（茶学专业论文）普洱茶多酚氧化产物的提取分离、成分分析及活性评价.pdf

昔洱茶多酚氧化产物提取分离及活性评价 英文缩写词语表 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 压 如需保密，解密时间年 月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究1 - 作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同2 r - 作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究蚴：数客帆，卜，月衫日 学位论文使用授权书 本人完全了解。华中农业大学关于保存，使用学位论文的规定”，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，* - 7 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇 编学位论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论 文的全部或部分内容 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书 撇槲张像鬈摊名：【渺 签名日期： 却年f 月 1 日 签名日期： 曰年月 - 4 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 普洱茶多酚氧化产物提取分离及活性评价 摘要 普洱茶属于后发酵茶，是我国特有的一类茶，有很大的市场发展潜力。本实验 首次以云南野生大茶树原料制作的普洱茶为材料，对普洱茶多酚氧化产物的提取分 离工艺进行了研究，并探索其降血脂、抗氧化的功能，旨在系统、全面地研究和科 学地评价普洱茶，为普洱茶深加工技术改进和产业化发展提供理论支持，为普洱茶 功能食品的开发提供科学依据。 1 普洱茶多酚氧化产物浸提工艺的研究及其提取物主要品质成分分析 以普洱茶为原料，研究溶剂p r i 值、浸提温度、时间、料液比对茶褐素( t b s ) 提取率的影响。结果表明，溶剂p h 值、浸提温度、时间、料液比等都显著影响t b s 的浸提效果，其中料液比、浸提温度、浸提时间达到了极显著水平，其影响效果的 重要性依次为：料液比 浸提温度 浸提时间 溶剂p h 值。同时得到茶褐素浸提 的优化条件为：温度1 0 0 ，溶剂p h = 7 ，料液比l ：3 0 ，时间2 0 m i n 。 发酵是影响普洱茶品质成分变化的主要原因。普洱茶所含的化学成分与其原料 相比差异较大，普洱茶中茶多酚、没食子酸、氨基酸( 尤其是茶氨酸) 含量远低于 晒青绿茶，茶黄素、茶红素、茶褐素含量以及可溶性糖含量则高于晒青绿茶。茶多 酚在普洱茶中主要以简单儿茶素的形式存在，而在晒青绿茶中则主要以酯型儿茶素 形式存在。主要品质成分没食子酸、茶氨酸和咖啡碱在普洱茶多酚氧化产物中的分 布差异较大。没食子酸主要存在于t f s ，茶氨酸主要存在于t r s 和t b s ，咖啡碱主 要存在于t f s 和t r s 。 2 普洱茶及其多酚氧化产物的降血脂功能研究 以晒青绿茶提取物( g e ) 为对照，分别以高、中、低不同剂量的普洱茶水提物 ( p e ) 、茶黄素( s ) 、茶红素( 1 r i 塔) 和茶褐素( i b s ) 灌胃高脂模型小鼠，4 0 天后眼眶取血、分离肝组织，测血脂指标。结果表明： ( 1 ) 普洱茶及其多酚氧化产物能有效调节预防性高脂小鼠血清血脂水平。t b s 中高剂量、p e 各剂量对高脂小鼠血清t c 含量有极显著的降低作用。t r s 、t b s 、 p e 各剂量组都能极显著的降低小鼠血清t g 含量，普洱茶效果好于其多酚氧化产物。 除p e 中低剂量组外其他供试品各剂量组均能极显著的增加h d l - c 含量，t f s 、t r s 组效果最好。 ( 2 ) 普洱茶及其多酚氧化产物对预防型高脂小鼠肝匀浆血脂调节作用主要体现 于t g 、t c 含量的降低。t r s 各剂量组，p e 各剂量组能有效预防肝匀浆中t c 升高， 除t r s 高剂量外其余各组都显著降低肝匀浆中t g 含量，且茶汤提取物效果较其他 单独多酚氧化产物效果显著。小鼠肝脏切片显示，灌胃组能有效防止高脂肝细胞正 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 常组织结构消失程度。 ( 3 ) 普洱茶原料晒青绿茶降低血脂的效果优于普洱茶。表现在晒青绿茶组t c 、 t g 含量最低，并且比普洱茶及其多酚氧化产物明显降低血清t c 含量。 3 普洱茶及其多酚氧化产物的抗氧化活性研究 按上述同样的方法分析普洱茶及其多酚氧化产物的体内外抗氧化作用。结果表 明： ( 1 ) 普洱茶及其多酚氧化产物能显著增强预防型高脂小鼠血清及肝脏的抗氧化 功能。p e 组，t b s 高剂量组、t f s 中剂量组能极显著提高血清s o d 活力，各供试 组均能极显著地提高肝脏s o d 活力。各供试组都能极显著的降低血清m d a 含量， 其中以t r s 对小鼠血清m d a 生成影响最显著，但在肝脏中仅p e 高剂量组能有效 降低m d a 含量。 ( 2 ) 普洱茶及其多酚氧化产物在体外对0 2 自由基有较强的清除活性。其清 除0 2 。自由基的成份主要集中在t f s 部分，清除能力大小依次为邛s 1 r s t b s p e 。 ( 3 ) 绿茶的抗氧化活性优于普洱茶。主要表现在体内能显著提高预防性高脂 小鼠s o d 活力，降低m d a 含量，体钋对0 2 。自由基有较强的清除能力。 关键词：普洱茶；多酚氧化产物；提取分离；降血脂；抗氧化 2 苎墨茎垩坠整些主塑丝坚坌塞墨重丝堡竺 a b s t r a c t p u e rt e ai sp o s tf e r m e n t e dt e a , as p e c i a lt e aw i t hm u c hm a r k e t d e v e l o p i n g p o t e n t i a li nc h i n a n 他m e t h o do f e x t r a c t i o na n di s o l a t i o no f p o l y p h e n o lo x i d e s 丘o m p u e l t e aw a ss t u d i e di nm yp r o j e c t ；a l s ow es t u d i e di t se f f e c to nr a t sb l o o dl i p i d sa n d a n t i o x i d a n tc a p a c i t y t 陆si st h ef i r s te x p e r i m e n to nt h em a t e r i a lo fy u n n a nw i l dt e a r a w i no r d e rt os t u d yi tc o m p r e h e n s i v e l y , e v a l u a t ei ts c i e n t i f i c a l l y , a n dp r o v i d e i m e n s i v ep r o c e s s i n gt e c h n o l o g ya n di n d u s t r i a ld e v e l o p m e n tt h e o r i e s a l s ow em a y g m d et h ed e v e l o p m e n to f f u n c t i o n a lf o o d s ，t h ec o n s u m e r s c h o i c ea n dt h et e a c o n 筒h n e rm a r k e t 1 s t u d yo re x t r a c t i o nt e c h n o l o g yo fp o l y p h e n o lo x i d e sa n dm a i nq u a f i t y c o m p o n e n tf r o mp u e rt e a t h ei n f l u e n c eo fp hv a l u eo fs o l v e n t , t e m p e r a t u r e , h e a t i n gt i m ea n dr a t i oo ft e a t os o l v e n to ne x t r a c t i o nr a t eo ft b sw a ss t u d i e d 1 1 壕r e s u l t ss h o w e dt h a ta n p a r a m e t e r sa f f e c t e dt h ee x t r a c t i o nr a t en o t i c e a b l y ，a n dt h ee f f e c t s o fl a s tt h r e e p a r a m e t e r sw a se x t r e m e l yr e m a r k a b l e 1 1 坼o r d e ro fi m p o r t a n c ew a s r a t i oo ft e at o s o l v e n t t e m p e r a t u r e h e a t i n g t i m e p h v a l u e o f s o l v e n t t h e o p t i m i z e d p a r a m e t e r s w 啪：u s i n gp h = 7 w a t e rs o l u t i o na se x t r a c ts o l v e n t , t h er a t i oo f t e at os o l v e n tw a s1 ：3 0 ， a n de x t r a c t i n ga t1 0 0 。