（微生物学专业论文）传统泡菜中乳酸菌的分离鉴定及其多样性分析.pdf

r 且1fh0 “ f 摘要 ( i i i i i ii|iillijfjfiiiiiiiiii i l l ，i l l ll舢lll y 17 3 5 16 0 乳酸菌是泡菜生产过程中的一个主要菌群，在整个发酵过程中起着积极的作用， 加强对其生物多样性的了解，对于开发泡菜中的优良乳酸菌资源具有重要的意义。本 研究旨在从生理生化特性和1 6 sr r n a 基因序列同源性方面分析泡菜中乳酸菌的多样 性。 从1 0 份市售及自制泡菜样品中筛选乳酸菌，经富集培养和分离纯化后，得到了 4 6 株乳酸菌。观察了各菌株的形态学特征，并进行了革兰氏染色，4 6 株菌均为革兰 氏阳性菌，其中3 1 株为杆菌，1 5 株为球菌。并对各菌株的发酵上清液p h 值进行了 测定，所有菌株的p h 值均在3 o 6 0 范围内。 研究了4 6 株菌的生理生化特性，经过氧化氢酶实验，精氨酸产氨试验，淀粉水 解试验，七叶苷水解试验，石蕊牛奶试验，明胶液化试验，乙酰甲基甲醇试验( v p 试验) ，h 2 s 的产生试验，精氨酸水解试验，葡聚糖的产生试验，脲酶的测定和碳水 化合物发酵产酸试验，4 6 株菌分别与4 个属的9 种菌有较高相似性，其中杆菌均为 乳杆菌属，球菌分布于肠球菌属、葡萄球菌属和片球菌属。 对4 6 株菌的1 6 sr r n a 基因序列同源性进行分析比较，结果显示4 6 株菌分别与 植物乳杆菌、耐久肠球菌、布氏乳杆菌、香肠乳杆菌、消化乳杆菌、短乳杆菌、巴氏 葡萄球菌、l a c t o b a c i l l u sn a m u r e n s i s 、戊糖片球菌相似，相互间同源性达到9 7 1 0 0 。 这一结果也验证了生理生化实验所得的结论。 对乳酸菌多样性进行了分析，不同样品的多样性存在着一定的差异性，其中样品 9 的多样性最高；不同样品中的优势菌也不尽相同，但以市售泡菜和自制泡菜作为两 大类筛选来源，植物乳杆菌均为其中的优势菌。 研究表明泡菜中存在着丰富的乳酸菌，更为重要的是在泡菜中发现有l a c t o b a c i l l u sn a m u r e n s i s 和巴氏葡萄球菌的存在。 关键词：乳酸菌，泡菜，生理生化特性，1 6 sr r n a 基因序列 l v 3 冉l i 、 p _ a b s t r a c t l a c t i ca c i db a c t e r i a ( l a b ) a i et h ed o m i n a n tm i c r o o r g a n i s m si n t h ef e r m e n t e d v e g e t a b l es i n c et h e y p a l ya na c t i v er o l e i nt h ew h o l ef e r m e n t a t i o n s t u d y i n go nt h e b i o d i v e r s i t yc a nh e l pt oe x p l o i tt h el a br e s o u r c e ，i tw i l lw o r kw e l li nt h ep r a c t i c a l l y a p p l i c a t i o n 1 h ea i mo ft h i ss t u d y w a st oi n v e s t i g a t et h eb i o d i v e r s i t yo fl a c t i ca c i db a c t e r i a i nt h et r a d i t i o n a lf e r m e n t e dv e g e t a b l eb yp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s a n d16 sr r n ag e n es e q u e n c i n g t h e4 6l a bs t r a i n sw e r ei s o l a t e df r o mt h e10s a m p l e so ff e r m e n t e dv e g e t a b l e b ye n r i c h m e n tc u l t u r e c o m p a r i n go fm o r p h o l o g ya n dt h eg r a mr e a c t i o n ，t h e4 6i s o l a t e s w e r ea l lg r a m p o s i t i v eb a c t e r i a ，i n c l u d i n g31b a c i l l ii s o l a t e sa n d15c o c c ii