（内科学专业论文）低浓度依托泊苷通过mdm2rb信号途径诱导a549细胞衰老的研究.pdf

j t 目的：本实验利用依托泊苷( v p 1 6 ) 作用于体外培养的人肺腺 癌a 5 4 9 细胞，探讨低浓度的v p 1 6 是否能诱导a 5 4 9 细胞衰老；通 过检测磷酸化r b 蛋白、m d m 2 蛋白的表达水平和细胞周期分布，探 讨m d m 2 r b 信号通路在细胞衰老中的作用，以深入低剂量节律 ( l d m ) 化疗机制的研究。方法：将a 5 4 9 细胞分为4 组：对照组( 单 细胞悬液+ 培养基) 、实验1 组( 单细胞悬液+ 含1l am v p 1 6 的培养 基) 、实验2 组( 单细胞悬液+ 含5 1 1m v p 1 6 的培养基) 、实验3 组( 单 细胞悬液+ 含2 5i im v p 1 6 的培养基) 。各组细胞培养4 8 小时后分别 进行噻唑蓝( m t t ) l k 色试验，观察v p 1 6 对人肺腺癌a 5 4 9 细胞增殖 的影响；细胞化学方法检测衰老相关b 半乳糖苷酶的活性；流式细 胞术检测v p 1 6 对人肺腺癌a 5 4 9 细胞周期分布的影响；免疫细胞化 学方法检测磷酸化r b 蛋白和m d m 2 蛋白的表达。结果：不同浓度的 v p 1 6 ( 0um 、1i lm 、5pm 、2 5 | lm ) 作用于a 5 4 9 细胞4 8 小时后， 对照组细胞生长旺盛，呈丛簇状排列，细胞呈长梭形或多边形，细胞 形态饱满，胞质丰富，胞核居于细胞中央：实验1 组细胞生长受到轻 微抑制，与对照组相比细胞形态无明显改变；实验2 组细胞多散在或 呈小堆排列，细胞皱缩呈圆形、卵圆形或多角形，或升出伪足，胞质 减少；实验3 组细胞生长受到明显的抑制，部分细胞变圆、浮起，活 细胞形态与对照组相比无明显改变。不同浓度的v p 1 6 ( oi j m 、1 i lm 、5l lm 、2 5l am ) 作用于a 5 4 9 细胞4 8 小时后，随着浓度的增 大细胞的增殖抑制率逐渐升高，各组间比较有明显差异( p o 0 5 ) 。结论：0 3 在体外，低浓度的v p 1 6 能增加人肺腺癌细 胞株a 5 4 9 细胞中衰老相关1 3 半乳糖苷酶的活性，诱导a 5 4 9 细胞衰 老；低浓度的v p 1 6 能减少磷酸化r b 蛋白和m d m 2 蛋白的表达， 使细胞周期停滞于g 1 期；低浓度的v p 1 6 可能通过m d m 2 r b 途 2 径，使细胞周期阻滞于g 1 期，从而诱导细胞衰老。 关键词：依托泊苷；细胞衰老；细胞周期；治疗；i ；m d m 2 t h er e s e a c ho fl o wc o n c e n t r a t i o no f e t o p o s i d ei n d u c i n gt h e s e n e s c e n c eo fa 5 4 9c e l l sb ym d m 2 一r b s i g n a lp a t h w a y a b s t r a c t ：o b j e c t i v e ：t o o b s e r v el o wc o n c e n t r a t i o no fe t o p o s i d e i n d u c et h es e n e s c e n c eo fc u l t u r e dh u m a nl u n ga d e n o c a r c i n o m aa 5 4 9 c e l l st r e a t e dw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fe t o p o s i d ei nt h i ss t u d y t o r e s e a r c ht h er o l eo fm d m 2 一r bs i g n a lp a t h w a yi nc e l ls e n e s c e n c ea n d m e c h a n i s mo flo w d o s em e t r o n o m i cc h e m o t h e r a p yb yd e t e c t i n g t h e e x p r e s s i o no fp h o s p h o r y l a t e dr bp r o t e i n ，m d r n 2p r o t e i na n dc e l lc y c l e d i s t r i b u t i o n m e t h o d ：a 5 4 9c e l l sw e r ed e v i d e di n t of o u rg r o u p s ：c o n t r o l g r o u p ( c e l l s + c u l t u r em e d i u m ) ，e x p e r i m e n t a lg r o u p1 ( c e l l s + m e d i u m c o n t a i n i n g 1l ame t o p o s i d e ) ，e x p e r i m e n t a l g r o u p2 ( c e l l s + m e d i u m c o n t a i n i n g 51 tme t o p o s i d e ) ，e x p e r i m e n t a l g r o u p3 ( c e l l s + m e d i u m c o n t a i n i n g2 5 1 tm e t o p o s i d e ) t h ec e l l sw e r ec u l t u r e df o r4 8h o u r sf o r t e t r a z o l i u m ( m t t ) c o l o r i m e t r i ct e s t i n go fa 5 4 9c e l l sp r o l i f e r a t i o n ； c y t o c h e m i c a lm e t h o d st e s t i n go fs e n e s c e n c ea s s o c i a t e d b - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y ；f l o wc y t o m e t r yt e s t i n go fc e l lc y c l ed i s t r i b u t i o n ；i m m u n o c y t o c - h e m i c a lm e t h o d st e s t i n go f t h e e x p r e s s i o no fp h o s p h o r y l a t e dr bp r o t e i n a n dm d m 2p r o t e i n r e s u l t s ：( ! ) c o n t r o lg r o u pc e l l sg r e ww e l l ，s h o w e d r o s e t t e l i k ea r r a n g e m e n to fs p i n d l eo rp o l y g o n a lc e l l s t h en u c l e u sw e r e i nt h ec e n t e ro ft h ec e l l s c o n t a i n i n ga b u n d a n tc y t o p l a s m t h eg r o w t h 4 i n h i b i t i n go fe x p e r i m e n t a lg r o u p 1c e l l sw a s s l i g h t l y t h ec e l lm o r p h o l o g y h a dn o s i g n i f i c a n tc h a n g ec o m p a r e dw i mc o n t r o lg r o u pc e l l s t h e e x p e r i m e n t a lg r o u p2 c e l l sw e r em o r es c a t t e r e d ，a r r a n g e di ns m a l l p i l e s ，c e l l ss h r i n k a g e ，r o u n d ，o r b i c u l a r - o v a t e o r p o l y g o n a l ，c y t o p l a s m r e d u c t i o n s o m ec e l l sh a dp s e u d o p o d i u m t h eg r o w t hi n h i b i t i n go f e x p e r i m e n t a lg r o u p3c e l l sw e r eo b v i o u s s o m ec e l l sw e r er o u n d ，f l o a t e d o nt h ef l u i d t h em o r p h o l o g yc h a n g eo ft h el i v i n gc e l l sw e r en o to b v i o u s