（有机化学专业论文）除虫菌素发酵工艺的研究.pdf

摘要 摘要 除虫菌素是由除虫链霉菌产生的一组具有抗虫活性的大环内醋类抗生 素。 本文以x 。2 8 4 菌株为实验菌株，对除虫链霉菌进行选育和对除虫菌素 生物合成与发酵工艺进行优化试验。结果表明： ( 1 ) 气生菌丝旺盛、色素深、产灰色孢子的菌株为高产株； ( 2 ) 用h p l c 对除虫菌素效价进行检测，得到种子培养基一发酵培养基i i i 的优化组合，摇瓶发酵总单位可达2 2 81g g m l ( 9 d ) ，比出发菌株提高了 5 0 ； ( 3 ) 通过种子培养基的优化，将种子培养时间缩短了将近2 0 h ，这对提高工 业化生产效率有很重要的意义。 ( 4 ) 通过对此菌株的发酵参数试验，为今后更深入地了解和掌握此菌种的 特性打下了基础 ( 5 ) 以菌株x 一2 8 ”为实验菌株分别进行p h 控制及丙乙酸钙前体实验，结果 表明，p h 控制试验中，除虫菌素的最适p h 值为6 3 左右，它的效价提高了 1 4 5 ；前体实验中，4 8 h 添加5 9 l 的丙乙酸钙为最适，发酵单位可达到 1 5 8 2 1 a g m l ( 7 d ) ，比对照提高了6 3 。 关键词除虫菌素；发酵工艺；高效液相色谱；前体；p h 控制 a v e r m e c t i ni sag r o u p s t r e p t o m y c e sa v e r m i t i l i s a b s t r a c t o fa n t i p a r a s i t i cm a c r o l i d ea n t i b i o t i c sp r o d u c e db y u s i n gs t r a i nx - 2 8 a se x p e r i m e n t a ls t r a i n ，t h ef a c t o r st h a ti n f l u e n c e dt h e b i o s y n t h e s i sa n df e r m e n t a t i o ny i e l do fa v e r m e c t i n w e r ei n v e s t i g a t e d t h e h p l cw e r eu s e df o rd e t e r m i n a t i o no fa v e r m e c t i n st i t e r t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a t 。 f i r s t l y ，o n l yt h ec o l o n yi s o l a t e df r o ms t r e p t o m y c e sa v e r m i t i l i sx - 2 8 ” w i t hl u x u r i a n tg r e yc o n i d i a ，t h i c ka e r i a lm y c e l i a ，a n dm e l a n i np r o d u c e rw a s t h eh i g hp r o d u c i n gs t r a i n s e c o n d l y ，t w op r e f e r a b l ef o r m u l a t i o n sh a db e e n f o u n da c c o r d i n gt o c u l t u r em e d i u me x p e r i m e n t ，t h e i ra v e r m e c t i n st i t e ra t t a i n e d 2 281p g m li n s h a k i n gf l a s kf e r m e n t a t i o nf o rn i n ed a y ，w h i c hw e r ei n c r e a s e d 10 0 t h a n c o n t r o l s t h i r d l v ，t h ec u i t u r et i m eo ft h es e e dc u l t u r ew a ss h o r t e n e db y2 0h o u r s a c c o r d i n gt os e e dm e d i u mi m p r o v e d i t i sa v a i l a b l et oe n h a n c ei n d u s t r i a l p r o d u c t i o ne f f i c i e n c y 。 