（微生物学专业论文）乳杆菌噬菌体的分离、功能基因表达及抗噬菌体菌株的选育.pdf

一 i1r 卢 ， 簟 矿 夕，分 一 原创性声明 眦y 州1 m 7 叭9 黼4 帆5 帆8 l 1 唧 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。 对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：圣! 里鱼 日期：兰坐生6 旦堡 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：量鲤垫一导师签名： 纽 垒 日 期：丝! ! 堡i 函参 j i t、#“j! 人， 番 ， s p ，、i 一 山东大学博士学位论文 目录 摘要i a l j l s t r a c t v 符号说明及缩写词x 第一章绪论1 1 1 孚l 酸菌1 1 1 1 乳酸菌简介1 1 1 2 乳杆菌分类1 1 1 3 乳杆菌在乳制品发酵中的应用2 1 1 4 德氏乳杆菌保加利亚亚种4 1 2 噬菌体5 1 2 1 噬菌体分类一5 1 2 2 乳杆菌噬菌体6 1 3 乳酸菌中的噬菌体防御系统7 1 3 1 常见防御系统7 1 3 1 1 干扰噬菌体吸附( a d s o r p t i o ni n h i b i t i o n ，a d s ) 7 1 3 1 2 阻止噬菌体d n a 的注入( i n j e c t i o nb l o c k i n gs y s t e m ) 。9 1 3 1 3 限制修饰系统( r m 系统) 9 1 3 1 4 流产感染系统( a b o r t i v ei n f e c t i o n ，a b i ) 1 0 1 3 2c a s s 一噬菌体防御新系统l l 1 3 3 三b u l g a r i c u sa t c c l1 8 4 2 存在的可能噬菌体防御系统1 3 1 4 噬菌体裂解机制。1 3 1 4 1 裂解盒简介。1 3 1 4 2h o l i n e n d o l y s i n 裂解机制模型15 1 4 3h o l i n 控制裂解时间模型16 1 5 本文研究内容2 0 第二章德氏乳杆菌烈性噬菌体( p h i l d b ) 的分离及性质研究2 1 2 1 弓i 言2 1 2 2 材料与方法2 1 山东大学博士学位论文 2 2 1 菌株2 1 2 2 2 培养基及试剂2 1 2 2 3 噬菌体的分离2 2 2 2 4 噬菌体宿主范围测定2 3 2 2 5 噬菌体颗粒形态观察2 3 2 2 6 噬菌体的大量繁殖2 3 2 2 7 噬菌体的浓缩2 3 2 2 8 噬菌体基因组d n a 的提取2 4 2 2 9 噬菌体基因组包装机制研究2 4 2 2 10 一步生长曲线测定2 4 2 2 1 l 二价阳离子对噬菌体裂解循环的影响2 5 2 2 1 2 噬菌体的稳定性2 5 2 2 1 3l b u l g a r i c u sa t c c l1 8 4 2 的稳定性2 5 2 2 1 4 噬菌体吸附性质研究2 6 2 3 结果2 7 2 3 1 噬菌体的分离及宿主范围一2 7 2 3 2 噬菌体形态观察2 7 2 3 - 3 噬菌体限制性酶切图谱及包装机制2 8 2 3 4 一步生长曲线2 9 2 3 5 二价阳离子对裂解循环的影响2 9 2 3 6 噬菌体稳定性研究3 0 2 3 7l b u l g a r i c u sa t c c ll8 4 2 的稳定性3l 2 3 8 噬菌体吸附性质研究3 2 2 4 讨论。 第三章噬菌体保存方法研究3 7 3 1 引言 3 2 材料及方法 3 7 3 7 3 2 1 噬菌体及其宿主菌3 7 3 2 2 培养基及试剂3 7 ，7 瓠 一 f 山东大学博士学位论文 3 2 3 噬菌体增殖3 8 3 2 4 保存剂及保存方法3 8 3 2 5 噬菌体裂解活性检测3 8 3 3 结果3 9 3 4 讨论z 1 第四章德氏乳杆菌抗噬菌体菌株的选育及性质研究4 3 4 1 弓i 言4 ：i 4 2 材料与方法4 3 4 2 1 菌株及噬菌体4 3 4 2 2 培养基及试剂4 3 4 2 3 自发突变抗噬菌体菌株的分离4 4 4 2 4y 射线诱变抗噬茵体菌株的分离4 4 4 2 5p c r - a r a p d 4 5 4 2 6 抗性菌株抗噬菌体特征4 6 4 2 7 噬菌体对抗性菌株的吸附测定4 6 4 2 8 噬菌体p h i l d b 受体分析4 7 4 2 9 抗噬菌体菌株的形态观察4 7 4 2 1 0 抗噬菌体菌株的发酵性能4 7 4 3 结果。4 8 4 3 1 抗噬菌体菌株的分离4 8 4 3 2p c r - a i 泔d 4 8 4 3 3 抗性菌株抗噬菌体特征4 9 4 3 4 噬菌体对抗性菌株吸附测定4 9 4 3 5 抗性菌株形态观察5 0 4 3 6 抗噬菌体菌株的发酵性能5l 4 4 讨论。