cf o r2 0 m i n f e r m e n t a t i o nw a st h em a i ni n f l u e n c ef a c t o ro fp u e rt e aq u a l i t y p u e rt e a c h e m i c a lc o n t e n t sh a dm u c hd i f f e r e n c ew i t hi t sm a t e r i a lr a w t e ap o l y p h e n o l ，g a l l i c a c i d , a n l i n oa c i d s ( i np a r t i c u l a rt h e a n i n e ) w a sm u c hl o w e ri np u e l t e a , w h i l et f s ， t r s t b sa n ds o l u b l es u g a rc o n t e n tw a sh i g h e rt h a nt h ed r y i n gg r e e nt e a 硼km a i n c a t e c h i n so fp u e rt e aw e r es i m p l ee a t e c h i n s ，w h i l et h ed r y i n gg r e e nt e ac a t e c h i n s w 讯c o m p l e xe a t e e h i n s t h ed i s t r i b u t i o no f g a l l i ca c i d , t h e a n i n ea n dc a f f e i n ei np u e r t e ap o l y p h e n o lo x i d e sw a s q u i td i f f e r e n c e g a l l i ca c i dw a sf o u n dp r i m a r i l yi nt h et f s ， w h i l et h e a n i n ei nt h et r sa n dt b s a n dc a f f e i n ei nt h et f sa n dt r s 2 s t u d yo rp u e rt e aa n di t sp o l y p h e n o lo x i d e so nr e d u c i n gb l o o df i p i d s u s i n gt h ed r y i n gg r e e nt e ae x t r a c t i o n ( g e ) 鹤ac o n t r o l ，h y p e r l i p i d e m i am o d e l m i c ew e r ci n t r a g a s t r i ci n f u s i o nw i t hd i f f e r e n td o s eo f t f s ，t r s ，t b s ，p ea n dg ef o r 4 0d a y s a f t e rl a s ta d m i n i s t r a t i o n , h em i c ew e 坞f a s t e da tl e a s t1 0h o m s ，a n dt h e nt h e y w e r os a c r i f i c e db yc e r v i c a ld i s l o c a t i o n 瓢强啪w a sp r e p a r e df r o mb l o o do b t a i n e di n e y ev e i nc l u s t e ra n dt c t g h d l - c , m d aa n ds o dw e r ea s s a y e d ；n 把l i v e rw a s h o m o g e n i z e di np h y s i o l o g ys a l i n ea n dt c ，t gm d a a n ds o dw e r ea s s a y e d 1 1 圮 r e s u l t sw 啪s h o w e d ： ( 1 ) p u e rt e aa n di t sp o l y p h e n o lo x i d e sc a nb ee f f e c t i v e l yr e g u l a t e dp r e v e n t i v e h i g hf a tm i c e 姗l i p i dl e v e l t b sw i t hm e d i - d 0 ，h i g h - d o s ea n de a c hd o s eo fp e 3 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 c o u l dr m a r k a b l yd e 溯s et h ec o n t e n to ft c ；t r s t b sa n dp ea ta l ld o s 档c o u l d s i g n i f i c a n t l yl o w e rt h ec o n t e n to ft gt h ee f f e c to fp u 盯t e aw a sb e t t e rt h a ni t s p o l y p h e n o lo x i d e s ；a l lt h et a s t e ds a m p l e sc o u l di n c