l a s t l y ，i n f l u e n c eo ft h ep hc o n t r o la n dp r e c u r s o rf e e do nt h ea v e r m e c t i n s b i o s v n t h e s i sw e r es t u d i e d t h e r e s u l ti n d i c a t e dt h a t ， w h e nt h ep hi n t h r o u g h o u tf e r m e n t a t i o np r o c e s s w a s6 3 ，t h ef e r m e n t a t i o n t i t e rw a s i m p r e v e d 14 5 w h e nt h ec o m p l e xo fc a l c i u mp r o p i o n a t e a n dc a l c i u m a c e t a t ef o rp r e c u r s o rw e r ea d d e di n48 h ，t h ef e r m e n t a t i o nt i t e ru p t o158 2 i _ t g m l ( 7 d ) w h i c hi n c r e a s e d6 3 t h a nc o n t r o l sw i t h o u ta n y p r e c u r s o r k e yw o r d ss t r e p t o m y c e sa v e r m i t i l i s ；a v e r m e c t i n sf e r m e n t a t i o n ；h p l c p r e c u r s o r ； p h c o n t r o l i i 河北大学 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 入已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教育机构的学位或证书 所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示了致谢。 作者签名： 鲤鱼氅 日期：兰互l 年三月尘日 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布 论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。 2 、不保密留。 ( 请在以上相应方格内打“一) 作者签名：垒l 塑幽日期：2 出旦月卫日 导师签名： 保护知识产权声明 ( 何嘲) ，是河北大学化学与环境科学学院的( 二o p t ) 届疋士 ) 研究生。 本人为获得河北大学疆鳓) 学位证书所提交的题目为： ( 除幺菌素竣霹幽研宪 ) 的q 里豸烫) 学位论文，是我个人在导师( 徐柔瓦 教授) 指 导并与导师合作下取得的研究成果，研究工作及取得的研究成果是在 河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费资助下完成的。本人完 全了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定的各项法 律、行政法规以及河北大学的相关规定。 本人声明如下：本人以任何形式公开和传播科研成果和科研工作 时，包括发表的学术论文、学术交流、科技咨询和科技成果转让等行 为时，如果涉及到本论文所包含的研究内容和研究成果，本人将征得 指导教师( 徐柔民 教授) 和河北大学的书面同意和授权。如果 违反本声明，本人承担法律责任。 声明人：签名( 章) 纫螂 日期：沙7 # 2 俨日 第1 章引言 第l 章引言 1 1 除虫菌素简介 1 1 1 发现 除虫菌素( a v e r m e c t i n s ，a v m ) 产生菌于19 7 5 年由日本北里研究所的大 村智教授首次在同本静冈地区土壤中发现、鉴别并命名【1 1 。19 7 9 年由美国 默克( m e r c k ) 公司的b u r gr w 等采用简单的小鼠线虫感染模型筛选法， 自该放线菌发酵液中发现并分离得到除虫菌素1 2 1 。 1 1 2 产生菌 除虫菌素的产生菌为除虫链霉菌( s t r e p t o m y c e sa v e r m i t i l i s ) ，又称阿 维链霉菌或阿弗曼链霉菌。目前世界各国生产除虫菌素的菌种，都来源于 上述静网地区土壤分离得到的菌株。 1 2 除虫菌素的化学结构和理化性质 1 2 1 化学结构 除虫菌素是全世界广泛使用的十六元大环内酯类杀虫、杀螨剂，既可 用于农业害虫的防治，又能作为畜用肠道驱虫剂1 3 1 。在其化学结构中，除 含有大环内酯配糖体和以糖苷键连接的两个齐墩果糖外，还并联有一个螺 缩酮和一个氢化苯并呋喃，而区别于普通的大环内酯类抗生素。根据c 5 位、c 2 s 位取代基和c 2 2 c 2 3 位结构的不同，可以有a 1 。，a l b ，a 2 。，a 2 b ， b bl b ，b 2 。和b 2 b 八个组分( 见图1 ) ：c 5 位为甲氧基称为“a ”组分，为 羟基称为“b ”组分：c 2 2 c 2 3 为双键称为“1 ”亚组分，为单键并在c 2 3 位含有 一个羟基称为“2 ”亚组分，c 2 5 为仲丁基侧链称为“a ”成分，为异丙基侧链称 为“b ”成分1 3 1 。