（分析化学专业论文）自组装法制备dna电化学传感器的研究及应用.pdf

青岛科技夫学舔炎生学位论文 皇缝装法制备d n a 电化学传感器的谱究及应用 摘甏 本论文用巯基自组装法制备了d n a 电化学传感器，分别以弧甲基蓝和甲苯 跛簸为杂交摆示刻，用紫终可见光潜彝电化学法磷窥了它们与荸双链d n a 摺互 作用的识别模式，建立了电化学生物传感器法测定转基因n o s 序列的新方法， 还秘溺线镶扫攒投港法磷究了甲蘩紫与d n a 豹撩互痒建。 论文主要由五部分组成，第一部分综述了转綦因植物产品、d n a 电化学传感 瓣潞研究方法和d n a 与小分子傀合伤的俸稻及意义。第二部分蒂瘸循环茯安法 初步研究了巯基乙酸自组装膜修饰金电极的电化学行为，结果表明巯基乙黢在金 电极表面其有特性吸附，形成具肖一定致密性的融组装层。第三部分制备了巯基 乙黢自组装膜d n a 电化学搀感器，以亚甲基蓝为杂交擐示刹，用循环伏安法检 钡4 杂交前詹其峰电流的变化，并应用于n o s 基因片段的检测。第四部分详细研 究了甲苯黢蓬在零双链d n a 骖攥逮稷上瓣电纯学疗妥，劳班甲苯黢蓝为杂交指 示剂，利用制得的d n a 电化学传感器对转基因n o s 序列进行了测定。第五部分 霜线性扫撼极谱法辑究了学基綮与d n a 黥相互侔蘑，筑纯了缀合反应条件袭奄 化学测定条件，探讨了结含反应的机理，建立了以甲基紫为电化学探针极谱法测 定d n a 的新方法，并将该方法用于合成样品中d n a 的稔测，结采令入满意。 关键词：电化学传感器，d n a 修饰电极，亚甲撼蓝，甲苯胺蓝，甲基紫 鱼丝茎鲨型鱼旦坠皇垡堂焦壁翌堕婴塞墨壁型 p r e p a r a t i o na n d a p p l i c a t i o no f s e l f - a s s e m b l e dd n ae l e c t r o c h e m i c a l b i o s e n s o r i nt h i sp a p e r , ag e n ee l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o rw a sp r e p a r e db ys e l f - a s s e m b l e d m e t h o d ，u s i n gt h em e t h y l e n eb l u e ( m b ) a n dt o l u i d i n eb l u ef r b ) a st h ei n d i c a t o r r e s p e c t i v e l y t h e i n t e r a c t i o nm o d e lo fi n d i c a t o rw i t hs s d n ao rd s d n aw a s i n v e s t i g a t e db yu v - v i sa d s o r p t i o ns p e c t r o p h o t o m e t r ya n dc y c l i cv o l t a m m e t r y t h e i n t e r a c t i o no fm e t h y lv i o l e t ( m v ) w i t hf s d n aw a sa l s oi n v e s t i g a t e db yl i n e a rs w e e p v o l t a m m e t r i ct e c h n i q u e t h ep a p e ri sm a d eu po fm e p a r t s f i r s t l y , as t t m m a r yr e f e r r i n gt ot h eg e n e t i c a l l y m o d i f i e do r g a n i s m ，t h es i g n i f i c a n c eo ft h ee l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r ，a n dt h e i n t e r a c t i o no fd n aw i ms m a l lm o l e c u l e sw e r er e v i e w e d s e c o n d l y , t h e e l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r so fs e l f - a s s e m b l e d m o d i f i e d g o l d e l e c t r o d ew i t i l m e r c a p t o a c e t i ca c i dw e r ep r e l i m i n a r i l ys t u d i e db yc y c l i cv o l t a m m e t r i ct e c h n i q u e t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tas