化，并再次结合到e 2 f 上( k r e k we ta l ，1 9 9 4 ) 。 ( 2 ) 靶基因转录被e 2 f 转录因子抑制的方式( 图1 1 ) ：当e 2 f 靶基因启动子的 e 2 f 结合位点下游存在被称作“细胞周期基因同源区( c e l lc y c l eg e n e sh o m o l o g y r e g i o n ，c u r ) 的d n a 序列时，该靶基因转录可被e 2 f 转录因子抑制。在细胞周 期的m 末期到g 1 中期e 2 f p r b 复合物与靶基因的启动子是结合的，并抑制其 转录。此时e 2 f 作为纽带将p r b 连接到靶基因的d n a 上，使p r b 靠近靶基因 启动子的d n a ，从而明显抑制了由其他蛋白因子所引起的转录，同时也抑制了 e 2 f 与其他转录因子的相互作用能力。当细胞周期接近g l 晚期时，p r b 被细胞 周期蛋白c d k s 磷酸化，使e 2 f 释放出来。当e 2 f 缺乏时，靶基因转录便不再 被抑制。( l i un e ta l ，1 9 9 6 ) 研究表明c h r 元件及结合到此序列的一种暂不了解 的蛋白( 在图2 中用c h r b p 表示) 对e 2 f 抑制靶基因转录是必须的，目前已在鼠 b m y b 等多个基因中发现了此序歹u ( z w i c k e r je ta l ，1 9 9 7 ) 。 g l 阜一中期 g l 末期s 期 6 硒 。+ 墓德 伊 区s 宝旺卫口巴昏 _ 砌调 匝孓四衰示e 2 f 在把基因d 毗的结合位点 r w r r r ”衰示c 姗船在雌因上的结台位点 p 表示p r b 蛋白被周期置自c d k 珊酸化 图1 - 1 磁f 激活( 1 ) 和抑制( 2 ) 靶基因的模型 i 豫l 1m o d e l so ft a r g e tg e n eb ea c t i v a c t l v a t e d ( 1 ) a n db er e p r e s s e d ( 2 ) b ye 2 p l a c t o r s 1 4 细胞周期调控因子对e 2 f 转录因子的作用 p r b 家族作为e 2 f 的直接调节者，其活性丧失( 即磷酸化) 可增加游离e 2 f 水 平，从而提高被e 2 f 活化的靶基因的转录，并且也可提高被e 2 f 抑制的靶基因 的转录。r b 基因的直接上游调解者是周期蛋白和c d k s 。例如，周期蛋白d 1 或 c d k 4 增加都将会增加p r b 的磷酸化，结果导致e 2 f 的释放。周期蛋白和c d k s 又受细胞周期依赖激酶抑$ i 齐i j ( c d ki ) 的蛋白所调控。这些蛋白通过直接抑制周 期蛋i 兰l c d k s 活性而起作用，因此导致p r b 蛋白磷酸化的降低。p 1 6 即是一种 c d k i ，它结合并抑制与d 型周期蛋白形成异源二聚体的c d k s ( i i c d k 4 和 6 c d k 6 ) 及其他使p r b 磷酸化的c d k 。另一个重要的c d k i 是p 2 1 ，它能使c d k 2 、 c d k 4 、c d k 6 失活( h a r p e rj we ta l ，1 9 9 5 ) 。c d ki 活性丧失将导致周期蛋白 c d k s 活性增加，提高p r b 磷酸化和使e 2 f 释放。p 5 3 肿瘤抑制蛋白是p 2 1 转录 的活化剂。在恶性肿瘤中p 5 3 经常发生突变，而突变的p 5 3 使p 2 1 基因的转录降 低，从而使周期蛋白c d k s 活性增加，再相继调控e 2 f 转录因子的活性。 