s o l a t e s t h ep h o ft h es u p e m a t a n to ft h e4 6i s o l a t e sw a sf r o m3 0t o6 0 t h ep h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c sp r o v e dt h a tt h e4 6l a bs t r a i n s h a dh i g hs i m i l a r i t yw i t ht h eo n e sb e l o n g e dt o4g e n e r aa n d9s p e c i e s t h eb a c i l l i b e l o n g e dt ol a c t o b a c i l l u s ，b u tt h ec o c c ib e l o n g e dt oe n t e r o c o c c u s ，s l n p h y l o c o c c u s a n dp e d i o c o c c u s m e a n t i m e ，t h el6 sr r n ag e n es e q u e n c i n gw a su s e dt oi d e n t i f yt h ei s o l a t e s t h er e s u l t sr e v a l e dt h a tt h e4 6i s o l a t e sh a dv e r yh i g hh o m o l o g yw i t h16 sr r n a g e n es e q u e n c e so fm e m b e r so ft h e 三p l a n t a r u m ，b u c h n e r i , 三f a r c i m i n i s , 上 a l i m e n t a r i u , l b r e v i s , l n a m u r e n s i s , e d u r a n s , s p a s t e u r ia n dpp e n t o s a c e u sf r o m g e n e b a n kd i f f e r e n t l y , a n dt h ei d e n t i t yw a sf r o m9 7 t o10 0 t h er e s u l t sa l s ov e r i f i e dt h e p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lt e s tr e s u l t s t h eb i o d i v e r s i t ya m o n gt h el a bs t r a i n sh a db e e na n a l y z e d i tf o u n dt h a tt h eb i o d i v e r - s i t yw a sd i f f e r e n ta m o n ge a c hs a m p l e s ，a n dt h en i n t hs a m p l eh a dah i g h e rb i o d i v e r s i t ya n l o n gl a b b u tt h ed o m i n a n tb a c t e r i ai nd i f f e r e n ts a m p l e sh a ds o m ed i f f e r e n c e s w h e t h e ri n c o m m e r c i a lo ri nh o m e m a d ef e r m e n t e dv e g e t a b l es a m p l e s ，p l a n t a r u mw e r et h ed o m i n a n tb a c t e r i a t h i sw o r ks u g g e s t e dt h e r ew a sah i g hl e v e lo fb i o d i v e r s i t ya m o n gl a bi nt h et r a d i t - i o n a lf e r m e n t e dv e g e t a b l e m o r e o v e ll n a m u r e n s i sa n ds p a s t e u r ih a v eb e e nf o u n di n t h e s et r a d i t i o n a lf e r m e n t e dv e g e t a b l e k e yw o r d s ：l a c t i ca c i db a c t e r i a , f e r m e n t e dv e g e t a b l e ，p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s ，16 sr r n ag e n es e q u e n c e s v j 1 一 咖 、 缩写 o d s e c m l n p l m l r p m e d t a e p 缩略词 英文全名 o p t i c a ld e n s i t y s e c o n d m i n u t e m i c r o l i t r e m i l l i l i t e r r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d e p p e n d o r f i i i 中文名 光密度 秒 分钟 微升 毫升 辕| 食决 乙二胺四乙酸 离心管 b v k 胁 目录 摘要i a b s t r a c t i i 文献综述1 l 引言7 1 1 研究意义与理论依据7 1 2 本研究拟解决的问题7 2 材料与方法8 2 1 材料8 2 2 方法1 0 2 2 1 乳酸菌的筛选j 1 0 2 2 1 1 样品采集和富集1 0 2 2 1 2 稀释涂平板1 0 2 2 1 3 分离纯化1 0 2 2 2 乳酸菌的初步验证1 0 2 2 2 1 革兰氏染色1 0 2 2 2 2 发酵上清液p h 值的测定1 0 2 2 2 - 3 菌种的保存1 0 2 2 3 乳酸菌的生理生化试验10 2 2 4 乳酸菌的1 6 sr r n a 基因序列分析1 2 2 2 4 1 种子液的培养1 2 2 2 4 2 生长曲线的测定1 2 2 2 4 3 对数期活菌个数的测定1 2 2 2 4 4 乳酸菌基因组d n a 的提取1 2 2 2 4 5 琼脂糖凝胶电泳。1 2 2 2 4 6p c r 扩增乳酸菌1 6 sr r n a 基因1 3 3 结果和分析1 4 3 1 乳酸菌的筛选1 4 3 1 1 形态学观察1 5 3 1 2 发酵上清液p h 值的测定1 5 3 2 乳酸菌生理生化特性分析1 5 3 2 1 生理生化试验l5 3 2 2 碳水化合物发酵产酸实验1 7 i v 3 2 3 乳酸菌生理生化分析结果1 8 3 3 乳酸菌的1 6 sr r n a 基因序列分析1 9 3 3 1 菌株生长曲线的测定1 9 3 3 2 对数期活菌数的测定2 0 3 3 3 基因组d n a 的提取2 0 3 3 41 6 sr r n a 基因p c r 产物2 l 3 3 51 6 sr r n a 基因序列分析2 1 3 4 泡菜中乳酸菌多样性的分析2 4 4 讨论2 5 5 结论2 7 参考文献2 8 致谢。3 5 个人简介。3 6 v 文献综述 乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物( 主要指葡萄糖) 产大量乳酸的革兰氏阳 性细菌的通称，其种类多、资源丰富，并广泛应用于工、农、医、食品、饲料和化工 等方面【l 】。乳酸菌在自然界分布广泛，是生物圈的重要组成部分，且具有特殊的生理 活性和营养价值，乳酸菌的分离、特性和应用研究受到日益重视。 近年来乳酸菌发酵制品越来越受到大家的欢迎，特别是通过乳酸菌发酵得到的蔬 菜加工品泡菜。蔬菜表面通常附生有细菌、酵母菌和霉菌等多种微生物，在泡菜 的制作过程中乳酸菌最终成为优势菌，其代谢产物和低氧份的环境抑制了食品腐败菌 的生长【2 1 ，从而保障了食品的品质和风味。为了更全面的认识和研究泡菜中的乳酸菌， 不仅必需了解乳酸菌发酵泡菜的机理，更要加强对泡菜中乳酸菌群的结构和多样性的 了解，这对于开发泡菜中优良乳酸菌资源，揭示乳酸菌群结构与功能的联系，指导乳 酸菌群落功能的定向调控具有重要意义【3 - 4 1 。 1乳酸菌与泡菜 根据国际公认的分类系统伯杰氏系统，在伯杰氏系统细菌学手册第9 版 中，乳酸菌属于真细菌纲( e u b a c t e r i a c ) 真细菌目( e u b a c t e r i a l e s ) 中的乳酸细菌科 ( l a c t o b a c i l l a c e a e ) 。6 0 年代之前，乳酸菌主要按细菌的形态、培养条件、碳水化合 物的利用、代谢产物等特性来进行分类；而6 0 年代之后，很多研究采用了乳酸菌细胞 d n a 中( g + c ) 的百分含量的测定。到9 0 年代，增加了脂类分析和醌类分析技术、 1 6 sr r n a 基因序列分析和基因探针等进行测定和分类。核分子探针杂交技术和聚合 酶链反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 是乳酸菌目前分类和鉴定的最常用方法。 