其中b 组分的生物活性优于a 组分，尤以b l 。组分的活性最 强。目前农畜牧业中应用的除虫菌素是b l 。含量大于8 0 、b l b 的含量小于 2 0 的混合物，商品名为阿巴丁( a b a m e c t i n ) 1 4 1 。 辩 娃， 辩 o j c i 河北大学理学硕士学位论文 a v c r m e c f i n r l x y r 2 a i - c h 3 c h = c h c 2 hs a 吩 c h 3 c h = c h c h 3 a 2 c h 3c h 2 c h ( o h )c 2 h s a 2 bc h ，c h ：c h ( o h )c h 3 bth c h = c h c 2 h s b t h hc h = c h c h 8 2 。 h c h 2 c h ( o h )c ：h ， b - , b h c h 2 c h ( o h )c h j 图l 一1 除虫菌素类化合物的化学结构 f i g 1 1t h ec h e m i s t r ys t r u c t u r eo fa v e r m e t i n s sc o m p o u n d 1 2 2 理化性质 ( 1 ) 物理性质本品为淡黄色至白色结晶无味粉末，熔点为l5 5 15 7 。 蒸汽压为1 5 10 一p a 。比重为1 16 + 0 0 5 ( 2 1 ) 。溶于甲苯，乙酸乙酯， 乙醇。难溶于水。除虫菌素与双氢除虫菌素在一些溶剂中的溶解度列于表 l - l 。 ( 2 ) 酸不稳定性和光不稳定性稀酸处理引起c 1 3 位第一糖酐键断开； 紫外光照射引起c 8 ，9 位和c 1 1 位双键异构。 ( 3 ) 烷基化作用由于除虫菌素对强碱较敏感，因此不太容易烷基化。 但在氧化银存在下，烷基碘可迅速与5 羟基反应，从而将除虫菌素“b ”组 分转化成组分“a ”的5 甲氧基化合物。在上述条件下，分子中其他羟基也 可缓慢的甲氧化。 ( 4 ) 氧化作用除虫菌素都含有8 ，l0 二烯，即c 2 和c 1 4 为两个孤立 双键。“a l ”和“b l ”组分在分子的螺酮部分还有一个孤立双键，它是分子中 唯一的双取代顺式孤立双键，因此可以( p h 3 p 3 ) r h c i 为催化剂，用w i l k i n s o n 法进行氢化，结果得2 2 ，2 3 双氢除虫菌素a l 和bl 。含有多于8 0 的2 2 ， 2 3 一双氢除虫菌素b l 。和少于2 0 的2 2 ，2 3 双氢除虫菌素b 1 b 的混合物即为 伊维菌素。 ( 5 ) 氧化作用除虫菌素的c 4 ”, c 5 ，及c 2 3 位上的3 个仲羟基容易受到 氧化，如“b i ”和“b 2 ”组分的烯丙位5 羟基可用二氧化镁将其氧化成1 ) ，d 不 饱5 一酮。 ( 6 ) 酰化作用除虫菌素在c 7 位有一个叔羟基，其中除虫菌素a 2 在 c 2 3 位还有仲羟基，它们都可被酰化。 ( 7 ) 生物学活性对细菌，真菌和原生动物无活性，对钩虫、蜊虫、 肺蠕虫、蛲虫、丝虫等线虫和螨、跳蚤、虱、苍蝇蛆等节足类昆虫有很强 的杀虫活性】。 第1 章引言 表i 1 除虫菌素利双氢除虫菌素的溶解度( 2 0 ，m g m l j ) t a b 1 1t h ed e l i q u e s c e n c ed e g r e eo fa v e r m e t i n sa n dd o u b l eh y d r o g e n ( 2 0 c ，m g m l 。1 ) 1 3 除虫菌素的作用机制 除虫菌素作用于细胞膜上的离子通道，从而引起氯离子的聚集，阻断 无椎动物的神经传导系统。拮抗无脊椎动物的神经传递物质丫氨基丁 酸( g a b a ) ，与存在于这类动物神经肌肉细胞中的受gaba 活化 的c l 一离子通道选择性结合，使该离子的膜通透性上升，造成神 经细胞过分极化以至麻痹，直至虫体死亡。除虫菌素具有广谱、高 效、安全、稳定的特点，一次用药可杀灭多种害虫，尤其对鳞翅目、双翅 目、同翅目、螨虫、线虫和节肢动物有效率均在9 0 以上。除虫菌素对虫 螨的药效虽然不如某些神经毒剂那样迅速，但它能够麻痹虫体，使之极少 取食，达到杀灭虫害的目的。已有资料表明，除虫菌素对几乎所有的线虫 和节肢动物有效。不考虑它们的种属，一次口服给药或非常到给药量在 0 0 1 - o 0 2 m g k g 时，虫体就产生很高的敏感性。 由于哺乳动物的这种离子通道只存在于脑组织中，而除虫菌 素不能通过血脑屏障，另外本类药物进入到体内后极少分布到哺乳动物 的脑组织，并且与禽畜脑组织特异性的结合较无脊椎动物低10 0 多倍，因 此可选择性的作用于宿主的体内外寄生虫，而对宿主本身不表现作用，故 除虫菌素具有良好的选择性毒性【l1 1 。 1 4 除虫菌素的生物合成 同本北罩研究室和美国默克( m e r c k ) 公司各自独立地研究了阿维茵 河北大学理学硕士学位论文 素的生物合成途径，现在巳基本弄清楚研究中采用的方法有添加同位素标 记前体，阻断突变株生物合成关键性的中间体的鉴别，阻断突变株或野生 型产生菌生物合成中问体转化以及生物合成中有关酶的体外测定等【心。