（微生物学专业论文）除草放线菌的筛选及其培养条件的研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农、l k 大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同恚对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：孑尔寥移 时间：- 即6 年月2 日 关于论文知识产权和使用授权的说明 本论文的知识产权为沈阳农业大学所有。本人完全了解沈阳农业大学有关保 留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论 文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 同意沈阳农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的内容。 学位论文中的所有内容不经沈阳农业大学授权不得以任何方式擅自对外发 表。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 孙孰 时闽：枷6年月2e 导师签名：已易卜售墨旆车时间：) “影年g 月二垌 沈罔j 农、i k 人学颂十。学位论文 摘要 放线菌作为大多数抗生素和一些活性物质的产生菌，也是丌发天然除草活性物质的 重要来源。因此本研究的主要目的是通过除草剂生测方法筛选出具有除草活性的菌株， 并对除草活性菌株的生长代谢、稳定性、鉴定及培养条件4 个方面进行了奄u 步的研究。 从沈阳农业大学标本园、植物园、试验f h 及铁岭市农科院试验田等地土壤样本中分 离出31 4 株放线菌，通过蛋白核小球藻生长抑制试验和培养皿法杂草生长抑制试验两套 筛子仞筛，筛选出一株具有较强除草活性的菌株w ，该菌株对稗草的萌发抑制率，芽长 抑制率和根长抑制率，分别为1 3 3 7 ，4 1 9 1 和9 7 9 6 。结果表明该菌株别稗草的抑 制作用主要表现为抑制根部生长。 通过植物生长抑制试验和温室瓮栽杂草生长抑制试验，对初筛菌株w 。的除草活性 进行了进一步的验证，首先进行对毒素敏感的植物的生长抑制试验，w 。菌株对4 种生物 学特性不同的单、双子叶植物表现出不同的抑制效果，这说明w 。菌株的生物除草活性 对高等植物具有一定的生理选择性；温室盆栽试验结果表明发酵上清液对水l ：l 稀释 时，对稗草的抑制效栗较显著，萌发抑制率和根长的抑制均达到了5 0 以上，但对根的 抑制率比培养皿法有所下降；l ：3 0 稀释时对稗草抑制效果大幅下降，这说明除草活性 物质对土壤复杂的环境因素比较敏感，而且按目前的发酵液配方和发酵条件对w 。菌株 进行发酵，所得发酵液中的除草活性物质含量很低，难以满足防治用间稗草的要求。 对除草活性菌株w 。的生长代谢研究表明，菌株活性最高时正处在菌体生长的衰亡 期，这说明除草活性物质主要是菌体的次级代谢产物，收获有效活性产物的时间应该在 衰亡期即9 6 h 一1 0 8 h 。 对w i 。菌株的稳定性研究表明：菌株具有很好的传代稳定性，从菌体的培养特征及 发酵液除草活性变化来考察菌株连续培养1 0 代的传代稳定性，各代菌株仍表现与出发 菌株相似的特征特性；菌株发酵液的热稳定性较差，8 0 以上处理3 0 m i n 活性明显下降， 1 1 0 以上处理3 0 m i n 活性完全丧失；菌株发酵液的酸、碱稳定性较好，在酸性条件p h = 3 及碱性条件p h = 1 0 下处理，其除草活性与未经处理的发酵液相比均没有明显变化。 根据w 。菌株的形态特征、培养特征以及生理生化特性对菌株分类地位进行了初步 的鉴定，鉴定结果为： w ，。菌株为链霉菌属的灰色链霉菌的一个变种。 对w ，。菌株发酵培养基配方和发酵条件进行正交试验，结果表明：眠。菌株的最佳发 摘要 醉培养糕配方为：丙三醇5 ( ) 、酵母啻4 o 、( n i i 。) j s ( 1 l1 0 、k ： i p ( ) 0 0 6 ；w 。菌株 的最佳培养条件为5 0 0 m l 三角瓶装液量6 0 m l 、接种量6 、p h 值为7 5 、液体种子种龄 为4 u h 。 关键词：微生物源除草剂：放线菌：分离筛选；除草活陛：鉴定 沈ri 农业人学顶 0 位论文 a b s t r a c t a c t i o n m y e c t e s i st h em o s ti m p o r t a n tm i c r o b e sw h i c hp r o d u c et t l e o v e r w h e l m i n g m a j o r i i yo fk n o 、v 1 1a n t j b i o t i c s 肌dai o to fa c t i v eb i o l o g i c a lc o m p o u n d si n c l u d i n gn a t u r a j h e r h i c i d e s s ot h ep u r p o s eo ft h i s 弧圮yi ss c r e e n i n gs t r a ；璐w