（光学专业论文）生物组织的二次谐波及其产生机制.pdf

福建师范大学刘嫩容硕士学位论文 摘要 二次谐波( s e c o n dh a r m o n i cg e n e r a t i o n ，s h g ) 成像技术由于具有空间高分辨率、 无需荧光标记，对生物样品的光损伤小，在介质中的穿透深度大等优点，在生物医学领域 具有广阔的应用前景。目前，尽管已有许多研究小组对生物组织的s h g 进行大量的实验报 道以及一些理论解释，但由于生物组织的复杂性和多样性，这些解释多少带有猜测性，有 些机制目前还没有认识清楚。 本论文主要通过对小鼠尾巴等组织进行光学二次谐波成像实验，获得不同条件下鼠尾 组织的s h g ，讨论不同的样品制各方式、激发光波长、功率、扫描深度等因素对生物组织 s h g 的影响，观察和比较生物组织的s h g 成像和双光子激发荧光( t w o p h o t o ne x c i t a t i o n f l u o r e s c e n c e ，t p e f ) 成像的规律，并根据实验结果和前人工作，结合非线性光学理论，对 生物组织s h g 的产生机制尝试作出新的解释。 关键词：二次谐波：生物组织；双光子激发荧光：非线性光学 福建师范大学刘嫩容硕士学位论文 a b s t r a c t s e c o n dh a r m o n i cg e n e r a t i o n ( s h g ) i m a g i n gn e e d sn of l u o r e s c e n tl a b e l sa n db r i n g sn o p h o t o b l e a c h i n go rt o x i c i t y i t sap r o m i s i n g t o o lf o rh i 曲一r e s o l u t i o n ，t h r e e d i m e n s i o n a ls t u d i e si n b i o m e d i c i n ef i e l d s n o w ，i nd e s p i t eo f m a n ye x p e r i m e n t sa n ds o m ee x p l a n a t i o n sa b o u ts h gi n b i o l o g i c a lt i s s u e s ，o w i n gt ot h ec o m p l e x i t ya n dv a r i e t yo f b i o l o g i c a lt i s s u e s ，t os o m ee x t e n ts o m e e x p l a n a t i o n sw e r ew i t hh y p o t h e s i s ，t h em e c h a n i s mo fs h g i nb i o l o g i c a lt i s s u ei sn o tc l e a ra l lt h e s a m e i nt h i st h e s i s ，s o m es h ge x p e r i m e n t sa r em a d ei nr a t t a i la n df a t p r e p a r a t i o no f s a m p l e s ， l a s e rw a v e l e n g t h ，l a s e rp o w e ra n ds oo n ，c a ni n f l u e n c es h gi nb i ot i s s u e a n ds h go f l o n g i t u d i n a l l yd i f f e r e n tl a y e r sa r ev a r i e d s h ga n dt w o p h o t o ne x c r a t i o nf l u o r e s c e n c e ( t p e f ) i m a g e sa r ea l s ob eo b s e r