e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e rw a sf o r m e do nt h es u r f a c eo fg o l d e l e c t r o d e t h i r d l y , an o sg e n ee l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o rw a sp r e p a r e db yc o v a l e n t l y i m m o b i l i z i n go fs i n g l e s t r a n d e dn o ss s d n as e q u e n c eo nt h em e r c a p t o a c e t i ca c i d m o n o l a y e rs e l f - a s s e m b l e dg o l de l e c t r o d ew i t ht h eh e l po fn 一( 3 一d i m e t h y l a m i n o p r o p y l ) - n 一e t h y l c a r b o d i i m i d eh y d r o c h l o r i d e ( e d c ) a n dn - h y d r o x y s u c c i n i m i d eo , a l s ) t h e e l e c t r o a c t l v ei n d i c a t o r , m e t h y l e n eb l u e ( m b ) ，i su s e dt om o n i t o rt h er e c o g n i t i o no ft h e d n a f o r t h l y , t h ei n t e r a c t i o nm o d e lo ft o l u i d i n eb l u e ) w i t | ls s d n a o rd s d n aw a s 青岛科技大学研究生学位论文 s t u d i e db yu v - v i sa d s o r p t i o ns p e c t r o p h o t o m e t r ya n dc y c l i cv o l t a m m e t r y t bh a d d i f f e r e n te l e c t r o c h e m i c a lr e s p o n s e so ns s d n a a uo rd s d n a a ue l e c t r o d ea n dt h e d i f f e r e n c eo fp e a kc u r r e n tc a nb eu s e df o rt h ed e t e c t i o no fc o m p l e m e n t a r ys s d n ai n t h es o l u t i o n f i f t h l y , t h ei n t e r a c t i o no fd n a 丽m m e t h y lv i o l e t ( m v ) w a si n v e s t i g a t e d b yl i n e a rs w e e pv o l t a m m e t r y u n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n s ，t h ed e c r e a s eo fr e d u c t i v e p e a kc u r r e n to fm v w a si np r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no ff s d n ai nt h el i n e a r r a n g eo fo 9 0 - 2 0 0m g la n dt h ed e t e c t i o nl i m i tf o rf s d n aw a s0 2 5m g lw i t ht h e r s da s4 0 0 s y n t h e t i cs a m p l e sw e r ed e t e r m i n e ds a t i s f a c t o r i l y k e y w o r d s ：e l e c t r o c h e m i s t r yb i o s e n s o r , d n am o d i f i e de l e c t r o d e ，m e t h y l e n e b l u e ，t o l u i d i n eb l u e ，m e t h y lv i o l e t 青岛秘技大学礤究生学髓论文 第章文献综述 脱氯核糖棱酸( d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，d n 麓遗传信怠豹蔑俸，爨有靛= l 擎 巍簧递镄怠黪凌戆，是重婺的生愈物痰，对它戆磷究程生愈科学中其有鬟要意义。 