k i b i c i d a 【a c t m t yb ym e a l l s o fh e r b i c i d eb i o a s s a y ，a n dr e s e a r c h j n go nt h eg r o 州hm e t a b o l i s m ，t h es t a b i l i l y t h e i d e n t m c a t i o na n dt h ec u l t u r a lc o n d i t i o n so ft h es t m i n sw i t hh e r b i c i d a la c t i v i t y 1 14s t r a j 1 so fa c t i n o m y c e t e sa r ei s 0 1 a t e df 如m 【 l es o i ls a m p l e sc o l l e c t e di nt h e s p e c i m e n - g a r d e n ， t l l e p l a n t - g a r d e n ， t h ee x p e r i m e n tf r m l a n do fs h e n y a l l ga g n c u t u r a l i j n j v e 础y ，a n dt h ee x p e r i m e n tf h r m l a n do ft i e l i n ga 鲥c u t 啪li n s t i t u t i o n o n es t r a i nn a m e d w 1 0w i 【hh i g hh e r b i c i d a la c t i v i t y i s p r i m a r i j ys c r e e n e du s i n gt w ok i n d s o fb i o l o g i c a l s c r e e n i n gm e t h o d s t h em i c r o s c r e e no f c 协，d ，罄，比f 二9 7 陀玎d f 跏玎m o d 0 1a n d p e t r id i s hb j o a s s a y s o fw e e d s t h ei n h i b i t o r yr a t i o so ft h es e e dg e n t l i n a t i o n ，s t e m l e n g t ha n dr o o tl e n g t ho f b a 丌l g m s sa r e ，r e s p e c t i v e l y ，1 3 3 7 ，4 1 9 1 锄d9 7 ，9 6 。t h er e s u l t ss h o wt l a tt 1 e s t r a i n s c r e e n e dh a s 心es i g n m c a n tj n h m i t i o no nt h er o o tg r o ho fb a m 舒a s s ， p e t “d i s hb i o a s s a y so fp l a n t s 趾dg r e e n h o u s eb i o a s s a y so fb 眦l g r a s sa r eu s e dt o e v a l u a 【et i l eh e r b i c i d a la c t i v 时o ft h es t a i nw i o f i e r s t l y a c c o r d i n gt h er e s u l t so fp e l r jd i s h b i o a s s a y so fp l a n t sw h i c ha r es e n 甄t i v et ot o x i n s ，i tc a nb ec o n c l u d e d 也a ts t r a i nw l oh a s d i 丘b r e mi n h i b i t o r ye 虢c t so nt h e s ep l a n t sw i t l ld i f r e r e n tb i 0 1 0 9 i c a lc h a r a c t e r s ，t h i ss h o w st h a t t 1 eh e r b i c i d a la c t i v i t yo fs 打a i nw l oh a sp h y s i o l o 百c a ls e l e c t i v i t y s e c o n d l y ，t 1 1 er e s u l t so f g r e e m l o u s eb i o a s s a y s o fb a n l 乒a s ss h o wm 8 tc o m p a r e d 、v i t hc e n 廿i f u g a lf 色r t r i e n t a t i o n s u p e r n a t a i l t s ( 1 ：3o ) ，t h ec e n 仃i f i l g a lf 咖e n t