1 5e 2 f 转录因子与细胞凋亡 培养成纤维细胞时在缺乏血清的条件下，当e 2 f 1 高度表达时能诱导细胞进 入细胞周期s 期，并随后发生细胞凋亡( k r e kw e ta l ，1 9 9 5 ；s h a hbe ta l ，1 9 9 4 ) 。 w a n g d w 等( 2 0 0 0 ) 也在e 2 f 1 转基因小鼠中观察到了角质形成细胞的凋亡现象。 同样有人在几个不同类型的细胞中企图建立e 2 f 高度表达的稳定细胞系均失败 了，这也表明高水平的e 2 f 对许多细胞的存活是不利的。酱经有人推测a r f 基 因与e 2 f 1 共同作用诱导了细胞的凋亡，但小鼠实验证实e 2 f 1 完全可以在缺乏 a r f 基因的情况下独立诱导表皮细胞发生凋亡( r u s s e l ljl e ta l ，2 0 0 2 ) 。k o w a l i k t f 等( 1 9 9 5 ) r a 阱究认为e 2 f 诱导细胞凋亡的能力是依赖细胞中野生型p 5 3 蛋白的 存在。但是s e t hjf 等( 1 9 9 6 ) r a 舞究报道缺失e 2 f 1 功能的小鼠在出生1 个月内胸 腺和淋巴结明显增大，而这个增大显示是由于缺失正常的细胞凋亡途径所引起 的，这提示e 2 f 1 可能具有类似p 5 3 肿瘤抑制蛋白的功能，在调节细胞凋亡中可 直接发挥作用。( i r w i nm e ta l ，2 0 0 0 ) 认为e 2 f 诱导细胞凋亡可能包括p 5 3 依赖和 p 5 3 非依赖两种方式，后者包括对p 5 3 类似蛋白p 7 3 的转录激活。除了e 2 f 1 可 以诱导细胞凋亡以外，e 2 f 2 和e 2 f 4 也能够促使p 1 6 阻滞的u 3 4 3 星型细胞瘤细 胞发生凋亡( d i r k sp b e ta l ，1 9 9 8 ) 。尽管对于e 2 f 诱导细胞凋亡的机制尚不清楚， 但目前对e 2 f 诱导细胞凋亡存在两种解释，一种解释是e 2 f 可刺激具有诱导细 胞凋亡能力的某些蛋白表达而产生细胞凋亡，另一种解释是在e 2 f 诱导后可引 起细胞不合适宜地进入s 期而产生细胞凋亡f r o gk l e ta l ，1 9 9 8 ) 。鉴于e 2 f 因 子作用机制及其影响范围的广泛性，l j utj 等( 1 9 9 9 ) 尝试通过e 2 f 3 的过度表 达来选择性地引发细胞凋亡，对肿瘤抑制进行了研究。 1 6e 2 f 转录因子与细胞增殖及肿瘤 l e o n eg 等( 1 9 9 9 1 通过小鼠动物实验已经证实。e 2 f 因子是细胞有丝分裂的 正调控因子：细胞过度表达e 2 f 因子或向细胞显微注射e 2 f 因子，能够促使静止 其或生长受阻的细胞通过“限制点”，进a s 期。还有研究表明，证常小鼠表皮角 质形成细胞的倍增时间是3 3 h ，e 2 f 1 牛角质形成细胞的倍增时间需要2 5 0 h ；e 2 f 1 基因失活可以使小鼠皮损处细胞的再生和修复速度减慢( d s o u z asj a e ta l ， 2 0 0 2 ) 。在研究e 2 f 转录因子调节细胞增殖作用的同时，人们也发现e 2 f 转录因子 与肿瘤形成有关。例如：e 2 f 1 的过度表达可以诱发转基因小鼠发生自发性的表皮 鳞状细胞癌和基底细胞癌( p i e r c e a me ta l ，1 9 9 8 ) 。e 2 f 1 高度表达还可引起大鼠 胚胎成纤维细胞转变成肿瘤细胞( x uge ta l ，1 9 9 5 ：l e e sja e ta l ，1 9 9 3 ) 。在这 些实验中，这种转化是依赖e 2 f 结合靶基因d n a 和调节靶基因转录的能力来实现 的。当e 2 f 突变时，他们不再具有这种转化能力，这表明e 2 f 作为一个癌基因起 作用。但是另有研究表明e 2 f 对肿瘤发生又有抑制作用。