r e a s eh d 卜cc o n t e n t so f 辩舢 s i g n i f i c a n t l ye x c e p tp em e d i - d o s ea n dl o wd o s e ，a n dt h ee t f e e to ft f s ，t r sw a s b e t t e rt h a no t h e r s ( 2 ) n 圯r e g u l a t i v ee f f e c to i lh i g h - f a tm i c el i v e ro fp u 盯t a n di t sp o l y p h e n o l o x i d e sw a sm a i n l yr e f l e c t e di nt h ed e c r e a s e do ft qt cc o n t e n t ；e a c hd o s eo ft r s a n dp ec o u l dp r e v e n tt h ei n c l c a f l eo ft cc o n t e n te f f e c t u a l l yo nt h el i v e ro fh i g h - f a t m i c e ，a n da l ld o s e so ft a s t e ds a m p l e se x c e p th i g l ld o s eo ft r sc o u l ds i g n i f i c a n t l y r e d u c e dl i v e rt r i g l y e e r i d ec o n t e n to f h i o , - 衄d i e tm i c e a n dt h ee f f e c to f p ew f l , sb e t t e r t h a ni t sp o l y p h e n o lo x i d e s n 地l i v e rb i o p s yo fh i g h - f a tg r o u ps h o w e dt h a t ：t h e e x p e r i m e n t a lg r o u p sc a l lb ee f f e c t i v ei np r e v e n t i n gt h ed i s a p p e a re x t e n to fh i g h - c e l l s o f n o r m a ll i v e rs t l l l c t u t e ( 3 ) t l a eg r e e nt e ah a dm o e f f e c to nr e d u c i n gb l o o dl i p i d st h a np u e rt e a a st h e g eg r o u ph a dt h el o w e s tc o n t e n to ft ca n dt ga n dg ec a l lr e d u c et h et cc o n t e n t m u e l am o l es i g n i f i c a n t l yt h a no t h e l s a m p l e s 3 t h ee t t e e to f p u e l t e aa n di t sp o l y p l a e n o lo x i d e so na n t i o x i d a n ta b i l i t y 1 1 a n t i o x i d a n ta c t i v i t yo ft f s ，t r s ，t b s ，t aa n dg r e e nt e ae x t r a c t s 嘲 s t u d i e d 1 1 舱r e s u l t ss h o w e d ： ( 1 ) p u e rt e aa n di t sp o l y p h e n o lo x i d e sc l t l ns i g n i f i c a n t l ye n h a n c et h ep r e v e n t i v e h l g h - f a tm o u f l es e r u ma n dl i v e ra n t i o x i d a n tf u l l c t i o n p eg r o u p ，t b sm e d i - d o s e ， h i g h - d o s eg r o u p s ，t f sm e d i - d o s eg r o u pc o u l ds i g n i f i c a n t l yi n c r e a s et h es o da c t i v i t y o fs e r u m , a n da l lt h es a m p l e sc o u l ds i g n i f i c a n t l yr a i s et h es o da c t i v i t yo fl i v e r a l l t h et e s tg r o u p sc i l ns i g n i f i c a n t l yr e d u c et h ec