a t i o ns u p e m a t a n t s ( 1 ：1 ) h a v em o r es i g n i f i c a n t i 出b i t i o no nb a r n g r a s s ，协ei n l l i b i t o 搿r a t i o so ft h es e e dg e h n i n a t i o na n dr o o tl e n 昏ho f b a l g r a s sa r eb o t ha b o v e5 0 ，b u t 恤i f l | l i b i t o r ym t i o sd e s c e n d e dc o m p a r e d 州t hp e 廿id i s h b i o a s s a y so fw e e d s ，i tc a nb ec o n c l u d 。dt h a tt l l eb i o l o g i c a lh e r b i c i d e sa r es e n s i 缸v et ot h e c o m p l e xs o i lf a c t o r s ，a 1 1 d 砒t h ec u r r e mc u l 乱王r a lc o n d i t i o n ，让l ec o n c e n 廿a t i o no ft h ec e n t r i f u g a l f e n l l e n t a t i o ns u p e m a t a l l t si ss ol o wm a ti ti s n tb ea p p l i e di n 廿1 ey i e l db i o l o g i c a lc o n t r 0 1o f b a m g r a s s ， t h er e s u l t so 九h er e s e a r c ho n 群。州hm c l a b o l i s md e m o n s t r a t et h a tt h eh i 曲e s th e r b i c i d a l a c t i v i t yi sa tt h ep e r i o do fd e a t hp l l a s e ，a n dt l l em a i l lh e r b i c i d a ls u b s t a i l c ei st 1 1 ep r o d u c eo f s e c o n d a r ym e t a b o l i s m ，t kb e s tt i m ew h e n t og a i nt h eh e r b i c i d a ls u b s t a n c ei sa tt h ep e d o do f d e a i hp h a s e9 6 h 一10 8 h 1 1 1 es t u d y0 ns t a b i l i t yo ft h es t r a j nw l od e m o n s t r a l e s ：t h es t a b i l i t yo fd i 脏r e n tg e n e m t i o n r 摘要 i ss og o o dt h a tt h ec u l c u r a lc h a r a c t e r sa n di h eh e r b i c i d a la c t j v i t yo fs t m i nw l ow e r en o ta l t e r e d ， a n dt h es l a b i l h yo fm eh e r b i c i d a la c t i v i t yo fs t r a i nw 1 0w e r en e i t h e ra l t e r e db ym o d i f y i n gt 1 1 e a c i d - b a s ec o n d i t i o n s t h eh e r b i c i d a ls u b s t a n c ec a t ln o ts u s t a i nh i 曲t e m p e r a t u r e ，t r e a t e df o r 3 0 m i na b o v e8 0 ，t h eh e r b i c i d a la c t i v i t yd e s c e n d e ds i g n i f i c a m l ma 1 1 dt r e a t e df o r3 0 m i n a b o v e8 0 ，t h eh e r b i c i d a la c t i v i t yd i s 印p e a r sc o m p l e t e l y b vm e a n so fm o d a lc h a m c t e r s ，c u l t u r a lc h a r a c t e r s ，b i o c h e m i c a la n dp h y s i o l o g i c a i c h a r a c t e r s ，s t r a i nw l ow a sp r i