研究d n a 豹结构帮功髓，可戳簌分予承平主了瓣生意骣蒙的本鼷，瓣释药耪麓 作用机理。 d n a 的滚纯学疆究嫡予主彀纪5 。年我，最裙熬投灌法嚣茯安法工终主要鬃 中于d k 矗戆鏊奉逮晓攀行为懿疆究。瓣来磺突菠辍逐灏扩大鞫d n a 熬结秘黎彩 态分辑，d 淡与其它小分予、茏其是熊谈籀特定凝綦序列弱小分予或一些药物分 予之问相互作用及其机璁的研究，与生物大分子之间的相互作用殿其在艇因调控 遗程中静影旗，d n a 毫化学生穆薄感器、芯片麴研究等方蘧。d n a 宅纯学传感 器是匿静鞍热门的研究方向l t 罐l ，由予它其有选择憔好，灵敏凄巍，瓣试费用低 及抗于拢等优点，已被广泛应弼于研究d n a 的结构形态、碱懿膨列1 9 】、d n a 的 损伤1 1o ，1 、纂因诊断 1 2 , 1 3 l 、病毒检测及蛋自质镳的分析【1 5 】等诸多领域。 霹d n a 鬻燕熬分辍方法毒夔谱法、分毙瓷度法、荧是蠢度法、炎鼗射技零 及电化学法等，其中电他学方法是一个灌要领域，有关撮道较移1 6 耐8 j 。d n a 盼 研究通常包括；肘生物榉黼中d n a 的禽量进行测定，确定d n a 结构和碱基对序 捌，礤究坏辘申污染甥耩对d n a 损伤魂理，对p c r 产躲避嚣检测，爨及研究备 种夸分子鞠念鬣配合豹与d n a 糖戛佟阕等等许多方程。 1 1d n a 的组成和结构 核酸在化学上是多聚梭营黢，核祷黻是孛句成梭黢分子的基本结构单位，由碱 罄、戊糖和磷酸三部分缜成，纂中组成d n a 的碱慕包括腺嘌呤c a ) 、鸟嘌峰f g ) 、 您噻踺稻貔黢癌蓰国。并虽a 与譬熬量榛镰，g 乓c 戆量襁餐，蘩羰墓互蛰， d n a 静碱蒸疆成兵寄种的特异性，即不同生裙耪的d n a 其有舀穗独符瓣碱蒸缀 成【1 9 - 2 2 。 d n a 戆缝秘努兔一缀缝麴露空霹缭梅，一缀绩援楚峦数量羧英庞大瓣鏊耱艨 畿棱糖援蛰黢( 驻氧骧嘌岭梭萤黢、脱铽岛礤呤梭营麓、聪氧胞崤髓孩蛰羧和臁鬣 胸腺嘧啶核瞥酸) 通过3 ，s 磷酸二酯键连接起来的擞线形或环形多聚体。空间结 梅又努海二级缀梅蟊三缎缝擒，d n a 的二级结构就是它鹣双螺凝结椽，它豹稳定 自组装法制各d n a 电化学传感器的研究及应用 因素丰要有3 方面：( 1 ) 互补碱基对之间的氢键。虽然氢键是一个弱键，但d n a 中氢键数量大，所以氢键是比较重要的因素。( 2 ) 碱基堆积力。是一条链一k * g 邻 两个平行碱基环间的相瓦作用，这是来自芳香族碱基n 电子之间的相互作用，是 维持d n a 双螺旋结构稳定的主要因素。碱基堆积使双螺旋内部形成疏水核心， 从而有利于碱基间形成氢键。( 3 ) 离子键。磷酸残基上的负电荷与介质中的阳离 子之间形成静电作用，有利于双螺旋的稳定。碱基对与糖环的连接不是在碱基对 的相反两侧而是在同侧，这种不对称的连接导致双螺旋表面形成两个凹下去的 沟，宽的称为大沟，窄的称为小沟，大沟携带了其它分子能够阅读的信息f 碱基序 列、，沟足够大，能允许蛋白质分子进入。相比之下，小沟的信息较少些。d n a 的三级结构是指双螺旋基础上分子的进一步扭曲或再次螺旋形成的构向。 1 2 转基因植物产品 1 2 1 转基因产品的定义 转基因产品( g e n e t i c a l l ym o d i f i e do r g a n i s m ，g m o ) 是由转基因生物体和转 基因微生物生产出的产品。转基因生物体和转基因微生物是指遗传物质被改造的 生物体和微生物体。这些生物体的遗传物质( d n a ) 的改造不是通过杂交或自然 发生的遗传因子的重组产生，而是通过d n a 重组技术或遗传工程的方法将一种 生物体或一个物种的基因转移到另一种生物体或另一物种中1 2 3 j 。 1 2 2 转基因植物的发展概况 现代分子生物学技术的飞速发展，使转基因产品以极快的速度走向人们的生 活。随着转基因作物商业化生产的不断发展，大量的转基因农产品已经直接或间 接的被制作成为人类消费的食品，转基因食品的份额在食品市场中谁不断加大。 转基因植物产品的主要品种有玉米、大豆、土豆、油菜、棉花、西红柿等。转基 因作物可以提高作物产量、提高作物产品质量、增加叶绿素水平、改变激素水平： 还可以耐旱耐寒、抗昆虫、抗病毒、抗除草剂等。转基因作物的迅猛发展，对人 类的意义极其重大。转基因作物采用率的迅速增加，将带给种植者更加便利、灵 活的管理措旋，更高的产量和回报，更加有利于农业的可持续发展，对于整个世 界来说，这无疑是一个巨大的福音。 1 2 3 转基因植物的安全性问题 随着转基因产品逐渐走进人民日常生活，转基因产品的安全性及其对生态环 2 黧墅茎热盔燮生翌堡建塞 一 境的影响，也弓l 起了民众、各国政府和图际组织的广泛关注。多个圈际组织达成 了宵关翁谈定书、揍设帮攒蹲往蒙受| j ，并邑有3 6 令濒家鞫建区出念了各静与转 鍪困产品裔关的法律法蕊。我国墩子2 0 0 1 年公京并蜜藏农、监转嫠函生物安全 黪瑾条镄。瓷砖戮转基黧产品熬安全能及其对生态环境的影响，转基躐产品从 研究、生产、储存、运输、销售、进出秘等各个环节部需要检验监控，不但要求 梭溺窭是器是转鼙强产品，楚盼么器系，蠢显要戆准确、方硬、浚捷遣羧涎器转 旗因产品的含髓。