（植物学专业论文）转抗虫、抗病基因水稻抗性鉴定及其农艺性状分析.pdf

转抗虫、抗病基因水稻抗性鉴定及其农艺 性状分析 为了 探讨转基因 水稻植株性状的变异特点， 筛选出 在生产上有应用价值的转 基因水稻新品系，本文以 分别导入了 b t 毒蛋白 基因 ( b t ) 、蛋白 酶抑制剂基因 ( p i n i i ) 、雪花莲凝集素基因 ( g n a ) 、几丁质酶基因 ( c h i )和卜1 , 3 - 葡聚塘 酶基因 ( g l u )的转基因釉型杂交稻亲本培矮6 4 s , e 3 2 ,盐恢5 5 9 和特青等为材 料，对其抗虫、抗病性和农艺性状进行了鉴定和分析，取得了如下的实验结果: 1 、转基因水稻抗虫和抗病性鉴定 采用离体叶片法和整株接虫法对转基因水稻植株及其后代的抗虫性进行鉴 定。 将鉴定结果与抗性标准进行比 较研究， 优化了 转b t 基因水稻对螟虫抗性的 快速检测方法， 确定了 较为可靠的 抗性标准。 根据本研究确立的校正食叶面积和 校正卷叶率等新标准，可以 迅速、 准确地运用离体叶片法确定不同品种的转 b t 基因水稻的抗虫性。 用此标准的鉴定方法对转b t + p i n 1 1 双价基因的特青株系进 行了t o 和t 1 代的抗虫性鉴定，获得了中抗螟虫的株系f - 1 1 。同时以大田自 然 病虫害调查法对t 1 代进行了 抗虫、 抗病性鉴定， 得到了 一些有价值的抗性材料， 其中 对 螟虫 表 现较好 的 有品 种培 矮6 4 s b - 卜b 一和 特 青f - 2 0 , h - 5 ; 对 稻飞虱 抗 性较好的有特青g - 4 , e - 3 ;对纹枯病表现较好的株系有特青e - 1 和h - 6 e 2 、转基因水稻后代农艺性状分析 对上述材料的转基因水稻当 代及自 交后代的株高、 穗长、 千粒重和结实率等 重要性状进行了 分析。结果显示: 与对照亲本相比， 多 数转基因植株及其自 交后代的农艺性状产生了 不同 程 度的变异， 特别是株高和育性等变异明显。 但随着世代的增加， 转基因水稻的农 艺性状会逐渐倾向于并趋于稳定。 在转基因自 交t i 代， 获得了农艺性状发生变异的一些单株， 有些显著优 于对照， 有些比 对照差， 说明外源基因的插入和转化过程中各种理化因素及生擞 因素的影响， 往往会使转基因后代发生各种各样的 变异， 而且这些变异是随机的， 如收 获到了e 3 2 的株系l - 2 5 ， 其群体中 有一单株其千粒重为4 3 .3 3 8 ， 显著高于 对照1 9 .9 7 8 ， 并且穗长和结实率都优于对照， 如果能稳定的遗传下去， 无疑会显 著增加其产量。 因此， 我们要充分利用这种遗传变异资源， 筛选对生产有利的能 够稳定遗传的变异，形成优良品系，加速育种进程。 筛选到了农艺性状与亲本相似或优于亲本且经连续两 代后仍具有很好抗 性的转基因 水稻株系， 如对螟虫具有抗性的 转基因培矮6 4 s 的 株系b - 1 和b - 3 , 特青的株系f - 1 1 , f - 2 0 和h - 5 ， 获得了抗稻飞虱的 特青株系e - 3 ， 对纹枯病具有 抗性的转基因 特青株系e - 1 , 且农艺性状与未转基因 对照相似; 对稻飞虱具有抗 性且穗长显著增长的 特青株系g - 4 和株高显著降 低、 其它性状与亲本相似的h 4 等，说明外源基因可以 在水稻自 交后代中稳定遗传并且可能产生优于对照的性 状。 关键词:粗 t 稻;转基因:抗虫抗病性:农艺性状 re s e a r c h e s c h a r a t e r s o n tra n s g e n i c r i c e s ag r o n o mi c a n d re s i s t i b i l i t i e s t o p e s t s a n d di s e a s e s i n o r d e r t o s t u d y v a r i a t i o n o f tr a n s g e n i c r i t e s c h a r a t e r s a n d s c r e e n o u t s u p e r i o r s t r a it s , r e s e a r c h e s w e r e m a d e o n r e s i s t i b i l it i e s o f m a n y t r a n s f o r m e d p a r e n t s o f h y b r i d r i c e t o p e s t s a n d d i s e a s e s a n d o n t h e i r a g r o n o m i c c h a r a c t e r s ;t h e s e p a r e n t s p a - 6 4 s、e 3 2 , y a n h u i - 5 5 9 a n d t e t s i n g w e r e a l t r e s p e c t i v e l y t r a n s f o r m e d w i t h g e n e s a s b t . p i n i i 、g n a, c h i a