m a r i l yi d e n t i f i e da sav a r i e t yo f 所，印f o 慢弦p s 打e 船 t h er e s u l t so fo n h o g o n a le x p e r i m e mo ff b r n l e n t e dc o m p o n e m sa n dc u l t u r a lc o n d i t i o n d e m o n s t r a t e ：t h eo p t i m a lf e 咖e n t e dc o m p o n e m st op r o d u c eh e r b i c i d a l s u b s t a n c ea r e 9 1 y c e r i n 5 o ，y e 4 o ，( n h 4 ) 2 s 0 41 o ，k 2 h p 0 4o 0 6 ；t 1 1 eo p t i m a lc u l t u r a lc o n d i t i o nt o d r o d u c eh e r b i c i d a ls u b 昀m c ea r et l l ev 0 1 啪e6 0 m l 5 0 0 m l ，a m o u n to fi n o c u l a t i o n6 ，p h 7 5 ， i n o c u l u m sa g e 4 0 h k e y w o r d s ：m i c r o b i a ls o u f c eh e r b i c i d e ；a c t j i l o m y c e t e s ；i s o l a t m ga n ds c r e e n i n g ；h e r b i c i d a i a c t i v i t ) r ；i d e n t m t a t i o n 4 沈川农业大学硕= f _ = 学位论文 第一章前言 进入二卜一世纪，除草剂仍将是同杂草作斗争的有效武器，并将发挥更大的作用。 随着环境保护意识的提高，高毒性农药的大量使用对农业生产及生态环境造成的负面影 响已引起世界范刚的广泛关注。为了保护人类生存的环境和农业的。j 持续发展，除草剂 的研制与使用受到环境和生态的制约。生物除草剂与化学除草i i l j 相比，以其资源丰富、 不破坏生态环境、无残毒、对非靶栎生物和哺群，动物安全、经济效益高等优点，正逐步 引起人们的重视。 1 1 生物除草剂的研究进展 1 1 ，1 生物除草剂的概述 生物除草剂是利用自然界种类繁多的动物、植物和微生物在各自生命过程中产生的 各种具有特定生理功能的生物活性物质而开发的除草剂。狭义上讲，指直接利用生物产 生的天然活性物质或生物活体作除草剂；广义上讲，还包括按天然物质的化学结构或类 似衍生结构人工合成的除草剂，包括植物源除草剂、动物源除草剂和微生物源除草剂。 1 杂草的生物防治类型 从杂草生物防治策略上来讲，它包括经典的或传统的微生物防治法与微生物除草 荆防治法两种。 ( 1 ) 经典的微生物防治法 ， 本方法是指依靠选择和引入一种在释放后能自我维持、生存和发展，并能长期控 制杂草数量的生物因子，主要在控制从其他大陆和地理区域引入的杂草时使用，涉及 从杂草操产地引入一种或多种天敌，被认为是一种生态反应( 山田昌雄，1 9 9 2 ) 。杂草 同进行管理、保护的栽培植物不同，病原微生物与其平衡共存，但对于外来杂草也存 在没有带病微生物的情况，这些杂草由于没有天敌会很快蔓延。如美国及澳大利亚就 有从欧洲及亚洲侵入的杂草大面积发生的先例，这些杂革用已有的化学除草荆防治几 乎无效。最好的办法是采用从该杂草的原产地采集只对目标杂草显示强致病力而对有 用植物完全没有致病性的病原微生物种系，然后进行人工接种使之感病死亡的经典的 方法。这种方法不仅有效而且成本低廉，即使导入菌不能完全消灭该杂革，也可以将 其控制在某一程度上( 万方牿，1 9 9 2 ) 。 其控制在某一程度上( 万方牿，1 9 9 2 ) 。 5 第一章前言 ( 2 ) 微生物除草剂防治法 本方法则涉及批量生产奇主专一型生物因子，并将其在寄主杂草泛滥地区按高浓度 接种水平使用。在这种杂草控制方式中起作用的主要生物因子为本地的病茼，且控制是 相对短暂的，生物因子也不能自我维持，被认为是一种技术反应。为了 呆证生物除草剂 的成功应用，用作生物除草剂的病原菌必须是：( i ) 能在人工培养巾产生大量而持久的 接种体；( 2 ) 对目标杂草具有专一性；( 3 ) 具有遗传稳定性；( 4 ) 在多种环境条件下侵染 和杀死杂草的数量达显著水平。 1 1 2 生物除草剂的杀草机理与除草药效 生物除草剂的杀草机理涉及到对防除对象的侵染能力、侵染速度以及对杂草的损害 性等。侵染能力可以扶侵染途径( 如直接穿透表皮或者只经过气孔) 、侵染部位、侵染 后在组织中感染能力等反映。如某些菌可以侵染但不能在组织中感染发病，对杂草的损 害常表现为引起杂草严重病症，如炭疽、枯萎、蒌蔫、叶斑等，这些症状的发生，有些 与病原蔼特异植物毒素有关。 病原菌的侵害一开始和杂草生长处于相互拮抗和斗争状态。杂草的防御机制和生长 会逐渐修复侵染物导致的损害，只有侵害速度高于杂草生长速度，才能控制住杂草。 