v e di nr a t t a i la n df a t t h ek e yi nt h i sd i s s e r t a t i o ni sm a k i n gs o m en e w c o m m e n t so nt h em e c h a n i s mo f s h gi nb i o l o g i c a lt i s s u eo nt h eb a s eo f t h ee x p e r i m e n t sa n d o t h e r s t h e o r i e s k e y w o r d s ：s e c o n dh a r m o n i cg e n e r a t i o n ( s h g ) ；b i o l o g i c a lt i s s u e ；t w o p h o t o ne x c i t a t i o n f l u o r e s c e n c e ( t p e f ) ；n o n l i n e a ro p t i c s i i 榻建师范大学刘嫩容硕：i ：学位论文 中文文摘 光学二次谐波( s e c o n dh a r m o n i cg e n e r a t i o n ，s h g ) 的产生，是激光出现后第一个被发 现的非线性光学效应，体介质产生二次谐波需要两个基本条件：一是介质必须具有中心非 对称性，二是要满足相位匹配条件。二次谐波成像技术由于具有三维高分辨率、无需荧光 标记，所采用的激发光源是近红外的飞秒级超快激光，对生物样品的光损伤小，在介质中 的穿透深度大，适合对活体进行动态测量等优点，在生物医学研究领域具有广阔的应用前 景。 目前，已有大量的有关各种生物组织s h g 的研究报道，但是，由于生物组织结构的复 杂性和个体的差异性，加之样品制备的方法各异，在不同组织中观察到的s h g 所表现的规 律不完全相同，影响生物组织二次谐波效应的因素仍不完善，对于生物组织二次谐波产生 的机理尚没有一种理论能够完满解释。进一步理解生物组织光学二次谐波效应的产生机制 及其影响因素，对更好地利用二次谐波技术获取生物组织的结构信息，促进生物成像仪器 的开发和临床应用具有一定的指导意义。因此，本论文主要围绕以下几个方面开展工作： 第一部分，简要概述了非线性光学二次谐波技术的特点以及在生物医学领域的广泛应 用，介绍了多种生物组织中的二次谐波效应及其影响因素，阐述了s h g 产生机制的一些理 论解释，对生物组织的光学二次谐波效应的国内外研究现状进行了综述，指出了尚需亟待 解决的问题，并阐述了本论文研究的意义和主要内容。 第二部分，简要介绍了非线性光学晶体和生物组织体的光学二次谐波理论：阐述了相 位匹配的物理意义；对生物组织二次谐波产生机制的现有理论解释作了简要阐述。目前众 多文献对生物组织s h g 的产生机制的解释主要有：( 1 ) 生物组织的s h g 不需要考虑相位匹 配问题：( 2 ) 富含纤维状反演中心不对称的组织很容易观察到s h g ，对于各向同性的组织 ( 如脂肪) 也可产生s h g ，认为s h g 的产生主要来自生物组织表面和散射单元界面。 第三部分，阐述了双光子吸收过程；简要介绍了双光子激光扫描共聚焦显微镜原理， 它不需要共焦小孔就可实现三维高分辨，信号收集效率高，光化学毒性小，能对细胞和组 织做光学上的切片，此外，所采用的近红外超快激光对生物样品的光损伤小，低的光散射 效应可得到较大的穿透深度。本章节还比较了s h g 成像与t p e f 成像的物理实质，s h g 成像 实质上是利用介质的二阶非线性极化率z ( 2 ) 的空间分布进行成像，而t p e f 成像是利用介质 的双光子吸收系数的空间分布进行成像，指出s h g 的产生并不是双光子吸收后的单光子跃 i i i 祸建师范大学刘嫩容硕：l ：学位论文 迁过程，而是在强激光场的作用下，介质体系分子的二阶极化强度所产生的倍频辐射。 第四部分，主要介绍对鼠尾组织的二次谐波和双光子激发荧光的实验观察结果。