n d g l u 1 . e x a m i n a ti o n o n r e s i s t i b i l i t y o f t r a n s g e n i c r i c e t o t o p e s t s a n d d i s e a s e s e x a m i n a t i o n o n t t a n s g e n i c r i t e s re s i s t i b i l i t y t o p e s t s w a s m a d e t h r o u g h i n o c u l a t i n g p e s t s i n p l a n t s a n d l e a v e s i n v i t r o w h i c h s i m p l i z e s t h e m e t h o d o f e x a m i n a t i o n o n b t - t r a n s f o r m e d r i c e s re s i s t i b i l i t y t o s n o u t m o t h s l a r v a , a m a i n p e s t i n r i c e . b y s u c h i m p r o v e d m e t h o d， e x a m i n a t i o n o n b t - t r a n s f o r m e d r i c e s r e s i s t ib i l i t y t o s n o u t m o t h s l a r v a w i t h a r e a s o f a t e n l e a v e s a n d l e a f r o l l 吨 p e r c e n t a g e t u rn e d o u t t o b e q u i c k , s i m p l e a n d a c c u r a t e . w i t h t h e i m p r o v e d i d e n t i fi c a t i o n m e t h o d o n m a t e r i a l s r e s i s t i b i l i t i e s t o p e s t s a n d d i s e a s e s , s e v e r a l h i g h l y re s i s t a n t v a r i e t i e s w e r e s c r e e n e d o u t s u c h a s f - 1 t f ro m t e t s i n g t r a n s f o r m e d w i t h b t + p i n i i , p a - 6 4 s b - 1 , b - 3、t e t s i n g f - 2 4 a n d , h - 5 , w h i c h a r e 胡r e s i s t a n t t o s m o u t m o t h s l a r v a、 t e t s in g - g 4 t o r ic e p l a n t h o p p e r a n d t e t s i n g - e - 1 t o r i c e s h e a t h b l i g h t . 2 . a n a l y s i s o n a g r o n o m i c c h a r a t e r s o f t r a n s g e n i c r i c e s o f f s p r i n g s ( 1 ) c o m p a r e d w i t h p a r e n t s , m o s t o f t r a n s f o r m e d r i t e s a n d t h e i r o f f s p r i n g s v a r i a t i o n i n a g r o n o m i c c h a r a t e r s s u c h a s l o w e r p l a n t h e i 助1、 fr u c t i f i c a t i o n a n d s t e r i l i t y . h o w e v e r , wi t h t h e mc r e a s mg ltr a n s g e n i c r i t e s a g r o n o m i c c h a r a t e r s g r a d u a l l y t u rn e d c l o s e t o p a r e n 比 、 ( 2 ) i n t h e f i r s t g e n e r a t i o n o f s e l f - c o p u l a t i o n， s o m e p l a n t s o f v a r i a t i o n i n a g r o n o m i c 比a r a t e r s w e re o b t a i n e d， s o me o f wh i c