不同的生物除草粼其杀草机理也不同。如c o r n e x i s t i n 是一种来源于嗜粪担子菌宛 氏拟青霉的植物毒素，对单子叶和双子叶杂草具有良好的除草活性。c o r n e x i s t i n 的作 用机理可能是前体除草剂的作用机理，即它要被代谢为至少一种天门冬酸氨基转移酶 ( 靠) 的同功酶抑制剂，莎草素( c y p e r i n ) 是一种天然产生的二苯醚类化含物，是由 侵染香附子的壳二孢菌、嗜粪真菌和侵染商陆的茎点霉产生的，它是一种中等活性的生 长抑制剂和膜干扰剂，其在光照和黑暗条件下可引起叶绿素的缺失。h y d a n t o c i d i n 是吸 水链霉菌的代谢产物，是一种强烈的腺苷酸琥珀酸合成酶抑制剂。似l 一毒索是由侵染番 茄的交链孢菌致病种产生的，其作用机理是抑制r n a 的合成( 欧晓明与唐德秀，1 9 9 8 ) 。 对生物除草剂的评价，从理论上说主要依据两条标准即有效性( 药效) 和专一性( 安 全性) 。而对生物除草剂发展而言，药效则是关键的因素。生物除草剂的药效包括控制 杂革的水平、速度以及施用操作的难易程度等( 强胜，1 9 9 7 ) ，并且防效与环境因素相关。 如露水持续时间和湿度直接影响真菌孢子及繁殖体的萌发、侵入、孢子产生及再侵入， 从而影响真菌除草剂的防效。因此开发成功的关键因素是使用田块的高湿度条件。 提高生物除草剂防效的途径之一是复配使用低量的化学除草剂或植物生长调节剂。 沈川农业人。7 硕卜学位沦文 通常，低量化学除草剂的存在i i ，以削弱杂草的防御机制，降低生长势柯利干微生物的 侵染，提高发病率，增强杀草效果。另外通过基因工程或原生质体融合技术将强敛病基 因导入的方式，改善生物除草剂的药效。 1 1 3 生物除草剂的研究现状 1 活体微生物防治杂草的研究现状 从二十世纪6 0 年代起，在国外就已经丌始研究微生物除草剂，目前报道的有除草 潜能的活体微生物类型包括：真菌、细菌、病毒。截至目前已制剂化并登记的商品只有 5 个。它包括4 个真菌制剂：美国2 个( d e v i n e ) 和( c o l l e g e o ) ，加拿大1 个( b f o m a l ) ， 巾同1 个( 鲁保一号) ；1 个细菌制剂：f 1 本的( ( ：a m p e l y o ) 。 “d e v i n e ”( 李杨汉，1 9 9 4 ) 第一个被注册的真菌除草帮，一种由棕桐疫霉 匝y 印 f 跚埘，耐阳阳( b u t le r ) 的厚壁孢子制成的液剂，用作柑桔园的耽盯1 。门拍 o d o r a t a ( h 的l n d z 鞍治。该菌最晕食蓠包牲谯椿审垂死讯怕r r e n i ao d o r a t a ( h l 砌d ，植株，最高防效可达9 5 ，施药后的有效除草期可达两年以上。然而所有 藤本植物对该制剂都具有敏感性，因此它的使用受到限制。 “c o l l e g e o ”一种盘长孢状刺盘孢合萌专化型 幻乃幻，曲删鲥。p d 印。，。j 出s ( p e n z ) 妇c 六f 踊8 p s 西肋蝴司真菌制剂，用以防治一p 5 e 细疗伽p 门e 订馏如，c d ( l i ) b s p ，一种水稻( 以w 船舶f ，怕厶) 和大豆( 醴y c 砌p 舾j ) 田里的豆科杂草。 “c 0 1 l e g e o ”是一种含干燥孢子的可湿性粉剂，施后防效可达9 0 1 0 0 。病原物产 生炭疽病斑，对杂草专一，用喷雾器对叶面作常规喷雾即可。该产品曾于1 9 8 2 1 9 9 2 年面市，但e c o g e n 公司现在不再出售，因为市场容量太小，所赚利润不足以回报技术 到产品的转化成本。 “b i o m a l ”( s m i t hr j ，1 9 8 6 ) 第一个在加拿大注册的生物除草剂，有效成份盘长 孢状刺盘孢锦葵专化型( c 鲥d e o 印n 订p 拍酚fs p m a l v a e ) 的孢子，被用作防治圆叶锦 葵( 施阳刀，“，a 册) 。该真菌在茎及叶柄上引起凹陷的侵蚀斑孢子悬液达2 1 0 6 个m l 即具有极好的除草效果，遗憾的是有效感染需要3 0 以下及2 0 h 以上的着露期。 因为与其它公司联合，p h 订o mb i o s 作为“b i o m a l ”的联合开发商之一，已经因为经济 上的权衡决定不再生产“b i o m a l ”，结论认为生产b i o m a l 的成本太高，对农民柬说。价 格也太昂贵。 “鲁保一号”是我国山东省农科院植保所于1 9 6 3 年在济南从罹病的大豆菟丝子上 第。章前言 分离获得的一种孽性寄生怍病原菌一一胶孢炭疽菌菟丝予专化型( 国o f o f ，j c 删 占，d 印盯j 口j 出sfmc “ “a 曲( 高昭远，1 9 9 2 ) 。该菌对大豆田的中国冤丝子及南方 菟丝了均可侵染致病，经在江苏、山东、宁夏等2 0 多个省区的大面积推广，防效均在 h i 以卜，截止1 9 9 2 年，推广面积已达6 1 8 万公顷，经济效益显著。后来，针对该菌 菌种的退化现象，专家们通过大量分析研究，在阐明退化原因的基础上分离获得了在菌 落特征、孢子形态、孢子大小、产孢量及对寄主毒力等方面均相对稳定的单孢变异株s 。 