（分析化学专业论文）环境中类固醇类内分泌干扰物的检测技术及其降解行为研究.pdf

山东大学博士学位论文 中文摘要 本文研究类固醇新的分析检测方法，降解行为及其环境分布，着重研究 污水处理厂的污水样品的新萃取方法及各种新的联用技术，全文分为六章： 第一章概述了内分泌干扰物与活性最强的类固醇激素的研究热点，介绍 了几种主要类固醇激素的生物功能、存在形式、环境命运和主要分析手段， 对我国内分泌干扰物的研究状况进行了综述。 第二章将t r i t o nx 1 1 4 非离子表面活性剂作为浊点萃取溶剂应用于水样中 雌激素类化合物的萃取富集，并与高效液相色谱结合，建立了这类化合物新 的小体积，高富集效率的分析方法。该方法首先使一定浓度的t r i t o n x - 1 1 4 非 离子表面活性剂与待富集的样品盐溶液混合并在水浴中平衡，离心分离，而 后弃去上层水溶液，取下层表面活性剂富集相2 0u l 直接进样，进入液相色谱 分离测定。实验优化了萃取过程中的影响因素如表面活性荆浓度、盐浓度、 平衡温度平衡时间和离心时间等。该方法对于雌激素类化合物雌酮，雌二醇， 雌三醇和孕酮的检测限分别为0 2 5 、o 3 2 、0 2 3 和5 0n gm l 。应用该方法测 定了几种环境水样如自来水、养鱼水和生活污水中雌激素类化合物的含量。 四类水样中均未测出雌激素类化合物，对雌激素进行加标回收，回收率分别 为8 1 2 9 9 5 。t r i t o n x 1 1 4 作为浊点萃取剂具有浊点温度低，密度较高， 有利于离心分离，价格低廉等优点。与传统液液萃取，固相萃取比较，整个 萃取过程不需要任何有机溶剂，是一种绿色、高效的分析方法，适合大批量、 小体积样品的快速检测。 第三章在浊点萃取雌激素的基础上继续探索浊点萃取在内分泌干扰物- 酞酸酯中的应用。预期能够在相同条件下同时富集多种内分泌干扰物。并用 于环境样品的处理。将t r i t o nx 1 1 4 非离子表面活性剂作为浊点萃取溶剂应 用于水样中酞酸酯类化合物的萃取富集，并与高效液相色谱结合，建立了这 类化合物新的分析方法。实验考察优化了萃取过程中的影响因素如表面活性 剂浓度，盐浓度，平衡温度和平衡时间等。该方法对于酞酸酯类化合物邻苯 二甲酸乙酯( d e p ) 、邻苯二甲酸乙基己酯( d e h p ) 和邻苯二甲酸环己酯( d c p ) 的检测限分别为2 0 ，3 8 ，1 0n g m l 一。应用该方法测定了环境水样如包装塑料 薄膜碎片溶出液和生活污水中酞酸酯类化合物的含量。水样中均未测出酞酸 山东大学博七学位论文 酯类化合物，对酞酸酯进行加标回收，回收率分别为8 5 8 1 0 3 2 。结果表明， 可以用同样的条件同时萃取多种内分泌干扰物，达到同时快速检测的目的。 第四章建立了一种新的超高效液相色谱( u p l c ) 与紫外光谱联用技术分离 检测水中雌酮，雌二醇，雌三醇和炔雌醇的方法。四种化合物在1 7 分钟内 可以完全达到基线分离，采用的反相色谱柱( 5 0 2 1m m ) 填料粒径为1 7 a m 。 样品先用固相萃取富集，浓缩后直接进样分析，四种雌激素化合物的回收率 都大于9 0 ，检测限在1 2 5 2 3 7n g l 间，相对标准偏差介于7 1 1 之间。该 方法成功应用于模拟自然水降解过程中雌二醇和炔雌醇的分析检测，4 8 小时 的连续监测结果显示，在该条件下，雌二醇的半衰期大约3 0 小时，炔雌醇的 半衰期大约为3 6 小时。相对常规液相色谱方法，该方法具有灵敏度高、准确 性好、操作方便的优点。适合大批量样品的快速检测和各种突发事件。对e 2 和e e 2 的动力学实验为我们的毒理实验提供了精确可靠的数据，可以指导实 验室条件下开展雌激素暴露实验的投毒帮量和频率，以提供表观浓度与实际 浓度相符的暴露环境。 第五章建立了高效、灵敏、可靠的h p l c m s m s 联用技术分离检测污水 中类固醇激素的方法，并对高碑店污水处理厂进水，出水及通惠河中类固醇 污染状况及季节变化进行了为期半年的调查研究。类固醇的含量通过高灵敏 度的h p l c m s m s 进行测定，所建方法加标回收率在7 3 9 1 之间，检测限在 o 1 1n g l 。结果表明，采集的夏、秋、冬三个季节6 批样品中，进水中所有 类固醇化合物含量都很高，浓度在3 0 6 0n g l 之间，但是经过二级处理后的所 有出水和河水中的类固醇浓度明显降低，雌酮雌三醇和睾酮是最常被检出的 物质，其浓度随季节变化呈现出规律性变化，孕酮没有检出，雌二醇、炔雌 醇和雄烯二酮也分别有几次检出。