5 3 第五章可控性自裂解乳球菌的构建5 5 5 1 引言5 5 5 2 材料与方法。5 5 1 1 1 山东大学博士学位论文 5 2 1 菌株和质粒5 6 5 2 2 培养基和试剂5 6 5 2 3 方法5 6 5 2 3 1h y b 5 - l y b 5 裂解盒基因的扩增5 6 5 2 3 2 重组载体构建5 7 5 2 3 3 乳酸乳球菌感受态制备5 7a 5 2 3 4 乳酸乳球菌电转化5 7 5 2 3 5h y b 5 和l y b 5 的诱导表达及活性检测5 8 5 3 结果5 8 5 3 1 重组质粒构建5 8 5 3 2 诱导过程中n z p h l ) j c n z p 的生长变化5 9 5 3 3s d s p a g e ( s d s - p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ) 分析6 0 5 4 讨论6 1 第六章发酵乳杆菌温和噬菌体t p p y b 5 编码的两组分细胞裂解盒的鉴定及性质 研罗琶6 3 6 1 弓i 言6 3 6 2 材料与方法6 4 6 2 1 菌株和质粒6 4 6 2 2 培养基和试剂6 4 6 2 3 方法6 5 6 3 结果 6 2 3 1 基因( h y b 5 一l y b 5 ) 的获得及分析6 5 6 2 3 2 基i 习( h y b 5 ，l y b 5 和h y b 5 一l y b 5 ) 扩增6 5 6 2 3 3 重组载体构建6 6 6 2 3 4 重组菌的诱导表达及s d s p a g e 6 6 6 2 3 5o d 值及半乳糖苷酶活性测定6 6 6 2 3 6l y b 5 胞外裂解活性测定6 7 6 2 3 7z y m o g r a m 分析及l y b 5 抗菌谱测定6 7 6 3 1 温和噬菌体c p y b 5 “两组分裂解盒”的鉴定。6 8 一 ? 1 一 ， 一 山东大学博士学位论文 6 3 2h y b 5 ，l y b 5 和h y b 5 一l y b 5 在大肠杆菌中的表达6 9 6 3 2 1s d s p a g e 6 9 6 3 2 2 重组菌株o d 值变化7 0 6 3 2 3 半乳糖苷酶活性检测7 l 6 3 3l y b 5 胞外裂解活性检测7 2 6 3 3 1 双层平板分析7 2 6 3 3 2z y m o g r a m 分析一7 3 6 3 4l r r b 5 抗菌谱测定7 4 6 4 讨论7 5 第七章h y b 5 - l y b 5 裂解机制的初步探测7 7 7 1 引言7 7 7 2 材料与方法7 7 7 2 1 质粒与菌株一7 7 7 2 2 培养基与试剂7 7 7 2 3 重组载体构建7 8 7 2 3 1 重组载体构建示意图7 8 7 2 3 2 基因扩增。7 8 7 2 3 3 目的d n a 及载体的酶切、连接及转化8 0 7 2 4 重组菌的诱导表达，s d s p a g e 及o d 值测定8 0 7 3 结果8 0 7 3 1l y b 5 序列分析8 0 7 3 2s a r 功能探测8l 7 3 2 1o d 值测定及s d s p a g e 8 1 7 3 2 2s a r 序列对l y b 5 裂解活性的影响8 2 7 3 3h y b 5 控制裂解时间机制的初步研究8 3 7 3 3 1h y b 5n - 端跨膜区作用8 3 7 3 3 2h y b 5 不同片段活性比较。8 4 7 4 讨论。8 5 参考文献8 7 v 山东大学博士学位论文 攻读博士学位论文期间发表论文9 9 至5 谢一10 0 外文写作一1 0 1 卅 山东大学博士学位论文 乳杆菌噬菌体的分离、功能基因表达及抗噬菌体菌株的选育 摘要 乳杆菌为乳制品发酵中的重要菌株，而乳杆菌噬菌体的普遍存在给乳制品行 业带来了巨大危害。为有效地对乳杆菌噬菌体进行防治及应用，本文以德氏乳杆 菌烈性噬菌体p h i l d b 和发酵乳杆菌温和噬菌体c p y b 5 为中心展开研究，具体结果 如下： 1 德氏乳杆菌烈性噬菌体的分离及性质研究 德氏乳杆菌保加利亚亚种l a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i is u b s p b u l g a r i c u s b u l g a r i c u s ) 为酸奶生产中的重要发酵剂，在奶制品发酵过程中主要负责乳酸的快 速积累，产品风味物质的形成，质地的改善等。当l b u l g a r i c u s 受噬菌体侵染时， 其发酵活性将受到破坏，整个发酵过程迅速减慢或完全终止，从而严重影响产品 质量。然而，与乳球菌噬菌体相比，关于乳杆菌噬菌体的研究信息非常有限。