首先， 对组织切片在单光予、双光子激发下荧光的产生情况进行观察，并比较h e 染色和未染色 样品的二次谐波强度的差异；其次，观察样品在相同功率不同波长、相同波长不同功率激 发光激发下的二次谐波效应，讨论不同的样品制备方式( 如：切片取向、h e 染色) 、激发 光的波长、功率等因素对生物组织二次谐波强度的影响：接着，探测样品在纵向不同断面 层上的二次谐波信号强度，并讨论扫描深度对二次谐波效应的影响：最后，扫描得到反映 样品微观结构的二维光学二次谐波图像，并且与双光子激发荧光成像信息进行对比。初步 讨论了生物组织s h g 的规律及其影响因素。 根据以上实验的结果，在分析已有理论的基础上，结合非线性光学理论，对生物组织 二次谐波的产生机制尝试作出新的解释：首先，提出生物组织s h 6 的产生无需特别考虑相 位匹配的实质在于：由双光子激光扫描共焦显微镜的纵向分辨率决定的有效相互作用长度 j i b j , ，在相干长度范围内；还指出生物组织背向二次谐波的产生有可能是由前向二次谐波 在生物组织的散射单元界面上的后向反射引起的；其次，实验发现激发光功率较小时，生 物组织的s h g 强度与激发光光强成平方律关系，当激发光达到一定的强度时，生物组织的 s h g 强度与激发光光强不再显示平方律关系，利用非线性光学原理给予了一种可能的解释： 另外，还指出像脂肪类的生物组织虽是中心反演对称的，但在飞秒强脉冲激光的作用下， 有可能会产生光致非对称性，使各向同性的介质变为各向异性，从而产生二阶非线性极化 强度并辐射二次谐波。 结束语部分，对本论文的主要工作进行了总结，并指出了工作中尚存在的不足和今后 将进一步开展的工作。 综上所述，本论文的研究工作将有助于对生物组织二次谐波的产生机制有进一步的认 识，对拓宽其在生物医学以及其它科研领域的应用具有一定的指导意义，并为今后工作的 进一步开展奠定了基础。 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 引言 双光子激光扫描共聚焦显微镜( t w o p h o t o nl a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p y ， t p l s c m ) 1 1 1 2 0 世纪9 0 年代出现以来，便在生物医学领域得到了广泛的应用“，是研究组 织和细胞内特定分子和特定结构动态变化的有力工具。由于双光子激发效率与激光光强的 平方成正比，且非线性的闽值过程使得双光子荧光只发生在焦点附近的极小区域，因此， 它不需要共焦小孔就可实现三维高分辨，信号收集效率高，而且降低了对焦点以外染料的 漂白，减少光化学毒性。采用近红外的飞秒超脉冲激光作为激发光源，对生物样品的光损 伤小，穿透深度大。 在双光子激光扫描荧光显微镜中，飞秒激光与生物组织相互作用还会发生其它非线性 光学效应，例如光学二次谐波( s e c o n dh a r m o n i cg e n e r a t i o n ，s h g ) 效应。二次谐波成像除 了具有双光子荧光成像的优点外，还具有自己独有的特性：有较高的图像分辩率和信噪比， 它反映的是样品本身的非线性光学性质，无需染料标记，可以避免由此带来的光毒性，因 此，利用二次谐波成像技术，可实现对活体进行动态测量。特别是二次谐波技术与激光扫 描共焦显微技术的完美结合而形成的二次谐波层析成像技术，在实现非侵入式的活体检 查，疾病的早期诊断等生物医学领域具有广泛的应用前景“。”，是一种极具发展潜力的医 学诊断技术，已成为国际上十分活跃的研究热点。除需要不同滤色片外，二次谐波成像与 双光子荧光成像的实验装置基本相同，二者的成像信息相互补充。 已有许多研究小组对不同生物组织的二次谐波效应进行了研究“”“，并且对其产生机 制也做了一些理论解释“”，但是，由于生物组织结构的复杂性以及个体的差异性，目 前对于生物组织二次谐波产生机制的认识还不完善，许多实验和理论工作有待于物理学 家、生物学家和医学家们的共同努力。 