c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u pc e l l s ( 墓) c e l lp r o l i f e r a t i o ni n h i b i t i o nr a t e i n c r e a s e dg r a d u a l l yw i t ht h ei n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o na n dl a s t i n ga c t i o n t i m ei nt h ea 5 4 9c e l l st r e a t e dw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fe t o p o s i d e ， t h ed i f f e r e n c ea m o n gt h ef o u r g r o u p sb e i n gs i g n i f i c a n t ( p 0 0 5 ) s e n e s c e n tc e l l s p e r c e n t a g e i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l ya m o n g t h e e x p e r i m e n t a lg r o u p sc o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u pc e l l s ( p 0 0 5 ) t h e p e r c e n t a g e o fg 1 - p h a s e c e l l so fe x p e r i m e n t a lg r o u p2i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y w h i l e e x p e r i m e n t a lg r o u p 3d e c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y ( c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p ，p o 0 1 ) t h ep e r c e n t a g eo fs p h a s ec e l l s o fe x p e r i m e n t a lg r o u p2d e c r e a s e d s i g n i f i c a n t l yw h i l ee x p e r i m e n t a lg r o u p 3i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y ( c o m p a r e d w i t hc o n t r o l g r o u p ，p o 0 5 ) t h ee x p r e s s i o no fp h o s p h o r y l a t e dr bp r o t e i na n d m d m 2p r o t e i ni ne x p e r i m e n t a lg r o u p2d e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yi nc o n t r a s t t ot h eo t h e r s ( p 0 0 5 ) c o n c l u s i o n ：o i nv i t r ol o wc o n c e n t r a t i o no f e t o p o s i d ec a l l i n c r e a s et h ea c t i v i t yo fs e n e s c e n c ea s s o c i a t e d f l - g a l a c t o s i d a s ei nh u m a n l u n ga d e n o c a r c i n o m ac e l ll i n ea 5 4 9c e l l s ，i n d u c i n gc e l ls e n e s c e n c e l o wc o n c e n t r a t i o n o f e t o p o s i d e c a l ld e c r e a s e t h e e x p r e s s i o n o f p h o s p h o r y l a t e dr bp r o t e i na n