h we r e b e t t e r t h a na n d s o me we r e o n t h e t h i s m e a n s s o m e p h y s i c a l a n d c h e m i c a l f a c t o r s i n t h e p r o c e s s o f tr a n s f o r m a t i o n c a n l e a d t o m a n y u n e x p e c t a b l e v a r i a t i o n s i n t h e i r t r a n s g e n i c g e n e r a t i o n s . f o r e x a m p l e , s o m e p l a n t s i n l - 2 5 o f e - 3 2 场o n s a n d s e e d s 4 3 .3 3 g r a m s t r ik in g ly h ig h e r t h a n t h a t o f i t wa s mu c h s u p e ri o rt o t h e c o n t ro l i n s p i k e l e n g t h a n d f r u c t i f r c a t i o n . i f t h e s e p r e m i u m c h a r a c t e r s c a n b e s t a b l y d e l i v e r e d t o n e x t g e n e r a t i o n s , f i n e s tr a i t s w o u l d b e p o s s i b l y o b t a i n e d b y s c re e n i n g t h e s e u s e f u l l c h a r a c t e r s w h i c h c a n d i s t i n c t l y i n c r e a s e ( 3 ) f i n e p l a n t s w e r e s c r e e n e d o u t , w h i c h w e re s u p e r i o r t o p a re n t s i n a g r o n o m i c c h a r a c t e r s e i t h e r i n t o o r i n t i g e n e r a t i o n s . i n t h e s e f i n e p l a n t s ， s o m e w e re r e s i s t a n t t o s m o u t m o t h s l a r v a ,s u e h a s b - i a n d b - 3 o f f a - 6 4 s , f - i i , f - 2 0 a n d h - 5 o f t e t s i n g ; s o m e w e r e re s i s t a n t t o p l a n t h o p p e r s u c h a s e - 3 o fs o m e w e r e r e s i s t a n t t o r i c e s h e a t h b l i g h t , s u c h a s e - 1 o f t e t s i n g w h o s e a g r o n o m i c c h a r a c t e r s w e r e t h e s a m e a s c o n t r o l ; q - 4 o f t e t s i n g， r e s i s t a n t t o h a d lo n g e r s p i k e t h a n c o n t r o l ; h - 6 o fh a d l o w e r p l a n t h e i g h t t h a n a n d t h e s a m e o t h e r c h a r a c t e r s a s c o n t r o l s . t h e s e m e a n t h a t e x o g e n e sc a r t n o t o n ly b e s t a b ly d e l iv e re d t +3 n e x t g e n e r a t io n s b u t p o s s ib l y p r o d u c e s u p e r io r c h a r a c t e r s t o c o n tr o l s . k e y w o r d s :i n d i e s 钾p e r i c e ; g e n e t r a n s f o r m a t i o n ; r e s i s t a n c e t o p e s t s a n d d i s e a s e s ; a g ron o m i c c h a r a c t e r s ; a g r o n o m i c c