1 2 本论文研究的背景及意义 激光发明的第二年，f r a n k e n 就在石英晶体中观察到波长为6 9 4 3 r i m 的红宝石激光的非 线性光学二次谐波现象( s h g ) 乜8 1 ，k l e i n m a n 在1 9 6 2 年首次确证了在石英晶体中观察到了非 线性光学二次谐波现象( s h g ) 。”，之后二次谐波技术便被应用于倍频脉冲激光以获得更短 波长的激光。随后于1 9 6 8 年，b l o e m b e r g e n 在物质的界面观察至u s h g 啪1 ，从而开创了表面二 次谐波的研究。，1 9 7 4 年，h e l l w a r t h 等首次将二次谐波效应和普通显微镜结合起来观察 福建师范大学刘嫩容硕士学位论文 晶体的微观结构o ”。 许多研究小组在很多生物组织及细胞中也都发现了二次谐波等非线性光学现象，例如： 1 9 7 1 年，f i n e 和h a n s e n 在近透明的组织中首次观察到了激光作用于生物组织产生的二次谐 波现象嘲；1 9 7 8 年，6 a n n a w a y 和s h e p p a r d 就提出了二次谐波成像方法汹1 ；f r e u n d 等于1 9 8 6 年首次进行了生物组织的s h g 成像实验，他们利用s h g 研究老鼠尾巴肌腱的胶原纤维方向 “”。此后，人们开始利用二次谐波成像研究生物组织的某些结构信息，不仅仅在富含纤维 状的生物组织，在高散射组织( 如脂肪等) 也观察到了s h g 。 随着激光技术的进一步成熟，自1 9 9 0 年d e n k 博士将非线性效应成像技术应用于生物领 域，提出了双光子生物学显微镜以来，细胞膜电位、牙齿、老鼠尾肌腱等的二次谐波成像 都相继开展起来。1 9 9 7 年，6 u o 等提出了用超短激光脉冲( 1 0 0 f s ) 可对生物组织进行二次 谐波成像，并对鸡的皮肤、肌肉和脂肪组织进行了实验比较研究，发现皮肤的二次谐波强 度比肌肉的强，而脂肪的二次谐波最弱“3 1 ”：1 9 9 8 年，g a u d e r o n 等用超短激光脉冲( 9 0 f s ) 对生物组织进行二次谐波三维成像的实验研究，并对嵌有硼酸锂( l b o ) 晶体的琼脂样品 进行了三维成像实验“；1 9 9 9 年，k i m 等利用超短激光脉冲( n ( ( 0 ) ，在此情况下，如不采取特殊办法是难以实现相位匹配的。除立方晶系的晶体 外，所有的单轴晶体和双轴晶体都是光学各向异性的，即具有双折射特性，因此采用晶体 的双折射特性来补偿色散的所谓角度匹配法就是实现相位匹配的重要方法。”。 福建师范大学刘嫩容硕士学位论文 2 2 2 相位匹配 根据非线性波动方程，并采用慢变振幅等近似，有倍频光与二阶非线性极化强度的关 系式蚓为： p 丘：d e s ：! 竺户( 2 ) e i f f , z( 2 7 ) d z 2 e o c n 2 其中，户( 2 ) = 2 s o 克, t 2 ) ：丘丘，t ，分别表示谐波和基波的波数。 对( 2 - - 7 ) 式整理得 d e 2 ：! 竺卢( 2 ) p ”( 2 8 ) d z 2 c o c n 2 其中 幽k 22 k , k 2 。一2 k ， 卢( 2 ) o cb峨=(2-9) 豆e k 2 。 如 2 - 2 所示，为相位匹配示意图。在晶体中，频率为u 的基频光传播到哪里，频率 为2u 的二阶极化波就在哪里产生。在一般的光学介质中，由于色散效应，t 0 ，这样 倍频极化波在各个不同位置所发出的倍频光，在出射面会由于相位的无规性而干涉相消， 从而观察不到倍频现象。 声( ，2 云 豆，丘 、八八趴 八八， 晶体 n 图2 - 2 相位匹配示意图 f i g 2 - 2s k e t c hm a po f p h a s em a t c h i n g 要获得倍频光，应该使基频光与倍频光在晶体中的传播速度相等，这样就可以保证倍 第2 章双光子共振增强的光学二次谐波理论 频极化波与倍频光的传播速度相等，即保证倍频极化波在任一位置发出的倍频光传到晶体 出射面时都有着相同的相位，干涉相长而互相加强。 由于= c n 。，v 2 。= 1 1 2 。，式中c 为光速，和。分别为基频光和倍频光的折射率。 因此，若= 屿。，则= n 2 。