p i e r c e a m 等( 1 9 9 9 ) 发 现至少有一种e 2 f 因子( e 2 f 1 ) 可在表皮乳头状瘤发生的起始阶段表现处肿瘤抑制 作用。在膀胱癌中，e 2 f 1 的低表达与转移和死亡星正相关，r a b b a n if 等( 1 9 9 9 ) 认为e 2 f 1 在膀胱癌中是一种抑癌基因。y a m a s a k il ( 1 9 9 6 ) 等和r o u n b e h l e rrj 等 ( 2 0 0 2 ) 发现在缺失e 2 f 1 功能的小鼠中，肿瘤的发生率明显增加，说明在正常情况 下推测细胞所处的环境不同或品系的不同e 2 f 即可作为癌基因起作用，又可作为 肿瘤抑制剂起作用，其作用机制有待进一步探讨。 1 7 国内e 2 f 转录因子研究概况 国内对e 2 f 因子研究较少，且主要集中在e 2 f 1 上。司晓辉( 2 0 0 0 ) 研究发现 e 2 f 1 在颌骨骨肉瘤中过表达，推钡e j e 2 f 1 与其发生有关。田燕雏等( 2 0 0 1 ) 发现在人 肺神经内分泌肿瘤q b e 2 f 1 过量表达而p r b 则很少表达。这说明e 2 f 1 过量表达是人 肺神经内分泌肿瘤发生的重要因素。林福地等( 2 0 0 3 ) 等研究发现，e 2 f 1 异常高 表达在肺癌发生发展过程中起重要的作用，可以作为肿瘤浸润程度的标记物。张 怀军等( 2 0 0 4 ) 研究发现e 2 f 1 基因在病理性瘢痕成纤维细胞中表达增高，他们推测 e 2 f 1 对于病理性瘢痕的形成起着主要的作用。吕红兵等( 2 0 0 4 ) 用免疫组化和原位 杂交的方法对正常组织、多形性腺瘤组织( p a ) 和恶性多形性腺瘤组织( m p a ) 进行 研究，发现e 2 f 1 在m p a 中的表达显著高于p a ，二者与正常组之间也有显著性差 异。这就说明e 2 f 1 可作为衡量多形性腺瘤的良恶性程度的有用指标。牛昀等( 2 0 0 4 ) 发现e 2 f 1m r n a 表达阳性率在乳腺轻度乳头状瘤病、重度乳头状瘤病和导管内 癌中分别为1 7 5 、4 5 0 和8 0 o ；e 2 f 1 蛋白表达阳性率分别为2 0 0 、4 7 5 8 丰 1 7 7 5 。随着乳腺乳头状瘤病程度的加重最终发展为癌，e 2 f 1m r n a 和蛋白表 达阳性率呈上升趋势。钟鸣等( 2 0 0 4 ) 研究发现人成釉细胞瘤与e 2 f 1 的高表达密切 相关。夏可以等( 2 0 0 4 ) 研究认为e 2 f 3 的失活表达是胃癌发生的关键。 1 8e 2 f 3 转录因子的研究进展 l e e sj a 等( 1 9 9 3 ) 用人e 2 f 1 的d n a 结合结构域的氨基酸序列设计探针，通 过非严谨性的杂交，从人c d n a 文库n a l m 6 中发现了两个新基因，经分析它 们和e 2 f 1 因子有一定的同源性。他们将这两个基因命名为e 2 f 2 和e 2 f 3 ，并将 e 2 f 2 染色体定位在l p 3 6 ，将e 2 f 3 定位在6 q 2 2 。e 2 f 2 和e 2 f 3 都可以结合野生 型的e 2 f 结合位点。 h ey 等( 2 0 0 0 ) 发现了e 2 f 3 b 转录因子，它和e 2 f 3 因子相比缺失了n 端1 0 1 个氨基酸。序列分析表明，e 2 f 3 基因1 0 2 位的密码子由a c g 突变成了a t g 。 与e 2 f 3 只在g 1 s 交界期表达不同，e 2 f 3 b 在整个细胞周期都有表达，并在g o 期表达量达到峰值。h e 等推测e 2 f 3 b 和e 2 f 3 在细胞周期里执行着截然不同的 功能。 