4 1 。 1 4 1 同位素标记法 标记葡萄糖的研究提供了除虫菌素前体的来源情况。除虫菌素全部是 由葡萄糖合成的。其中竹桃糖单元直接衍生自葡萄糖并且有最高的掺入量。 c a n e 等【15 】阐明：配糖体骨架是由一个支链脂肪酸为生物合成起始物与7 个乙酸盐和5 个丙酸盐头尾缩合而形成。a 组分的二甲基丁酰基衍生自异 亮氨酸，而b 组分的异丁基衍生自缬氨酸。l 异亮氨酸、l 缬氨酸通过脱 氨、转氨和脱羧作用形成支链脂肪酸。其中异亮氨酸通过草酰乙酸盐经由 已知的苏氨酸缩醛酶存在下的途径合成。 除虫菌素c 5 、c 3 7 、c 3 “位上的甲氧基已确认来自l 甲硫氨酸的甲基。 通过分离甲基转移酶突变株，证明糖苷配基c 5 位氧甲基化和竹桃糖c 3 7 、 c 3 “位上的氧甲基化需要需要不同的酶完成，纯化的b o 甲基转移酶催化 去氧除虫菌素的c 5 位上的氧甲基化而不催化c 3 7 、c 3 位上的氧甲基化这一 事实支持了这一观点。s t r e r p t o m y c e sa v e r m i t i l i s 发酵液提取物仅催化去甲 基除虫菌素c 5 位氧的甲基化，这一发现表明竹桃糖部分的甲基化发生在其 连接到糖苷配基之前，即形成完整的竹桃糖之后才与糖苷配基结合生成除 虫菌素。因此除虫菌素的合成不同于红霉素、泰乐星，后者糖部分的甲基 化是生物合成的最后步骤。 内酯中的氧原子，即c l 、c 5 、c 7 、c l3 、c 1 7 、c 1 9 和c 2 3 ( 二组分) 上 的氧来源于o 标记的乙酸盐和丙酸盐，c 2 1 的氧可能来自2 甲基丁酰基或 异丁酰基的侧链，c 6 和c 8 。之间的氧则不是，似乎是来源于分子态的氧。 1 4 1 1 糖苷及配糖体骨架的形成通过同位素标记的前体，如1 3 c 和1 4 c 标记的乙酸盐、丙酸盐、2 一甲基丁酸盐、异丁酸盐，及1 3 c 和c 标记 的蛋氨酸( m e t ) 、颉氨酸( v a l ) 和异亮氨酸( i l e ) 对除虫菌素的掺入研 究，c a n e 等【i 列阐明：配糖体骨架( 十六元环) 是从一个支链脂肪酸开始， 经过加成反应由7 个乙酸盐和5 个丙酸盐头尾缩合而成，a 组份的二甲基 丁酸基( c 2 5 n c 2 8 ) 衍生自异亮氨酸，而“b ”组份的异丁基( c 2 5 c 2 7 ) 衍 生自颉氨酸。由l i l e ，l v a l 通过0 c 支链氨基酸脱氨，转氨和脱羧作用形 成支链脂肪酸。设想这些支链氨基酸的c o a 衍生物作为乙酸及丙酸辅酶a 衍生物作为引物，类似于脂肪酸的链增长方式，乙酸c o a 和丙酸c o a 依次 结合法，最终经修饰形成糖苷配基，其中丙酰c 。a 的重要来源是琥珀酰 c 。a 异构化形成甲基丙二酰c 。a ，i l e 通过草酰乙酸盐经由己知的丙氨酸缩 4 第1 章引言 醛酶存在下的途径合成，n g u y e n 等人【1 6 l 对颉氨酸的代谢也作了比较详细 的研究，发现颉氨酸脱氢酶( v d h ) 和氨基转移酶的活性在除虫菌素的合 成过程中起了一定的作用。 通过标记b c 的葡萄糖和( n 一”c ) 标记葡萄糖进行代谢实验，阐明了 葡萄糖分子直接转化为奇墩果糖，进而合成双糖。 1 4 1 2 配糖体中氧原子的来源通过同位素标记的前体( 1 1 4 c ) ( 1 ”o ) 乙酸盐及丙酸盐，对除虫菌素的掺入表明：内酯中的氧原子来源于他o 标 记的乙酸盐和丙酸盐，c1 、c 5 、c 7 、c l3 、c l 、c19 和c 2 3 ( “2 ”) 组份仍 维持原来的同位素含量。c 2 1 的氧可能来自于2 一甲基乙酰基或异丁酰基之 侧链，但是苯并呋喃c 6 和c 8 之间的氧可能来自于其他基团，也许来自于 “分子念的氧”。 1 4 。1 3 配糖体及糖苷分子中的甲基来源大环上c 5 以及齐墩果糖上c 3 7 和 c 3 川的甲基取代物来源于蛋氨酸的甲基。采用1 4 c 甲基蛋氨酸和2 1 4 c 蛋氨 酸作掺入实验时，它们的s 甲基而不是碳骨架掺入除虫菌素，s 一甲基等量 地掺入所有3 个甲氧基。蛋氨酸来自于葡萄糖，其途径如己知的丝氨酸衍 生物的合成途径。 1 4 2 除虫菌素合成的阻断变株 通过对除虫菌素生物合成途径中的几种阻断交株的研究，并依据中间 体相互转化的关系和对突变株积累产物的分析，除虫菌素生物合成途径基 本得到了阐明。 这些突变株可以分为下述两大类型：即生物合成早期阶段突变( 6 ，8 a 闭联6 ，8 a 脱氧5 氧化除虫菌素糖苷配基的形成) 以及生物合成后期阶段 发生的突变( 形成糖苷配基后修饰配基) 。表1 1 概括了诸突变株的特征， 图1 3 为推测的除虫菌素生物合成途径。 