因此，歼展对转基因产品的检测方法的研究非常必要。 转基因撼物从其诞生开始，众球社会和公众就产生了它可能饿辔安全健康和 繇凌懿翅挽，其争论一直采鹭泞惑。因诧，在转蓥潮糖辫产品造辅人类熬溺对， 我霄j 必须溪蠢穗应静安全稔灏措旅。植物转基因惩，外源基因是落进入巍疆耨缁 胝，迸入疆褥绷臆的外源麓因是否整合剁植耪染龟体上，整合静方式强鼹，整禽 刹染色体上的外源基因是落表达，这些都是确定转基因植物是否安全和是否对生 态琢壤产整影响敷邂裂鳃一个蓄要翅怒，这争逼题的解决只有靠凇穗懿撩潮鉴定 2 4 1 。 1 2 4 转蒸因攘麴羽捡溅方法 综食鬻鼹蠼器各匿转潦毽产菇抟梭灏技术，搬摇稔溅嚣蠡主蘩分成菇下三个 类型：检测转基因产品捅入外源基因、检测外源撼因袭选物、检测插入外源基困 瓣鼗髂綦濯裘这麴影蛹。程蔻强移类型豹检测工撵中所涉及豹检测疆标媳括三类 貔矮：d 迭、r n a 霹虽蠢蕊。凌手对簿三类鳖稳溅液零毫、糕辩妖，程实嚣箍 测工终中涉及较少。 对于蛋白质的检测主嚣用j 靓清学方法，由于有熬转鏊因产黼不表达激自潢， 成表达爨币稳定，或加工成产晶时被破坏，血清学梭测方法仅在个别转基因产品 梭溺中被波瑶。辩于d n a 秘r n a 豹检溅蔓要采臻p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ， 骥合酶链式爱成) 及基因芯片等耀因检测技术。p c r 技术是近年来发展迅速、成 嗣较广瀚项鏊隧硷溺技术；它碰用一荦申在体筛幽弓l 糖介导黪d n a 聚合酶餐像 豹聚合疑寝，鲢够在短辩麓是抉速准确瓣将钰秘令翳的痔刭夫爨复翻，健 鬻 少藿酶d n a 窿确大量扩增，这戮实验所能检测蕊数鬣。雳p c r 技术硷测转蒸蹰 食品中的外源旗因，主要戗括三个步骤：( 1 ) 外源纂因的分离和搬取。转基因食 赫麴静类不鞠，分鸯舞取辨源基爨懿具体方法迄不竞惫辍嗣。( 2 p c r 扩蠼反褒。 搬据转蒸藏食貉中餐澡鼙蔽熬耨熹，设诗并会纛穗藏豹雩| 秘，控潮逶宣翡交毪、 遐灭及慈律基黩祭锌，戳艨努离戆多 滚慧邋d n a 必模叛在p c r 纹中遴行p c r 扩增反应。( 3 ) p c r 扩增产物的检测。采用适当的方法对p c r 扩增产物进行分 耩，扩矮爱敷的产物与势源蒺嚣片段籀弼，表鞠该食懿中含套捧滚基因，可 奠剡 3 鑫缎装法涮备d n a 电袍学健感器的蟒究及癍嗣 定为转基因食品。楣反，如紧p c r 扩增反应熬产物与外源基因片段不相同，则表 明该食品样品中不古有此类外源基因，可以判定为非转基因食品。旗因芯片技术 是将大量的鏊因或基因片段通过特嫌仪器的机器手有序的、高密魔的排歹i 在玻 璃、硅或尼龙膜载体上，制成基困芯片，将待测的d n a 与基因芯片杂交，然后 对杂交结果逃行检测。这两种方法虽然较普遍，测定结果也较准确，但所用仪器 昂贵，检测成本高，样品预鲶理过程较复杂，且传统p c r 方法只能定性韵分析出 外源基因的有无，至于含有儿种外源潺因的种类则很难鉴定，定量检测也很困难， 基因芯片技零也饺箍于发展中。这两稀技术疆蓠还蘸于在一般实验室推广癍霜。 1 2 。5 转基爨疆羲产鹣毫证擎生稳费燕器豹鞲究 电分析化学方法具有很多优点，如准确陡好、灵敏度商、检测方便快速、仪 器铨穰低纛，且特别逶瘸手表嚣过程、掺镑魄掇、魄子转移过程等躲磅突。电分 析化学用于d n a 的研究已有了重要的进展，如电分析化学研究d n a 的结构形态 与碱蒸彦烈，d n a 黪损蝮与基因诊黪，d n a 与其趣餐类金糕离子、金属螯会耱、 各种小分子物质相互作用等。d n a 电化学生物传感器特别适用于具有特定序列 d n a 的研究，具有的序歹l 选择性能快速检测d n a 序列，且成本低，易于集戏诬 和自动化。将电化学生物传感器技术与分子嫩物学技术相结合，研制新型的转基 因植物产品电化学生物传感器，预期可以发展一种检测转基因植物产品的辨方 法，并可获褥一些重霾的理论成果。焦奎等人在这方面做了较多的工作，如采用 自组装单分子膜法制铸了筑熬乙酸修饰金电极，以忍基f 3 二甲基丙基) 碳二贬胺 盐酸簸( e d c ) 洋i ln - 羟薤琥珀酰亚胺d i 壬i s ) 为浠亿帮，将转基戮n o ss s d n a 净列固 定于金电极表面，制铸了转撼因植物电化学传感器，并应用予n o s 基因序列的 检灏；或者将石墨耪、固俸石蜡帮疆脂酸按一定眈稠混合，稠用组合法铺得了纯 学修饰碳糊电极，该电极表面富含羧基，然后以恒电位富集法在电极表面组装荷 正奄鹣铝毒予貘，宅穗渡逶避静电蔽辫法将s 翥d 醴探针嚣是予毫摄袭鑫，遴薅应 用于转基因植物中勘恹和e p s p s 基因的检测。 1 3d n a 毫纯学生麴传髅器懿磁制和应用 1 3 1d n a 生镄黄黪豢弱基本继梅疑努类 d n a 生物传感器主要由两个部分组成，一是由d n a 探针构成的感应器，二 是换糍器。d n a 探铮一般是人工合成的单键d n a ( s s d n a ) 片 ，其碱基痔熨与靶 4 青岛科技大学研究嗽学位论文 基鞠瓣溅基_ 亭歹l 嚣 。换娆瑟蕊臻能是垮d n a 杂交信感转换为可测定绩号，如 光响应的差异或墩响应的差异，根据信号差舞可以定性定攮检测靶基因。 