本 论文从发酵异常的酸奶样品巾分离获得一个厶b u l g a r i c u s 的烈性噬菌体，并命名 为p h i l d b 。该噬菌体具有一个直径大小为4 7 7 a ：0 9a m 的头部和一条长1 2 9 8 + 2n l l 的尾，因此被归为s i p h o v i r i d a e 科。噬菌体p h i l d b 基因组大小约4 1k b p ，而且不含 粘性末端。该噬菌体的一步生长曲线显示，其潜伏期和裂解期分别为4 5m i n 和7 5 m i n ，裂解量为5 6 a ：2p f u 。噬菌体p h i l d b 对l b u l g a r i c u s 的侵染具高度专一性。二 价阳离子c a 2 + 或m 9 2 + 对促进宿主细胞裂解和提高噬菌斑的形成是必需的。噬菌体 p h i l d b 在p h2 1 0 的范围内均维持高的存活率，并表现出对乙醇和异丙醇的高耐 受性。然而，9 0 0 c 高温处理4 0m i n 可将噬菌体p h i l d b 彻底灭活。c a 2 + ，p h 及温度 对噬菌体p h i l d b 的吸附影响较弱。另外，噬菌体p h i l d b 对正常宿主细胞和经灭活 处理的细胞的吸附曲线相似，说明宿主细胞的生理状态对该噬菌体吸附影响也不 明显。本论文对新分离到的噬菌体p h i l d b 的各方面性质的研究为生产环境中采用 最有效的噬菌体防治策略奠定了理论基础。 2 噬菌体保存方法研究 噬茵体是专性活细菌细胞内寄生的病毒，离开宿主易于死亡。为长期保存噬 菌体，本论文以大肠杆菌九噬菌体和德氏乳杆菌噬菌体p h i l d b 为实验材料，分 山东大学博士学位论文 量nn n 量曼曼曼曼量量曼量曼曼曼曼量曼曼曼曼曼皇曼皇鼍皇曼量曼曼曼曼曼曼皇皇量曼曼曼曼曼曼曼量皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼量舅曼曼量曼曼曼曼曼! 曼曼曼曼曼曼舅量曼曼曼 别在不同稳定剂和不同温度下保存6 个月，检测期间噬菌体的存活性，探索最有 效的保存方法。结果显示，保存效果最好的稳定剂为甘油，其次为二甲基亚砜， 效果最差的稳定剂为脱脂奶粉；效果最好的温度为4 0 c ，其次是8 0 0 c 。因此， 以甘油或二甲基亚砜为稳定剂，置于4 0 c ，2 0 0 c 或8 0 0 c 保存均为比较简便有 效的噬菌体保存方法。 3 德氏乳杆菌抗噬茵体菌株的选育及性质研究 噬菌体侵染造成的巨大损失促使许多噬菌体防治策略的提出及应用。然而， 噬菌体抗性菌株通常是通过d n a 重组或携带噬菌体抗性基因的质粒的转移获得 的，因而赋予所得菌株潜在的安全隐患。而自发突变的方法，由于不涉及基因操 作，已被认为是一种简便有效且“天然”的获得抗噬菌体菌株的策略。6 0 c o 吖射线 是最常用的物理诱变剂之一，并且6 0 c o - 1 , 射线诱变已成功用于微生物菌种的改 造。本论文通过自发突变及6 0 c o 吖射线辐照诱变的方式分别获得3 0 株抗噬菌体 的l b u l g a r i c u s 突变株。所有6 0 株突变株均表现出对噬菌体p h i l d b 的完全抗性 ( e o p 1 0 。9 ) 。溶源性测定结果表明，除2 株自发突变获得的抗性菌株外，其他5 8 株突变菌株的噬菌体抗性均与溶源性无关。所有抗性菌株对噬菌体p h i l d b 的吸 附率明显下降，说明突变菌株可干扰噬菌体的吸附。实验证明，噬菌体p h i l d b 的吸附受体与肽聚糖多糖的附属聚合物有关。自发突变获得的抗性菌株间的蛋 白酶活性差别较显著，但是大多数抗性菌株的蛋白酶活性及p h 值与初始菌株 b u l g a r i c u sa t c c l 18 4 2 的类似。根据各抗性菌株的蛋白酶活性与p h 值，我们以 b i m1 0 和丫1 9 为代表，进行发酵乳试验。两株抗性菌株不管噬菌体p h i l d b 的存 在与否，均表现出良好的发酵特性。因此，除自发突变方法外，6 0 c o - 7 射线辐照 诱变也被证明是一种获得发酵性能优良的l a c t o b a c i l l u s d e l b r u e c k i i 抗噬菌体菌株 的简便有效方法。此外，本研究为工业生产中提供了大量抗噬菌体德氏乳杆菌， 可作为替换受噬菌体感染发酵剂的后备资源。 4 可控性自裂解乳球菌的构建 在复制周期的最后一步，噬菌体将产生一系列酶类来裂解宿主细胞，从而释 放子代颗粒。所有双链d n a 噬菌体编码的裂解相关酶类均涉及两个蛋白，即穿 孔素( h o l i n ) 和裂解素( 1 y s i n ) ，组成了“两组分裂解盒”。对发酵乳杆菌温和噬菌体 9 p y b 5 的基因组进行测序过程中获得了其“两组分裂解盒”的基因：幻砌o y b o h 天 一 r ， 一 山东大学博士学位论文 和l y s i n ( 1 y b 5 ) 。