，又j | = 2 州五= 2 z c g , n c ( 这里的表示相应的光频率) ，即 得k 2 。= 2 吒，则a k = 如。一2 k = 0 。 由( 2 6 ) 式可以看出，当a k l l 2 = 0 ，即a k = 0 1 对， 子 s i n ( a k l l 2 ) l a k l l 2 2 = l ， 此时，7 = 叩。若七o ，当吲2 = 石，即j = 2 州l 时， 子 s i n ( t e s , 1 2 ) l m l l 2 2 = o ， 则r l = 0 ，则没有倍频光输出。 当a k 0 时，倍频光输出功率b 。将沿晶体长度方向里周期性变化，空间变化的周期 为2 z l a k ，从非线性光学晶体z = 0 的入射端面算起，当入射基波行进距离o z = 州| | 处时， 倍频光输出功率县。达到第一个最大值，这个距离定义为相干长度，用厶表示， l c = = 。一2 吒2 心。一) 2 1 0 ) 显然，当o z 乞时，倍频光输出功率b 。较大：在o z 2 t 距离范围内，当= 2 厶时， 最。变小至零。龇愈大，t 愈小，即最。沿o z 方向的变化就愈快，若a k = 0 时，昱。将随 o z 的增长而单调地变强，直至饱和，此时称作相位匹配“3 1 “。 2 3 生物组织的非线性光学二次谐波理论 s h g 已成为生物医学领域重要的研究手段之一，根据不同生物组织产生的二次谐波图 像，就可以实现对其细微结构进行探测。上皮和肌肉中含有较多的胶原纤维和蛋白纤维等 非对称结构的分子“3 ，一些氨基酸如色氨酸、酪氨酸等含有7 【电子结构的分子也有很强的 非对称性“，会产生较强的二次谐波效应，像脂肪类中心反演对称的组织也会产生很弱的 一i 次谐波n 4 1 。 生物组织产生二次谐波的原理同晶体一样，也是在入射光的照射下产生t - - 阶非线性 极化效应。许多小组已经对生物组织的s h g 进行了大量的研究“”2 ”，对其产生机制也已有 一些相关的理论解释，以下简要介绍几种有代表性的结论： 根据p a t r i c ks t o l l e r “。等人的实验理论，胶原纤维组织的二阶非线性极化强度表达 式为 卢：西g 巨) 2 + 孤仁丘) + 氓g 丘) ( 2 1 1 ) 其中i 是纤维轴向单位矢量，丘是外电场，a ，b ，c 是与生物组织的二阶非线性极化率相关 福建师范大学刘嫩容硕士学位论文 的系数。 文献中将耦合波方程应用到生物组织，对上式通过进一步假设得到s h g 沿纤维轴向 分量和径向分量分别为 驰，f ) 划咖业壁篇掣 如( i ，) ：爿：( z ) ( 拿，e x p i ( k 2 z - c 0 2 1 t + ) - f ( r z 2 。0 9 。o ) 2 1 + i ( z z n ) ( 2 1 2 ) ( 2 1 3 ) 其中a 2 1 1 , a ：分别表示平行和垂直于纤维方向的慢变振幅，满足如下方程 z 啦警= - - 2 ( 0 2 2 南( 2 - - 1 4 ) z 如警= - p a ，2 2 啡) ) 高 c z 娟， 式中声是二阶非线性极化强度，是激光传播方向，q ，如分别表示s h g 的频率和波数；r ， z 分别表示半径和轴向位置；o ) 0z 。分别表示聚焦高斯光束的柬腰和r a y l e i g h 范围： 缸= 2 丘一t ；u 是磁导率。 忽略线性双折射，胶原纤维二次谐波信号k 。对激发光的偏振依赖性可以用下式表 示： o c ( 卢j ) 2 + ( 卢( ；c ) ) 2 ( 2 - 1 6 ) 根据式( 2 1 4 ) 和( 2 - - 1 5 ) ，如果相位匹配不满足，即a k o ，a 2 上和a 2 将趋于零，除非 产生二次谐波的有效相互作用长度小于相干长度，关于无相位匹配问题的解释留待第四章 分析。 c a m p a g n o l a 等1 通过对活细胞的s h g 实验，也分析了二次谐波的产生机理，根据二阶 非线性极化强度的表达式 卢= 氏：面 ( 2 1 7 ) 其中，声和云都是矢量，可见，对于中心对称的介质，其二阶非线性极化强度贡献的总和 为零。 