自从1 8 7 5 年巴斯德发现乳酸菌以来，1 3 0 多年来己发现的乳酸菌有4 3 个属，包括3 7 3 个种和亚种。而近年来，国内外对泡菜这一微生态系统进行了多方位的研究，利用不 同的分析手段从各种泡菜样品中筛选出了许多具有优良性能的菌种，其中包括乳杆菌 属( l a c t o b a c i l l u s ) 1 5 - 1 0 】、链球菌属( s t r e p t o c o c c u s ) 11 1 、肠球菌属( e n t e r o c o c c u s ) 1 2 】、 乳球菌属( l a c t o c o c c u s ) 1 3 】、片球菌属( p e d i o c o c c u s ) 1 4 - 1 5 】、明串株菌属( l e u c o n o s t o c ) 【1 6 - 1 8 】竺 寸o 1 1乳酸菌在泡菜生产中的作用 1 1 1 改善泡菜的风味 首先乳酸菌经过发酵可以产生醋酸、丙酸等有机酸，它们赋予了制品独特的酸味， 可以刺激人们的食欲。另外，这些有机酸可与乳酸菌或其他微生物发酵过程中产生的 醇、醛、酮等物质相互作用，形成多种新的呈味物质具有芳香味的羧酸酯类，如 乳酸与乙醇结合形成乳酸乙酯等，而这些呈味物质的产生就改善了制品风味【1 9 。2 1 】。 1 1 2 提高泡菜的营养价值 当今用于乳酸发酵泡菜的乳酸菌一般不具有硝酸还原酶和氨基酸脱羧酶，因而不 会使硝酸盐还原成亚硝酸盐，也不会产生胺，所以乳酸发酵蔬菜中一般不会产生亚硝 酸胺。相反，乳酸菌分泌的肽酶可产生多种氨基酸，这些氨基酸既可以提高食品的鲜 味也具有一定的营养价值。乳酸菌进入人体后参与调节人体肠道的微生态平衡，不仅 可以利用代谢产物抑制有害菌群增长，还可促进有益菌群的增殖。另外，乳酸菌进入 人体后可促进胃肠道蠕动，帮助消化，还能刺激肠道免疫细胞产生抗体，预防疾病 1 2 2 - 2 3 1 o 1 1 3 延长泡菜的保质期 一方面，乳酸菌通过竞争氧气及养分来抑制其它微生物的生长。另一方面，乳酸 菌在其代谢过程中，会产生一些具有抗菌活性的物质，如：有机酸、双乙酰、过氧化 氢、二氧化碳等，这些物质可以抑制泡菜中一些腐败菌的生长，延长泡菜的保质期。 更为重要的是很多乳酸菌都能产生细菌素，经研究表明这些物质在抑制病原菌上具有 重要作用。而细菌素本身具有许多优良性质：易被人体消化道中的一些蛋白酶( 如胰 蛋白酶) 所降解，不会在体内蓄积而引起不良反应，无副作用、无残留，同时也不污 染环境；具有热稳定性，并耐酸、耐低温贮藏：对制品的口感、口味等无不良影响， 因而不仅适用于泡菜，更被广泛用作于食品添加剂【2 睨7 1 ，如：n i s i n 2 8 1 ，p l a n t a r i c i n 2 9 3 1 】， s a k a c i n 3 2 1 等，其中研究较多的是n i s i n ，n i s i n 对革兰氏阳性菌具有广谱抗菌活性，所 以被作为硝酸盐的替代剂广泛的应用于食品的保鲜【3 3 出】，减少或避免了亚硝胺类物质 对人体健康的威胁，同时又延长了食品的储藏期。 1 2 泡菜中常见乳酸菌 1 2 1乳杆菌属 杆菌，细胞形态多样，一般不运动。以发酵代谢，专性的分解糖，在碳的终产物 中至少5 0 是乳酸。通常不发酵乳酸盐，副产物可能是乙醇、乙酸盐、琥珀酸盐、甲 醇盐和c 0 2 ，一般不会产生多于2 个碳原子的挥发性酸。氧化酶阴性，几乎没有菌株 以假接触酶分解过氧化物。接触酶阴性。罕见产色素者，如有色素一般是黄或橙色到 锈红。 通常不还原硝酸盐，只有p h 值最终平衡在6 o 以上才会还原硝酸盐。不液化明胶， 不产生吲哚和h 2 8 1 3 5 - 3 6 1 。营养需求复杂，需要氨基酸、肽、核酸衍生物、脂肪酸、可 发酵的碳水化合物和盐类等，般而言，每个种都有特殊的需求i 刁引。 1 2 2 链球菌属 现包括在链球菌属的细菌经修改后已限定为无芽孢的化能异养菌，是类球或者球 杆状的细胞，排列成链或成对，不生成芽孢。其中很少菌株可合成过氧化物酶。不能 2 合成血红素，由此在联苯胺试验中是阴性【3 引。发酵代谢过程中主要是产生乳酸，不产 气，不能利用氧，但可在氧中生长，因而被认为是耐氧的厌氧菌。 1 2 3 肠球菌属 肠球菌属最先由s c h l e i f e r 和k i l p p e r - b a l z 在1 9 8 4 年提议的，多数成对排列或成短 链，少数种有色素如em u n d t i i 和ec a s s l i f l a v u s 。化能异养菌，能量产生主要通过同型 发酵乳酸的途径，利用碳水化合物发酵后的代谢产物主要是l ( + ) 哥l 酸。具有 l a n c e f i e l dd 群抗原。一般能在l o 和4 5 下生长，在p h 9 6 、4 0 胆汁同样可以生长 h o 】，耐热，6 0 。c 处理3 0 m i n 仍可存活【4 1 1 。 1 2 4 乳球菌属【4 2 】 卵圆形细胞，成对或成短链状。