dm d m 2 p r o t e i n ，l e a d i n gt og 1a r r e s t l o wc o n c e n t r a t i o no f e t o p o s i d em a yl e a d i n gt og 1a r r e s tb ym d r n 2 r b s i g n a lp a t h w a y , i n d u c i n gc e l ls e n e s c e n c e k e y w o r d s ：e t o p o s i d e c e l ls e n e s c e n c e c e l l c y c l e t h e r a p y r b m d m 2 6 上- j - 刖蟊 肺癌被认为是当今世界上对人类健康与生命危害最大的恶性肿 瘤。作为癌症中的第一杀手，其治疗相当困难。我国肺癌的5 年生存 率仅1 0 ，8 0 的肺癌患者在临床确诊时已经失去手术机会，等待生 命的终结。在过去的半个多世纪里细胞毒化疗药物的应用是以达到破 坏肿瘤细胞为目的，这种以最大耐受量( m t d ) 为基础所设计的化 疗方案是通过损伤肿瘤细胞d n a 复制或代谢的酶来干扰细胞的分 裂，从而达到抗肿瘤作用，是肿瘤综合治疗的重要组成部分。 但这种m t d 方案毒副作用大、费用昂贵，患者不易耐受，常常 导致化疗中止。由于化疗间歇期长，处于间歇期时，接受其供养的未 被杀死的肿瘤细胞恢复和生长，导致肿瘤的复发与耐药。从而至今未 取得满意成绩，因此寻找新的突破口已迫在眉急。 目前研究认为：一些化疗药物在采用小剂量( 通常是最大耐受量 的1 1 0 - 1 3 ) 、长时间连续或高频率给药模式时，能明显提高病人的 生活质量，延长生存期，人们将这种化疗方法命名为低剂量节律 ( l d m ) 化疗【1 捌。 与传统化疗相比，低剂量化疗具有很多优点，如：( 1 ) 毒副作用 小；( 2 ) 费用相对较低；( 3 ) 由于副反应小，费用低，患者易接受， 易于长期治疗；( 4 ) 由于间歇期短，在间歇期肿瘤细胞不易恢复， 可能长期稳定肿瘤，减少复发，减少耐药细胞的出现；( 5 ) 改善患 者生活质量，延长生存期。 低剂量节律化疗的机制目前仍不清楚，可能通过抑制新生血管形 成，也可能是对肿瘤细胞的直接杀伤作用或诱导分化作用，还可能是 通过诱导细胞衰老( s e n e s c e n c e ) ，使细胞停滞于g 1 期而起作用睁5 1 。低 剂量化学治疗剂导致d n a 损伤，抑制肿瘤细胞生长，使s a b g a l 活 性增加，诱导细胞衰老，表达细胞周期抑制子p 1 6 1 煳a 和 p 21 1 舢删s d n ，这些化疗剂包括阿霉素【6 - 8 】、顺铂 9 1 、阿非迪霉素、阿 糖胞苷、羟( 基) 脲l o - 1 1 、喜树耐1 2 1 、溴脱氧尿掣1 3 。1 4 1 、依托泊苷【1 5 】、 长春新碱等。 细胞衰老是指细胞从一个活性的生长状态转变为不可逆转的生 长停滞状态。它有两层含义，一是指其增殖分化的停止，二是指其同 时能够维持细胞的基本功能，仍然是存活的细胞，是生物体中普遍存 在的一种不可逆的生长停止现象，是器官衰老的基础。它不同于凋亡， 细胞衰老是细胞增殖能力的丧失，细胞凋亡是细胞发生一系列变化而 引发的程序性的细胞死亡【m 7 】。 细胞衰老的特征是生长停止，但仍保持代谢功能。衰老的细胞体 积较大，呈多角形；细胞核变大、内有包含物、核膜内陷；染色质聚 集、固缩、碎裂、溶解；细胞质内有空泡形成；线粒体的数目及形状 改变；高尔基体碎裂；尼氏体消失；细胞膜的流动性也减低；衰老相 关b 半乳糖苷酶活性增加【1 s - 2 1 。这些是衰老细胞的一些基本特征， 是区分衰老细胞、复制细胞和凋亡细胞的基础。产生这些现象的一部 分原因可能是由于调节细胞生长所依赖的一些基因受到了抑制。 研究发现衰老细胞主要含有g 1 期的d n a 含量，因此认为衰老 细胞停滞于g 1 期，不能顺利进入s 期。细胞衰老的机制可能与 a r f - p 5 3 - p 2 1 和p 1 6 i n k 4 a r b 通路以及依赖p 5 3 信号通路的端粒途径 等有关 2 2 硼。多种肿瘤细胞系及不朽细胞系，当遇到d n a 损伤试剂 或其他攻击时，能够发生可逆的增殖停滞，而激活的p 1 6 、p 2 1 、p 5 3 以及r b 都与g 1 期停滞有关。目前认为这些关卡( c h e c kp o i n t ) 蛋白能 够阻止细胞增殖，以使受到损伤的d n a 能够进行修复。与此相比较， 衰老细胞或将近衰老细胞的生长停滞是不可逆的，表明有可能细胞周 期g 1 期的关卡是衰老的关键调控点。 细胞周期一般包含下列四个阶段：g 1 期、s 期、g 2 期和m 期。 