o n t e n to fm d ai ns e l - u m ，a n dt r sh a d t h em o s ts i g n i f i c a n ti m p a c t , b u to n l yh i g h - d o s eo fp ec o u l de f f e c t i v e l yr e d u c et h e c o n t e n to f l v i d a s i g n i f i c a n t l yi nt h e l i v e r ( 2 ) l u e rt e aa n di t sp o l y p l a e n o lh a ds t r o n ga c t i v i t yi nv i t r oo x i d e so f0 2 一r a d i c a l s c a v e n g i n g 1 1 地r e m o v a lo fo x y g e n - f l e er a d i c a l si n g r e d i e n t sm a i n l yc o n c e n t r l l t e d i n t h et f s t h eo r d e ro f r e m o v i n ga b i l i t yw a s ：t f s 1 1 良s t b s p e ( 3 ) a n t i o x i d a n ta c t i v i t yo fg r e e nt e aw 鹤姗t h a nt h ep u e l t e a m a i n l y b c c a l l s eo f t h a ti tc a l ls i g n i f i c a n t l yi m p r o v et h es o d a c t i v i t ya n dl o w e rm d a c o n t e n t o f p r e v e n t i v eh i g l af a tm i c ei nt h eb o d y , a n di t ss t r o n gs c a v e n g i n gc a p a c i t yo f 0 2 - k e y w o r d s ：p u ，钟t e a ；p o l y p h e n o lo x i d e s ；e x t r a c t i o n ；a n t i l i p e m i e ；a n t i o x i d a n t 4 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 第一章文献综述 普洱茶是以云南大叶种茶树鲜叶经杀青、揉捻、日晒等工序制成的晒青毛茶 为原料，再经发酵、蒸压制成各种形状的成品茶，原产于我国云南西双版纳地区， i 司早期集散地在云南普洱县而得名，是一类具有独特内质风格和文化内涵的特种 茶。普洱茶具有消食去腻、减肥防龋、降血脂、降低胆固醇等多种保健功能，被 世人冠以“减肥茶”、“窈窕茶”、“益寿茶”等美称。近年来，普洱茶年产销量直 线增长，其增长幅度为我国各特种茶之冠。 1 普洱茶品质特征及影响因素 普洱茶分为散茶和蒸压成型两大类，属于后发酵茶。普洱散茶外形条索肥硕 壮实，色泽褐红( 俗称“猪肝色 ) ，或带灰白色。压制的普洱茶是用晒青毛茶或普 洱散茶经蒸压做形而成，前者又称生普，后者称熟普。依形状不同，可分为碗形 普洱茶，长方形的普洱砖茶和圆形的七子饼茶等( 周红杰，1 9 9 7 ) 。 普洱茶的内质汤色红浓，具独陈香，滋味纯和。罗龙新( 1 9 9 5 ) 等对不同产 地普洱茶品质的风格比较研究表明，广东、广西的普洱茶外形多呈黑褐色。条索 较紧细，云南普洱茶外形肥壮，色泽呈棕红褐色，越南河江茶外形色泽与两广的 相似，但条索粗松肥壮，含梗量较高，内质上云南大叶种更耐冲泡。从普洱茶色、 香、味、形品质特点来看，一般人们认为普洱茶越陈，品质越佳，并把它作为衡 量普洱茶品质优良的重要指标，也是普洱茶与其它茶类的最大区别之处 普洱茶品质形成是加工工艺的特殊性决定的，渥堆是普洱茶品质形成的关 键。在渥堆过程中形成的霉菌和酵母菌以及黑曲霉是导致普洱茶品质变化的主要 霉菌。普洱茶加工中优势菌的产生是由于在堆积发酵过程中水分逐步蒸发减少， 酸度增加，营造了微生物活动良好的环境。其旺盛代谢活动所产生的热促使雄温 升高，进而又促进了微生物自身的繁殖生长( 邓时海，1 9 9 4 ) 。普洱茶加工过程 中温湿度的变化，是影响微生物数量消长的主要因素，同时对普洱茶醇、厚、甘、 甜、滑等品质特点的形成也密切相关( 罗龙新，1 9 9 5 ) 。 普洱茶因其独特的加工工艺，酚类物质的组成与其它茶类比较有很大区别。 吕海鹏( 2 0 0 5 ) 对普洱茶的化学成分进行分析，发现普洱茶中的茶多酚含量明显 低于绿茶和红茶，但普洱茶中的表儿茶素( e c ) 含量高于红茶和绿茶，而且普 洱茶中的儿茶素以非酯型儿茶素为主。折改梅等( 2 0 0 5 ) 对普洱茶的化学研究结 果也表明，与其原料晒青毛茶相比较，普洱茶的没食子酸含量显著增加。吕海鹏 还利用d p p h 方法检测乙酸乙酯萃取层中所分离化合物的抗氧化活性，发现没食 子酸清除自由基的活性最强，因此认为没食子酸是普洱茶重要的活性成分之一。 