表1 2 影响除虫菌素产品的突变异种的特点 t a b 1 2c h a r a c t e r i s t i c si 1 3 f l u e n c e da v e r m e t i n sam u t a t i o nd i f f e r e n tr a c e m u t a n tc l a s sf e r m e n t a t i o np r o d u c t s m u t a n ti r i a v e an d p l ( s ( p o l y k e t i d 霉s y n t h a s e ) a v e b a g l y c o n sg l y c o s y l a t i o n av e c a2a n db 2c o m p o n e n t s c 2 2 。2 ，d e h y d r a t i o n a v e d bc o m p o n e n t s c s 0 一m e t h y l a t i o n a v e e 6 ，8 a s e c o - 6 ，8 a - d e o x y c 6 。缸f u r a nr i n g d e r i v a t i v e s c l o s u r e a v e f a v e r x 5 - o x oa v e r m e c t i n s n d ac o m p o n e n t s c 5k e t or e d u c t i o n r e g u l a t o r yr e g i o n 河北大学理学硕士学位论文 a c e t a t e p r o p i o n a t e v e al & a l l 6 g a d e o x y - 5 - o x oa g l ybl 6 ，8 a - d e o x y 一5 0 x o - a g l yb 2 b 批e 一1 l r 5 - o x oa g l yb15 - o x oa g l yb 2 b i 瞄剖 a b 忙 a 上佻 8 2 a m a g l ya 2 曩枭 扣 上赢 图1 2 除虫菌素链霉菌中的除虫菌素的应有的生物合成路径 f i g 1 2t h el i v i n gc r e a t u r et h a ta v e r m e t i ni ns t r e p t o m y c e sa v e r m i t i l i ss h o u l dh a v e s y n t h e s i z e sp a t h 1 4 3 除虫菌素生物合成过程中单组份之间的关系 综上所述，除虫菌素有8 个组份，“a ”型与“b ”型区别在于起始物不同， 前者是i i l e ，后者是i v a l 其它部分完全一样。因而两者合成过程是相似 的。c 2 2 c 2 3 有双键的“l ”组份是由组份“2 ”脱水形成的。除虫菌素b 组份 通过除虫菌素b o 甲基转移酶可转变为“a ”组份。 1 5 除虫菌素的临床应用 自4 0 年代以来，抗蠕虫药以平均每年开发种新药的速度增长，从 4 0 年代的吩噻嗪( p h e n o t h i a z i n e ) 到7 0 年代的奥吩哒唑( o x f e n d a z o l e ) ， 抗蠕虫药的发展趋势是药效越来越强，用药剂量越来越低( 从6 0 0m g k g 下 6 第1 章引言 降到5 m g k g ) 。19 7 6 年除虫菌素( a v e r m e c t i n s ) 的发现揭开了抗蠕虫药研 究的新纪元，成为2 0 世纪最后的奇迹：其衍生物伊维菌素( i v e r m e c t i n ) 让河盲症一一盘尾丝虫病从地球上消失。 作为一种抗寄生虫药，a v m 化学结构新颖、作用机制独特。由于其优 异的驱虫活性和较高的安全性，被视为目前最为优良、应用最广泛的兽用 驱虫药，是近2 0 年来抗寄生虫药物研究中最为杰出的研究成果。a v m 在 农业中也应用广泛，特别是对防治难而危害严重的农作物害虫如螨类、斑 潜蝇、小菜蛾、棉铃虫具有显著防止效果，而且与环境相容性好，与目前 其他农药没有交互抗性。由于a v m 的广谱、高效、使用安全等诸多优点， 使其在全世界畜牧业及农业生产中获得广泛应用，极大的促进了农业和畜 牧业的发展。 其衍生物依维菌素( i v e r m e c t i ni v m ) ，已成为重要的兽药并用于治疗 人体盘尾丝虫病等寄生虫病，产品在国际上有很强的竞争力，在2 0 世纪 9 0 年代世界畅销的10 种动物用药中占首位。 虽然除虫菌素具有如此广泛的应用前景，但在我国的起步还比较晚， 市场占有率不高，因此寻求一套理想的发酵工艺变成为研究的热点。除虫 菌素产生菌存在严重的自然分化现象，虽然通过高频电子流和亚硝基胍诱 变除虫菌素可获得高发酵单位的突变株，但大多数突变株是不稳定的，经 多次传代培养后会很快丧失高产特性。在菌种选育中注意选择生长强壮的 菌株，同时配合发酵培养基的改进，进行补料和前体实验，集菌种选育与 发酵工艺于一体，从而达到提高发酵单位的目的【2 5 1 。 1 6 除虫菌素含量的主要检测方法 1 6 1 薄层色谱法( t l c ) 除虫菌素a l 、a 2 、b l 、b 2 在环己烷：异丙醇= 8 5 ：15 的体系中有较好 的分离效果，可在硅胶6 0f 2 5 4 薄层板上由紫外线照射显示清晰的4 个荧 光斑点【l 引。但这一方法不能分离a 、b 小组分，故不适用于定量分析。