浓度在几个n g l 水平，这一浓度已经高于 雌激素对水生生物造成影响的最低浓度( 9 0 ) ，d e t e c t i o nl i m i t s ( 1 2 5 2 3 7n g l ) a n dr s d s ( 7 - 11 ) f o rt h ef o u re s t r o g e n sw e r ea l l s a t i s f a c t o r y t h ep r o p o s e d m e t h o dw a ss u c c e s s f u l l ya p p l i e di nd e t e r m i n i n gt h ed e c r e a s eo fe 2a n de e 2i n s i m u l a t i v en a t u r a lw a t e r i tw a sf o u n dt h a tw i t h i n4 8h o u r s ，t h ec o n c e n t r a t i o no f e 2d e c r e a s e dt o3 0 o fi t si n i t i a ll e v e l ( w i t hah a l f - l i f eo fa b o u t3 0h ) ，w h e r e a s e e 2d e c r e a s e dt o4 5 o fi t si n i t i a ll e v e l ( w i t hah a l f - l i f eo fa b o u t3 6h ) l o w l e v e l so fe1w e r ef o u n d ，w h i l ee 3w a su n d e t e c t a b l ed u r i n gt h ep r o c e s s i nt h ef i f t hp a r t ，c o n c e n t r a t i o n so fn a t u r a la n ds y n t h e t i ce s t r o g e n s ( e s t r i o l ， 17 p e s t r a d i o l ， 17 a e t h y n y l - e s t r o d i o l ， e s t r o n e ，1 7 a h y d r o x y p r o g e s t e r o n e a n d p r o g e s t e r o n e ) a n da n d r o g e n s ( t e s t o s t e r o n e ，e p i t e s t o s t e r o n e ，m e t h y l t e s t o s t e r o n e ， 4 - a n d r o s t e n e - 3 ，1 7 - d i o n e ) i nt h ei n f l u e n ta n de f f l u e n to ft h eo a o b e i d i a ns e w a g e t r e a t m e n tp l a n t ( b e i j i n g ，c h i n a ) a n da l o n gt h er e c e i v i n gr i v e r ，t h et o n g h u i h e r i v e rw e r ed e t e r m i n e db yh p l c - m s m s t h es a m p l e sw e r ec o l l e c t e dd u r i n gs i x m o n t h s ，s ot h es e a s o n a lv a r i a t i o n so fs t e r o i d sw e r es t u d i e di nt h er i v e r e s t r o n e ， e s t r i o la n dt e s t o s t e r o n ew e r et h ed o m i n a n tc o m p o u n d s ( d e t e c t e di na l le f f l u e n t s a m p l e s ) ，w h i l ee s t r a d i o l ，17 a e t h y n y l e s t r a d i o l a n d4 - a n d r o s t e n e - 3 ，17 - d i o n e w e r ed e t e c t e di nt w os a m p l e s ，a n dp r o g e s t e r o n ew a s h td e t e c t e di na l lt h ee f f l u e n t a n dr e c e i v i n gw a t e rs a m p l e s t h er e c o v e r i e so f t h ea n a l y t e sr a n g e df r o m7 3 t o 91 a n dt h el i m i t so fq u a n t i f i c a t i o nw e r ei nt h er a n g eo f0 1 - 1n g l t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h ec o n c e n t r a t i o n so fs t e r o i d si nw i n t e rw e r eo b v i o u s l yh i g h e rt h a n v 山东大学博士学位论文 t h o s ei ns u m m e r , w h i c hm