为阐明噬菌体c p y b 5 编码的由穿孔素( h y b 5 ) 矛n 裂解素( l y b s ) 组成 的裂解盒在乳酸菌中的作用特征，并有效利用该裂解盒构建可控性自裂解的乳酸 菌株，我们将基因砂b 5 1 y b 5 克隆到ec o l i l 1 a c t i s 穿梭质粒p s e c 的n i s i n 诱导 型启动子下游，构建了重组质粒p s e c - h y b 5 - l y b 5 。将p s e c h y b 5 - l y b 5 电转入 l a c t o c o c c u sl a c t i sn z 9 0 0 0 ，获得重组菌株n z p h l 。经n i s i n 诱导后，h y b 5 l r r b 5 的表达表现出高的裂解活性，使n z p h l 菌液的浊度( o d 6 0 0 ) 急剧下降，并释放出 大量胞内蛋白，为利用自裂解菌株生产优质乳制品奠定了基础。 5 发酵乳杆菌温和噬茵体裂解盒在大肠杆菌中的克隆与表达 与其他裂解盒不同，h y b 5 经预测只含有一个跨膜区，且l y b 5 具有n 端信 号肽。为研究该组合奇特的裂解盒的作用特征，并阐明l y b 5 作为诊疗剂的潜在 应用，本论文中，将h y b 5 ，t y b 5 及h y b 5 t y b 5 分别插入大肠杆菌表达载体，实现 了h y b 5 ，l r r b 5 在大肠杆菌中的单独表达和共表达。s d s p a g e 结果显示，h y b 5 的分子量大小约1 9k d a ，l y b 5 大小为4 5k d a 。h y b 5 或l y b 5 的单独表达均可引 起宿主菌的裂解，导致胞内f l - g a l a c t o s i d a s e 的释放。然而，h y b 5 l r r b 5 裂解盒的 共表达则使宿主菌裂解地更迅速，更彻底。双层平板观测法及z y m o g r a m 复性胶 检测确定了l y b 5 对宿主菌的胞外裂解活性。经z y m o g r a m 复性胶分析，l y b 5 展 现出非常广泛的裂解谱，可裂解包括致病茵金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u s a u r e u s ) 在内的所有测试革兰氏阳性菌及部分革兰氏阴性菌如沙门氏菌 ( s a l m o n e l l at y p h i ) 等，显示出l y b 5 作为诊断工具及治疗剂的巨大潜力。 6 h y b 5 l y b 5 裂解机制初步研究 基于大肠杆菌噬菌体的研究结果，h o l i n 1 y s i n 裂解盒的裂解作用模型及 h o l i n 控制裂解时间的机制已有报道。但对侵染其他菌的噬菌体的裂解机制研究 比较缺乏。本论文试图通过对l y b 5 蛋白n 端信号肽的功能分析及对h y b 5 不同 基因片段的表达和活性分析来阐明h y b 5 l y b 5 裂解作用模型及单次跨膜h y b 5 控 制裂解时间的作用机制。我们将l y b 5 或a s a r l y b s ( 除掉n 端s a r 序列的t y b 5 ) 插入载体p e t d u e t - 1 的多克隆位点1 ，将h y b 5 ，h y b s p ( 砂 5 端3 2 4b p 基因片段) 或h y b 5 n 3 0 ( 编码h y b 5n - 端跨膜区3 0 个氨基酸的序列) 插入载体p e t d u e t 1 的多 克隆位点2 ，构建了一系列重组载体。并实现了各基因的单独表达及不同基因间 的共表达，观察宿主菌的裂解情况。结果显示，s a r l y b 5 与h y b 5 p 的共表达 i i i 山东大学博士学位论文 使宿主菌的o d 值明显下降，而a s a r l y b 5 的单独表达反而使宿主菌生长更旺盛， 说明s a r 序列可作为信号肽引导l y b 5 穿膜，但l y b 5 的裂解活性不依赖于s a r 序列。h y b 5 的n 端跨膜区单独表达时抑制了宿主菌的生长，表明h y b 5 的n 端3 0 个氨基酸可以完成跨膜功能，表现出对细胞的毒性。而n 3 0 h y b 5 与l y b 5 或a s a r l y b 5 的共表达并未引起宿主菌的大量裂解，暴露了n 3 0 h y b 5 辅助l y b 5 或a s a r i y b 5 穿膜功能的缺陷性。比较有趣的是，缺少c 端4 6 个氨基酸的h y b 5 对l y b 5 穿膜的促进作用明显高于h y b 5 ，暗示了h y b 5c - 端序列对其行使运输活 性的调节作用。至于s a r 在裂解过程中是否被切割以及h y b 5 作用时本身及其 他调节因素的阐明，以致最后总结出h y b 5 l y b 5 奇特组合的裂解机制模型和像 h y b 5 这样不具备其他h o l i n 具有的典型的双翻译起始位点且仅具一个跨膜区的 蛋白控制裂解时间机制模型的提出均需要大量的进一步的实验摸索，推测及证 实。 