a i k a w a 等【1 8 】应用这一方法进行菌种的自发突变与诱变筛选，获得b l 含量较高的 突变株。 1 6 2 高效液相色谱紫外检测法( h p l c u v d ) 利用除虫菌素共轭二烯结构在k = 2 4 0 2 5 0 n m 处的强吸收可直接建立 h p l c u v 检测法。在k = 2 4 5 n m 下，纯品除虫菌素的最小检测量可低于 0 2 n g ，但在此光谱区域众多的机体内源性物质存在吸收，如皮质激素、维 生素、脂类、核酸等，其色谱行为与除虫菌素相近因而易产生干扰。所以 欲使用u v 检测法建立符合除虫菌素残留分析要求的测定方法，需要非常 河北大学理学硕士学位论文 复杂的净化过程。事实上，在己报道为数不多的h p l c - u v 检测方法中， 除测定血浆样品的方法较成功外( 检测限可达o 0 0 2 m g l ) ，对组织样品的 检测限都高于0 0 0 5 0 0 1m g k g ，难以满足残留分析需要。然而，h p l c u v 检测法仍不失为测定制剂、食物或发酵液中除虫菌素的常规方法。光二极 管阵列检测器( p d a ) 能实现对流出的色谱峰进行瞬间的全光谱扫描，同 时得到色谱峰保留值、纯度和吸收光谱方面的信息，是一种较好的检测手 段【1 ”。 1 6 3 高效液相色谱荧光衍生化检测法( h p l c f l d ) 由于直接u v 检测法的选择性和灵敏度不能满足除虫菌素残留分析要 求，科学家一直致力于研究新的检测手段。荧光衍生化检测法使检测的选 择性和灵敏度显著提高，检测限较u v 法约低1 2 个数量级，可满足除虫 菌素残留分析要求。但是，该方法对样品净化和分析操作同样要求严格， 如进行衍生化反应时样品中不能含有微量的水分、醇类或其他亲核性物质， 否则会严重影响衍生化反应的得率，导致分析结果的变异率增高。为保证 定量的准确性和重现性，分析时最好采用标准除虫菌素作为内标物 2 0 l 。 1 6 4 液质联用分析法( l c m s ) l c m s 是除虫菌素的理想确证方法，近年来已有相关文献报道。在 l c m s 中常采用的接口或离子化方式有大气压化电离( a p c i ) 、电喷雾离 子化( e s i ) 和热喷雾离子化( t s i ) 。伊维菌素的检测限一般低于 0 0 l m g k g 0 0 1 5 m g k g 。z e n g r uw u 等采用免疫亲和色谱纯化法，建立了除 虫菌素在猪肝脏中的多残留l c m s 检测法，在5 l0 0 1 x g k g 的添加水平时， 除虫菌素的平均回收率为7 4 9 4 ，伊维菌素的平均回收率为6 5 8 7 ， 对除虫菌素和伊维菌素的检测限均为5 9 9 k g 。t w a y 等最早曾试用串联质谱 ( m s m s ) 测定牛组织中伊维菌素的残留量【30 1 。 1 6 5 免疫测定法 李俊锁等建立了测定牛组织中除虫菌素残留的间接竞争酶联免疫吸附 测定法( e l i s a ) 。研究发现，不同的牛血清提取液对竞争反应的抑制作用 为乙腈( 3 4 ) 乙醇( 2 8 ) 丙酮( 3 o ) 甲醇( 2 4 ) ，所以选择甲 醇为提取溶剂较为理想。其分析过程如下：取5 m l 样品，加10 m l 甲醇， 高速捣碎2 m i n ，样品液全部转至5 0 m l 聚丙烯离心管中，以适量甲醇洗涤 刀片和捣碎杯并收集于离心管中，样品液总体积加至15 m l ，涡动混合， 超声震荡3 0 m i n ，离一t l , 5 10 m i n ，取适量上清液与等量体积的磷酸盐缓冲 液混合后直接测定。该方法样品处理简单，回收率为8 6 10 8 ， c v = 3 l7 ，检测限为0 1 0 5 i - t g k g ，适用于大批量样品中除虫菌素残 第1 章引言 留的筛选性分析1 5 引。 1 6 6 免疫色谱法 为了探讨高选择性的纯化方法，李俊锁等将免疫色谱法 ( i m m u n o c h r o m a t o g r a p h y ，i c ) 引入除虫菌素残留分析研究。该工作的意 义在于将免疫分析的高选择性与h p l c 的快速分离与检测有机结合，设计 一种新的除虫菌素分析方法。首先将抗除虫菌素抗体固定在一种惰性填料 上，制成免疫色谱柱，利用抗除虫菌素抗体选择性的捕获和浓缩杨品种的 除虫菌素，再用h p l c u v 进行测定 4 6 1 。 综上所述，目前最适用于发酵液中除虫菌素分析的方法是高效液相 紫外检测方法。 1 7 除虫菌素的衍生物 近年来，由于虫害抗药性的大量发生，对除虫菌素衍生物的研究相当 活耀。美国默克公司通过对除虫菌素结构的改造从千余个衍生物中筛选了 两个新结构的农药双氢除虫菌素( i v e r m e c t i n s ，又称伊维菌素) 【5 】和 埃玛菌素( e m a m e c t i n s ，又称甲胺基除虫菌素) 【6 】。除此以外，还有埃普 菌素( e p r i n o m e c t i n s ，又称乙酰胺基除虫菌素) 7 1 、多拉菌素( d o r a m e c t i n s ， 又称环己除虫菌素) 8 1 、5 羟亚氨基5 脱氧阿维霉菌素引、西拉菌素 ( s e l a m e c t i n s ，又称环己肟双氢除虫菌素) 【】等相继问世。