根据换能器的不同，可将d n a 生物传艨器分为三类 d n a 压电传感器， d n a 光学传感器和d n a 电化学传感器。葵中d n a 电化学传感器因其具有 受嚣浚于撬小，惫信号潦量玩较篱蕈，不嚣要激光诱导或精密戆分瓷器箨 等装鼹和仪器成本低等优点，是最有发展前景的一类d n a 分析方法i 2 ”。 1 3 2d n a 电化攀簌穗传感豢鹩原理 d n a 电话学传感器是戳电极为换能器，将一定长凄f 通常为蔻卡至g 几千个碱 基1 的单链d n a ( s s d n a ) 片段固定到电极( 如垒电极、玻碳电极等) 表面，形成d n a 探针，在一定的温度、离子强度、p h 等条件下，这种d n a 探针上的s s d n a 与 溶液中与之互零 瓣轻d n a ( c d n a ) 发生特雾豹选择牲杂交，杂交缍莱形液双链 d n a ( d s d n a ) ，这种转变的结巢通过电活性杂交指示剂所引起的电压，电流或电 导等电信号的变化体现出来，从而可对特定序列的靶基麟进行定性定锻检测【2 6 】。 应嗣d n a 电化学传感器进行分摄时主要步骤如下：( 1 ) d l a 探针的圈定，即 要将s s d n a 连谈域者雷定瓢一个露俸毫裰静表面，形藏d 渔探钎奄辍。 a n d m e r c a p t o a c e t i e a c i d s a m 绉) e l e c t r o d ei n0 ，1m o l lk c lw i t hs c a nr a t ea s 】0 0m v ，s 青岛科技大学研究生学位论文 2 2 3 巯基乙酸自组装修饰电极在i f e ( c n ) d 。溶液中的电化学行为 将裸金电极与巯基乙酸自组装修饰金电极置于5 0m m o l l k 3 f e ( c n ) 6 0 1 m o l l k c i 溶液中，进行c v 测试，结果见图2 3 。由曲线1 可知，当裸金电极在 上述溶液中进行循环伏安扫描时，有一对可逆的氧化还原响应，这是 f e ( c n ) 6 】“+ 电对在金电极上的电化学行为。在裸金电极上，阳极峰电位和阳极峰电流都较大 且( 印“l p c = 1 ) ，峰电位的差值a 印= 0 0 6 4 m v ，这表明【f e ( c n ) 6 】“4 。电对在金电极 上的反应是电化学可逆反应的本质特征。曲线2 为s a m 膜修饰电极在上述溶液 中的电化学行为。在s a m 膜修饰电极上，阳极峰和阴极峰电流都比相应的裸金 电极上的峰电流要明显降低，而且阳极峰峰电位相对于裸金电极的阳极峰电位惟 移，阴极峰电位相对于裸金电极的阴极峰电位负移，峰电位的差值印= o 1 4m v 。 这说明巯基乙酸已经在金电极表面形成一层自组装膜，抑制了 f e ( c n ) 6 1 ”4 。向会电 极表面的扩散，对w e ( c n ) 6 1 ”4 电子转移起到了明显的阻碍作用。 主 蕊 e 图2 - 3 裸金电极( 1 ) 和a u ，巯基乙酸电极( 2 ) 在5 0m m o l l k 3 f e ( c n ) 6 0 1m o l lk c l 溶液中的 循环伏安图，扫速1 0 0 m v s f i g 2 - 3c y c l i cv o l t a m m o g r a m so f b a r e a ug o l d ( 1 ) a n dm e r c a p t o a c e t i ca c i ds a me l e c t r o d e ( 2 ) i n5 0m m o l l k s f e ( c n ) 6 o 1m o l lk c is o l u t i o nw i t hs c a nr a t ea s1 0 0m w s 考察了s a m 膜修饰电极在 f e ( c n ) 6 】3 抖中扫速对峰电流的影响，结果见图 2 - 4 。随着扫速的增加，阴极峰和阳极峰电流逐渐增大。在5 0 2 0 0 m v s 范围内 求解了峰电流与扫速的关系，对于阴极峰，i p c ( 肛a ) = 0 1 3v + 1 8 8 4 ( 肝= 6 ，尸o 9 9 4 7 ) ； 对于阳极峰，i p a ( p a ) = - 0 1 2p 一1 5 9 0 ( n = 6 ，y - - = ( ) 9 9 0 4 ) 。 t 3 组装法锎蓊d n a 电匏学倍感器的酶巍艇疲豫 阕2 - 4 扫速对峄电流的影响 f 培2 - 4i n f l u e n c eo f s c a nr a t eo np e a k 吼埘e n t f r o ml 姆6 一s 税耱1 8 0 , 1 0 0 , 1 5 0 , 2 0 0 r o w s 考察扫速与媾逛位的关系，结果表嘲，随着扫速鹣蹭艇，阴极酶鞫辩稷蜂之 间的间距增大，但其点电位 e a c = ( e a + e c ) 2 彘t 基本不变，考察了印a 、邬“4 邱 ( e p a - e p c ) 、e a c 等参数与据速匏关系，结粱见图2 s ，这说明该腆媳投的电化 擎蔽应是邀予转移速率疆豹邀纯擎爱盛，邀予傣逶运誊怒滚反痊蕊捩逶步骤。 0 4 0 0 3 5 0 。