关键词：德氏乳杆菌；噬菌体；抗噬菌体菌株；裂解盒；裂解谱；裂解机制 i v p t 山东大学博士学位论文 s t u d i e so nt h ei s o l a t i o n ，f u n c t i o n a lg e n ee x p r e s s i o no f l a c t o b a c i l l u sp h a g e sa n dm u t a t i o nb r e e d i n go fp h a g e r e s i s t a n c e s t r a i n s a b s t r a c t l a c t o b a c i l l ia re o n eo ft h em o s ti m p o r t a n ts t r a i n si nd a i r yf e r m e n t a t i o n h o w e v e r , t h ei n f e c t i o no fl a c t o b a c i l l u sp h a g e sw o u l dr e s u l ti nl a r g ed a m a g et od a i r yi n d u s t r i e s i no r d e rt oc o n t r o la n da p p l yl a c t o b a c i l l u sp h a g e se f f e c t i v e l y , w es t u d i e dm a i n l yo n c h a r a c t e r i z a t i o n so ft h el a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i is u b s p b u l g a r i c u s b u l g a r i c u s ) v i r u l e n tp h a g ep h i l d ba n dt h el a c t o b a c i l l u sf e r m e n t u mt e m p e r a t eb a c t e r i o p h a g e c p y b 5 ，t h er e s u l t sw e r ed e s c r i b e da sf o l l o w s ： 1 i s o l a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fan o v e lv i r u l e n t p h a g e ( p h i l d b ) o f 三b u l g a r i c u si sa ne s s e n t i a ls t a r t e rc o n t r i b u t i n gt of a s tl a c t i ca c i dd e v e l o p m e n t ， a n da l s ot of l a v o ra n dt e x t u r em o d i f i c a t i o n si nf e r m e n t e dm i l k s h o w e v e r ，t h i ss t a r t e r a c t i v i t yo fl b u l g a r i c u sc a nb es e r i o u s l ya f f e c t e dw h e np h a g ei n f e c t i o no c c u r s c o n s e q u e n t l y , t h ef e r m e n t a t i o np r o c e s sm a yb es l o w e do rc o m p l e t e l ys t o p p e d ， t h e r e b yr e d u c i n gt h eq u a l i t yo ft h ef i n a lp r o d u c t s n e v e r t h e l e s s ，i nc o m p a r i s o nw i t h p h a g e so fl a c t o c o c i ，t h ea v a i l a b l ek n o w l e d g ea b o u tl a c t o b a c i l l ip h a g e si sl i m i t e da n d o n l yaf e wo ft h e mh a v eb e e ns t u d i e di nd e t a i l i nt h i