这些通过化学 改造制得的衍生物，它们或杀虫活性增强，或毒性降低，或能克服虫害的 抗药性，从而提高了除虫菌素的应用效率，扩展了其应用范围。 上述除虫菌素衍生物及其相关化合物的化学结构如图1 3 所示： 多拉翁囊( 2 5 - 环已萋阿缭篱翥由嘲瑚c 蛞n 西拉蘑鬻( 缱细鼬o t i 艟) 9 河北大学理学硕士学位论文 岔 c 爱学莆馔( | 垂。一袋乙酸基爱比荫豢，c p f i 棚c t i nb “) 0 c h ， nh 辩，h j c 蝴 4 。- 表甲氮糍爱l 幺翰褒( 4 。- c p i a v c r m c c f i nb l 。) m o x i d e c t i n m i l b e m y c i nd 图1 3 除虫菌素衍生物和相关组分的化学结构 f i g 1 3t h ec h e m i s t r ys t r u c t u r eo fa v e r m e t i n 、s d e r i v a t i v e sw i t hr e l a t e ds e tc e n t 1 8 除虫菌素的发酵工艺概况 除虫菌素的发酵工艺流程大致为：4 c 冰箱保存的砂土孢子，转接于斜 面，2 8 下培养7 10 天，待生长出丰富的灰色孢子后接种于摇瓶，2 8 下 摇床培养1 d ，转接于种子罐，再于2 8 下培养1 8 - 2 4 h ，接种于发酵罐( 罐 温控制在2 7 2 8 ，罐压0 0 5 m p a ，搅拌速度2 0 0 r m i n ) ，发酵1 0 d 左右。 关于除虫菌素的发酵培养基通过实验证实，淀粉、酵母粉使除虫菌素 发酵的最合适碳源物质和氮源物质。磷酸盐对除虫菌素合成的影响比较特 殊，一般而言，磷酸盐一直刺激代谢产物的生物合成，但在实验中发现， 在发酵培养基中即使加入2 o g l 的也不会抑制除虫菌素的生物合成。 c a c 0 3 时在发酵培养基中必须加入的成分，如果在发酵培养基中不加入 c a c 0 3 ，则除虫菌素合成非常低，c a c 0 3 的作用可能与稳定p h 值有关 2 2 1 。 1 9 除虫菌素的国内外生产及市场情况 1 9 1 除虫菌素的国内生产及市场情况 大部分除虫菌素衍生物都已经形成了产业化生产。表卜2 为形成产业 化的除虫菌素类药物介绍【5 引。 截至2 0 0 4 年，我国生产的除虫菌素原料药的厂家共有8 家，其产量如 1 0 第1 章引言 表1 3 所列 1 9 1 。 表1 - 26 种已产业化除虫菌素药物 t a b 1 - 26k i n d so fa l r e a d yt h ei n d u s t r yt u r na v e r m e t i n m e d i c i n e z 称鳓薄f 皇特点防衍对象 ! 曼! 塑q ! ! ! 翌! ! 堂i ! l ! ! 坠! 型! ! ! ! 堡! 一 ! i 竖! 甜巴汹袁甜纬，简索b i杀虫诺厂湔性离广泛j j 二裔家街消化道内外各种害虫农业售皿中p 翅f 砹 a k j t r 旧：f i n 州驱虫和农j l i ! 搿出防治翅 | 馥翅i 、骥翅f 1 、糕翅| ：| 、半翅 、籀翘l l 娩 虫等 伊簿酾豢 i e r m o i n 竣局简索 e i i k i l l l “i | n 2 2 2 3 双氰化辫维对唾乳功物肌体组织渗透性增家裔体内外毛鳞线虫翘科类疑线虫超科纲趣 消裘l ! ；l 强安全性提高祷袭期延长科。尖培超抖旋尼趣科鞭l 龅科的多神线虫 4 ”表q 。胺壤- 4 ”对鳞翅 j 害! l ! 幼虫特效活性有瓣铃虫段f l 珊船胛a r m i g e r a ，秘浆俊蛾s p o d o p t e r 脱饼维掰采b 1 举i 爨艟挺岛。毒性大夫降瓿 口e x t g u a 头翅改蛾s c r l d a # i a 嘲f i j ：经蛾l k g i o t l r l = 】簸钛西u t l a ，酉箭壹吗f r a t t l l i , i e l k ；a t r i d e a t a l i j 笛 道 ? 甬采 2 5 环已烷旗甜雏利j 宠娈，扛物f 歧力汝得到对舆氏奥斯持线业d 聊f 谢玎l t e r t a g t a 黪孔打确线 d 们1 1 默1 i n 谐索b i 浆咎拄箭体内外的寄生虫骐有虫t 社忉o t r o p l ；r a 胎生嘲尾线虫d 船肼硝瞪 很癌瞥燃血率 w 蝴蝴凇眨蝇t f y p o d e m a 毛虱d a m a l i a i a 扭艚 艟 埃耳佯0 诺曲索 r 乙醚毓鹱 ”乳r 残箭遥较低删了髋裔罐縻生阑尾绂虫。捻转血矛线虫i 妇挪o g 商撼p l a r e t 。 