兼性厌氧菌，不运动，接触酶阴性，不产芽孢。 化能异养菌，营养需求复杂。乳球菌一般能在4 n a c i 中生长，而乳酸乳球菌乳脂亚 种例外，只能耐受2 n a c i 。通常能在1 0 下生长，但不能再4 5 中生长。 1 2 5 片球菌属【4 2 l 细胞球形，在特定条件下，以直角的两个平面方向交替分裂形成四联状。化能异 养菌，细胞生长需要含有复杂的生长因子和丰富氨基酸的培养基，都需要生物素、泛 酸和烟酸，但不需要硫胺素。生长依赖于可发酵的碳水化合物，发酵葡萄糖产生d l 或l ( + ) 乳酸盐，产酸不产气。一般不酸化和凝固牛奶，不分解蛋白，不还原硝酸盐， 不产吲哚。氧化酶阴性，接触酶也阴性。 1 2 6 明串株菌属【4 3 】 细胞常呈豆状，不运动，不产生芽孢，接触酶阴性，无细胞色素。 化能有机营养，生长通常需要丰富的生长因子和氨基酸，所有的菌种都需要生物 素、硫胺素和烟酸，不需要泛酸或泛酸的衍生物。最适生长温度一般为2 0 3 0 。 均可发酵葡萄糖产酸产气，主要产物为d ( ) 哥l 酸、乙醇。不还原硝酸盐，精氨酸不 水解，不酸化和凝固牛奶，不产生吲哚。 2 影晌乳酸菌生长的因素 2 1氧气 由于乳酸菌种类繁多，因此不同的菌对氧气的需求也不尽相同。但各种乳酸菌通 常以发酵方式代谢产能，且因普遍缺乏好氧的呼吸链酶，在与游离氧的关系上，一般 是一些耐氧性厌氧菌、微好氧菌、兼性厌氧菌或是专性厌氧菌。如乳杆菌属的菌种一 般都是耐氧性厌氧菌，但有少数的是微好氧，当培养时充以5 1 0 的c 0 2 或降低氧 压可促进其生长【4 4 舶】；链球菌属、乳球菌属、片球菌属、肠球菌属等都是兼性厌氧菌； 双歧杆菌属则为专性厌氧菌。 氧气与培养液中的p h 值，对乳酸的产量有一定的影响【4 7 1 。在厌氧条件下，连续 培养保加利亚乳杆菌，培养液的p h 则由酸性变为碱性，同时原来的同型乳酸发酵也 会转化为异型乳酸发酵，乳酸的产量也相应减少。 2 2 温度 一系列的生物化学反应组成了各种微生物的正常生命活动，温度对这些生命活动 的影响极其明显。乳杆菌属一般生长温度范围为2 5 3 ，最适生长温度在3 0 4 0 之 间，如短杆菌最适生长温度一般为3 5 c t 4 引，但其中发酵乳杆菌一般在1 5 c 不生长，而 植物乳杆菌在4 5 也不生长【4 9 】：片球菌属最适生长温度通常为2 5 , - - 4 0 * ( 2 ，一般培养温 度为3 0 ；链球菌属生长温度范围为2 5 4 5o c t 5 0 j ，一般最适生长温度为3 7 ；乳球菌 属的最适生长温度为3 0 ，可以在1 0 下生长，但不能在4 5 下生长；肠球菌属最适 生长温度为3 7 ，能在l o 4 5 下生长。 2 3 p h 乳酸菌通常以乳酸为唯一或主要代谢产物，所以它们对酸性环境十分适应，乳酸 菌的几个主要属的生长p h 如下： 乳杆菌属最适p h 为5 5 6 2 ，p h 为9 0 的时候不能生长，一旦接种到初始p h 为中性 或碱性的培养基中时，生长速度明显很低：明串珠菌属一般生长p h 范围在5 o 以上， p h 4 4 时基本停止生长；乳球菌属可以生长在酸性和中性范围内，一般在p h 4 5 可以 生长【5 l 】，在p h 为9 6 时不能生长；肠球菌属的生长p h 范围比较广，在中性和碱性条件 下生长较好，可以在p h 为9 6 下生存【5 2 1 ；链球菌属生长p h 范围也较广，一般还可以生 长在p h 为9 6 下。 2 4 渗透压 不同乳酸菌对渗透压的适应能力有较大差别，例如大多数的乳球菌属只可以在 4 n a c l 中生长，也有研究证明在6 n a c i 中生长良好，但在8 n a c i 中则生长缓慢f 5 3 j ； 生长肠球菌属和链球菌属的菌种能在6 5 n a c l 环境下生长，植物乳杆菌对n a c i 的耐 受能力最强，能耐受9 1 的n a c l ，而发酵乳杆菌只能耐受5 3 的n a c l 5 4 j 。 3 适用于乳酸菌鉴定的方法 3 1形态特征和生理生化特性分析 形态特征鉴定主要是依据乳酸菌菌落形态和细胞形态的不同进行初步鉴定，但不 能作为独立的鉴定方法。菌落形态主要包括菌落在培养基平板上的色泽、形状、大小 等；而细胞形态则是对菌落在进行革兰氏染色后，再进行显微镜观察。 生理生化特性鉴定则是依据菌株不同的生理生化特性进行分析，一般可以将菌株 鉴定到属。内容一般包括过氧化氢酶试验，精氨酸产氨试验，淀粉水解试验，七叶苷 水解试验，石蕊牛奶试验，明胶液化试验，乙酰甲基甲醇试验( v p 试验) ，h 2 s 的 产生试验，精氨酸水解试验，葡聚糖的产生试验，脲酶的测定和碳水化合物发酵产酸 试验等【5 5 。5 7 】。商军【1 2 】等就利用了形态学和生理生化相结合的方法从泡白菜、泡萝卜和 -_一一 4 泡辣椒中分离出的1 1 个乳酸菌株进行了初步鉴定。