w ul 等( 2 0 0 1 ) 用e 2 f 1 、e 2 f 2 ，e 2 f 3 突变型的小鼠进行杂交实验，发现e 2 f 1 - - e 2 f 2 4 - 的小鼠可以发育成熟，而e 2 f i - - e 2 f 3 斗和e 2 f 2 壬e 2 f 3 4 - 的小鼠在胚胎发育 早期就会死亡，这说明e 2 f 3 在小鼠的发育过程中起着非常重要的作用。 l e o n eg 等( 2 0 0 1 ) 等用去除了e 2 f 基因活性的小鼠初期纤维原细胞进行研究 发现，如果缺少e 2 f 2 或者e 2 f 3 的活性，m y c 促使细胞进入的s 期的能力就会 减弱，e 2 f 1 和e 2 f 4 则不具有这种活性。e 2 f 1 活性的缺失会减弱m y c 诱导细 胞凋亡的能力，e 2 f 2 和e 2 f 3 则没有这种活性。作者认为在m y c 途径中，对不 同e 2 f 因子活性的诱导是调控细胞增值和凋亡的关键。 s a a v e d r ah i 等( 2 0 0 3 ) 发现在小鼠胚胎纤维原细胞m e f s ( m o u s ee m b r y o f i b r o b l a s t s ) q h ，e 2 f 3 活性丧失会导致中心体早熟和异常增生而使有丝分裂紊乱 ( e 2 f 1 、e 2 f 2 、e 2 f 4 、e 2 f 5 均无此活性) ，他们认为e 2 f 3 因子对于细胞周期中 d n a 和中心体的复制非常重要，它保证了遗传物质真实地传递到子代细胞。 2 0 0 3 年，美国生物科技网b i o c o m 报道，缺乏细胞生长和发育所需的e 2 f 3 因子可能会帮助癌细胞增生。细胞如果没有这种蛋白质( e 2 f 3 ) 通常会使基因不稳 定。在许多情况下，这样的不稳定会杀死细胞或使其不再生长。然而有时候，突 变会使细胞兴旺和倍增，而造成肿瘤。对癌症而言，缺失e 2 f 3 是一把双刃剑。 在大多数的病例中，缺乏e 2 f 3 会减缓细胞分裂。但基因的不稳定性会增加细胞 突变的潜力，并使突变的细胞分布于身体中。e 2 f 3 本身并不会造成癌症，但是 它的缺失会使一个正常细胞有机会突变为癌细胞。e 2 f 3 是转录因子蛋白质家族 的一员，该家族对于控制整个细胞周期很重要。这种蛋白质负责在细胞分裂期间， 将基因准确地从父母细胞传送至子细胞。如果传输的过程受到干扰，细胞就会从 原始细胞突变。 f e b e r a 等( 2 0 0 4 ) 人发现e 2 f 3 的基因的多重复制与细胞增殖及膀胱癌的发病 存在一定关联。研究人员在实验室中测试膀胱癌细胞中e 2 f 3 含量时，发现其含 量与膀胱肿瘤的“严重程度”密切相关。危险性较小的膀胱癌细胞中，e 2 f 3 含量 也较少；危险性越大，肿瘤细胞扩散性越强，e 2 f 3 的含量也越高。与此同时 o e g g e d im 等( 2 0 0 4 ) 人也发现了这一现象，并将e 2 f 3 基因列为膀胱癌的一个候 选基因。 2 0 0 4 年，继发现e 2 f 3 基因为膀胱癌的候选基因后，f o s t e rc s 等( 2 0 0 4 ) 发 现该基因在前列腺癌预后判断中的重要作用。他们的研究显示，e 2 f 3 基因在前 列腺癌细胞中的表达越高，癌细胞的侵袭性就越强，患者的预后也就越差。该 研究共纳入了1 4 7 例确诊前列腺癌患者，研究人员对其前列腺组织进行了e 2 f 3 检测，并对这些患者平均随访了6 年。结果显示，9 8 例前列腺癌患者( 6 7 ) 存在 e 2 f 3 超表达，而取自7 名健康男性的前列腺样本则都无e 2 f 3 表达；e 2 f 3 表达 水平越高，患者的预后越差，高e 2 f 3 水平是前列腺癌预后不良的独立危险因素。 综上所述，e 2 f 转录因子在细胞周期调控、肿瘤抑制和发生以及细胞增殖 和凋亡中都发挥着重要作用。