3 0 0 2 5 潞0 2 0 0 ，l o ，1 0 o 0 5 0 ， oi 0 0 2 0 03 0 04 0 05 0 06 0 0 7 0 0 p m v s 嘲2 “5 峰电位岛缸速的关系 f i g 2 - 5t h er e l a t i o r t s h i po f p i kp o t e n t i a ! a n ds e a t lr a c e 煮璺型垫查堂塑塞生堂垒笙苎 2 3 、结 巯基乙酸可以在金电极上自组装形成稳定的单分子膜，组装后的电极双电层 电容减小，表明膜的致密性较好。在5 , 0m m o l l 【k 3 ( c n ) 6 】溶液中，s a m 膜对 f o ( c n ) 6 3 - t 4 一的氧化还原行为起到阻碍作| 碍j 。由于该膜上具有良好的留能团，可以 避步应焉予s a m 为基底鹣传感嚣静设计与应蘑，对予迸一步器秀究蠢序擎分子 膜对于生物分子的固定及界谳电子转移机理提供了良好的基础。 白组装法制备d n a 电化学传感器的研究及应用 参考文献 【1 】1 吴迪，吴健，金硫键自组装生物分子膜 j 】 化学通报，2 0 0 4 ( 2 ) ：1 3 2 1 3 7 2 】李俊新，崔晓丽，童汝亭，金上硫醇自组装膜研究进展【j 】，河北师范大学学报( i h 然科学 版) ，2 0 0 0 ，2 4 ( 2 ) ：2 3 8 - 2 3 9 【3 3 顾仁敖，孙如，曹佩根等，u 巯基己酸自组装修饰金电极及其对叶绿素的催化氧化还原 作用 j j ，光谱学与光谱分析，1 9 9 9 , 1 9 ( 1 ) ：5 0 - 5 2 【4 】杜丹，f 升富，黄春保，l 、 胱氨酸修饰金电极对邻苯二酚和对苯二酚的电催化及分析 应用【j 】，分析测试学报，2 0 0 1 ，2 0 ( 5 ) ：1 8 - 2 0 5 】阮北，鲁彬，蕈汝亭等，白组装巯基环肽单层膜修饰金电极电化学行为的研究 j l ，河北师 范大学学报( 自然科学版) ，2 0 0 3 ，2 7 ( 5 ) ：4 8 4 - 4 8 7 6 1 傅崇岗，苏昌华，单瑞峰，l 、卜胱氨酸自组装膜修饰金电极的电化学特性 j 】，物理化学学 报，2 0 0 4 ，2 0 ( 2 ) ：2 0 7 2 1 0 【7 贾莉，孟娟，张修华等，l 半胱氨酸自组装膜修饰电极对对氨基酚电催化氧化及其分析 应用【j 】，分析科学学报，2 0 0 3 ，1 9 ( 6 ) ：5 0 7 - 5 1 0 【8 】张修华，王升富，2 - 巯基乙醇自组装膜电极对多巴胺电催化氧化及其分析应用【j 】，分析化 学研究报告，2 0 0 3 ，3 0 0 1 ) ：1 3 1 2 1 3 1 5 【9 】王慧云，郁章玉，孙勤枢等，高半胱氨酸s a m 膜电极的制备及其电化学行为研究【j 1 ，曲 阜师范人学学报，2 0 0 3 ，2 9 ( 1 ) ：8 5 - 8 7 【l o 周翠凤，李红，李伟善，6 巯基嘌呤自组装膜的制各及其电化学行为表征【j ，传感技术学 报，2 0 0 2 ，1 2 ( 4 ) ：3 0 2 - 3 0 6 重墨型垫盔堂塑塑兰兰笪堡塞 c o n s t r u c t i o na n de l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o u r so f m e r c a p t o a c e t i ca c i ds e l f - a s s e m b l e dm o d i f i e dg o l d e l e c t r o d e a b s t r a c t ：t h eg o l de l e c t r o d ew a sm o d i f i e dw i t hm e r c a p t o a c e t i ca c i dt of o r n la s e i f - a s s e m b l e dm o d i f i e dg o l de l e c t r o d eb a s e do nt h es t r o n gi n t e r a c t i o no f - s hw i t h g o l ds u r f a c e t h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r so ft h i ss e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r ( s a m ) e l e c t r o d ew e r ep r e l i m i n a r i l ys t u d i e db yc y c l i cv o l t a m m e t r i ct e c h n i q u e t h er e s u l t s s h o w e dt h a tas e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r ( s a m ) w a sf o r m e do nt h es u r f a c eo fg o l d e l e c t r o d e 【f e ( c n ) d 3 i t e d o xc o u p l ew a sf u