i g h tb ec a u s e db yt e m p e r a t u r ea st h em a j o rf a c t o ri n b i o d e g r a d a t i o np r o c e s s i nt h es i x t hp a r t ，as e n s i t i v ea n da u t o m a t e dm e t h o dw a sp r e s e n t e df o rt h e d e t e r m i n a t i o no ff o u re s t r o g e n s ( e 1 ，e 2 ，e 3 ，e e 2 ) i nw a s t e w a t e rb yg c - m s e q u i p p e dw i t hap r o g r a m m a b l et e m p e r a t u r ev a p o r i z e r ( p t v - l v ) i n j e c t i o np o r t n 一0 一b i s - ( t r i m e t h y l s i l y l ) 一t r i f l u o r o a c e t m n i d e i n p y r i d i n e c o n t a i n i n g l t r i m e t h y l c h l o r o s i t a n ew a sc h o s e na sd e r i v a t i z a t i o nr e a g e n t t h ep t v i j vi n j e c t i o n s e t t i n g su s e dh e r e i nc o u l dg r e a t l yi m p r o v et h es e n s i t i v i t yo f t h ea n a l y t i c a lm e t h o d t h ep r o p o s e dm e t h o do f f e r e dd e t e c t i o nl i m i t sr a n g i n gf r o mo 1n g lt oo 3 3n g l f o rf o u rt e s t e dc o m p o u n d s ，w h i c hw a sa b o u t10t o5 0t i m e sm o r es e n s i t i v et h a n t h er e s u l t sa c h i e v e db yt h ec o n v e n t i o n a l1 t l s p l i t l e s si n j e c t i o n t h ei m p r o v e d m e t h o dw a ss u c c e s s f u l l ya p p l i e dt ot h ea n a l y s i so fe s t r o g e n si nt h ew a s t e w a t e r 、 t h er e s u l tw a sp r o v e db yh p l c m s m s k e y w o r d s ：s t e r o i d ，c l o u dp o i n te x t r a c t i o n ，u p l c ，h p l c - m s - m s ，p t v - l v v i 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本 文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标 明。本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：型型釜日期：坦1 2 ：13 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允 许论文被查阅和借阅：本人授权山东大学可以将本学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他 复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：皇型基导师签名：童盔垄：日期：士竺z ；j 山东大学博士学位论文 1 1 引言 第一章绪论 1 9 9 6 年c o l b o r n 在( o u rs t o l e nf u t u r e ) 一书中向人们展示了具有激素功 能化合物对生物体内分泌系统的干扰所造成的危害，如雌性化、发育缺陷和 生殖能力下降等。这些影响都可能最终导致种群的灭绝，引起全世界对环境 类激素问题的广泛关注。从8 0 年代开始，人们开始注意到东京西郊、英国南 部和美国弗罗里达州的野生动物出现了生殖障碍、发育异常以及雄性个体雌 性化等现象。进入2 l 世纪，安大略湖的西北部水体中的雌激素浓度达到了 5 - 6 n g l ，由此而引起的雄鱼雌性化导致了整个湖中的鱼类全部灭绝【1 1 越来 越多的调查结果表明，人类的生殖障碍、发育异常及某些癌症，如乳腺癌、 睾丸癌和卵巢癌等，与内分泌干扰物的分布水平密切相关。