真核细胞的分裂增殖必须经过两个关键的调控点：即g 1 s 和g 2 m ， 其中g 1 s 点的调控作用更重要2 6 】。g 1 期限制点( r e s t r i c t i o np o i n t ，r ) 是增殖细胞唯一能够接受外界增殖和抑制增殖信息的调控点。细胞必 须在顺利经过这两个调控关键点之后，才可能完成细胞的分裂增殖， 即细胞周期。细胞周期调节因子包括：细胞周期蛋e t ( c y c l i n ) ：包括 c y c l i na h ，其中以d l 最为重要，它们作为调节亚基与催化亚基 c d k 结合成复合物，在细胞周期各时相发挥作用。细胞周期蛋白 依赖性激酶( c d k ) ：包括c d k i 一c d k 7 共7 种。c d k 通过与c y c l i n 结合成复合物而控制细胞周期的检查点实现对细胞周期的调控。 c y c l i n 和c d k 促进细胞增殖、分化，被认为是细胞周期的正调节因 子。细胞周期依赖性激酶抑制因子( c i o ) ：通过抑制c d k 的活性， 导致细胞周期停止，阻断细胞增殖，是细胞周期的负调节因子。目前 已知c k l 分为两类 2 7 - 2 8 】：一类为i n k 4 即p 1 6 家族：包括p 1 5 、p 1 6 、 p 1 8 和p 1 9 ；另一类为c i p k i p 即p 2 1 家族，包括p 2 1 、p 2 7 和p 5 7 ， 对c d k 有广泛抑制作用。 ( 3 1 8c h e c k p o i n t r b 基因是一种抑癌基因，定位于染色体1 3 q 1 4 区，其表达的蛋 白是一种转录因子，位于细胞核内，也可位于细胞浆，通过磷酸化及 去磷酸化方式来调节细胞周期，并与p 1 6 、c d k 4 6 和c y e l i n d l 等多 种因子形成复杂的反馈调节网络，在细胞周期g 1 s 检查点，决定细 胞增殖进程 2 9 - 3 0 1 。低磷酸化型的r b 蛋白可与转录因子e 2 f 形成复合 体，抑制其转录激活作用，阻止细胞分裂；而高磷酸化型的r b 蛋白 则不能与e 2 f 形成复合体。催化各型r b 蛋白由低磷酸化型转变为高 l n 磷酸化型的蛋白激酶就是各型c d k 。 m d m 2 是一种进化保守的癌基因，基因位于1 2 q 1 3 - 1 4 染色体区 域，编码区1 4 7 6 k b 。其表达产物是一种分子量为9 0 k d a 的蛋白质， 蛋白质位于细胞浆，半衰期很短，是调节p 5 3 、r b 通路的重要因子。 目前认为m d m 2 产物可分别与p 5 3 、r b 结合而使其功能丧失，从而 调节细胞周期，以维持细胞增殖及分化平衡 3 1 - 3 2 】。 新近m d m 2 与r b 形成的负反馈调节通路在肿瘤产生中的作用逐 渐受到人们的重视，已发现在一些肿瘤中m d m 2 过度表达而r b 基因 表达下降，呈现明显的负相关性【3 3 。3 4 1 。已有实验对胃黏膜序列病变检 测的结果显示：m d m 2 在癌前病变中的表达率随病变的进展逐渐升 高，而r b 表达率则随病变的进展呈下降趋势，两者在胃癌中的表达 呈明显的负相关性。提示在癌前病变阶段m d r n 2 基因在各种致癌因 子作用下被激活，过度表达癌基因蛋白，而r b 基因则发生突变而表 达缺失，但r b 基因抑制也有可能与过表达的m d m 2 蛋白与r b 蛋白 结合而降解r b ，使其功能下调有关。癌基因m d m 2 表达上调及抑癌 基因r b 下调引起p 5 3 抑癌通路及r b 抑癌通路的异常，导致细胞周 期调节失控，细胞由g 1 期顺利而持续地进入s 期进行分裂、增殖， 对胃黏膜异型增生的形成直至最后胃黏膜恶变可能起到重要作用。统 计学研究发现：r b 基因在早期胃癌中的表达率明显低于轻度异型增 生病变，提示r b 基因可作为胃黏膜病变进展的监测指标，应用于胃 黏膜高危人群的随访检测，以期提高早期胃癌发现率。 依托泊苷( v p 1 6 ) 为细胞周期特异性抗肿瘤药物，作用于细胞 周期中持续时间较长的s 期及g 2 期。作用机制是通过作用于d n a 拓扑异构酶i i ，形成药物酶d n a 稳定的可逆性复合物，阻碍d n a 修复，这些复合物可随药物的清除而逆转，使损伤的d n a 得到修复。 前期的实验证实：低剂量v p 1 6 可以诱导细胞衰老。基于以上研究， m d m 2 r b 通路能导致g l 期的停滞，而g 1 期的停滞能导致细胞衰老， 低浓度v p 1 6 也能导致细胞衰老，由此设想低浓度v p 1 6 可能通过 作用于m d m 2 r b 通路，下调m d m 2 蛋白及磷酸化r b 蛋白的表达起作 用。 ， 1 2 材料与方法 1 实验材料与仪器 1 1细胞株 人肺腺癌细胞株a 5 4 9 ，由四川大学华西医院肿瘤实验室提供。 1 2 主要试剂和药物 1 6 4 0 培养基美国g i b i c o 公司 新生小牛血清明海生物公司 0 2 5 胰蛋白酶 美国s i g m a 公司 青霉素、链霉素华北制药厂 p b s北京中杉 m t t 美国a m r e s c o 依托泊苷江苏恒瑞医药股份有限公司 细胞衰老1 3 半乳糖苷酶原位染色试剂盒碧云天 s p 超敏试剂盒福州迈新生物技术公司 一抗( 兔抗人m d m 2 多克隆抗体)a b z o o m 公司 纯 上海富众生物科学有限公司 福州迈新生物技术公司 上海生化试剂二厂 碧云天 碧云天 1 3 主要仪器 超纯水仪m i l l q法国m i l i p o r e 电子天平f a 2 0 0 4 、1 0 0 4上海上平仪器公司 压力蒸汽灭菌器l d z x 4 0 s上海申安医疗器械厂 n u a i r e 超净工作台蚌埠净化设备厂 c 0 2 孵箱美国h a r r i s 公司 8 5 立式超低温冰箱美国n u a i r e 公司 倒置光学显微镜 日本o l y m p u s 光学仪器公司 微量移液器法国g i l s o n 紫外分光光度仪b e c k m a n 美国p e d u 6 0 0 恒温干燥箱1 0 1 型上海浦东欣科学仪器厂 恒温水浴箱b s 2 i北京医疗设备厂 细胞用离心机l d 2 5 。2北京医用离心机厂 其它器皿、耗材均为国产优质品 2 实验方法 2 1 相关实验用品的准备 2 1 1 各种玻璃器皿和塑料器皿的准备 各种玻璃器皿和塑料器皿常规洗涤、泡酸、冲洗、烘干、包装、 消毒后备用。洗涤：各种玻璃器皿和塑料器皿浸泡在洗衣粉水中过夜 ( 注意要让水完全进入器皿，不应留有汽泡) ，随后用试管刷醮洗衣粉 反复刷洗3 遍，清洗干净，在恒温干燥箱中烘干备用。泡酸：将玻璃 1 4 器皿浸泡在清洁液( 浓硫酸、重铬酸钾、蒸馏水按一定比例配制) 中， 塑料器皿先后浸泡在2 氢氧化钠、5 稀盐酸中，浸泡都要过夜以 除去蛋白质等生物大分子。冲洗：将器皿从酸中取出，倾倒酸液，自 来水冲洗2 0 遍，蒸馏水反复冲洗3 遍，中和平衡电荷，烘干后用纸 包好，再用消毒饭盒和包布包装好，贴上标签。消毒：高压蒸汽灭菌， 烘干后备用( 消毒后1 周内使用有效) 。熟悉生物安全柜、低速和高速 离心机、c 0 2 培养箱、电子天平等实验室各种仪器的使用。 2 1 2 溶液的配制 配制分装r p m l l 6 4 0 细胞培养基( r p m l l 6 4 0 培养基粉剂，1 0 新生小牛血清，p h 7 2 ，青霉素1 0 0 i u m l ，链霉素链霉素1 0 0l ag m 1 ) 、 0 2 5 胰酶和p b s 液( n a c l 8 0 9 ，k h 2 p 0 4 0 2 9 ，n a 2 h p 0 4 7 h 2 01 5 6 9 ， k c l 0 2 9 ) 。 2 2a 5 4 9 细胞的复苏、培养、传代和冻存； 2 2 1 细胞的复苏 将保存在液氮( 1 9 6 ) 中的a 5 4 9 细胞株取出，立即置于3 7 * ( 2 水浴 中快速解冻，解冻后加入少量培养基离一l , ( 1 0 0 0 r p m 5 m i n ) ，弃上清 液，悬浮细胞后转入塑料培养瓶中，加入适量r p m l l 6 4 0 培养液，显 微镜下观察细胞吹散情况，置于3 7 * ( 2 、5 c 0 2 、饱和湿度条件下培养， 2 4 d , 时后倒置显微镜下观察细胞，见细胞贴壁生长，说明复苏成功。 2 2 2 细胞换液及传代 a 5 4 9 细胞为贴壁生长细胞，每2 天左右换液一次。待细胞长满 8 0 9 0 时传代，细胞传代时先吸尽培养液，p b s 洗细胞，再用o 2 5 1 胰蛋白酶消化细胞，3 7 ( 2 消化约2 - 3 m i n ，在显微镜下观察消化情况， 发现细胞变圆，细胞之间间隙增大后，终止消化，加入适量培养液吹 打细胞，使其从培养瓶底脱落，制成细胞悬液，按1 ：2 1 ：3 传代，加 入培养液后在3 7 c 、5 c 0 2 孵箱中继续培养。实验选用对数生长期 细胞。 2 2 3 细胞冻存 在细胞传代的同时可以冻存细胞株以便日后使用，细胞生长密度 达到8 0 可以进行，冻存2 4 h 前更换培养基。配制冻存液，将d m s o 加 入新鲜培养基中，最后浓度为1 0 ，混合均匀，避光备用。常规方法 将细胞制成细胞悬液，取少量细胞悬浮液( 约0 1 砌) 计数细胞浓度及 冻前存活率。离心去上清，加入适量冻存液，使细胞浓度为5x1 0 6 m l ， 混合均匀，分装于冻存管中，封口标记。