目前也有很多研究是根据a p i 细菌 鉴定标准 s s - 6 0 】，利用a p i5 0c h 试剂条和a p ic h l 培养基对分离菌株进行4 9 种碳水化 合物发酵反应，经a p i l a bp l u s 软件对各菌株进行鉴定。d i c k s 6 1j 等就采用了a p i5 0c h 试剂条和a p ic h l 培养基对从南非红酒中4 分离得到的1 9 株菌株进行了分析，经a p i 系统鉴定1 1 株菌为l h i l g a r d i i ，另外8 株菌为短乳杆菌。 3 2 分子生物学鉴定 越来越多的研究采用了分子生物学技术来进行菌种的分类鉴定，如扩增片段长度 多态性分析技术( a f l p ) 6 2 - 6 4 、随机扩增多态d n a 技术( r a p d ) 【6 5 柳】、变性梯度凝 胶电泳( d g g e ) 6 s 】和1 6 sr r n a 基因序列分析【6 9 - 7 2 等，这些技术显示出了特异、敏感、 快速、简便、重复性好等优点。 3 2 1a f l p a f l p ( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 技术作为一项新的分子标记技术， 是以p c r 技术为基础扩增基因组d n a 限制性片段，基因组d n a 首先用限制性内切酶 切割，再将双链接头连接到d n a 片段的末端，以接头序列和相邻的限制性位点序列， 作为引物结合位点。限制性片段可以用二种酶切割产生，一种为罕见切割酶，一种为 常用切割酶。因为它结合了r f l p 和p c r 技术特点，所以具有r f l p 技术的可靠性和p c r 技术的高效性。a f l p 扩增可使某一品种出现特定的d n a 谱带，但是在另一品种中可 能无此谱带产生，因而，这种通过引物诱导及d n a 扩增后得到的d n a 多态性可以做为 一种分子标记。a f l p 可在一次单个反应中检测到大量的片段。n i c h o l e 7 3 j 等在验证 a f l p 技术是否具有重复性时，同一株菌得到的是相似的多态性图谱，h a r tl t 7 4 l 等在 重复试验的过程中发现图谱中平均有0 5 的条带出现或缺失，这都说明了重复性如 果是在一定误差范围内，就可以认为有重复性或重复性很好。所以a f l p 技术不仅是 一种新的而且有很大功能的d n a 指纹技术，而且其重复性强，县有可靠性好，可信 度高等优点，近年来广泛应用于遗传育种研究，在动物遗传育种、动物基因组研究中 有着广泛的应用前景。如2 0 0 7 年m a f f e ob u s c o n i 7 5 】等对小牛肠道中的乳酸菌菌群采用 了a f l p 技术进行分析，结果显示在两只健康小牛肠道中的31 l 株乳酸菌共有8 个属， 其中比例最高的的是1 6 9 株的乳杆菌属和9 9 株的链球菌属。 3 2 2r a p d r a p d ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ) 技术是建立在p c r 基础之上，可 以对整个未知序列的基因组进行多态性分析的一种分子技术。它以基因组d n a 为模 板，单个人工合成的随机多态核苷酸序列( 通常为1 0 个碱基对) 为引物，在热稳定的 d n a 聚合酶作用下，进行p c r 扩增。扩增产物经聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离、溴化 乙锭染色后，在紫外透视仪上进行多态性检测。扩增产物的多态性反映了基因组的多 态性。r a p d 技术现已广泛的应用于生物的品种鉴定、系谱分析及进化关系的研究上 7 6 - 7 7 】。2 0 0 7 年i s a b e ll o p e z 等； 7 8 】对4 6 株植物乳杆菌分别采用了传统生理生化方法和 r a p d p c r 技术进行分析，而结果显示r a p d p c r 技术更能显示出这4 6 株植物乳杆菌 之间的同源性。c o c c o n c e l l i 7 9 】等也利用了r a p d 技术成功区分了la e i d o p h i l u s ，三 h e l v e t i c u s ，ef a e c a l 担，ef a e c i u m 和t h e r m o p h i l u s 等菌株。 3 2 3d g g e d g g e ( d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ) ，即变性梯度凝胶电泳，是根 据d n a 在不同浓度的变性剂中解链行为的不同从而导致电泳迁移率发生变化， 从而将片段大小相同而碱基组成不同的d n a 片段区分开来。