流行病学资料表 明，许多环境化学物质能够模拟或者干扰动物体的内分泌功能，尤其是影响 处于发育阶段的哺乳类、爬行类、鸟类以及鱼类【2 巧】。这些天然的或者人工合 成的，包括环境污染物、工业化学物质、农药以及天然植物化合物等，能通 过模拟或阻断内生激素，刺激或者抑制激素的生物效应，干扰激素的合成、 转运及清除等生物过程，或者能干扰人类或野生动物内分泌系统诸环节的正 常调控功能，从而对机体生长造成危害的化学物质，统称之为内分泌干扰物 ( e d c s ，e n d o c r i n ed i s r u p t i n gc h e m i c a l s ) 1 6 ，7 1 。 环境中内分泌干扰物质引发的一系列问题已经引起了世界各国尤其是欧 美和日本等发达国家政府、民间组织和国际组织的广泛关注。1 9 9 5 年，美国 政府设立了由环保局( e p a ) 领导的内分泌干扰物工作组( w o r k i n gg r o u p0 1 1 e d c s ) 进行e d c s 的研究。1 9 9 6 年美国国会通过两项立法( 食品质量保护法， f o o dq u a l i t yp r o t e c t i o na c t ，p u b l i cl a w1 0 4 - 1 7 0 ，和安全饮水法，u s e n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o na g e n c y 19 9 6 t h es a f ed r i n k i n gw a t e ra c ta m e n d m e n t s o f1 9 9 6 e p ap l1 0 4 1 8 2 g o v e r n m e n tp r i n t i n go f f i c e ，w a s h i n g t o n ，d c ) 督促 e p a 加强对e d c s 筛选识别方法的研究，并对环境中内分泌干扰物质如e e 2 在主要饮用水中进行检测并做出相应的生态和健康风险的评价【6 ，引。由于环境 内分泌干扰物污染范围广、影响大，对人类生存的威胁更直接，在o u rs t o l e n 山东大学博士学位论文 f u t u r e ) ) 一书中提到，西方国家将环境内分泌干扰物问题与臭氧层破坏及温室 效应相提并论，足见对其重视程度【9 j 。 随着对内分泌干扰物质研究的深入了解，类固醇激素化合物展现出更强 的内分泌干扰作用，与人工合成的化工物质相比，对生态环境影响更显著 1 0 l ， 在极低的环境浓度( 雌二醇 雌三醇【35 1 。 y a m a m o t o 等监测了市内的河流以及感潮河中的类固醇含量，结果显示，几乎 所有样品中都能测到雌酮和雄烯二酮，最高浓度分别是5 l 和6 4 n g l 1 3 6 。h u 等检测了北京河水中的雌激素( 每天大约有2 0 3 0 万吨污水处理厂出水注入) ， 发现雌酮含量为1 1 n g l ，雌二醇含量为0 2n g l 1 3 7 。 b r a g a 等对海洋沉积物中雌激素进行了研究。样品点接近一深海污水流出 口以及与此出口7k m 远的对照点。研究发现，所有样品中都有雌激素存在， 样品中的雌激素含量都在n g g 水平，与河口7k m 远的样品点雌激素浓度较 高，雌酮在o 1 6 - 1 1 7n g g ，雌二醇在o 2 2 2 1 8n g g ，炔雌酵在小于0 0 5 0 5n g g 范围内f 3 8 j 。 1 2 4 类固醇的环境命运 1 2 4 1 吸附 类固醇在水相和固体颗粒间的吸附与分配，是影响类固醇环境命运的重 要因素之一，在这方面的实验研究已经有了部分报道1 3 3 , 3 9 】。水相中的类固醇 激素可以快速结合到悬浮颗粒上，并且结合速度与各物质的l o g k o w 有关，而 7 山东大学博士学位论文 颗粒的大小和有机碳含量也能影响吸附过程【3 。雌二醇和睾酮能够与土壤颗 粒中有机质强有力的结合，从而在土壤水中不溶解或者不转移4 仉4 。l e e 等 研究了睾酮、雌激素和它们的主要转移产物( 雌酮、雄烯二酮) 在土壤中的吸附 和去吸附机理。通过测定水溶液的浓度以及吸附的母物质或者转化产物获得 吸附等温线。结果显示，这些物质在几个小时内就能达到明显的吸附平衡， 疏水性隔离是吸附机理的主导性因素，较大的l o g k o c 值( 3 4 ) 使其很难从土 壤中渗出【3 0 】。 当在污水处理厂的出水中加入n a c i 时，溶液中的雌二醇浓度显著地随盐 度升高而降低，炔雌醇几乎检测不到，当n a c i 浓度达到6 时，雌二醇也几 乎检测不到，由此得出结论，离子强度即盐度对雌激素在水溶液中的溶解有 很强的抑制作用，从而加强了雌激素在海底的沉积与吸附，迸一步对海洋生 物和生态环境造成深远的影响。s c h i c k s n u s 等也在实验室模拟实验中得出了 如下结论：雌二醇的溶解与溶液的离子强度和p h 有关【4 2 1 。 1 2 4 2 降解 即使在实验室获得的自来水中，室温太阳光照下，雌激素也会在2 4 小时 后有2 0 的降解。