置于4 c1 0 分钟，2 0 3 0 分钟，一8 0 c1 6 1 8 小时( 或隔夜) ，液氮罐中长期储存。 2 3 细胞的分组 实验细胞分为四组：对照组( 单细胞悬液+ 培养基) 、实验1 组( 单 细胞悬液+ 含ll am v p 一1 6 的培养基) 、实验2 组( 单细胞悬液+ 含5 | lm v p 一1 6 的培养基) 、实验3 组( 单细胞悬液+ 含2 5um v p 1 6 的培 养基) 。 2 4 m t t 法测定v p 1 6 对a 5 4 9 细胞增殖及增殖抑制的影响 ( 1 ) 接种9 6 孔板：取对数生长期的人肺腺癌a 5 4 9 细胞株，制 备单细胞悬液，通过血球计数板光镜下计数，加含1 0 d x 牛血清培养 液调整细胞浓度，按l 1 0 4 孑乙、2 0 0 p l 孔接种至9 6 孔培养板上； ( 2 ) 用含1 0 小牛血清的r p m i 1 6 4 0 培养液，置于3 7 。c 、5 c 0 2 培养箱中培养2 4 小时，次日取出培养板，分别加入含o | lm 、1l lm 、 5um 、2 51 1m v p 1 6 的培养液，每个浓度重复5 个孔，并设培养液加 细胞孔作为对照，不加细胞只加培养液的空白对照孔调零； ( 3 ) 将9 6 孔板放入3 7 。c ，5 c 0 2 孵箱内继续培养4 8 h ； ( 4 ) 每孔中加入浓度为5 m g m l 的m t t 各2 0ul ，避光培养4 小时； ( 5 ) 终止培养，小心吸弃孔内培养液，每孔中各加入d m s o1 5 0 pl 溶解紫兰色结晶，振荡摇匀1 0 分钟，使结晶物充分溶解； ( 6 ) 将9 6 孔板置全自动酶标仪上，选择4 9 0 n m 波长，测定每 孔吸光度( o d ) 值。实验重复3 次，每次、每一浓度均设5 复孔， 抑制率= ( 1 一实验组o d 4 9 0 值对照组o d 4 9 0 值) 1 0 0 。 2 5 流式细胞术检测细胞周期分布 ( 1 ) 取对数生长期细胞，倒去培养液，胰酶适度消化，用培养 液吹打，8 0 0 r p m 1 5 m i n 离心，去上清液； ( 2 ) 用p b s 洗细胞两次，加0 5 m l p b s 吹匀，务必吹散； ( 3 ) 用5 m l 注射器将细胞吸起，用力打入5 m 1 7 0 预冷乙醇中， 封口膜封口，4 固定过夜； ( 4 ) 8 0 0 r p m x1 5 m i n 离心收集固定细胞，p b s 洗细胞两次； ( 5 ) 用0 4 m l p b s 重悬细胞并转至t u b e 中轻轻吹打( 防止细胞 破碎) ； ( 6 ) 加r n a s e - a 至终浓度约为5 0 肛酌m ，3 7 * c 水浴消化3 0m i r a ( 7 ) 加p i 至终浓度约为5 0l 上g m l ，在冰浴中避光染色3 0m i r a ( 8 ) 样品分析测定及打印。 2 6 细胞化学染色检测用药后细胞衰老 ( 1 ) 6 孔细胞培养板接种细胞之前放置洗净灭菌的血盖片，每 孔加入1x1 0 5 个细胞，3 7 c 、5 的c 0 2 孵箱中培养过夜至细胞贴附 于血盖片上，分别加入含o 、1 、5 、2 5um 的含药培养基，置培养箱 中培养4 8 小时； ( 2 ) 吸除培养液，用p b s 洗一次，加入l m l 细胞衰老相关1 3 半乳糖苷酶固定液( 含1 3 半乳糖苷酶染色液a 1 0u l 、1 3 半乳糖苷酶 染色液b 1 0u l 、1 3 半乳糖苷酶染色液c 9 3 0u l 、x g a l 溶液5 0u 1 ) 室 温固定1 5 m i r a ( 3 ) 吸除细胞固定液，p b s 洗3 分钟3 次； ( 4 ) 吸除p b s ，加入l m l 染色工作液； ( 5 ) 3 7 孵育过夜，用保鲜膜封住6 孔板防蒸发； ( 6 ) 普通光学显微镜观察。 2 7免疫细胞化学检测用药后细胞内蛋白的表达 ( 1 ) 6 孔细胞培养板接种细胞之前放置洗净灭菌的血盖片，每 孔加入1x1 0 5 个细胞，3 7 。c 、5 的c 0 2 孵箱中培养过夜至细胞贴附 于血盖片上，分别加入含o 、1 、5 、2 5um 的含药培养基，置培养箱 中培养4 8 小时； ( 2 ) 吸去培养液，用4 。c 预冷的p b s 冲洗细胞三遍，取出贴有 细胞的血盖片放入玻璃平皿中，用纯丙酮固定l o 分钟，p b s 液冲洗 5 分钟3 次； ( 3 ) 3 过氧化氢甲醇溶液( a 试剂) 室温下浸泡5 1 0 秒，以阻 断内源性过氧化氢酶的活性，p b s 液冲洗5 分钟3 次； ( 4 ) 1 0 正常山羊血清( b 试剂) 封闭，3 7 孵育3 0 分钟，减 少非特异性染色背景，甩去多余血清，勿洗； ( 5 ) 分别滴加1 ：5 0 和1 ：1 0 0 稀释的一抗：鼠抗人r b 单克隆抗 体和兔抗人m d m 2 多克隆抗体各5 0 u l ，用p b s 缓冲液代替一抗作为 阴性对照； ( 6 ) 4 。