并且利用s h g 的强度关系式 第2 章双光子共振增强的光学二次谐波理论 ，( z ) 。c z t 2 ，吾( ) 2r (2-18) 其中z ( 2 ) 是二阶非线性极化率，i 是激发光脉冲能量，f 是脉冲宽度。双光子激发荧光过程 ( t w o - p h o t o ne x c i t a t e df l u o r e s c e n c e ，t p e f ) 荧光强度与峰值功率的二次方成正比，s h g 是个瞬间过程，只在激光脉冲持续过程才会产生，提出z ( 2 ) 可以用超极化率来表示 z 2 = n 。( ) ( 2 1 9 ) 其中，n 。是分子密度， 表示对分子取向求平均。这方程再次强调了介质必须具有非中 心对称性，因为对于偶极矩各向同性的介质，( 卢) = o 。 认为对双层结构的介质，超极化率就是分子二阶非线性极化率z 【”，因此s h g 效应可 由下式给出 户芸彦物( 2 - - 2 0 ) 式中e 是电荷，。k ，丘和如分别是激发态与基态间的能级差、振荡频率和偶极矩的变化。 从式( 2 - - 2 0 ) 可以看出，当激光的基频接近于电子跃迁频率时，总的二阶非线性效应可 以看成是由共振项和非共振项贡献的总和： 砘l = 耀。+ 蒯 ( 2 2 1 ) 对于不同的激发波长和发色团，共振效应会使得s h g 效应得到不同数量级的增强，已 经有相关文献报道t s h g 效应得到很大数量级( 1 0 4 ，1 0 6 ) 增强的情况“”。此外，还 提出当样品表面的介电常数发生很大的变化，其产生的电四极矩也可能会导致8 h g 效应， 例如：金属表面。这种相互作用产生的s h g 效应就不要求介质具有非中心对称结构，然而， 对于生物组织样品还是对此有一定的要求。 g u o 等对鸡的皮肤、肌肉和脂肪组织进行了二次谐波实验的比较研究，发现脂肪的二 次谐波比皮肤和肌肉的弱，提出是因为脂肪组织中含非对称结构的分子较少，并提出s h g 的产生来自生物组织的表面和散射单元界面，对于各向同性介质由于其表面和散射单元界 面的反演对称性被破坏，在其表面和散射单元界面也会产生s h g “；马辉等通过对皮肤、 肌肉、动脉、尾巴肌腱、肝、心脏、脂肪等多种生物组织进行了大量的背向二次谐波实验， 发现富含胶原纤维和蛋白纤维的皮肤和肌肉的二次谐波较强，也认为生物组织的背向二次 谐波可能是组织内部的微小界面所产生的表面二次谐波的总和，例如胶原原纤维( f i b r i l ) 的表面”1 。可是这就存在疑问：激光聚焦点通常小于细胞尺度，所产生的表面二次谐波应 福建师范大学刘嫩容硕士学位论文 该很弱，很难观察到，那么表面二次谐波的说法就很难解释各向同性介质( 如脂肪) 二次 谐波的产生。 综上所述，目前相关文献对生物组织二次谐波产生机制的解释主要有：( a ) 生物组织 的光学二次谐波是非相位匹配的；( b ) 只要生物组织中存在中心反演不对称的分子结构， 就可能产生s h g ，胶原纤维状组织是最典型的种，( c ) 像脂肪类中心反演对称的组织， 也可观察n - - 次谐波( 强度弱得多) ，是因为其表面和散射单元界面的反演对称性被破坏， 属于表面s h g ：对生物组织二次谐波的产生机制没有给予更合理、更深入的理论解释，因 此，在本论文的后续部分章节中将通过实验以及理论分析做进一步的探索。 2 4 小结 本章主要简要介绍了非线性光学晶体的二次谐波理论；阐述了相位匹配的物理意义： 阐明了光学二次谐波产生的前提：一是满足相位匹配条件，二是介质具有反演中心非对称 性；对生物组织二次谐波产生机制的已有理论解释作了简要概述，目前众多文献的观点主 要有：( 1 ) 生物组织的光学二次谐波是非相位匹配的；( 2 ) 除了富含纤维等反演非对称 性分子的生物组织外，像脂肪类中心反演对称的组织，也可观察到其二次谐波，提出脂肪 类组织二次谐波的产生主要来自其表面和散射单元界面。 