s 。在生产过程中性状稳定、产孢量高，生产效益显著。目前，采用小规模的国体发酵_ ，l t 产工艺进行工厂化生产，已摸索出了一套简易可行的生产规程及产品质量检查制度，稳 定了生产，提高了质量，菌剂中每克的含孢量稳定在2 0 2 5 亿( 林冠伦，1 9 9 1 ) 。但由 于生产厂家少、生产规模，l 、且成本高、产品制剂单一、应用技术尚不十分完善等阃题严 重地制约了该制剂向标准化、商品化、大规模化的发展。 c a m p e r i c o ( 冯化成，2 0 0 1 ) 是由日本横滨的同本烟草公司开发的一种细菌除草剂， 在1 9 9 7 年5 月2 0 日获 导正式登记。其有效成分是鳃菌妇n 诒删疗a so a 印e s 拈p 让 p 。a 岛能引起顽性杂草早熟禾及翦股颖类杂草的枯萎病，主要用于防除高尔夫球场的草 坪杂草，防效可达9 0 以上。该制剂的细菌持效甚长，并随季节不同而呈现不同的效果， 在旌药后1 3 个月中可使草坪中的早熟禾密度城少，且该菌株寄主专一性较强，对同 属的许多草坪草不致病。 目前，世界上很多科研机构都在研究微生物除草剂，只是商品化的很少，以上是对 已经商品化的微生物除草剂的简要介绍。由于微生物除草剂具有资源丰富、环境污染小 等化学除草剂所不具备的优点，故有很大的开发利用潜力，成为科研人员研究的热点。 目前世界各国的研究机构相继研究与开发出了一系列的具有除草活性的生物有机体。真 菌主要有以下9 个属：刺盘孢菌属( 国，j p d d t 订f 加祜、疫霉属( 脚啦矗口m ) 、 镰刀菌属( 助鼢，抑) 、交链孢菌属( 月f 8 m 甜妇) 、柄锈菌属( 胁c j 刀妇) 、尾孢霉 属( 国邶d 印d 馏) 、叶黑粉菌属( 助州d 脚) 、壳二孢菌属( 彳o c 船招) 、核盘菌属 ( j 盯o ? 船) 。共有4 1 个属的真菌已经被考虑或正被考虑作为微生物除草剂的候选。 虽然首选的那些可以引起致病性病害如炭疽病、萎蔫病、枯萎病及叶斑病的种群，但其 选择范围仍然是相当广泛。尽管在关于微生物除草剂的报道中真菌除草剂是研究的最多 的，但困真菌孢子型制剂对环境条件要求严格，在批量生产、配方、储藏等技术问题上 要求过高，因而未被广泛接受，没有产生显著的社会和经济效益。2 0 世纪9 0 年代开始， 8 沈刚农业人学硕i 学位论文 从杂草根系土壤的微生物菌群中筛选具有除草活性的细菌，成为除荦：剂丌发研究的热 点。 在美国和加拿夫，讶多研究工作已致力于丌发致病的根际细菌作除草剂。这些上壤 微生物常常因为在地卜引起一些致命的而不易被发现的症状诸如根变色，萎蔫等而被忽 视。 具有除草潜能的根际细菌主要集中在以下八个属：假单孢菌属( 咫p “如册d 月a s ) 、肠 牛下菌属( 助c 日，。6 a c 盯) 、黄杆菌属( 丹a 阳6 a c f p r ，栅) 、柠檬酸细菌属( “，d 幻c f o r ) 、 无色杆菌属( 刀c 打凸施口f 目，) 、黄单胞菌属( ，册f 巾蝴月a s ) 、欧文氏菌属( 丘矿加妇) 以 及产碱菌属的一些种c a ，僖鲫p | 5 1 印p ，) 。 s o u is 【a n dk r e m e r ( 1 9 9 4 ) 从乳浆草( 正如 o 而如p s 如) 的根部分离到根际 细菌，利用乳浆草的细胞培育物及愈伤组织检测分离物的除草活性，有两个分离物明显 地降低了细胞活力，影响了愈伤组织的生长，一个分离物导致细胞破裂，另一个导致愈 伤组织褐变。据此，研究者断言这两个分离物的致病机制互不相同，因为它们各自在愈 伤组织上引起的症状互不相同。用细胞培养作为根际细菌生物测定的方法是一个既省 力，又经济的检测方法。 k e n n e d ye ta 1 ( 1 9 9 1 ) 报道荧光假单孢菌( 咫e 5 妇月a s 订“d ，e s c 舢s ) d 7 菌株可抑 制匠r 蜊 ，f e c f d r 啪的生长，在田间能降低该杂草的数量。d 7 菌株所产生的次生代 谢物( 即毒害植物成份) 可导致根的变色，阻碍根的延伸。有毒成份的粗提物被发现含有 多个成份，但进一步的纯化却发现失去了对植物的毒性。由于这种不稳定性，可能直接 以细菌本身作除草剂还可行些。 在加拿大西部，有除草潜能的根际细菌正在被发掘，从草原土壤中已分离出1 0 0 0 株以上的根际细菌作防除年生杂草的目标菌株筛选。利用许多对出鲫u s g c 凹姗 有抑制作用的分离物作杀草谱实验，发现根际细菌及其次生代谢物均有寄主专一性， 它们对根生长的抑制作用与旌用浓度相关。其它研究者的报告也指出根际细菌的作用具 有寄主专一性。在非靶寄主( 即春冬季谷物) 上的实验表明，根际细菌对根及茎的生长很 少或没有危害，在某些情况下，某些根际细菌对某些作物还有促进生长之作用。在这种 情况下，通过在作物上施用某些对杂草有害又可促进作物生长的根际细菌有可能增强作 物的竞争机制( 陈永强，1 9 9 8 ) 。 近几年，我国天津农科院和浙大生命科学学院也开始对杂草的根际细菌进行研究。 第。章前吉 但汉斌用两年的时州从狗尾卓根际分离筛选到的s - 菌株能l o o 的抑制狗尾草萌种，j ：丽 发，对供试草坪草高羊茅不仅没有负面影响，而且对高羊茅的种子萌发还有轻微的促，l 作用( 但汉斌与李永泉，2 0 0 2 ) 。