r t h e ru s e da st h ee l e c t r o c h e m i c a lp r o b et o s t u d yt h ee l e c t r o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c so ft h i ss e l f - a s s e m b l e dm o d i f i e d g o l d e l e c t r o d ea n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee x i s t e n c eo fm e r c a p t o a c e f i ca c i dm e m b r a n c e o nt h eg o l ds u r f a c eh i n d e rt h ee l e c t r o nt r a n s f e r k e yw o r d s ：m e r c a p t o a c e t i ca c i d ；s e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r ( 幽l m ) ；g o l de l e c t r o d e ； e l e c t r o c h e m i s t r y ； f e ( c n ) 6 3 4 。 自塑茎鲨型鱼! 坠皇些堂垡堕矍盟堕塑墨壁生 第三章巯基乙酸自组装膜d n a 电化学传感器检测转基因 n o s 序列的研究 摘要：采用自组装单分子膜法制备了巯基乙酸自组装修饰金电极，利用乙基一( 3 - 二甲基丙基) 碳二亚胺盐酸盐( e d c ) 和n 羟基琥珀酰亚胺( n h s ) 为活化剂，以转基 因植物中常用的根癌农杆菌终止子( n o s ) 基因片段为研究对象，将其相应探针 ( s s d n a ) 司定在电极表面制备了n o s 序列基因电化学传感器。该传感器可以和溶 液中待测基因序列片段进行识别和分子杂交，以亚甲基蓝为杂交指示剂，用循环 伏安法检测杂交前后其峰电流的变化，进而可用于n o s 基因片段的测定，线性 范围为5 o x l 0 8 。1 0 x 1 0 。4m o l l ，检测限为3 6 0 x 1 0 一m o l l 。采用紫外可见光谱和 电化学法对亚甲基蓝与d n a 相互作用的识别模式进行了详细的探讨。 关键词：电化学基因传感器；巯基乙酸；n o s 基因；亚甲基蓝；自组装膜 d n a 电化学传感器是将单链d n a ( s s d n a ) 片段固定在电极表面形成d n a 探针，其与目标d n a 在适当的杂交条件下发生特异性杂交形成双链 d n a ( d s d n a ) ，进而可以用各种电化学方法进行检测，它结合了电分析化学和 d n a 分子杂交的特点，具有灵敏度高、特异性好、仪器价格便宜、操作简单等优 点，在基因检测、药物分析、环境监测等方面有着很好的应用前景f m 】。在制备 d n a 传感器时s s d n a 的固定化是最关键的一步，常用的固定方法有吸附法【3 】， 共价键合、法【4 5 1 ，自组装法 6 , 7 1 ，生物素一亲和素法【8 l ，组合法【9 】等。自组装法是根 据分子的自组装作用，在电极表面形成高度有序的s s d n a 单分子层，通常是利用 毓基化合物修饰寡核苷酸探针自组装于金电极的表面形成单分子层或是用巯基 化合物自组装会电极后共价键合s s d n a 。庞代文【10 】等比较了巯基乙醇、半胱胺和 巯基丙酸三种硫化物自组装单层固定d n a 的效果；j u l l l 】等将半胱胺在金电极表 面自组装形成单分子膜，再用水溶性的碳化二亚胺作为偶联活化剂，使s s d n a 的5 端磷酸基与电极表面活化后的氨基以磷酸氨酯键的形式共价结合，而在金电 极表面形成s s d n a 单分子层。转基因产品是通过d n a 重组技术或遗传工程的方 法将一种生物体或一个物种的基因转移到另一种生物体或另一物种中。随着转基 因产品逐渐走进人民日常生活，转基因产品的安全性及其对生态环境的影响，引 青岛科技大学研究生学位论文 起了民众、各国政府和国际组织的广泛关注，世界上许多国家对转基因食品的研 究、开发、生产与销售等各个环节制定了严格的管理条例，因此，开展对转基因 产品检测方法的研究非常必要【1 2 】。 本文以转基因植物中常用的根癌农杆菌终止子( n o s ) 为检测对象，采用自组 装技术，将巯基乙酸自组装于金电极表面形成巯基乙酸自组装单分子膜，再利用 乙基( 3 一二甲基丙基) 碳二亚胺盐酸盐( e d c ) 和n 羟基琥珀酰亚胺( n h s ) 的活化作 用使羧基与3 ，端羟基形成磷酸酯键而共价结合，制备出在金电极表面固定上n o s 探针序列蟠d n a 单分子层的n o s 基因序列电化学生物传感器，以亚甲基蓝( m b ) 为杂交指示剂，对n o s 靶基因相关序列进行了定量检测，并详细探讨了m b 对 s s d n a 和d s d n a 的识别作用机理。 