普洱茶的品质还受鲜叶原料和加工环境影响。因为普洱茶加工过程中茶叶的 老嫩、气温、空气湿度、季节、发酵场地、发酵茶叶水分不同，品质形成是不同 6 普洱茶多酚氧化产物提取分离及活性评价 的，且即使同种原料在不同地域加工品质也是不同的，这也是普洱茶之特殊性所 在( 周红杰，2 0 0 3 ) 。 2 多酚氧化产物提取分离研究进展 由于茶多酚及儿茶素单体较好的保健功能，其化学、生物活性研究已经比较 系统深入。茶多酚进一步氧化形成了复杂的聚合产物，主要是一些色素类物质。 而对这些多酚氧化聚合产物的研究相对较少，特别是普洱茶中的多酚氧化聚合产 物的研究更是鲜为涉及。近年来，有研究表明这些多酚类氧化产物有可能比儿茶 素具有更强的生物活性，因而也引起不少专家的兴趣。 2 。1 茶黄素的提取分离 2 1 1 茶黄素粗提取物的制备 茶黄素粗提物的提取主要有c o l l i e r 法和u l l a h 法。 c o l l i e r 法是指茶样用热水浸提( 8 0 1 2 ，s h a h ) ，浸提液过滤、浓缩、冷冻干燥，所 得的水可溶性物质用甲醇、水( 体积比3 ：1 ) 溶解，再用三氯甲烷萃取。除去咖啡 碱( c a f ) 等杂质。水相减压浓缩，除去甲醇( c m o h ) 和三氯甲烷( c n c u ) 。用乙酸 乙酯反复萃取5 次，萃取液用硫酸镁( m g s 0 4 ) 脱水，3 0 下蒸馏至干，得到茶黄 素粗提物。该方法工艺技术比较简单，但是有机溶剂用量多。 u l l a l l 法是用适量的磷酸二氢钠与乙酸乙酯混合萃取，茶红素能全部被固定 在水相中，而茶黄素被固定在有机相中。红碎茶用沸水浸提1 0 m i n ( 9 0 y 3 ) ，过滤， 滤液减压浓缩，三氯甲烷萃取，除去咖啡碱等杂质，然后用磷酸二氢钠( n a h 2 p 0 4 ) 和乙酸乙酯混合萃取3 次，乙酸乙酯层经减压浓缩干燥，得茶黄素粗提物。该方 法简单，只需1 次萃取就可较好地分离茶黄素。 2 1 2 茶黄素的分离纯化 自从r o b e r t s e a h 发现茶黄素以来，已经进行了许多茶黄素的提取和分离纯 化的研究。2 0 世纪5 0 、6 0 年代，b r a d f i l e d v u a t a z 、r o b e r t s 等曾用硅胶纤维层析 和纸层析对红茶多酚物质进行分离纯化获得茶黄素没食子酸酯纯品。c r i s p i n 等 ( 1 9 6 8 ) 提出s e p h a d e x l h - 2 0 柱层析是一种有效的分析方法，丙酮梯度淋洗分离 红茶中茶黄素，可分离出3 个峰，达到分离纯化效果，后来不少人使用此法分离 红茶色素。但是s e p h a d c x l h - 2 0 柱层析法成本高，分离时间长，并且多次使用时 会造成不可逆吸附，分离效果变差。江和源等( 2 0 0 0 ) 用高速逆流色谱法分离茶 黄素，茶黄素的4 种主要成分均能得到有效分离。 茶黄素的分离提取方法，一般采用热水提取，乙酸乙酯转溶，然后用 s e p h a d e x l h - 2 0 柱层析分离，茶黄素异构体再辅以制备性纸色谱分离，分离物可 再利用s e p h a d e x l h - 2 0 柱层析分离纯化，或者用高速逆流色谱法分离纯化。 7 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 c r i s p i n d j p e 、1 2 a a g h 应用s e p h a d e x l h 2 0 柱层析对红茶中茶黄素进行了 分离。竹尾忠一应用s e p h a d e x l h 2 0 ( 色谱柱3 l m x 3 5 c m ) 将红茶水浸出物进行柱 层析分离，以体积分数为3 0 、4 0 、5 0 的丙酮顺序梯度洗脱，茶黄素和其他 色素达到有效分离。b a j a i k l 也应用s e p h a d e x l h 2 0 柱层析分离红茶茶汤取得茶 黄素。 s e p h a d e x l h - 2 0 凝胶层析法纯化茶黄素的制备流程一般是将粗提物加入柱 ( 用3 5 的丙酮水溶液将s e p h a d e x l h - 2 0 浸一夜装柱) ，用3 5 的丙酮水溶液淋洗， 流速l m l j m i n ，洗脱液每1 5 m l 收集1 次，测定吸光度。先洗出的是2 个淡黄橙 色带b 1 和b 2 ( 最大吸收波长为4 0 0 r i m ) ，随后洗出的是3 个深橙色带b 3 ，b 4 和 b 5 ( 最大吸收波长3 8 0 r i m 和4 6 0 h m ) 。合并同一色带的洗脱液，3 0 下馏去丙酮， 再用乙酸乙酯萃取，萃取液用m g s o 。干燥后浓缩至于，得到色素p l 、p 2 、p 3 、 p 4 、p 5 。该方法只需1 次层析，分离效果也不错。 此外，还可以将凝胶柱和硅胶柱结合起来分离茶黄素。将茶黄素粗提物过 s e p h a d e x l h 2 0 柱，用6 0 的丙酮洗脱，分部收集，会集e 3 8 0 e 4 6 0 比值在2 5 3 0 范围内的部分，在3 0 c 下减压馏去丙酮，然后用乙酸乙酯萃取，用m g s 0 4 干燥 后在3 0 下减压蒸馏至干，得明亮鲜红色固体物。