y i n g 等的研究表明，类固醇物质具有低挥发性而且在环境 中不稳定【4 孙。l a c o b s e n 等实验室模拟研究了在好氧条件下关于雌二醇和睾酮 在不同有机质和肥料中的最终去向，结果显示，6 天的培养实验后，在施肥 和未施肥的土壤中，分别有4 7 和3 6 的睾酮矿化成c 0 2 。在消毒土壤中， 没有矿化发生，这说明在好氧条件下，微生物降解过程是类固醇降解的主导 因素，高温比低温降解快，湿度高比湿度低降解快【“】。j u r g c n s 等的研究表明， 在自然水环境中，雌二醇在好氧条件下能够被微生物氧化成雌酮，2 0 下半 衰期从0 2 9 天不等，然后雌酮以相似的速率降解【4 5 1 。除好氧条件外，盐度 是另个影响类固醇生物降解的因素，类固醇的半衰期会随盐度的增强而延 长【4 6 1 。它们指出，类固醇在土壤孔隙水中比在地表水中降解更快，因为在这 种环境下，类固醇的停留时间较长，因此半衰期比在地表水中短。h a k k 等研 究了好氧条件下鸡肥料( 6 0 水分的混合肥料) 中雌二醇和睾酮的水萃取随时 间减少，一级降解速率常数是o 0 1 0 d ，睾酮是o 0 15d - q 4 7 1 。f a n 等研究了分 别在好氧和厌氧培养实验下，雌二醇和睾酮在农业土壤中的命运和机理，根 8 山东大学博士学位论文 据研究可以推测，在雌二醇和睾酮的降解中占主导作用的是生物过程而不是 物理化学过程f 4 8 1 。 1 2 4 3 生物可利用性与生物积累 生物可利用性与生物积累是研究毒性物质环境命运的重要指标。由于不 同的学科领域对生物可利用性涵义的理解不同。对环境科学家而言，生物可 利用性是指化学物质被吸收的能力和可能的毒性；对哺乳动物毒理学家而言， 生物可利用性是指化学物质细胞膜进入细胞内的有效性。一般溶解于水中或 水可抽提的化合物容易被生物利用，而与溶解有机物或固体颗粒相结合的物 质则不易被生物利用【4 9 税】。同时，生物可利用性也取决于化合物的暴露途径， 比如一些以含有污染物质的沉积物为栖息地或食物的底栖生物实际摄入的污 染物会明显增加【5 2 1 。f a n 等的研究发现，如果土壤中有机质含量低，类固醇 更容易萃取，相应地生物可利用性也会升高 4 s 】。但是大部分土壤中的腐殖质 含量都很高，能够与绝大部分的雌激素结合，降低了这些物质的生物可利用 性和毒性，由此使雌激素的环境风险过高地被估计。l a i 等的研究用模型预测 了在河系的水生生物中雌激素的生物累积因子和体重关系，类固醇对所有的 生物体都有生物累积作用，不过值很小【”】。在研究中发现，最大和最小的生 物累积因子分别发生在炔雌醇在最低营养级的鱼中：3 3 2 ，雌三醇在最高营养 级的鱼中：1 8 。研究还发现，类阐醇雌激素在自由生物体中的代谢速率也与 生物累积因子有很灵敏的关系，而沉积物中的类固醇激素浓度在决定深海底 无脊椎动物的累积因子值时是一个很重要因素。 1 3 废水中类固醇化合物的萃取提纯 1 3 1 样品采集与预处理 除极个别现场直接萃取样品外，一般都是把采集的样品保存在用有机溶 剂和去离子水清洗的棕色玻璃容器中【5 4 】。 对污水处理厂水样，可以采用连续和离散两种采样方式，其中连续 ( c o m p o s i t e ) 采样周期从6 个小时【5 5 1 到5 天 5 6 1 不等，这种采样方式获得的样品 是能够代表污水处理厂的典型样品，但是也要考虑到由于类固醇激素的不稳 9 山东大学博士学位论文 定性，过长的采样周期过程中的降解会带来结果的不准确；评价污水处理能 力时，离散( d i s c r e t e ) 采样一般不能很恰当地评价污水处理厂进水和出水中类 固醇激素以及外源性类固醇激素的浓度水平，但是由于受采样条件的限制和 类固醇激素的特殊性，大部分监测工作采用相对快速简便的离散采样方式。 一般来说，如果不加甲醛等保存试剂，在4 0 c 下，从采集到萃取，不应 超过4 8 小时。b a r o n t i 等人第一次监测了河水保存过程中雌激素的降解，根 据他们的研究，最好的保存方法是：样品经固相萃取后，氮气吹干固相萃取 柱，甲醇洗脱，一1 8 0 c 保存，这样便于高通量监测，保存的样品6 0 天后没 有检测到重大损失。当加入l 的甲醛保存水样时，2 4 天后没有明显损失， 但是如果不加甲醛，会有严重损失 2 1 1 。其它的作者吸取了b a r o n t i 等的方法， 加入如甲醛( 1 ，v ，v ) 【5 7 1 ，甲醇【2 5 1 ，硫酸【5 8 】，氯化汞【5 9 】等化学物质来降低细 菌活性。c u l l u m 等详细地说明了水样在加有保护试剂和没有的条件下，雌激 素的降解情况【6 0 1 。如果样品萃取后不能马上检测，也可以把样品储存在固相 萃取小柱上，氮气吹干后冷冻保存，这样有利于批量样品的处理和保存，提 高工作效率 2 5 , 5 6 1 。一般情况下，采集的样品即使能够在2 4 小时内处理，最好 也加入l 的甲醛等保护试剂，避光保存在4 0 c 下，因为整个处理过程比较漫 长，即使是加标自来水在2 4 小时后也会有2 0 一3 0 的分析物降解。 采样体积主要取决于样品来源，处理方法和检测技术。