李永泉从杂草反枝苋的根际分离筛选到一株具有较强 除草活性的细菌一野油菜黄单胞菌反技苋致病变种( 妇n 拍。册月a sc 丑册e 5 汀s ，) y ， 旭r 。髓p 删s ) ，在筛选上采用了单细胞藻类悬浮培养物直接作为靶标进行筛选，与传统 的吼测和盆栽方法相比，具有快速、简便、微量化，且对光合作用型除草荆敏感等优点 ( 李明智与李永泉，2 0 0 4 ) 。 此外，应用病毒控制杂草的研究也获得了进展。 在美国，佛罗罩达大学的r c h a r u d a t t a n 发现了一种能控制严重危害美国东南部牧 场、草地等自然区域的杂草t r o 口i c 8 1s 。d a a p p l e ( 踟，醐埘p f 8 f t ，刃jt s a ) 的病毒t o b a c c o m 1 dg r o e nm o s a i c 加6 a d r 坩( t m g m v ) ，这种病毒能引起系统的超敏感反应，从而杀 死t s a 的幼苗和成熟植株。在接种该病毒1 2 1 4 d 后，植株首先会在叶片上出现坏死叶 斑。接连在叶颊、茎失及整株发生系统性的坏死。在温室试验中，除了白艘j c 鲫 a 册“脚( 这种病毒的寄主) ，3 1 种茄属的植物( 包括2 3 种栽培品种) 都对这种病毒具有 抗性。罔间试验表明t m g m v 对不同大小和处于不同生育阶段的t s a 的致死率可达到8 3 9 7 。由于t m g m v 是唯一能杀死t s a 各个生长阶段植株的微生物，因此它可以被认为是 防除t s a 的高效生物除草剂，有待成为第一个病毒类的生物除草剂产品 ( r c h a r u d a t t a n 2 0 0 3 ) 。 2 微生物天然产物防治杂草的研究现状 近年来，以微生物天然产物开发生物源除草荆或新颖除草荆的先导化合物引起了杂 草科学家和农药化学家的极大兴趣。利用微生物天然产物防治杂草具有许多潜在优势： ( i ) 杂草对现有除草荆抗性的发展需要发现作用方式新颖的除草帮。许多微生物天然 产物具有不同于合成农药的化学特性，研究这些天然产物可能发现新的除草剂品种，而 其作用位点是现有除草剂未涉及到的；( 2 ) 这些微生物天然产物可以为新的合成方案提 供线索；( 3 在低浓度时锾生物天然产物比化学合成衍生而得的化合物具有生物活性的 可能性大；( 4 ) 已登记的化学除草剂，含有氯代烃类化台物的约占6 0 ，大多数微生物 天然产物几乎不带这些化合物，在环境中半衰期比合成农药短得多，容易迅速降解或解 毒，函此其为登记的试验比化学农药所用的时间短、资金少；( 5 ) 植物细胞培养技术、 发酵技术、分子遗传学和基因工程最新发展，把昂贵的微生物天然产物防除杂草变为现 沈m 农业人学硕十学位论文 实。 许多植物病原微生物在侵染寄主植物使之感病死亡= 的过干里中会释放植物毒素物 质，植物病理学家将微生物产生的植物毒素分为寄主特异性毒素和非寄主特异性毒素。 i 仃者是指只作用于产生毒素病菌所能侵染的植物种或个亚种的鸯素：后者是指产生毒 素的微生物在自然条件下不感染植物，这些毒素侵入寄主植物，可使植物感病产生病斑 或枯萎，破坏其细胞结构，从而达到防治杂草的目的。这些微生物不一定是致病菌，细 菌、真菌部可以产生这类毒素。农药工业发掘具有除草活性的微生物主要是集中在非病 原土壤微生物和腐生微生物上，而不是植物病原菌。从微生物天然产物分离得到的植物 毒素在贮藏、应用、制剂的相容性和半衰期方面都比活体微生物具有优越性，使用分离 出束的毒素不会使非靶标植物感病，其药效通常不依赖环境因素，便于预测。毒素分予 大小，化学种类( 如肽类、萜类、二酮毗嗪、大环内酯、酚类) ，和寄主专一性( 病原 菌从完全专一寄生到非专一寄生) 上差别很大。利用微生物的天然产物通常可以开发出 抗生素类除草剂，目前已知的微生物源的植物毒素约8 0 种。表l 例举了一些具有除草 活性的微生物天然毒素。 1 1 4 生物除草剂的研究方向与展望 杂草的防除一直是困扰人类的一大难题，化学除草剂能控制许多杂草，但也引发了 环境问题。随着环境意识的提高和农业可持续的发展，高效和对环境友好的微生物除草 剂的研制越来越显示其重要的社会价值和经济价值。利用微生物及其天然产物，开发新 的除草剂或作为化学除草荆的扑充手段表现出强大的生命力。今后利用微生物及其天然 产物防治杂革的研究重点应放在发酵、剂型加工、贮藏寿命以及在可变的环境条件下提 高活体微生物防除杂草的田间效果；解决孢予的大规模生产和剂型加工技术；进一步收 集和鉴定杂草植物病原菌。以便于发掘新的有用的微生物天然产物，通过增加可利用的 商品化的微生物及其天然产物的数量和质量，扩大其防除杂草的应用市场。随着人们对 微生物及微生物天然产物侵染和控制寄主杂草机理的深刻了解，通过基因工程和细胞融 合技术，可以重组自然界存在的优良除草基因( 如强致病和产毒索多的基因) ，改良微 生物除草剂的品种和寄主专一性：通过与低量的化学除草剂混配，进一步提高微生物除 草剂的防效；而且随着发酵培养技术的发展，会有更多的活体微生物及其天然产物实现 商品化生产，利用微生物及其天然产物防治杂草有着广阔的发展空间。 