ss t u d y , an e wv i r u l e n tp h a g e ( p h i l d b ) o f b u l g a r i c u sw a si s o l a t e df r o mac h i n e s ey o g u r ts a m p l es h o w i n gs l o w a c i d i f i c a t i o n i tb e l o n g e dt ot h es i p h o v i r i d a ef a m i l yw i t ha l li c o s a h e d r a lc a p s i do f 4 7 7 4 - 0 9h i 1i nd i a m e t e ra n da l o n gt a i lo f12 9 8 4 - 2n m t h eg e n o m eo fp h a g ep h i l d b w a se s t i m a t e dt ob ea p p r o x i m a t e l y41 k b p ，a n dd i dn o tc o n t a i nc o h e s i v ee n d s o n e s t e pg r o w t hk i n e t i c so fi t sl y t i cd e v e l o p m e n tr e v e a l e dl a t e n ta n db u r s tp e r i o d so f 4 5m i na n d7 5m i n ，r e s p e c t i v e l y , w i t hab u r s ts i z eo f5 6 士2p h a g ep a r t i c l e sp e ri n f e c t e d c e l l p h a g ep h i l d bw a sh i g h l ys p e c i f i cf o r 厶b u l g a r i c u s t h ep r e s e n c eo fc a l c i u mo r m a g n e s i u mi o n sw a sn e c e s s a r yt oa c c e l e r a t ec e l ll y s i sa n di m p r o v ep l a q u ef o r m a t i o n v 山东大学博士学位论文 p h a g ep h i l d bw a sa b l et os u r v i v ei nap hr a n g eb e t w e e n2a n d10 ，a n dr e s i s te t h a n o l a n di s o p r o p a n 0 1 h o w e v e r , at r e a t m e n to f9 0 。cf o r4 0m i nw a so b s e r v e dt oi n a c t i v e p h a g ep h i l d bt h o r o u g h l y c a l c i u mi o n s ，p ha sw e l la st e m p e r a t u r e d i dn o ts h o w s i g n i f i c a n ti n f l u e n c eo np h a g ea d s o r p t i o n , a n dt h ea d s o r p t i o nk i n e t i c sw e r es i m i l a ro n v i a b l ea n dn o n v i a b l ec e l l s t h ec h a r a c t e r i z a t i o no ft h i sn o v e lp h a g ew a sh e l p f u lt o e s t a b l i s hab a s i sf o ra d o p t i n gt h em o s te f f e c t i v ep h a g ec o n t r o ls t r a t e g i e si ni n d u s t r i a l p l a n t s 2 r e s e a r c ho ns t o r a g em e t h o d so fp h a g e s p h a g e sa r eo b l i g a t ei n t r a c e l l u l a rp a r a s i t eo fb a c t e r i aa n d w i l le a s i l yl o s ea c t i v i t y w i t h o u th o s tc e l l s i no r d e rt os t