h a r a c t e r s . w 缩略词表 缩略词 p i c p t l p m oc s ti a - ai 1 ,e c gr a c h i i cp c a mv3 5 s bt c ry 13 一 1 , 3 - g l u p i n t i gi t s 中文名 蛋白 酶抑制剂 y1豆胰蛋白酶抑制剂 马铃薯蛋白 酶抑制剂 水稻流基蛋白酶抑制剂 大豆胰蛋白 酶抑制剂 淀粉酶抑制剂 外源凝集素 雪花莲外源凝集素 几丁质酶 b t 杀虫晶体蛋白 花椰菜花叶病毒3 5 s 启动子 苏云 金芽饱杆菌 杀虫晶体蛋白 基因 p - 1 , 3葡聚糖酶基因 马铃薯蛋白 酶抑制剂t i 0 葡聚糖普酸酶 英文名 p mt e i n a s e i n h i b i t o r c o w p e a t r y p s in i n h i b i t o r p o t a t o i n h i b i t o r i i o r y z a c y s t a t i n s o y b e a n t ry s i n i n h i b i t o r a a m y l a s e i n h i b i t o r l e c t i n g a l a n t h u s n i v a l i s a g g l u t i n i n c h i t i n a s e s i n s e c t ic i d a l c ry s t a l p r o t e i n c a mv 3 5 s p r o m o t e r b a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s i n s e c t i c i d a l c rys t a l p r o t e i n g e n e 0 - 1 , 3 一u c a n a s e p o t a t o p r o t e i n a s e i n h i b i t o r h 11 一 】 u c o r o n i d a s e 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。 尽我所知， 除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他 人己 经发表或撰写过的 研究成果， 也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构 的 学位或证书而使用过的材料。 与我一同 工作的同志对本研究所做的 任何贡献均 已在论文中作了明确的说明，并表示了谢意。 研 究 生 签 名 : 秘 ， ， 司 1时 间 :) i v 士 年 月 iv 日， 关于论文使用授权的说明 本人完全了 解湖南农业大学有关保留、 使用学位论文的规定， 即: 学 校有权 保留 送交论文的 复印 件和磁盘， 允 许论文被查阅 和借阅， 可以 采 用影印、 缩印 或 扫描等复制手段保存、 汇编学位论文。 同意湖南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学 位论文在解 密后应遵守此协议) 研 究 生 。:孤， 同 竿 ol :t : 砂 时间: 时间: - - 互 年 子 月 a 日 户s ir i 月 ft ; 日 第一章文献综述 1 水稻抗虫基因工程研究进展 虫害是造成农业减产的重要原因。 据不完全统计， 我国每年因虫害造成水稻减 产1 0 % 以 上， 损失达数十亿元 ( 侯丙凯， 陈振华. 2 0 0 0 : 化学农药的 长期和大量使用 增加了 生产成本， 导致环境污染， 破坏了生态平衡， 危及人类健康，同时诱导害虫 产生抗药性。 近年 来， 利用转基因技术培育抗虫水稻品 种被认为 是一 个经济、 有效 的解决 途径。自1 9 8 7 年首次报道 抗虫转基因植物以 来， 国内 外相继开展了 大量转 基因抗虫水稻的 研究， 且取得了 重大进展。 但转基因抗虫水稻也存在生物安全性弃 抗虫持久性等不可忽视的潜在问题。 1 . 1 几种常见的抗虫基因及其在水稻抗虫基因工程中的 利用 2 0 世纪8 0 年代以 来， 随 着植物基因工程的兴 起与发展， 人们逐步将一些具有 抗虫性的外源物质基因克隆并转入植物体内， 从而获得转基因抗虫植物。 目前 应用 于植物转化的抗虫 基因根 据其来源可分为 三种类型: 一类是微生 物来源的的 抗虫基 因， 主要是苏云 金芽抱杆菌毒蛋白 基因 简称b t 基因; 二 类是植物来源的 抗虫基因， 主要为蛋白 酶抑制剂基因、 淀粉酶抑制剂基因、 外 源凝集素基因 等; 三类是 动物来 源的抗虫 基因， 主要有蝎毒素基因 和蜘蛛毒素基因等。 1 . 1 . 1 苏云金芽抱杆菌毒蛋白 基因 b t 毒蛋白 基因来 源于苏 云金芽 抱杆菌， 是目 前 抗虫基因工程中 应用最为 广泛和 成熟的 一类基因。 它是一 种革兰氏阳 性菌， 该菌在形成芽抱时 产生的 不溶性伴抱晶 体中多 含有杀虫晶 体蛋白 ， 对鳞翅目 、 鞘翅目 、 膜翅目 、 同 翅目 和直翅目 昆 虫及瞒 类、 线 虫等显 示 有杀虫 活 性。 