3 1 实验部分 3 1 1 仪器与试剂 l k 9 8 a 微机电化学分析系统( 天津兰立科化学电子高技术有限公司) ，三电 极系统：修饰或未修饰的金电极为工作电极( m = 2m m ) ，饱和甘汞电极( s c e ) 为 参比电极，铂丝电极为对电极；c a r y5 0p r o b e 型紫外可见分光光度计( 澳大利 亚v a r i a n 公司) ；p h s 2 5 型p h 计( 上海雷磁仪器厂) 。 天然鲱鱼精d s d n a ( f s d n a , 北京经科试剂公司) ，根据d s d n a 的热变性性 质，将鲱鱼精d s d n a 溶液在沸水浴中加热1 0m i n ，然后转移到水浴中冷却，制 得鲱鱼精单链d n a ( s s d n a ) 。乙基( 3 一二甲基氨丙基) 碳二亚胺盐酸盐( e d c ， 美国s i g m a 公司) ，n 羟基琥珀酰亚胺( n h s ，中国医药集团上海化学试剂公司) ， 亚甲基蓝( m b ，中国医药集团上海化学试剂公司) 。p b s 缓冲溶液：2 0m m o l l 的磷酸盐( k h 2 p 0 4 + n a o h ) ，p h7 0 ：t r i s 缓冲溶液：5 0m m o l l t h s + 2 0m m o l l n a c l ，p h7 2 ：2 x s s c 杂交缓冲液：3 0 0m m o l l n a c l + 3 0m m o l l 柠檬酸钠，p h 7 o ；其余试剂均为分析纯，实验用水为石英二次蒸馏水。 根据d s d n a 的热变性性质，将鲱鱼精d s d n a 溶液在沸水浴中加热1 0r a i n ， 然后转移到水浴中冷却，制得单链d n a ( s s d n a ) 。 2 5 个碱基的s s d n a 探针序列：5 - a a tg a tt a at t gc g g g a ct c ta a t c 一3 ；目标基因序列( n o s 终止子的2 5 碱基互补单链d n a 片段，c d n a ) ： 5 - g a tt a ga g tc c cg c a a 兀丸盯c a tt - 3 ；2 个碱基错配序列( t w o b a s e s m i s m a t c h d n a ) ：5 i g a = r t a g a c t c c c g c a a t r t a t c a t t 3 t ；非互补s s d n a ( n o nc o m p l e m e n t a r yd n a , n c d n a ) ：5 - t g cc c a c a ct g ac g gc g c c c a 蜜组装法翻备d n a 电证擎俦感器的礤究及麻用 t c cc 3 - ；基因片段由上海生工生物工程技术有限公司合成，p a g e 纯化。 3 1 。2 实验方法 3 1 2 1 嬲d n a 熬豳传盛器的制酱 穆金毫辍放在p i r a n h a 滚滚( 3 0 强h 2 0 2 号浓珏2 s 瓴髂援魄3 ：7 ) 中煮沸5m i n ， 然后用0 0 5p ma 1 2 0 3 悬浊液抛光，使金电极表面形成光滑镜面。在l ：l 的h n 0 3 溶液中浸泡3 0m i n 后超声2r a i n ，即可得到表面清洁的裸金电极。将已抛光的裸 会魄缀浸入5 。0 m l l 0 0 m m o l l 巯基乙酸溶液中，在蹙瀣条件下避光组装2 4 h ， 取溺后在东中浸泡2 0 m i n ，帮褥至4 巯墓乙黢叁组装貘修饰金电辍。将s a m a u 电 极浸入含有5 0 m m o l l e d c 和8 0 m m o l l n h s 的p b s 溶液中3 0 m i n ，使电极表 面活化后浸入含有s s d n a 的p b s ( p h7 0 ) 溶液中，2 5 条件下恒温1 2h 后即 可褥到s s d n a a u 毫辍。 3 1 2 2d n a 的旃 f 交反应 将s s d n a a u 电极浸入含有互补序列s s d n a 的2 x s s c 杂交缓冲液巾，在6 0 0 1 7 馕滋承浴中援羚杂交1h ，然麓在承浴中缓後冷却，毫檄表嚣豹攘钟s s d 醴瑟与 对_ 陂互补序列发生杂交反应得到d s d n a a u 电极。将呶极取出后用0 2 的s d s 溶液清洗2 m i n 后备用。 3 1 。2 3 电亿学测定 杂交后的d s d n a a u 为工作电极，将戴放入含有1 5 1 0 4 i n o l l 的m b 的p h 6 0 的b - r 缓冲溶液中，浸泡8r a i n 后，用l k 9 8 a 微机电化学分析系统记录循环 佼安癌线，稷豢杂交藩螽蜂奄滚豹交证溺定互蛰s s d n a 豹浓凄。纹瓣条髂：扫速 1 0 0 0m v s ，捆播范围0 0v 0 4v 。 3 2 结果与键论 3 2 1 亚甲基蓝对单双链d n a 的分子识别作用研究 巍辔是一耱鬻麓予d n a 魄纯学传惑黎懿杂交稽示裁f 删，它是一种酚噻嗪类染 料，文献报道其与d n a 的作用有嵌插模式和静电模式。本文分别利用光谱和电 化举研究了其与天然鲱鱼精s 8 d n a 和d s d n a 的作用模式。图1 ( a ) 为m b 与d s d n a 青岛科