再经p h 7 硅胶 ( s i l l i c a r c c - 7 1 0 0 2 0 0 ) 柱( 8 0 c m x 4 c m ) 色谱分离。分离步骤如下；先用少量的丙酮、 甲醇、水( 体积比为2 5 ：6 ：2 ) 溶解样品并过柱，用三氯甲烷、丙酮、甲醇、水( 体 积比为4 0 ：2 5 ：6 ：2 ) 进行洗脱。分别收集后于3 0 下浓缩至干。洗出物的顺序 是：t f l 、t f 2 、t f 3 从柱上回收率为8 2 。这3 种产物分别经过硅胶柱分离提 纯1 次，分离物用含水甲醇再结晶，分别得到t f 、t f 3 g 和t f 3 o 的混合物 及t f d g 。该方法分离纯化的效果好，但操作复杂，需要经过2 次柱层析 高速逆流色谱法( h i g h - s e dc o u n l e r o t r r c n tc h r o m a t o g r a p h y , h s c c c ) 是2 0 世纪 8 0 年代发展起来的一项新技术，是不用固态支撑体或载体的液液分配色谱技术， 能实现连续有效的分配功能的实用分离技术。江和源等首次将高速逆流色谱法应 用在分离纯化茶黄素上。q i z h e n d u 和d e g e n h a r d t a 等也利用高速逆流色谱分离出 了茶黄素。 此外，还可以结合使用高速逆流色谱法与s e p h a d e x l h 2 0 柱层析法，两者具 有互补效应，达到茶黄素成分高纯度、快速、高效的分离纯化。 可见仅用一种分离纯化技术可能难以获得组分较单纯、专用性较强的系列产 品。如果将柱层析法和高速逆流色谱法相结合，或许是理想的分离纯化方法，有 望成为今后茶黄素单体制各的有效途径，并预示着将高速逆流色谱法与其他技术 结合使用将成为天然产物研究与开发的一种有效的新手段。目前有学者正在进行 吸附树脂对红茶酚性色素茶黄素的吸附分离研究，以期获得高纯茶黄素产 品，然后再同制备性液相色谱相结合，分离制备茶黄素单体，从而开拓茶黄素分 离纯化新工艺。无疑，茶黄素产品的分离纯化应达到何种程度，宜采用何种方法 矗 普洱茶多酚氧化产物提取分离及活性评价 分离纯化，应取决于茶黄素产品应用领域的需要及综合经济效应。 2 2 茶红素的提取和分离纯化 层析是分离色素的常用方法，但由于t r s 是一类分子量分布广泛的异质多 聚物，任何一种洗脱条件都不可能适用于分离分子量差异大的混合物。再者t r s 对硅胶层析柱上的活性表面有强烈吸附作用，常使色谱图上产生不溶峰和拖尾峰 而影响分离效果。常用的单波长h p l c 色谱资料也影响了色素定性分析的工作效 率及准确判断。 b a i l e y 和o p i e 等在色素的i - i p l c 分析技术方面取得了很大进展。他们将 h p l c 与光电二极管阵列检测器耦联，并借助相应软件对茶汤进行分析，针对 t r s 各组分分子量差别大及吸附性强的特点，他在h p l c 分析中选择了几种色 谱柱如适于分析可溶性低分子量多酚的h y v s i lo d s 柱、适于分析高分子量多聚 物的h y r s i lo c t y lw i d e - o i r e 柱、柱表面不存在活性基团的h a - m i l t o n p r p l 柱以及 几种洗脱液加以比较，发现利用h y r s i lo d s 柱并结合柠檬酸缓冲液洗脱可较好 地分离红茶色素，并在3 8 0 n m 下分离出3 8 种酚性色素，在4 6 0 n m 下可得到2 9 种可溶性t r s ，利用h a m i l t o np r p 1 柱可有效分离与茶汤颜色密切相关的花青素 类物质。 2 3 茶褐素的提取和分离纯化 在普洱茶加工中，茶褐素的含量一直增加，也是多酚氧化产物中含量最多的 一类色素，并且对普洱茶的品质形成有十分重要的作用，是一类能溶于水而不溶 于乙酸乙酯和正丁醇的褐色色素，除含有多酚类的氧化聚合产物外，还含有氨基 酸、糖类等结合物，其化学组成及结构十分复杂，有待探明，目前对其研究却甚 少，其变化规律也需要进一步探讨。 3 普洱茶及其多酚氧化产物生理功能研究进展 普洱茶具有降血脂、减肥、抑菌、助消化、暖胃、生津、止渴、醒酒解毒等 多种功效。因其较强的减肥、降血脂的功能，近年来，日、美、英、法、德等国 的销量在逐年增加，港澳市场供不应求。目前，研究工作者正在开展广泛、深入 的生理、药理功能的研究。 3 1 降血脂 我国茶色素与心血管疾病的基础与临床研究证明，茶色素有显著的抗凝，促纤 洛，防止血小板粘附和聚集的作用，能显著降低动物血清中甘油三酯f i g ) ，低密度 脂蛋白( l d l ) 。而同时又能提高血清中高密度脂蛋e t ( h d l ) 的含量。 巴黎大学营养生理学试验室主任吕通教授在奥尔赛营养生理学试验室用两 组白鼠进行了实验，一组用普通食物喂养，一组用富含胆固醇物喂养，两组都同 9 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 时加入云南沱茶茶汁，实验结果显示：第一组脂肪降低1 0 ，第二组脂肪降低 3 0 ，因此他认为云南沱茶有促进新陈代谢平衡和节制胆固醇的奇效。法国的一 家医院临床实验证明：饮用云南普洱茶对脂肪新陈代谢作用明显，血脂的含量可 下降1 3 ( 一个月中每日喝三碗) 。