b t 杀 虫晶 体 蛋白 包 括晶 体毒 素c r y 类蛋白 和 溶 细 胞毒 素吻类 蛋白 ，但 两 者 存 在 较 大 差 异 ， 而 应 用 较 多 的 是 前 者。 h o ft e 1 9 9 5 年c r i c h m o r . 等依据b t 晶体蛋白 基因的核昔酸序列以及演 化关系， 采用阿拉伯数字将其重新进行分类。目 前已 测序并经国际统一命名的杀虫 晶体蛋白已 有2 3 0 多 个。 b t 晶 体蛋白 毒素的 杀虫机理， 一般认为是 其进入昆 虫消化 道后， 在特定蛋白 酶的水解作用下， 释放出6 0 k d左右的毒性肤核心片断， 并与昆 虫消 化 道刷状 缘 膜囊 ( b ra s h b o r d e n n e m b e r a n e v e s i c l e s , b b m v ) 上的 受体 ( 目 前 普遍 认为 受 体是 一种糖蛋白 或 氨 肤 ) 高 亲合性结合， 快速 而不可 逆地 插入 细胞质 膜， 形成孔或病灶， 引起细胞 膜非极性化， 破坏细胞渗透平衡，导致细胞裂解。 将编码 这种杀虫晶 体的 基因 克隆并 转入植物细胞中， 就可以 使植物获得内 在的 抗虫性。 在我国，自1 9 8 9 年中国 农 科院 生物技术中 心杨虹等首次 报道了 用原生质体电 融合技术将b t 基因 导入水稻“ 台 粳2 0 9 ” 和1 9 9 1 年谢道听( 谢道听 等， 1 9 9 1 ) 又用 花粉管通道技术将b t 基因导入水稻栽培品种“ 中花1 1 号”以 来， 这方面的研究已 取得很大进展。向 友 斌等 ( 向 友斌等，1 9 9 9 ) 用农杆菌介导法将密 码子经优化的 c ry l a ( b ) 基因 导 入 秀 水1 1 ， 获 得 高 抗 二 化w , 稻 纵 卷 叶 螟的 转c ry l a ( b ) 基 因 品 系 t 8 5 , t s 9 等( 命名为克螟 稻) ， 并 检测出 其b t 毒蛋白 的 含量占 可溶性蛋白的0 .5 % 4 3 % ， 对1 -5 龄幼虫的毒杀 作用达到1 0 0 0/ 0 ;卫剑文等 ( 2 0 0 0 ) 利用基因 枪法将单 个b t 毒蛋白 基因c ry l 伪 ) 单 独或 与 大 豆 胰蛋白 酶抑 制 剂 基因( s b t i ) 一 起导 入 釉稻 品 种中，获得对稻纵卷叶 螟抗性增强的转单、 双抗虫基因的水稻植株。 王爱菊等 ( 2 0 0 2 ) 用用水稻的幼胚、 愈伤组织作受体， 采用p i g基因 枪法， 成功的 将苏云金 杆菌毒蛋白 基因 和马 铃薯蛋白 酶抑制剂基因 连同 抗除 草剂b a r 基因 分别转入不同的 水 稻中， 抗虫 测试结 果 表明 两 种转 基因 株系 均具 有 较强的 抗虫 性。 也 有人 将c ry l a , p i n l 1 及 g n a三基因串 联在同一载体上，获得了转三基因的水稻植株 ( 范钦等， 2 0 0 2 ) . 曾 千 春 等( 2 0 0 2 ) 将 修 饰 的c r y l a 。 基因 导 入 釉 稻明 恢8 1 获 得 抗 虫 纯 合 系。 沈圣泉等 ( 2 0 0 3 )以b t 转基因水稻 “ 克螟稻”为供体，与农艺性状优良 的釉稻品 种杂交， 经8 代系谱选择， 育成了3 个集高产和抗虫子一体的 优良 粳稻新品 系。 在国 外， 1 9 9 3 年冽im o t o l 等( 1 9 9 3 ) 用 原生 质 体 电 击 法 获 得了 转b t 基因 粳 稻 植株，该植株对水稻二化螟和稻纵卷叶螟二龄幼虫的最高致死率分别达 4 4 % 和 5 5 % ， 并且首次提出了昆 虫 对b t 基因 产生抗性的 预防 策略。 wn 等( wu c 等， 1 9 9 7 ) 利用基因枪法将a c t i n - 1 启 动子驱动的c ry l a ( b ) 荃因导 入釉稻台 北3 0 9 的 愈伤组织， 获得了 对三化螟具有抗性的 可育的 转基因植株。w u n n 等 ( 1 9 9 6 ) 也用基因枪法将 c r y l a ( b ) 基 因 转 入 釉 稻品 种ii t 5 8 . r 0 . r i , r 2 代 植 株对 几 种 鳞 翅目 昆 虫 具 有 明 显 的杀虫效果，对二化螟、 三化螟的杀虫效果达到 1 0 0 %， 对稻纵卷叶螟、 m a r a s m i a s upp r e s s a l i s 也 有抑制 取 食的 作用。 l m n i n t v等 ( 2 0 0 0 ) 将b t - t o x i n 基因 导 入明 恢 6 3 ，并利用其制得杂交后代汕优 6 3 ，对此杂交后代进行田间分析表明其对螟虫表 现高 抗， 且 没 有 受 到 任 何 影 响。 m a q b o o l 等( 1 9 9 8 ) 用 基因 枪 首 次 将c r y 2 a基因 导 入釉 稻品 种b a s m a t i - 3 7 0 和m 7 中 ， 分子 检测 表明c r y 2 a 基因 整合 到r o 及r i 代转 基因水稻植株基因组中，并且杀虫晶体蛋白 的表达量高达 5 % ， 对三化螟和稻纵卷 叶螟的抗性也有所增强，同时后期的研究发现该基因能够稳定遗传到 r 3代 ( g a h a k w a d等，2 0 0 0 ) 0 1 . 