c 孵育过夜； ( 7 ) p b s 液冲洗，5 分钟3 次； ( 8 ) 滴加2 3 滴生物素标记二抗( c 试剂) ，3 7 恒温箱孵育3 0 分钟； ( 9 ) p b s 液冲洗，5 分钟3 次； ( 1 0 ) 滴加链霉素抗生物素过氧化物酶溶液( d 试剂) ，3 7 恒 温箱孵育3 0 分钟； ( 1 1 ) p b s 液冲洗，5 分钟x4 次； ( 1 2 ) d a b 显色，新鲜配制的d a b 溶液：取l m l 蒸馏水，加 d a b 试剂盒中a 、b 、c 试剂各l 滴，混匀后加至切片，室温显色， 显微镜下控制显色时间； ( 1 3 ) 自来水充分水洗后，蒸馏水冲洗5 1 0 分钟； ( 1 4 ) 苏木素轻度复染2 分钟； ( 1 5 ) 梯度酒精脱水，二甲苯透明，甘油封片，镜检。 1 9 3 免疫组织化学结果判断标准 结果判定标准阳性细胞必须具备：细胞结构清晰；阳性颗粒 定位、定性好；着色明显高于背景。阴性对照采用p b s 代替一抗 染色。使用n i k o n 光学显微镜对切片观察，用s p o tc o o lc c d 摄像 头进行图像采集。用i m a g ep r op l u s4 1 0 版本的专业图像分析软件进 行图像分析。每张切片在2 0 0 倍光学显微镜下随机选取5 个视野，每 个视野统计1 0 0 个细胞中的阳性细胞数，总数除以1 0 ，乘以1 0 0 ， 得到该标记物的阳性细胞表达指数。 。 4 统计学处理 应用s p s s l 3 0 软件系统进行统计学处理，p 0 0 5 为有统计学意 义，统计方法使用单因素方差分析。 _-_-一 结果 1倒置显微镜观察细胞形态学改变 a 5 4 9 细胞为贴壁生长细胞，倍增时间是2 2 d , 时，传代后3 小时左 右细胞陆续贴壁，8 小时后细胞逐渐升出胞突，变为多角形、长条形 或不规则型，细胞核大，核形不规则，常见畸形核，核内见多个核仁， 细胞质较少，细胞形态趋于稳定。不同浓度的v p 1 6 ( o 、1 、5 、2 5 i im ) 作用于a 5 4 9 细胞，加药前对照组与试验组a 5 4 9 细胞数量和形 态基本一致，4 8 d 时后对照组细胞生长良好；实验l 组细胞数减少， 每个高倍视野可见少数几个细胞升出长伪足，体积明显增大；实验2 组细胞数量减少、大部分细胞形态更不规则，细胞体积增大，部分细 胞变长梭形，升出几条长伪足，细胞核变大，胞质减少，胞质内有空 泡形成；实验3 组细胞数明显减少，部分细胞变圆浮起，细胞间接触 变松，胞质中颗粒增多，细胞周围碎片增多，表明v p 1 6 对a 5 4 9 细胞 的形态改变的影响与浓度有关( 图1 1 ) 。 2m t t 比色法测定v p 1 6 对a 5 4 9 细胞增殖及增殖抑制的影响 m t t 法是m o s m a n n l 9 8 3 年报道的方法，其原理是活细胞线粒体 中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的m t t 还原为难溶性的篮紫色结晶物 并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。d m s o 能溶解细胞中紫色结晶 物，用紫外分光光度仪在4 9 0 n m 波长处测定其光吸收值，可间接反 映活细胞数量。在一定细胞数范围内，m t t 结晶物的产量与活细胞 数呈正比。 图1 - 1 v p - 1 6 对a 5 4 9 细胞形态的影响( 2 0 0x ) a ：对照组b ：实验1 组c ：实验2 组d 实验3 组 f i g 1 - 1 。e f f e c t i o no fv p - 1 60 1 1c e l lm o r p h o u si na 5 4 9c e l l s ( 2 0 0 x ) 用不同浓度的抗癌药物v p 1 6 ( oum 、1um 、5um 、2 5um ) 处理人肺腺癌a 5 4 9 细胞，4 8 d x 时后检测各组细胞的吸光度值，抑制 率( ) = ( 1 实验组o d 值对照组o d 值) x 1 0 0 ，结果显示：各实验组 与对照组比较有显著性差异( p o 0 5 ) ，各实验组之间比较有显著性 差异( p o 0 5 ) ，表明v p 1 6 对a 5 4 9 细胞的增殖抑制作用与浓度明显 相关，呈剂量依赖关系( 表2 1 ，图2 1 ) 。 表2 1 不同浓度v p 1 6 对a 5 4 9 细胞增殖抑制的影响( j 士s ) t a b 2 1 e f f e c t i