它们通过在细胞周期中调节靶基因的转录，来调控 细胞的增殖。随着对e 2 f 转录因子家族研究工作的深入，e 2 f 转录因子的功能已 同细胞凋亡和肿瘤形成联系起来。但是目前e 2 f 诱导细胞凋亡的机制以及e 2 f 在肿瘤形成中的作用尚不十分清楚，这都有待进一步的去研究。目前国内对于 e 2 f 1 以外其他e 2 f 家族成员的研究很少，我们选择另外一个e 2 f 家族成员e 2 f 3 作为研究对象。选择原因如下：1 实验经费和时间的限制，不可能对其余e 2 f 因 子都进行研究。2 国内对于e 2 f 3 因子研究报道很少，使得我们的研究具有一定 的创新性。3 在我们选题时，同时期的癌基因上正好有关于e 2 f 3 研究的最 新成果( f e b e r a e ta l ，2 0 0 4o e g g e r l i me ta 1 2 0 0 4 ；f o s t e r c se ta l ，2 0 0 4 ) ，这说 明对e 2 f 3 的研究有一定的先进性。我们从人组织中克隆e 2 f 3 基因构建其原核 表达载体和真核表达载体并检验其表达活性，旨在为进一步研究e 2 f 3 因子结构 和功能奠定基础。 实验流程图 第二部分材料和方法 提取人肝癌细胞株的总r n a j 逆转录反应制各c d n a 模板 j p c r 扩增e 2 f 3 全长基因 j t a 克隆测序发现e 2 f 3 基因近5 端序列缺失严重，分析基 因序列结构，对e 2 f 3 基因分段进行克隆 j 对缺失区域进行桥联p c r 得到e 2 f 3 前半段基因将e 2 f 3 前半段基因克隆至原核表达载体p e t 2 8 a 和p e t 3 2 a 中。 j 将e 2 f 3 后半部分基因克隆至上一步构建的原核表达载体 中，得到含有全长e 2 f 3 基因的p e t 原核表达载体。 j 转化b l 2 1 工程菌，诱导，e 2 f 3 没有表达 j 构建p o e 3 0 - e 2 f 3 原核表达载体，诱导，e 2 f 3 仍无表达 i 构建p g e x - 4 t - e 2 f 3 原核表达载体，诱导，e 2 f 3 表达，w e s t e r n 检测重组蛋白 i t 构建真核表达载体p e g f p n 1 e 2 f 3 ，转染细胞，荧光检测 2 1 主要试剂和材料 2 1 1 材料 人肝癌细胞株由同济医学院廖雯君硕士惠赠。工程菌d h 5 a 、b l 2 1 、m 1 5 由博亚公司项目部提供。 2 1 2 主要试剂 t r i z o l ，北京鼎国公司； 逆转录酶和限制性内切酶，上海p r o m e g a 公司； r n a s e 抑制荆和p m d l 8 t 载体，大连t a k a r a 公司； 质粒抽提试剂盒和胶纯化试剂盒，杭州维特洁公司； g o l d - t a q 酶，上海罗氏公司； t 4 d n a 连接酶，m b i 公司； t a q 酶、p f u 酶以及各种p c r 试剂为博亚公司产品； w e s t e r n 抗体，华美公司； p c r 引物由上海博亚公司合成； 其余化学试剂均为分析纯。 2 1 3 缓冲液配方 5 x s d s p a g e 电泳缓冲液：1 5 1 9t r i s ，9 4 9 甘氨酸，5 0 m l1 0 s d s ，去粒子 水补至1 0 0 0 m l 蛋白上样缓冲液：5 0 m m o l l t r i s h c l ( p h 6 8 ) ，1 0 0 m m o l l 二硫苏糖醇( d t r ) ， 2 s d s ( 电泳级) ，o 1 溴酚蓝，1 0 甘油 转膜缓冲液：3 9 m m o l l 甘氨酸，4 8 m m o l l t r i s ，o 