1 .2 蛋白 酶抑制剂基因 蛋白 酶抑 制剂 ( p r o t e i n a s e i n h ib i t o r ,p i ) 是 对蛋白 水 解 酶有 抑 制活性的 一 种小 分 子蛋白 质， 普遍存在于植物、 动物和微生物中， 是自 然界中 含量最为丰富的蛋白 种 类之一。 p i 具 有防 止体内 不必要的 蛋白 降 解的 作用， 能 调节蛋白 代谢及调节各种蛋 白 酶 的 生 理 活 性 。 很 多 黝的 p i 还 肺抑 制 某 些 病 原 微 生 物 及 某 些 昆 虫 体 内 蛋 占 酶的作用， 是植物体的一 种自 然防御体系。 它的种类很多， 按其性质可分丝氨酸蛋 白 酶 抑制剂、 疏基蛋白 酶抑制剂、 金属蛋白 酶抑制剂和天冬氨酞蛋白 酶抑制剂4 大 类 ( b a r re n a等， 1 9 8 2 ) 。 不同的 害虫 对不同的蛋白 酶抑制剂的 敏感性不同， 如丝 氨酸蛋白 酶抑制剂只对鳞翅目昆 虫起作用， 而疏基蛋白酶抑制剂只对鞘 翅目昆 虫起 作用。 植物蛋白 酶抑制剂一般是由6 0 - 1 2 0 个氨荃酸组成的多 肤，分子量约为8 - 2 5 k u ， 在植物体内的主要功能是与蛋白 酶相互作用、 相互制约控制生物体内细胞、 组织和体液中 有关的 生理过程以 及防止细胞、 组织及体液中的蛋白 成分被外 源蛋白 酶降解。 蛋白 酶抑制剂能与昆 虫消 化道内 的蛋白 消化酶相互作用， 形成酶抑制剂复 合 物 ( p ) , 削 弱或阻 断 消 化 酶刘 食物中 的 蛋白 质的 水解 消 化作 用。 所以， 一旦昆 虫 摄食进蛋白 酶抑制剂， 就会影响外来蛋白的正常消化。同时，蛋白酶抑制剂和消化 酶形成的e i 复合物能 刺激昆 虫消化酶的过度分泌， 通过神经系统的反馈， 使昆 虫 产生厌食反应，最终导致昆虫的非正常发育和死亡。此外，蛋白 酶抑制剂可通过消 化道进入昆虫的血淋巴系统， 从而严重千扰昆虫的蜕皮过程和免4应 答。 研究表明 大 部分 植食 性害 虫 体内 以 疏 基蛋白 酶 津佳p h 值为6 .0 ) 、 丝 氨酸蛋白 斌最 佳p h值 为9 .0 ) 为 主 。 因 此 疏 基 蛋白 酶 抑 制 剂 和 丝 氨 酸 蛋白 酶 抑 制 剂 抗 虫 效 果 较 好， 而 疏 基 蛋白 酶抑制剂由 于其丝 毫不影响 哺乳动物包括人类消化酶的活性，因而倍受育睐。 目 前发现的 蛋白 酶抑制剂中 活性最强的 是觅豆胰蛋白 酶抑制剂 ( c o w p e a t r y p s ih t fi h i b it o r ， 以 下 简 称c p t i ) 基因 ， 它 是 一 种 丝 氨 酸 蛋白 酶 抑 制 剂， 具 有 广 谱 抗虫性， 对鳞翅目、 鞘翅目 及育 翅目 的许多昆虫都有毒杀活性。 其作用位点 在酶的 活性中 心，昆 虫产生抗性突变的 可能 性几乎没有， 而且安 全性较高， 被人或牲畜食 用后可被胃蛋白酶降解，因此对人畜无害。另外，马铃薯蛋白酶抑制剂 ( p o t a t o i n h i b i t o r l i i , p i 1 i ) 、 水 稻 疏 基蛋白 酶 抑制剂( o ry z a c y s ta t in o c ) 、 大豆 胰蛋白 酶 抑 制 剂 ( s o y b e a n t r y s in in h ib it o r , s t d 、 烟 草 天 蛾 胰 蛋白 酶 抑 制 剂、 牛 胰 腺 胰 蛋白 酶 抑制剂等在较低浓度下也可抑制一些害虫的 胰蛋白 活性。 该基因目 前已 被转入获得 成功的植物有烟草、 水 稻、 甘蓝、马 铃薯、 首箱、 油 菜、 番茄、 葛芭等2 0 余种， 所 转蛋白 酶 抑制 剂的 种 类 有c p t i , o c i , p i l l 等1 0 余种. 早在1 9 8 7 年， h id e r 等 ( 1 9 8 7 ) 人就 获 得了 转c p t i 基因 烟 草 植 株， 并 表 现出 一 定 的 抗 虫 能 力。 之 后 美国 康 奈尔 大学( 1 9 9 3 年) 成 功 地将c p t i 基因导 入水 稻， 获 得了 转基因 植株 经喂虫 试 验 发 现 其 对 二 化 螟 、 三 化 螟 均 具 有 一 定 的 抗 虫 性 x u 等( x u d等 ， 1 9 9 6 ) 将 电 a c t i n - 1 启 动 子驱 动的c p t i 基因 导 入水 稻品 系， 获 得了 抗二 化 螟的 株系， 安 韩冰等 ( 2 0 0 1 ) 将c p t i 基 因 用 基 因 枪 导 入 水 稻 ， 获 得了 抗 性 可 育 株 。 朱 祯( 2 0 0 1 ) 对c p t i 基因经体外修饰后导入水稻恢复系明恢8 1 和明恢肠， 其对螟虫表现出良 好的抗性; 用其配置的 杂交组合目 前已 完成中 试， 表现出良 好的 应用前景。 冉学忠等 2 0 0 1 ) 用基因 枪将c p t l 基因 转入中 花8 号、中花1 0 号 和中 作3 2 1 号的水 稻愈伤组织中， 分子检测和抗虫实验表明， 抗虫基因能 够遗传到i 2 2 代， 并对玉米螟有较好的 抗性。 