o r ep h a g e sf o ral o n gp e r i o d ，e s c h e r i c h i ac o l i 九p h a g e a n dl a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i ip h a g ep h i l d bw e r ek e p tw i t hav a r i e t yo fs t a b l i z e r sa n d t e m p e r a t u r ef o r6m o n t h s a n da t o n em o n t hi n t e r v a l s ，t h ep h a g et i t e r sw e r e e n u m e r a t e da n dc o m p a r e dt oo p t i m i z et h es t o r a g ec o n d i t i o n s t h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h eb e s ts t o r a g et e m p e r a t u r ew a s4 。ca n ds e c o n d l y - 8 0 。c ；t h eb e s ts t a b l i z e rw a s g l y c e r i n e ，a n ds e c o n d l yd i m e t h y ls u l f o x i d e t h e r e f o r e ，p h a g es t o r a g e sw i t hg l y c e r i n e o rd i m e t h y ls u l f o x i d ea t4 0 c ，一2 0 。co r 一8 0 。ca r es i m p l e ，e f f i c i e n ta n dr e c o m m e n d a b l e m e t h o d s 3 i s o l a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fp h a g e r e s i s t a n td e r i v a t i v e so fl a c t o b a c i l l u s ， 一 f o r2s p o n t a n e o u sm u t a n t s ，t h ep h a g e r e s i s t a n tm e c h a n i s m so ft h el a s t5 8m u t a n t s w e r ei r r e l e v a n tw i t hl y s o g e n y t h eo b v i o u sd e c r e a s eo ft h ea d s o r p t i o nr a t e se x h i b i t e d b y a l lm u t a n t si n d i c a t e dt h e p r e s e n c eo fa d s o r p t i o n i n t e r f e r e n c ed u r i n g p h a g e i n f e c t i o n a n dt h ea c c e s s o r yp o l y s a c c h a r i d e - p e p t i d o g l y c a nc o m p l e xw a sp r o v e dt ob e i n v o l v e di n t h e p h a g er e c e p t o rs i t e s p r o t e o l y t i c a c t i v i t i e sw e r eh e t e r o g e n e o u s d i s t r i b u t e d a m o n gt h es p o n t a n e o u sm u t a n t s n e v e r t h e l e s s ，m o s to ft h em u t a n t s r e v e a l e dp r o t e o l y t i ca c t i v i t i e sa n dp hv a l u e ss i m i l a rt ot h o s eo b s e r v e df o rt h ep a r e n t s t r a i n t w om u t a n t s ，b i m10a n d 丫19w e r ec h o s e na sm o d e ls t a r t e r sf o rp i l o t f e r m e n t a t