具体来说，就是将 特定的双链d n a 片段在含有从低到高的线性变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中电 泳，在电泳过程中，d n a 片段向高浓度变性剂方向迁移，当它到达其变性要求 的最低浓度变性剂处，双链d n a 就形成部分解链状态，从而导致其迁移速率变 慢。这种变性具有序列特异性，因此d g g e 能将同样大小的d n a 片段很理想地 分开，它是一种很实用的分子标记方法，现已广泛应用于生物多样性调查、亲 缘关系鉴定、基因突变检测等多个领域。m u y z e r 8 0 j 等人在1 9 9 3 年将d g g e 技术应 用于微生物生态学研究后，现在食品微生物学、环境微生物学等研究方面有关d g g e 技术都有很多报道【8 1 - 8 4 1 。马俊孝【8 5 1 等同样是采用y p c r d g g e 对5 种含有乳酸菌的乳 制品进行了菌群组成分析，并通过传统培养方法和核酸序列分析进行了验证，结果表 明可以利用d g g e 技术对样品中的乳酸菌进行分析和鉴定。 3 2 41 6 sr r n a 基因序列分析 聚合酶链反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 是8 0 年代中期发展起来的体外核 酸扩增技术。它具有特异、敏感、简便、快速、产率高、重复性好、易自动化等突出 优点：能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一d n a 片段于数小时内扩增至十 万乃至百万倍，使肉眼可以直接观察和判断；可从一滴血、一根毛发、甚至一个细胞 中扩增出足量的d n a 供分析研究和检测鉴定：类似于d n a 的天然复制过程，它的特 异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。r a n d a z 8 6 】对分离自绿橄榄的乳酸菌进 行了1 6 sr r n a 基因序列分析，证明大多数是干酪乳杆菌。徐进1 87 1 等用聚合酶链式反 应( p c r ) 扩增1 6 sr r n a 可变区基因鉴定从泡菜汁中分离产凝集素乳杆菌，通过同源 性比较，此菌株与厶p l a n t a r u ms t r a i np 2 1 5 的同源性为9 9 ，鉴定表明此菌株为植物 乳杆菌。 6 1 引言 1 1 研究意义与理论依据 乳酸菌在自然界分布广泛，与人类生活关系密切，在工业、农业和医学等重要领 域有较高应用价值，特别是食品行业。而与乳酸菌密切相关的食品行业中，泡菜是历 史比较悠久的，且随着微生物学的发展，乳酸发酵蔬菜的研究也日益深入。近年来， 国内外对泡菜这一微生态系统进行了广泛的研究，利用不同的分析手段从各种泡菜样 品中筛选出了许多具有优良性能的乳酸菌。 乳酸菌作为食品原料被安全地应用于泡菜生产中，它在泡菜制作过程中以其代谢 产物和低氧份的环境抑制了其他细菌，霉菌，酵母菌的生长，最终成为优势菌。首先， 乳酸菌发酵产生的醇、醛、酮和有机酸等物质，赋予泡菜柔和的酸味和香气；其次， 乳酸菌分泌的肽酶可产生多种氨基酸，这些氨基酸改善了泡菜的品质和营养：最后， 乳酸菌在其代谢过程中，会产生一些具有抗菌活性的物质，且乳酸菌进入体内有促进 消化、调节肠道菌群等功效。 乳酸菌的存在和活动是受到环境因素的影响和制约的，同时，它们通过自身的代 谢活动参与自然界的物质转换和元素的生物循环。因此了解乳酸菌在自然界的分布规 律，可为人类更好的利用乳酸菌资源提供依据。所以，为了更全面的认识和研究泡菜 中的乳酸菌，不仅需探讨乳酸菌发酵泡菜的机理，更要加强对泡菜中乳酸菌的菌群结 构及其多样性的研究，这对于丌发泡菜中优良乳酸菌资源，揭示乳酸菌结构与功能的 联系，指导乳酸菌群落功能的定向调控具有重要意义。 1 2 本研究拟解决的问题 本文的研究包括以下几个部分 第一部分i 从1 0 份泡菜样品中筛选乳酸菌，并对筛得的菌株进行初步形态学鉴 定。 第二部分：从生理生化特性和1 6 sr r n a 基因序列同源性两个方面对所筛得菌株 进行比较分析。 7 2材料与方法 2 1材料 2 1 1 菌种 实验所筛得的4 6 株乳酸菌 2 1 2 仪器设备与试剂 ( 1 ) 仪器设备 超净工作台 电热恒温培养箱 电热恒温水浴锅 显微镜 t g l 2 0 m 冷冻高速离心机 电子天平 v i s 7 2 2 0 分光光度计 p h 2 - - 3 c 型酸度计 电热压力蒸汽灭菌器 振荡培养箱 w h 3 微型旋蜗混合仪 m i n i 4 k 6 k 微型离心机 p c r 扩增仪4 8 0 凝胶成像系统u v i s 2 0 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 湖北黄石医疗器械厂 江苏金坛荣华仪器制造有限公司 l e i c am i c r o s y s t e m 湖北湘仪 上海生化仪器厂 北京瑞利 上海康仪 上海医用核子仪器厂 上海智城分析仪器制造有限公司 上海沪西分析仪器厂 珠海黑马 珠海黑马 美国柯达公司 ( 2 ) 主要试剂 1 ) 溴甲酚紫指示剂：1 6 9 溴甲酚紫，蒸馏水1 0 0 m l 。 