巴黎圣安东尼医学系临床教学主任爱米乐卡 罗比医师实验证明：普洱茶对脂肪代谢有意想不到的良好效果，凡饮用云南普洱 茶的4 0 以上的病例均有不同程度的体重减轻，年龄在4 0 至5 0 的病例效果更 显著。法国国立健康和医学研究所8 0 年代以来的临床试验表明，普洱沱茶可降 血脂，使2 0 名血脂含量很高的病人两个月内血脂下降了2 2 。巴黎亨利伦多医 院贝纳尔贾可托教授在克雷泰伊的莫道尔医院给2 0 位血液脂肪过多的病人一天 喝三碗云南沱茶，一个月后发现病人血液中的脂肪几乎减少了四分之一。 日本学者也曾用中国云南生产的普洱茶和日本绿茶进行动物试验，观察对血 清脂质代谢的影响，结果发现饲喂茶叶提取物6 至8 周后，血浆胆固醇脂类明 显降低，而且连续喂饲普洱茶可以促进脂肪组织中三酸甘酯分解。吴文华( 2 0 0 5 ) 以普洱茶的原料晒青毛茶为对照，以普洱茶的代表云南七子饼茶为材料，比较 它们的降血脂能力。结果表明，晒青毛茶、普洱茶均能有效地抑制高脂饮食小鼠 血脂的升高，并能使血脂以上各项指标全面降至正常水平，普洱茶的效果略优于 晒青毛茶，二者对甘油三酯( 1 g ) 的作用强于血清总胆固醇( t c ) ，普洱茶中茶 多糖抑制高脂饮食小鼠血脂升高的作用远远强于茶多酚。 王旭华等对云南沱茶降低血清血脂进行动物试验，沱茶煎剂“o 蛳每鼠2 m l 灌胃，结果发现2 0 - 4 0 1 1 后血清血脂( 胆固醇、磷脂质和甘油- - - - , q ) 开始明显降低。 昆明医学院对云南普洱沱茶医治6 6 例高脂血症的疗效作了临床观察，并与疗效 较好的降脂药物安妥明治疗的3 1 例作对比，云南普洱茶的疗效还高于安妥明， 其降低胆固醇的效果则与安妥明相似，且长期饮用无副作用( 王树文，1 9 9 0 ；梁 铭志，1 9 9 6 ) 。何国藩，林月婵等( 1 9 9 8 ) 用大白鼠离体肠段做的试验结果表明： 普洱茶有消滞、开胃、去腻、减肥等作用。他们还对茶叶降血脂效应进行研究： 认为普洱茶对高脂模型兔有降低胆固醇、甘油三脂、蛋白质总脂含量的效应。台 北荣总教学研究部和台湾大学食品科技研究所的研究者以普洱茶之水提物为试 验材料，探讨了降血脂的效果，发现普洱茶能够抑制胆固醇合成，并可降低血中 的胆固醇，三磷酸甘油脂及游离脂肪酸，增加粪便中胆固醇的排出。 3 2 防癌抗癌 日本科学家( m a t s u m o t o n k c h r i t , o l m s h i o k1 9 9 6 ) 使用儿茶素四个单体，茶 色素，乌龙茶提取物，观察了对大鼠肝癌致癌过程的抑制效应。结果显示，茶色 素具有与儿茶素单体一样的对肝癌的化学预防作用。w a n g z y , h u a n g m t 等( 1 9 9 4 ) 对皮肤癌的研究报道，喂饲1 2 5 浓度的红茶，绿茶，去咖啡因红茶，绿茶制剂， 能使受紫外线b 照射的小鼠角化棘皮瘤发生数分别减少9 3 ，8 8 ，7 7 和7 2 。 1 0 普洱茶多酚氧化产物提取分离及活性评价 云南昆明天然药物研究所教授梁明达、胡美英用细胞培养及电子显微镜方 法，对普洱茶的抗癌作用进行了十多年的研究，提出了饮普洱茶能防癌的观点。 他们发现，普洱茶杀癌细胞的作用最为强烈，甚至常人喝茶百分之一的浓度就有 明显的作用。他们还利用环磷酰胺诱导c 5 7 小鼠的细胞突变，同时用茶水灌胃 发现普洱茶有抗突变的作用，也就是有防癌的功效。经检测发现，普洱茶含有 普洱茶具有多种丰富的抗癌微量成分，如肛胡萝i - 素，维生素b l 、1 3 2 、c 、e 等 ( 苏芳华，2 0 0 2 ) 。 3 3 防龋抑菌 目前医药界已经有不少研究和临床实验证明云南普洱茶具有较好的抑菌作 用，特别是浓的茶汁，日服4 次，可以治疗细菌性痢疾( 梁铭志，1 9 9 6 ) 。湖南 医科大学口腔系茶与健康实验室赵燕等( 1 9 9 3 ) 通过对普洱茶的氟化物及茶多酚 含量的动态观察，对其防龋作用进行了研究，结果显示，若每人每日用4 9 普洱 茶，冲泡浓度为0 5 ，5 0 m i n 内，摄入氟量都具防龋作用。湖南医科大学口腔 系茶与健康实验室主任曹进对普洱健齿茶抑制变形球菌附着能力进行了体外实 验观察研究，结果发现普洱健齿茶具有抗菌斑形成作用，其有效浓度在 0 1 2 5 1 之间，以l 浓度效果最佳，酱洱健齿茶的抗菌斑形成作用，主要表 现在通过抑制葡萄糖基转移酶活性，抑制了胞外葡聚糖的产生( 黄桂枢，1 9 9 4 ) 。 3 4 防治心血管疾病 西南农业大学研究认为，普洱茶渥堆过程中，黄酮类物质中以黄酮苷形式存 在最多，而黄酮苷具有跟维生素p 一样的作用，可防止人体血管的硬化。而“渥 堆”正是普洱茶形成其独特风味的一个重要工序，因此普洱茶对心血管硬化有很 好的治疗作用( 梁铭志，1 9 9 6 ) 。何国藩，林月婵( 1 9 9 5 ) 在临床上观察了普洱 茶对脑血流图以及血压、心率的影响，结果表明，饮用普洱茶后能引起人体血管 舒张，血压暂时下降，心率减慢和脑部血流量减少等生理效应，提示普洱茶能够 防治心脑血管疾病，所以老年人和高血压与动脉硬化患者饮用普洱茶均有良好作 用。孙璐西等( 2 0 0 2 ) 的研究证实，普洱茶可以降低血浆总胆固醇、三酸甘油酯 及游离脂肪酸，亦可减轻胆固醇性脂肪肝现象及增加粪便中胆固醇的排出。也可 轻微地抑制肝中胆固醇的合成，增加