0 4 s d s ( 电泳级1 ，2 0 甲醇 考马斯亮蓝r 2 5 0 蛋白染色液：9 0 m l 甲醇，9 0 m l 水，1 0 r a l 冰乙酸，0 2 5 9r 2 5 0 蛋白脱色液：2 2 5 m l 甲醇，2 2 5 m l 水，5 0 m l 冰乙酸 2 1 4 主要实验设备 灭菌锅、p c r 仪( m j r e s e a r c hi n cp t c 1 0 0 1 、细菌摇床、低温离心机、离心 机、振荡器、电泳仪、水浴锅、超净工作台、超声破碎仪、紫外成像仪、转膜电 泳仪、脱色摇床、摄影暗室、c 0 2 培养箱、荧光显微镜 2 2 实验方法 厂 广 厂 厂 i 型! ! ! 垫堡垦坠 _ 叫望壁墨r 叫! ! 墨芏望r 叫坠塞堕型壁i 2 2 1 人e 2 f 3 基因的克隆 2 2 1 1 总r n a 的抽提 一步法总r n a 提取试剂t r i z o l 比其他纯化方法可提高产率3 0 1 5 0 ( x i a n gx ye ta l ，2 0 0 1 ) 。这种酚和异硫氰酸胍的均相溶液可直接用于从人类、动 物、植物、细菌等的细胞或组织中提取总r n a 、d n a 或蛋白质( p a u l ad e ta l ， 2 0 0 1 ；v e r h o f s t e d a ce ta l ，1 9 9 6 ) 。纯化的r n a 可用于p c r 、r n a 印迹分析、p o l y ( a + ) 筛选或斑点杂交。 操作步骤： 将人肝癌细胞收集到1 5 m l 离心管中，加入l m l t r i z o l ，室温放置5 r a i n ，裂 解细胞 1 2 0 0 0 r p m m i n m i n ，离心5 m i n ，弃沉淀 按l m l t f i z o l 加入2 0 0 # 1 氯仿的比例加入氯仿，振荡混匀后室温放置t s m i n ( 禁 用漩涡振荡器，以免基因组d n a 断裂1 4 。c 1 2 0 0 0 9 m i n ，离心1 5 r a i n ，小心吸取上层水相至另一离心管中 按l m lt r i z o l 加入0 5 m l 异丙醇的比例加入异丙醇，混匀，室温放置1 0 m i n 4 c1 2 ，0 0 0 9 m i n ，离心1 0 r a i n ，弃上清液，r n a 沉于管底 按l m lt r i z o l 加入l m l7 5 乙醇的比例加入7 5 乙醇，温和振荡离心管，悬 浮沉淀 4 08 , 0 0 0 9 m i n 离心5 m i n ，尽量弃上清液，室温晾干或真空干燥5 - 1 0 m i n 加入5 0 a d e p c 水，6 0 5 m i n 溶解r n a 2 2 1 2 逆转录制各c d n a 逆转录酶可以将m r n a 逆转录成e d n a ，有三种引物可供选择： 1 随机引物：当特定m r n a 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长 序列时，可采用随机引物这一不特异的引物来拷贝全长m r n a 。用此种方法时， 体系中所有r n a 分子全部充当了e d n a 第一链模板，p c r 引物在扩增过程中赋 1 4 予所需要的特异性。 2 p o l y ( t ) ：是一种对m r n a 特异的方法。因绝大多数真核细胞m r n a 具有3 端p o l y ( a + ) 尾，此引物与其配对，仅m r n a 可被转录。由于p o i y ( a + ) r n a 仅占 总r n a 的1 - 4 。故此种引物合成的e d n a 比随机引物得到的e d n a 在数量和 复杂性方面均要小。 3 特异性引物：最特异的引物是用与目标r n a 的序列互补的