2 ) 卢哥氏碘液：碘1 0 9 ，碘化钾2 0 9 ，蒸馏水3 0 0 m l 。 3 ) 精氨酸液：l - 精氨酸1 5 9 ，l 1 0 m l 蒸馏水的半胱氨酸溶液0 0 5 m l ，蒸馏水 1 0 m l ，调p h7 0 ，灭菌后备用。 4 ) 奈氏试剂：a 液( 氢氧化钾2 0 9 ，蒸馏水5 0 m 1 ) 与b 液( 碘化钾5 9 ，碘化汞l o g ， 蒸馏水5 0 m 1 ) 混合后过滤，贮存于暗色瓶内备用。 5 ) 柠檬酸铁溶液：5 0 1 0 o g 柠檬酸铁，蒸馏水1 0 0 0 m l 。 6 ) 甲酚红液：甲酚红0 5 9 ，0 0 1 m o l l 氢氧化钠2 6 2 m l ，再稀释至2 5 0 m l 。 7 ) b t b m r 试剂：b t b0 2 9 ，m r0 1 9 ，9 5 7 , 醇3 0 0 m l ，蒸馏水2 0 0 m l 。 8 ) 5 0 x t a e ( 终浓度配制1l 溶液) ：分别取2 4 2 9 的2 m o l lt r i s 碱、5 7 1 m l 的 1m o l l 冰乙酸、1 8 6 2 9 的p h8 0e d t a ，用水补足l l ，混匀。 9 ) u n i q 1 0 柱式细菌基因组d n a 抽提试剂盒和s k 2 0 7 2 即用型p c r 扩增试剂 盒，m a r k e rf 和m a r k e rm n a h i n d i i i ，购自上海生工生物工程有限公司。 1 0 ) 上游引物：5 - a g a g t t t g a t c c t g g c t c a g 3 ，下游引物：5 - t a c g g t t a c c t t g t t a c g a c n 3 ( 上海生工) ，上游引物靶向大肠杆菌e c o l i1 6 sr r n a 基因 序列的8 2 7 位核苷酸( 2 7 f ) 8 8 】，下游引物对应于e c o l i1 6 sr r n a 基因序列的第 1 5 3 l 1 5 0 9 位碱基( 1 5 0 9 r ) 。 2 1 3 培养基 ( 1 ) m r s 液体培养基：蛋白胨1 0 9 ，葡萄糖2 0 9 ，牛肉膏1 0 9 ，酵母粉5 9 ，磷 酸氢二钾2 9 ，乙酸钠5 9 ，柠檬酸氢二铵2 9 ，吐温一8 05 m l ，硫酸镁0 5 8 9 ，硫酸锰0 2 5 9 ， 蒸馏水定容1 0 0 0 m l ，p h6 2 6 4 ，1 1 5 灭菌3 0 m i n 。 m r s 固体培养基：m r s 液体培养基加琼脂1 5 9 ，1 1 5 灭菌3 0 m i n 。 m r s 半固体培养基：m r s 液体培养基加琼脂8 9 ，1 1 5 c 灭菌3 0 m i n 。 ( 2 ) p y 基础培养基：蛋白胨5 9 ，胰蛋白胨5 9 ，酵母提取物1 0 9 ，盐溶液4 0 m l ( 盐 溶液成分( l ) ：无水氯化钙0 2 9 ，硫酸镁0 4 8 9 ，磷酸氢二钾1 0 9 ，磷酸二氢钾1 0 9 ， 碳酸氢钠1 0 0 9 ，氯化钠2 0 9 ) ，蒸馏水1 0 0 0 m l 。 ( 3 ) 明胶基础培养基( 1 0 0 0 m l ) ：明胶1 2 0 9 ，蛋白胨1 o g ，酵母提取物1 0 9 ， 葡萄糖0 1 9 ，盐溶液4 0 m l ( 与p y 基础培养基相同) ，1 1 5 灭菌2 5 m i n 。 ( 4 ) 产葡聚糖试验培养基( l ) ：胰蛋白胨l o o g ，酵母提取物5 0 9 ，柠檬酸三铵 5 0 9 ，磷酸氢二钾5 o g ，蔗糖5 0 0 9 ，琼脂1 5 0 9 ，1 1 5 。c 灭菌2 5 m i n 。 ( 5 ) 可溶性淀粉培养基：向p y 基础培养基中加入0 5 的可溶性淀粉。 ( 6 ) 产h 2 s 实验培养基：胰蛋白胨1 0 o g ，肉浸膏3 0 9 ，酵母提取物5 0 9 ，氯化 钠5 0 9 ，葡萄糖2 o g ，半胱氨酸0 4 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h7 2 - 7 4 ，1 1 3 c 灭菌2 0 m i n 。 ( 7 ) 精氨酸水解试验培养基：蛋白胨5 0 9 ，肉浸膏5 o g ，葡萄糖0 5 9 ，l - 精氨 酸1 0 0 9 ，吡多醛5 0 m g ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，1 6e , 1 0 0 m l 溴甲酚紫