第一章前言 表1 已商品化和有开发潜力的微生物天然植物毒素 t a b ie 1c o 嗍e r c ia ia n dp o t e n 七i a im i c r o b ia lh e r b ；c i d e sa n dm jc r o b i a in a t u r a ip h y t o t o jn s 名称 防除对象或作j 玎卅【理 双哪氯嶝( b i 8 l 郇h 。s ) 链霉蔼( z 印f 哦虻p s v i r i d o c i l 。m o g e n e 自啦产觏 除草索( h e r h i c i d i n s ) 吸水链霉菌 is t rh v g r o s c 。p i c u s 、一嘲2 桷产勘 t e n t 锨i n 交链孢 n 口豫f r 坩“t p 埘日亩钓产 物 c o f n e x i s t n 来源十嗜粪担子菌纲宛氏拟青霉 的撬物毒素 双微毒索( b i p 0 1 a r o x h ) 狗芽棍鸽植物病碌蔼 8 p o l a r i sc y n o o o n t i s 姆产觇 蛇孢毒豢a ( o p h j o b o l i n a ) 出日拍5 e 旭菌厘产物 弯孢毒素( c u r v u l i n ) 植物病原菌 m e c h s l e r a h d j c a 鹊产辘 斑点状毒素( m a c u lo s i n ) 变链孢一删叮a a i t e r n a t a 鹋产物 茴香霉素( a n i s o m y c i n ) 链霉菌的产物 万寿菊毒素“a g d t j t d x i n ) 从l 一毒暴和 u s t r a l i f u n g i n 由侵染番茄的室链 孢菌致病种产生 h y d a n t o c i d i n 吸水链霉菌的代谢产物 沙草索( c y p e r i n ) 侵染香附子的壳二孢苗嗜粪 真菌和侵染商陆的茎点霉菌产生 存选择性除革剂 莎草或一些单、双于n | _ 植物 玉米 i 1 阿拉们岛粱、天豆i 阎n 1 绒狭叶杂草 单、双子叶杂草 狗牟根、约翰逊草 约翰逊草 马齿苋、刺三色苋 二花风仙花 稗草、马唐 抑制叶绿豢r n 聚合体 植物神经酰胺台成酶 脾苷酸琥珀酸合成酶抑制剂 生长抑制剂、膜干扰嗣诱使叶绿素发生酶解 1 2 研究的目的和意义 杂革是危害农作物的主要劲敌之一。据统计，每年因杂草造成的农作物减产达9 7 ， 全世界达2 亿t 。而据中国农业年鉴1 9 9 6 年的统计显示，中国因草害损失农产品近9 0 亿k g ，通过杂草防治挽回约4 0 亿k g 。自从人类进行农业生产以来，人们就采用各种方 式除草。化学除草剂因其作用迅速、使用方便的特点，因此到上世纪5 0 年代得到迅速 的发展。但随着化学除草剂的不断应用，已明显暴露出其弊端。首先是除草剂雾滴飘移， 药液挥发，选择性不理想及降解产物的危害等原因引起作物的药害；其次是反复使用化 学除草剂造成耐药杂草种群的上升、抗除草剂杂革的出现和对环境污染日趋严重，使得 开发新除草剂的难度和经费投入日益加大。故寻求更安全有效的除草制剂或方法成为除 沈刚农业人。7 ：顾1 学 奇：论文 革剂发展的方向；以微生物产生的植物毒索物质来丌发新型除草剂，已成为能满足更高 除草效果与选择性以及确保对环境安全性要求的新型除单剂方向。据估计，不到【的土 壤微生物被分离鉴定出来，这就给未知次生代谢产物的发现提供了很大的可能性。臼| m ， 我国埘微生物源除草剂的研究还处于钏步阶段，能广泛应用的更是少之又少，尤其是对 放线菌源除草物质更是鲜有报道。而9 【) 的抗生素都是山放线菌产生的，我国土壤多样， 放线菌资源丰富，兼之放线菌发酵周期短，因此利用土壤中的放线菌开发新型除草剂具 有极大的可行性。 本课题基于这一思想，在借鉴前人经验的基础上，通过对土壤中放线菌的分离，从 中筛选h 具有较高除草活性的菌株，并对除草活性菌株进行代谢和稳定性等方面的研 究，优化除草活性菌株的培养条件，为其在生物防治中的应用奠定基础。 基r 以上目的，本文主要从以下几方面进行了研究： l 、土壤中放线菌的分离纯化 2 、通过对除草活性产生菌的初筛和复筛，获得具有较高除草活性的菌株。 3 、对所筛选出的除草活性菌株进行代谢研究，包括发酵过程中p h 值及除草活性变 化等方面。 4 、对菌株的除草活性进行稳定性研究，包括传代稳定性，热稳定性，及对酸、碱 的稳定性。 5 、对除草活性菌株进行分类地位的初步鉴定。 6 、除草活性菌株的最佳培养条件研究，包括发酵培养基配方的优化和发酵条件的 优化等。 第二章材料与方法 2 1 材料 第二章材料与方法 21 1 土壤样本 从沈阳农业大学标本园、试验田、植物园及铁岭市农科院实验田等地采集土壤样本。 采样时，先铲去表层上，取5 2 0 c m 深度土壤1 0 0 9 ，装入无菌牛皮纸袋内，写蚶标签， 封好袋口，带回实验室。 21 2 培养基 1 高氏一号琼脂培养基： k n o ，l g ，k ：h p 吼0 5 9 ，n a c l0 5 9 ，m g s 0 4 7 h 。0o 5 9 ，f e s o n 7 h z oo 0 l g ，可溶性淀 粉2 0 9 ，琼脂2 0 9 ，蒸馏