李 永 春 等( 2 0 0 2 ) 利 用 农 杆 菌 介 导 法 获 得了 大 量 转c r y l a c 和c p t i 双 价 抗 虫 基因 水稻植株， 抗虫鉴定表明， 转基因t i 代株系对二化螟有很高的抗性。 张良 佑等 ( 1 9 9 8 ) 用基因枪法将s k t i 基因转化到水稻品 种台北3 0 9 的胚性愈伤组织， 得到对 稻纵卷叶 螟和三化螟具有抗性的 植株。 d u a n等 ( 1 9 9 6 ) 通过农杆菌介导 法将p in - 1 1 基因导入水稻，获得了 抗螟虫的 植株， 且其抗性可以 连续四代遗传。 1 . 1 . 3 淀粉酶抑制剂基因 淀 粉酶抑 制剂 ( 。a m y l a s e in h i b i t o r ,。 - a i ) .在 植 物界中 普 遍存 在，尤其 在禾 谷类 和 豆 科 作 物中 含 量 更 高 . a m是 从 墨 西 哥 的 觅 属 植 物( a m a r a n t h u s h y p o c h o n d r ia c u s ) 种子中 提取的。 一 淀粉酶抑 制剂， 含有3 2 个氨基酸残基， 分子量3 5 8 6 . 1 ， 分子中的 6 个半耽氨酸以1 一 、 2 - 5 , 3 - 5 的 方式形成三对二 硫键。 它是己 知最小的 蛋白 质性 质的。 一 淀粉酶抑制剂，能 普遍抑制哺乳动物和昆 虫体内的a 淀粉酶，且对几种昆 虫 幼虫 的“ 淀 粉 酶 有专 一 抑 制 作 用， 而 对 植 物 本 身 和 细 菌的。 淀 粉 酶 不 起 作 用。 非常适合通过转基因技术来赋予植物尤其 是农作物抗虫特性。 其杀虫机理是。 - a i 与昆 虫的a 淀粉酶以1 . 1 的 分子比 相结合形成e l 复合物 ， 从而抑制锭粉酶活性 a 使食入的 淀粉不能正常消化， 阻断昆 虫主要的能 量来源， 同时 幸 j 激昆 虫消化酶分泌 过量， 导致昆 虫厌食而发育不正常或死亡。目 前， 小麦、 大麦、 菜豆、 豌豆等作物 中的a - a i已 有较详细的 研究。 但由于a - a i 对哺乳动物的淀粉酶也有抑制作用， 故它们的 应用须谨 慎。 淀粉酶抑制剂 抗虫基因已 在烟草、 绿豆、 豌豆、 大豆、 菜豆、 可豆等植物上获得表达。 1 . 1 .4 外源凝集素基因 植 物外源凝集素 ( l e c t i n ) 是非免疫来源的 糖蛋白 或结合糖的 蛋白 质能聚 集细胞 和 ( 或 ) 沉淀 糖蛋白 ， 它 广 泛 存 在于 植物的 各种器官中， 尤以 豆 科 植 物的 种子中 含量 最丰富。 凝集素具有对多种单糖和寡聚糖的专一性结合能力， 不同 植物的 凝集素对 同 翅目 、 鞘 翅目 、 鳞 翅目 和 双 翅目 表 现 有毒 性。 凝集 素 抗虫的 作 用 机 制可 能 是 其 特 异性地结 合到昆 虫消化道围食膜的几丁质或上皮细胞的 糖缀合物或糖基化的消化 酶上， 影响营养物质的正常吸收; 同时还可能在消化道内 诱发病灶， 促进消化道内 细胞的 繁殖， 使昆 虫得病或引起拒食、生长停滞甚至死亡; 另外凝集素也能 微弱地 与脂肪体、 卵巢、 血淋巴 结 合， 破坏循环系统。目 前用于 植物抗虫基因工程的凝集 素 基因 主 要 有: 雪 花 莲 凝 集 素 ( g n a ) 基因 、 豌 豆 凝 集 素 ( p i - ) 基因 、 麦 胚 凝 集素 ( w g a ) 基 因、 半 夏 外 源 凝 集 素 (p t a ) 基因 、 稻 胚 凝 集 素 ( r g l ) a 凝 集 素 虽 可 用 来杀 虫 ， 但 有 些凝集素对哺乳动物也有显著毒性， 如麦胚 凝集素、 半夏凝集素， 这样 就使得这些 凝集素不适合用来转基因。 g n a对刺吸式口 器的害虫如蚜虫、褐飞虱等及线虫具 有抗生效应， 且对哺乳动物的毒性相对较小，因而研究的比 较多， 其一级、 三级结 构、 生 物 合 成及 基因 结 构己 搞 清楚。 目 前凝集 素 基因已 成 功 地导 入到 烟草、 马 铃薯、 油菜、玉米、水稻、 甘蓝、 甘薯、 番茄、 葡萄等十几种植物上。 研究表明， 豌豆凝集素 ( p - l e c ) 和雪花莲凝集素 ( g n a ) 对一定害虫有很强 的 抗代谢作用， 而对人、畜的毒副作用较小， 饲喂结果表明， g n a具有抗褐稻飞 虱 、 叶 蝉 和 蚜 虫 的 作 用。 周 兆 澜 等( 1 9 9 4 ) 报 导 ， 雪 花 蓬 夕 崛凝 集 素 以 及 麦 胚 凝 集 素对稻褐飞虱有毒性作用， g n a还能抑制桃蚜的生长。1 9 9 8 年， r a o 等 ( 1 9 9 8 ) 报 道了 雪 花 莲 夕 随凝 集 素 ( g a la n th u s n iv a li s a g g l u ti n in ,g n a ) 基 因 在 转 基因 水 稻中 得 到 表达， 并发现抑制了 褐飞虱的生 长、 发育和繁殖， 是 第一个在水稻中 表达并能 对刺 吸式口 器害虫起明 显抑制作用的 植物凝集收素。 