s h o r e 等用放射免 疫分析的方法分析，需要样品体积从5 0m l 一2 0l 不等，t a b a k 等用液液萃取， 气相色谱检测的方法甚至用了8 0l 水样，近几年由于l c m s m s 的使用，仪 器灵敏度能够达到低于n g m l 的范围，因此大大降低了样品体积，一般只需 要5 0 0 m l 2 l t 6 0 1 。 1 3 2 样品制备 1 3 2 1 过滤 由于废水中高含量的有机材料和悬浮颗粒物，因此过滤是样品处理的第 一步。特别是使用固相萃取方法富集样品时，因为悬浮颗粒物很容易堵塞萃 取装置，或者在用免疫方法分析时，颗粒物可能会引起不必要的抗体吸附， 所以过滤步骤是必不可少，至关重要的一步。过滤步骤可以与样品采集或者 l o 山东大学博士学位论文 萃取同步进行，也可以单独进行。主要取决于滤膜的使用，特别是实物形态( 衬 垫，萃取材料，玻璃纤维等) 的直径和过滤支持物。大部分研究都使用直径在 o 4 5 9 m 玻璃纤维膜过滤，而且过滤和萃取单独进行的更为普遍。一些实验证 明，类固醇激素和外源性类固醇激素不会保留在吸附材料上而是以溶解态存 在于水样中。加标雌二醇废水经过滤，萃取和纯化步骤后，回收率达到 9 9 【2 5 6 。 对于污水处理厂的入水，通常含大量悬浮颗粒物和杂质，不易过滤，因 此一些作者用离心分离的方式移走悬浮物代替过滤6 2 1 。当然，如果用传统的 液相萃取，就不需要任何过滤或离心分离步骤。 1 3 2 2 萃取 1 ) 液- 液( 固) 萃取法( l - l ，l s ) l l l s 常见有索氏提取法和溶剂萃取法两种，兼有富集与排除基体干 扰的效果。如u s e p a 5 0 0 6 0 4 及u s e p a 6 2 5 等系列方法大多采用此方案。 但液一液( 固) 萃取法的缺点是溶剂耗量大、样品损失也较大，环境负担重，所 以在本实验中我们只是用来萃取粘稠度较高的入水样品由于入水中含大量 悬浮颗粒物和杂质，不易过滤，也无法进行固相萃取，所以通常选择液液萃 取。虽然很少有这方面的文章，但是实验结果证实，虽然液液萃取需要大量 的有毒溶剂，如二氯甲烷，而且步骤繁琐，但是回收率在9 0 以上。萃取步 骤：取4 0 0 m l 入水于5 0 0 m l 分液漏斗中，加入4 0 m l 二氯甲烷，振荡三分钟， 静置分层，收集下层二氯甲烷萃取液，重复三次，合并萃取液，旋转蒸发， 剩下1 2m l 留待继续纯化。 2 ) 固相萃取法( s p e ) s p e 是自7 0 年代发展起来的环境样品前处理技术，主要用于环境样品分析 前的富集与净化。相对于液一液( 固) 萃取，由于s p e 采用了高效、高选择性的 固定相，所以s p e 具有低溶剂消耗、自动化操作程度高、所需费用少等特点。 一般来说，s p e 萃取所需时间为l l ( s ) 的1 1 2 ，费用为l l ( s ) 的i 5 。另外，s p e 的适用范围也较广，既可提取极性和离子类化合物，也可以提取非离子低极 性化合物。此外，s p e 处理样品量也不受限制，既可以处理小体积样品( 几m l ) ， 山东大学博士学位论文 也可以处理大容量样品( 几升到几十升) 。现今，s p e 已广泛地用于气相色谱、 液相色谱、红外光谱等各种仪器分析方法的样品前处理。 3 ) 固相微萃取( s p m e ) s p m e 是在固相萃取基础上发展起来的崭新的样品前处理技术。该方法具 有操作时间短、样品用量少、无需萃取溶剂、萃取头可重复用1 0 0 次、不同的 物质被不同的萃取头吸附后可直接进样、整个步骤操作简单等优点。但此法 一般存在分析重复性较差等缺点，其应用范围不如s p e 广。当样品量少时，可 采用此法1 6 射。 在实际操作过程中，常用的方法是离线固相萃取。固相萃取盘和柱子都 是常用的选择，两者比较，柱子容易被悬浮颗粒物堵塞，而盘的萃取速率相 对快，污染少【“】。但是考虑到其它因素，比如洗脱的有机溶剂，柱子用量相 对较少，造成较小环境问题。而且可以通过过滤除悬浮颗粒物来解决柱子堵 塞的问题。萃取柱较萃取盘还有下面一系列优势：已经存在无需人照看的洗， 活化，上样，洗，干燥，最后的洗脱全部在线完成的自动装置，可以与系统 自动化，大大节省了人力资源。所以，近几年的文献资料显示，绝大部分工 作都是采用萃取小柱完成的。 硅胶修饰的c 1 8 萃取柱 2 5 , 5 6 , 5 8 , 6 2 , 6 5 】，萃取盘 6 1 , 6 4 j ，是目前应用最广泛的 的填充材料。还有石墨化炭黑填充柱 2 1 , 6 6 , 6 7 】，s d b 柱，商业化的i s o l u te n v + 柱【17 1 ，s d b x c 盘【5 4 , 5 5 , 6 6 都有应用。近年来的o a s i sh l b ( w a t e r s ) 1 3 7 1 萃取小柱， 因其填料的高度稳定性和高的萃取效率，在萃取废水中痕量类固醇激素时， 更加受到广大环境工作者的青睐，但是价格也比普通的萃取小柱高很多。虽 然对于这几种目标分析物，这些填料的萃取效率都很高，但是最近有研究表 明，比较c 1 8 和s d b 的萃取效率，由于雌三醇有相对高的极性，所以在s d b 小柱中的保留不强，而c 1 8 可以有效萃取水中雌三醇。