医学细胞生物学设计型实验——细胞核的分离与鉴定概要.ppt

医学细胞生物学设计型实验设计报告细胞核的分离与鉴定,成员：彭英、向欢欢、令狐琪琦、杨秀麟、敬昱宸、李明先,第一大组,细胞破碎的方法,实验原理,一、分离细胞质与细胞核,细胞核的分离和鉴定,.破碎细胞,机械法,物理法,化学法,高速组织捣碎机,玻璃匀浆器（匀浆）,研钵,超声匀浆器,冻融法,自溶法,表面活性剂处理法,酶处理,细胞核的分离和鉴定,在低温下，将组织块放入匀浆器，加入等渗浆介质进行研磨，破碎细胞，使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆液。,匀浆：,.离心技术,细胞核的分离和鉴定,细胞内各种结构的比重和大小等都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同介质和不同转速的离心，将细胞各种组分分级分离出来(cellfractionation)。,细胞核的分离和鉴定,离心方法,差速沉降离心法,速率区带离心法,等密度区带离心法,密度梯度区带离心法,差速离心differentialcentrifugation,细胞核的分离和鉴定,加速,低速,高速,差速沉降离心法一般用于分离沉降速度相差较大（一般为10倍）的颗粒。,细胞核的分离和鉴定,实验步骤：,1、颈椎脱臼法处死小白鼠。迅速开腹取肝，在盛有生理盐水的小烧杯中反复洗涤。,2、称取湿重约1g的肝组织，量取8ml预冷的匀浆缓冲液（0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液）并加入烧杯中，尽量剪碎肝组织。,3、将剪碎的肝组织倒入匀浆器匀浆（匀浆器下段浸入盛有冰块的小烧杯中保持低温），捣毁组织，直至看不到明显的组织块。,细胞核的分离和鉴定,4、匀浆彻底后，8层纱布过滤（先用少量匀浆缓冲液润湿纱布），滤液转移至玻璃离心管中。,5、平衡离心管，离心15min(2500r/min),将上清移入另一玻璃离心管中。取上清液制一张涂片,残余约1ml液体将沉淀吹打均匀制成悬浊液，制另一张涂片，自然干燥。,6、将涂片、用甲苯胺蓝染色10min，冲去染液晾干后，在显微镜下观察。,甲苯胺蓝是常用的人工合成染料的一种,属于醌亚胺染料类,这类染料一般含有两个发色团,一个是胺基,一个是醌型苯环,来构成色原显色。染料除有发色团外,还要有能使色原对组织及其他被染物产生亲和力的原子团即助色。助色团能促使染料产生电离成盐类,帮助发色团对组织产生染色力,使切片上的组织细胞着色。甲苯胺蓝不仅含有两个发色团,还含有两个助色团,为碱性染料,因此可以和组织细胞的酸性物质结合而使其染色。即可染细胞核使之呈蓝色。另外，肥大细胞胞质内含有肝素和组织胺等异色性物质遇到甲苯胺蓝可呈易染性紫红色，因此可用于肥大细胞的检测，例如色素性荨麻疹。,细胞核的分离和鉴定,预期结果：,细胞核的分离和鉴定,低倍镜下找到标本，再换到高倍镜，可见肝细胞的细胞核已经游离出来，圆形，被染成蓝紫色，核仁有2到4个。,实验用品,细胞核的分离和鉴定,材料：小白鼠肝脏试剂：生理盐水、0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液、1%甲苯胺蓝染液。仪器设备：显微镜、普通离心机、天平、离心管、滴管、玻璃漏斗、量筒、25毫升烧杯、解剖剪、镊子、冲洗瓶、纱布、玻璃匀浆器、载玻片、盖玻片、染色盘架。,注意事项：,细胞核的分离和鉴定,（1）尽可能充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。（2）将匀浆液过滤于离心管中后应及时离心，以防止浆液中的颗粒自然下沉过快，影响后面的离心分层效果。（3）涂片制作过程中把握好涂片的力度，不可太厚。,（4）染色后的洗涤要注意时间，不可过长，避免