印i m m e c i i n鹱氧斟纬阿索乳蚓缒j 1 艾氏矛线虫t r i c 鼢t r o n g t l t am 一蛇形矛线虫l 耐曲r 辨黼l ，点状甫艄线虫c 肚成t a t u 等 色拉简鬃粤磷旗( j - 肟屡伊安仑住订f 夫挺离h l 驻往魁扁甄d 麒胁n 插率犬恶丝虫d i r t 扩i l a r i ai r a q i - 一a n 砒“n ! | r 荫翥题f j 良 融袈 m ，罄跳蚤o e n o c e p k a l i d 瞵纠扛挥 表1 32 0 0 4 年度中国除虫菌素的生产厂家及其产量 t a b 1 32 0 0 4y e a r st h ep r o d u c t i o nf a c t o r yh o u s ea n di t sy i e l do ft h ec h i n e s ea v e r m e t i n 排序生产厂家 年产量( t y ) l 河北威远生物化工公司 8 0 2 华北制药集团爱诺有限公司5 0 3 浙江海正药业公司5 0 4 浙江升华拜克生物化工公司 40 5 浙江钱江生物化学公司2 5 6 齐鲁制药有限公司 l2 7 浙江康裕药业公司 l2 8 桂林集琦药业公司 12 近两年来，由于市场发展较快，上述厂家大部分都有较大的扩建，有 的地方还兴建了新厂，使国内除虫菌素原料药产量大幅度增长，生产能力 已经超过国内需求。 河北火学理学硕士学位论文 目前我国除虫菌素产品已登记8 4 个u 9 i ，其中原药占4 8 ，制剂占 9 5 2 ，在制剂中单剂占5 2 3 ，单剂的数量比混剂的稍多。混剂中以与高 效氯氰菊酯复配的为最多。除此之外，还包括含锌硫磷，敌敌畏、苏云金 杆菌等12 个品种的复合制剂。混剂具有明显增效、提高初效、扩大抗虫谱、 降低成本等优点 1 9 1 。 而且2 0 0 4 年以来我国除虫菌素产量的3 0 - 4 0 都用于出口外销，这 种出口外销呈现的特点为： ( 1 ) 出口量逐渐增加，出口价格也是逐年增高。 f 2 ) 出口区域主要集中在巴西和西班牙地区，巴西的除虫菌素主要用 于农药，西班牙主要用作兽药。 ( 3 ) 生产企业用于出1 3 的份额比自销国内的要高。 表1 4 为2 0 0 4 年一季度的出口企业构成表： 表1 42 0 0 4 年一季度的出口企业构成 t a b 1 4t h ee x i tb u s i n e s se n t e r p r i s eo ft h eq u a r t e r l yd e g r e ec o n s t i t u t e di n2 0 0 4 排序出口机构出口数量( k g )出口份额( ) l河北威远生物化：有限公司 2 ，1 1o 2 9 8 8 2华北制药集团爱诺有限公司 1 ，6 7 02 3 6 5 3浙江海正药业有限公司 l ，15 016 2 8 4浙江钱江生物化学股份有限公司8 0 011 3 3 5浙江升华拜克生物股份有限公司5 0 07 0 8 6齐鲁制药厂平阳分厂3 7 0 5 2 4 7浙江康裕生物制药有限公司3 1 04 3 9 8 深圳市奥康德生产资料有限公司 9 01 2 7 9深圳市粮油食品有限公司5 20 7 4 lo深圳市中联医药对外贸易有限公司1o0 1 4 合计7 ，0 6 21 0 0 0 0 1 9 2 除虫菌素的国外生产及市场情况 据文献报道，欧洲生物农药在未来七年将增长6 9 ，19 9 7 年销售一亿 美元，到2 0 0 4 年将达到1 6 9 亿美元，其中除虫菌素占有相当大的比例。 但是由于国外制药巨头因为环境问题、人力成本等因素转向我国等具有成 本优势的国家建设除虫菌素原料厂家，并且购买原料【4 4 1 。 1 1o 此课题的立题背景、目的及意义 1 1o 1 立题背景 ( 1 ) 生产技术背景本课题中的除虫菌素产生菌 s t r e p t o m y c i n 1 2 第1 章引言 a v e r m i t i l i s河北科技大学医学生物实验室提供( - 4 冰柜保存) 。发酵技 术以及生产技术也由河北科技大学的徐亲民高级工程师和威远生化制药集 团的李师傅、华曙制药集团的徐明琴师傅与周南师傅提供，并由徐亲民高 工和李师傅、徐明琴师傅与周南师傅亲自进行指导。 ( 2 ) 市场需求背景除虫菌素经过化学改造可以转化为伊维菌素甲胺 基除虫菌素乙酰氨基除虫菌素等原药，它们可分别应用于农业杀虫( 农药) 、 兽用驱虫、卫生用杀虫、人用驱虫等四大行业，可以制成3 0 多种新剂型， 上百种产品，市场容量极大。就现在的市场来看，年销售额可达几十亿美 元。据估计，2 0 0 2 2 0 0 6 年，随着各种新型专利的全面到期，a v m 和i v m 系列产品( 包括农药兽药医药) 的全世界年营销额可达上百亿美元。 1 1o 2 立题目的及意义 a v m 作为农药于l9 8 5 年投入市场，i v m 作为兽药于l9 81 年投入市场， 自a v m 及其系列产品上市以来，世界各国科学家及研究人员都认为它的 发现及应用是继青霉素以来抗生素科学对人类的又一巨大贡献，同时，对 除虫菌素农药的研制与开发，也成为人类研制生物农药的热点。在我国的 八五、九五和十五计划中，对a v m 和i v m 的研究仍为热点。并且近来我 国生产除虫菌素的厂家越来越多，但是这些厂家的除虫菌素菌种不稳定、 发酵单位和菌体效价普遍不高。本实验室基于这种