还有几位作者把c 1 8 和s d b 柱连接成复合柱使用，对于目标化合物得到满意的回收率【2 2 , 6 8 】，s p e 串联使用时有商品化的通用接头可供选择。 萃取的样品通常是未经处理的废水，样品中也没有调节p h 值或者没有加 入改良剂。一些例外的情况是样品中加入l - 2 甲醇，有助于s p e l 5 6 1 或者是过 滤，还有几位作者调节p h 值( 3 到5 ) t 2 2 ，5 7 ，6 2 】，这些对回收率没有大的影响。 1 2 山东大学博士学位论文 q u i n t a n a 等用o 1 m 的h c i 或者n a o h 调节废水样品p h 值在中性范围内有利 于降低腐殖酸在固相萃取柱上的保留，使萃取到的样品更干净【6 叭。 q u i n t a n a 等还考察了固相萃取柱的穿透体积：通过串联两根相同的柱子 萃取2 0 0 0 m l 加标纯水，在第二根柱子上未有检出，然后再萃取加标出水水 样，在第二根上也未有检出。但是萃取到1 5 0 0 1 6 0 0m l 时，固相萃取柱可能 会有堵塞，因此萃取的体积最好在1 0 0 0m l 以内【6 9 1 。一般情况下，上样速率 保持在1 0 一2 0m l m i n 左右。萃取结束后，用1 0m l 去离子水清洗萃取柱。 接下来的干燥步骤，不管用氮气还是空气，都没有导致损失的报道。通常在 不超过4 0 0 c 的条件下用普氮吹一个小时。 洗脱溶剂的选择和溶剂的体积，洗脱的步骤主要取决于吸附材料和萃取 结构( 盘或者柱) 。这里我们以现在通用的萃取柱为例，一般的洗脱试剂有纯甲 醇，乙腈，乙酸乙酯，二氯甲烷，或者是两种按一定比例的混合物。太强的 洗脱溶剂既可将分析物洗脱下来，也可能将较多的杂质同时洗脱下来，干扰 后续测定。有时为了得到干净的洗脱溶液，宁愿选择较弱的溶剂，使用较大 体积的溶剂将分析物洗脱后，再用氮气吹干。只要体积超过5m l ，回收率一 般都在9 0 以上【3 7 ，5 7 1 。 1 3 2 3 纯化 这些从废水中萃取的物质在分析检测前需要进一步的纯化，包括液液萃 取，固相萃取等。常用的有硅酸镁( f l o r i s i l ) 填充柱，具有离净化效果，能够有 效去除油脂和色素；硅胶( s i l i c a ) 填充柱，用于分离非极性、弱极性化合物和 油脂等，特别是结构相似的上述物质；氨基柱( n h 2 ) 【3 7 1 ，是以硅胶为基质的氨 丙基萃取柱，可以用于去除样品中的磺酸根等强阴离子；还有一种与n h 2 相 似的吸附柱p s a ，有两个氨基修饰，能够有效去除有机酸、色素、金属离子和 酚类，因此p s a 更适合孕激素和雄激素类没有酚基的类固醇物质，对于雌激 素会降低回收率；还有作者用凝胶渗透色谱【6 0 1 和高效液相色谱馏分5 6 1 以及 这些柱子串联在一起的复合柱 2 5 , 5 5 】。检测废水中这些痕量化合物，通常需要 三步纯化步骤，如果没有纯化步骤，只有通过生物方法检测才能获得满意的 检测限【6 2 6 4 1 ，还有一些研究者用石墨化炭黑萃取柱固相萃取，l c m s m s 分 析检澳1 2 1 , 6 6 , 6 7 1 。根据已经建立的可靠方法，如果只用f l o r i s i l 填充柱纯化萃取 1 3 山东大学博士学位论文 的物质，干扰很明显，即使加标5n g l 富集1 0 0 0 倍的实际废水样品用 l c - m s m s 也无法检测到。所以一般都会再加步氨基柱纯化，进一步去除 腐殖酸和色素，方法的检测限也可以降低到低于n g l 的水平。因此也使分析 方法更加繁琐，耗时。c u l l u m 等把固相萃取的分析物用正相制备色谱收集一 定波长下馏分的方法纯化，然后用体积排阻色谱收集馏分进一步纯化，得到 了很好的回收率和纯化效果1 6 们。在分析环境水样时，一般都包括这几个纯化 步骤| 1 9 , 2 1 , 2 l 2 6 , 3 7 5 7 , 7 0 7 1 , 7 2 l 。 1 3 2 4 浓缩 溶剂交换或者是为了达到整个方法的高灵敏度，萃取液通常需要浓缩， 一般在一个完整的分析步骤中，会有几次浓缩过程。根据要被浓缩的萃取物 体积和温度( 一般不高于4 0 0 c ) 选择旋转蒸发或者氮气吹千。虽然b a r o r , t i 等报 道了如果萃取物完全变干后，会有分析物的损失【2 ，但是h u a n g 等获得了满 意的回收率，作出了最终的结论：吹干步骤损失很小，所以浓缩步骤对于分 析类固醇激素并不是决定性的【6 4 1 。 尽管如此，应该谨慎对待，使损失最小化；这包括控制氮气流量，防止 光照( 避免光降解) ，不要长时间的不完全干燥放置( 因为类固醇激素在水中容 易降解1 。 1 4 废水中类固醇的分析技术 检测废水中的类固醇激素常用的方法包括生物技术和气相色谱质谱 联用以及越来越多的液相色谱- 质谱联用。所有技术都有其优缺点。下面就目 前存在的方法做一介绍。 1 4 1 生物技术 放射性免疫法和酶联免疫法虽然灵敏度比较高，但是放射性免疫法容易 受样品中共存物质，特别是和类固醇激素具有类似结构物质的干扰，使检测 结果不准确；酶联免疫法必须在分析前应用萃取技术，去除复杂的环境母体 背景所造成的干扰，这就对萃取技术提出很高的要求，操作复杂，而且酶联 免疫实验对实验操作要求严格，影响因素多，实验成功率低。 