马炳田 等 ( 2 0 0 2 ) 用基因 枪法将雪 二 ，之 花 莲 外 源 凝 集 素 基 因 ( 咖) 转 移 到 优良 粕 型 杂 交 稻 恢 复 系 蜀 恢5 2 7 中 ， 分 子 方 法 检 测 证明， 外源基因己 稳定遗传到转荃因 第三代， 实 现了 外源有益基因向 釉稻转移， 创 5 造了 新质源。 张良 佑等 ( 1 9 9 8 ) 采用基因枪将g n a基因 转化到水稻中，田间 接虫 鉴定表明， 转化株当 代对 褐稻虱的 抗性明显， 杨长登等 ( 1 9 9 8 ) 单倍体植株加倍及 加倍后g n a基因 表达的后 续报道。易自 力等 ( 2 ( 1 0 1 ) 用农杆菌 介导法将g n a纂 因导入 粕稻品 种中， 经p c r检测外 源荃因己 整合到染色体中，目 前正在进行田 间 鉴定。 1 . 1 . 5 其它抗虫基因 除 上 述 几 种 抗 虫 基因 以 外， 目 前 被 研 究 并 应 用的 还 有 营 养 杀 虫 蛋白( v e g e t a t iv e i n s e c ti c id a l p r o t e in ) 基 因 、 昆 虫 毒 素( in s e c ti c id a l t o x in s ) 基 因 、 几 丁 质 酶 ( c h iti n a s e s ) 基因以 及多 种氧化酶基因等等。 对于 这些基因的 研究多 集中 在 烟草等模式植物上， 表现出了 一定的 应用潜力。 朱祯( 2 0 0 1 ) 已 开始着手利用其中的 某些基因对水稻进 行转化， 但目 前尚 未见 成功的 报道。 1 . 2 水稻抗虫转基因中存在的问题及其对策 1 .2 . 1 抗性持久问 题 某些培育出的 转基因 扰虫 水稻虽然对虫害表现出 很大的 抗性， 但一 个潜在的问 题是抗性的 持久性。 目 前己 获得的 尤其是生产上准备推广应用的转基因 水稻新品 种 ( 系) 大多为转单一的b t 基因， 且 现有的研究已 充分 证明， 害虫长期接受抗虫物 质之后 容易 产生 耐 受性。 早 在1 9 8 5 年m c o a n 沙 e y 就证明了 印 度谷 螟在长期 饲 喂 含 有b t 杀 虫 晶 体 蛋 白( in s e c ti c id a l c r y s ta l p r o t e in ,i c p ) 基因 的 人 工 饲 料 后， 其 后 代 产 生了 对i c p 的 抗性， i c p 的 半数 致死剂 量提高了2 5 0 倍。 除此之外， 至少有8 种昆 虫在实验室条件下也产生了 对i c p 的抗性。 更为 严重的是在长期 使用b t 杀虫剂的 田间 也发 现了抗1 c p 的 小菜 蛾 ( k r i s c h e t a l . 1 9 8 8 ) 。目 前 世界上有不少地区 都已 经 发现了 对b t 抗虫 植物产生抗 性的 害虫。 因此， 保持转基因水稻的抗性稳定 就显得 十分重要。目 前 解决这一 问 题的 相关对策主要有: 培育 转多基因 抗虫水稻， 将多 个抗虫基因同时 导入植物以 提高植物的抗虫性和扩大抗虫谱已 成为抗虫分子育种 的新策略; 寻 找和 筛选广 谱抗虫基因; 利用特异启 动子和诱导启动子; 加 强 田间管理，改善 稻田生态环境。 1 .2 . 2 外源基因的 表达效率间 题 外源抗虫基因的表达水平也是直接影响转基因 植株能否得到成功运用的关键 问 题之一。 一般 而言， 抗虫 基因的表达 量越高， 其抗虫 效果就越好。 因 此， 人们 提 出了若干策略来克服外源基因 在受体中的表达限 制。 启动子优化: 转译序列的 修饰; 信号肤的使用: 叶绿体的转化。 1 . 2 . 3 转基因沉默问 题 基因 沉默( g e n e s i l e n c i n g ) 是 指生 物体中 特定 基因由 于 种种原因 不表达， 并不是 所 转的基因发生了 丢失或突变， 而是整合进植物基因组的 外源基因在转化体的当 代或 其后代中的表达受到抑制， 出现了失活的现象。转基因沉默的最早报道是在诱发 冠瘦瘤的根癌农杆菌 t - d n a转移中， 多拷贝 t - d n a引起了甲基化和基因沉默 ( p e e r b o lt e e t a l , 1 9 8 句 。 基因 沉默的原因有很多， 转基因的 拷贝 数和构型、 在植物体上 的整合位点、转基因的转录水平、环境和发育因子都与沉默有 关 ( f i n n e g a n a n d m c e lro g , 1 9 9 4 ) 。 主要有以 一下 儿种: 重复诱导的 基因 沉默; 位置效 应引起的基因沉默; d n a甲 基化引起的 基因 沉默。 研究发现， d n a甲 基化主要 发生在基因的5 端的启动子区域， 阻碍转录因子与启动子的接触， 从而引 起转录抑 制 ( n a n x等，1 9 9 8 )甲基化并可伸到基因的3 端 ( v a n h o u l t h , 1 9 9 7 ) 。目前针 对基因沉默现象采取的措施主要有: 转化方法的选择; 避免重复序列的 产生; 实现共整合与共表达的一致: 对外源基因进行修饰， 并采用植物偏爱的密码子， 可以 提高基因的 表达， 降 低基因 沉默的 几率; 避免反义r n a的 产生; m a r的 应用。 1 . 2 .