1 4 山东大学博士学位论文 h u a n g 等【6 4 】用酶联免疫的方法检测污水处理厂出水中雌二醇，炔雌醇以 及雌二醇的糖基化复合物和硫酸盐复合物，前处理包括c 1 8 萃取，酶水解， h p l c 制备柱馏分。用多克隆抗体检测雌二醇和炔雌醇与另外几种雌激素的 交叉反应率小于1 ，测定波长为吸收：6 3 0 n m ，发射：4 5 0n m ，方法检测限 0 1n g l 。s h i s h i d a 等报道了相似的方法，检测半工业试验规模的污水处理厂 出水中的雌二醇，具有略低的检测刚6 5 】。用s e p p a k c l 8 柱萃取后，方法的检 测限达到l on g l 。t s c h m e l a k 等用选择性的生物传感器检测雌酮，检测限达 到1 4n g l t 7 3 】。s n y d e r 等用免疫方法检测了废水出水中的雌二醇和炔雌醇， 样品是经s d b 盘固相萃取，h p l c 制备柱获得的馏分，该方法检测限达到 p g l - 1 f 5 4 1 。测定雌二醇的抗体血清与雌酮的交叉反应率1 1 2 ，雌三醇是1 7 ， 炔雌醇等0 1 。炔雌醇的抗体血清与雌二醇的交叉反应率小于0 1 3 ，炔诺酮 ( 一种口服避孕药) 小于o 】。s h o r e 等用放射免疫的方法检测废水进水和出水 中的雌二醇，样品经c 1 8 萃取，由于雌二酵的抗体与雌酮的交叉反应为2 5 ， 导致测得的雌激素水平在每升n m o l 或p m o l 水平，检测限为2n g l - 1 1 3 4 1 虽然有以上报道，但是到目前为止，还没有很完善的生物技术用来检测 废水中的类固醇激素，其更多应用在生物样品和体液的分析检测。 1 4 2 液相色谱 从1 9 0 3 年俄国植物学家t s w e r 发表了吸附色谱分离植物色素的论文至今， 色谱技术已经发展了一百多年，特别是6 0 年代现代液相色谱技术的问世，使 其在生命科学、药物化学、食品卫生、环境化学等诸多领域得到了广泛的应 用。经过3 0 多年的发展，现代高效液相色谱技术得到了不断的完善和改进， 在输液泵、检测器、色谱柱及数据控制和处理系统等方面采用了许多高科技 技术，使泵的稳定性和重复性、检测器的灵敏度和检出能力、色谱柱的分离 效能和应用范围及数据处理软件的智能化得到了很大的提高。 1 4 2 1 高效液相色谱技术f f i p l c ) 高效液相色谱法已经成为分析领域中最重要的仪器分析方法之一，越来 越多的应用于生物、化工、制药、环境、食品等多个领域的分析。紫外可见 光检测器和二极管阵列检测器是一种对在紫外，可见区有吸收的化台物进行 1 5 山东大学博士学位论文 检测的常用检测器。h p l c - u v 是最常规，普通，应用也最广泛的仪器。分析 物一般有共轭双键或芳环等基团，对特定波长处的紫外光有吸收，这样可同 时对分离组分进行定性和定量分析，直接得到有效信息。电化学检测器和荧 光检测器也有很多应用，所选用的有机溶剂流动相通常是甲醇或者乙腈和水 的混合溶液。这两种流动相体系的紫外吸收波长多小于2 0 0 r i m ，一般不影响 普通类固酵物质的检测。 一般分离都是在o d s ，z o r b a r x ，x b r i d g e 等色谱柱上，l o p c zd ea l d a 等人用二极管阵列紫外检测器检测了各种水中雌激素和孕激素，样品用在线 固相萃取的方法富集，获得了满意的结果【5 8 1 。蔡亚歧等用亲水性c 1 6 极性硅 胶反相色谱柱分离测定血清样品中的四种常见雌激素，也得到了满意的结果。 但是由于废水机体复杂，干扰明显，紫外检测器在定性时不太准确，所以液 质联用更为普遍可靠。 1 4 2 2 超高效液相色谱技术( u p l c ) 环境样品大多成分复杂，含量很低，用h p l c 分析时，分析时间往往很长， 分离能力和灵敏度不尽人意。因此高灵敏度、高选择性、高通量和高准确性 是需要解决的重要问题。为了提高液相色谱的分离性能，色谱工作者对液相 色谱的性能一直不断的进行改进，色谱填料和仪器都得到了发展。超高效液 相色谱( u l t r ap e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ) 技术的出现是整个液相色谱 的一场技术革命。大幅度地改善了液相色谱的分离度、样品通量和灵敏度。 使用1 7 肛m 粒径的色谱柱，柱长可以比用5t i m 粒径时缩短3 倍而保持柱效不 变，由此分离时间也可以根据实际样品的特点成倍地减少。根据范式方程， 颗粒度愈小，柱效愈高，而更小的颗粒使最高柱效点向更高流速方向移动， 而且有更宽的线速度范围。但是随着粒径的减小柱压降急剧增加，对填料及 仪器的耐压都有非常高的要求，压力大始终制约着小粒径填料的应用。而 u p l c 解决了压力问题，使系统死体积更小，分离更加快速高效。 目前u p l c 在环境领域的应用正在起步中。由于出峰时间快，对检测器的 扫描频率要求更高，因此能与u p l c 联用的商品化检测