第3 章双光予激光扫描共聚焦显微镜的成像原理 第3 章双光子激光扫描共聚焦显微镜的成像原理 3 1 引言 激光扫描共聚焦显微镜( 1 a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p y ，l s c m ) 是8 0 年代发 展起来的分子细胞生物学分析仪器，它是随着激光、视频、计算机等技术的飞速发展而诞 生的新一代显微镜，较传统显微镜有着不可比拟的优势，如高空间分辨率、非介入无损伤 连续光学切片、三维图像、实时动态等细胞结构和功能的分析检测，这项技术从问世至今 一直处于不断发展进步中。自1 9 9 0 年美国c o r n e l l 大学的d e n k 等人首次结合双光子过程 和扫描共焦显微成像系统获得生物样品体内的荧光像“3 以来，双光子荧光显微成像技术在 物理、化学、生物、医学等广泛领域受到极大关注，并获得迅猛发展。“3 。 双光子激光扫描共聚焦显微镜( t w o p h o t o nl a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p y ， t p l s c m ) 是研究组织和细胞内特定分子和特定结构动态变化的有力工具，它是利用双光子 激发荧光效应进行成像，二次谐波成像与双光子荧光成像在装置上几乎完全相同，只是采 用不同的滤波片，本论文中就利用z e i s s 的l s m5 1 0m e t a 双光子激光扫描共聚焦显微镜对 鼠尾等组织的胶原进行二次谐波和双光子激发荧光实验。因此，本章简要介绍双光子吸收 理论和双光子激光扫描共焦显微原理，阐述双光子荧光成像和二次谐波成像的异同。 3 2 双光子吸收理论 双光子吸收过程是指一个分子或原子同时吸收两个光子，通过一个中间虚能态从基态 跃迁到激发态的过程。这两个光子的能量和等于跃迁过程的终态与初态的能量差： a e = h c o , + h a ) 2 ，它伴随有荧光现象。如图3 1 所示为双光子吸收过程的示意图。 激发态 基态 7 一、， 图3 - 1 双光子吸收过程示意图 f i g 3 1s k e t c hm a po f p r o c e s so f t w o - p h o t o na b s o r b i n g 福建师范大学刘嫩容硕士学位论文 根据非线性光学理论，双光子吸收是三阶非线性光学过程，是一种瞬时的非线性现象， 与瞬时光强有关，对小的z 来说“，有 ( 国，z ) = ( ，o ) 1 一( ，0 ) a t a z ( 3 1 ) 表示在介质深度z 内被吸收的光子数与n 2 ( ，0 ) 成正比，即与入射光强度的平方成正比。 因为双光子吸收的吸收几率与入射光强的平方成正比，在低强度的情况下比单光子吸 收的几率要小几个数量级，故在一般强度光波辐照下难以观察到。只有激光达到足够强度 方能产生双光子吸收，所以它是一种阈值过程。 3 3 双光子激光扫描共聚焦显微原理 共焦扫描光学显微镜特别适用于生物组织的研究，特别是2 0 世纪9 0 年代激光扫描双 光子荧光显微镜出现之后，已经在生物医学领域得到广泛的应用，本节首先对激光扫描共 焦显微原理作简要介绍。 3 3 1 共焦显微镜原理 激光扫描共焦显微镜具有许多常规显微镜所没有的特性。它利用激光作为光源，采用 共轭焦点( 共焦) 技术，使光源、被照物点和探测器处在彼此对应的共轭位置。光源经物 镜在样品内聚焦成衍射极限的光点，其荧光( 或反射光) 再次通过物镜或聚光镜到达空间滤 波器的共焦针孔内，由靠近针孔后面的探测接收器接收信号，通过移动扫描聚光点在样品 内的位置可对样品进行三维成像。激光扫描共焦显微镜的共焦原理“”可以由图3 2 来说明。 它的关键技术是共焦小孔( p i n h o l e ) 的引入。被光源照射的针孔光阑起点光源的作用，检 测针孔光阑及其后的探测器起点探测器的作用，在图3 2 ( a ) 中，系统被精密调准时，由光 源通过照明针孔光阑射出的光，经物镜形成受衍射限制的光点照射位于物镜焦平面上的样 品中的一点，由此点反射回来的光线再次通过物镜及其后的检测针孔光阑被其后的探测器 所探测，即可获得共焦图像。如果当观察样品的对象移出焦平面，其反射光线来自物镜的 焦平面的上方或下方的物体的反射，这些反射光线经物镜后不能被聚焦到检测针孔光阑里 去，而被散焦到其针孔光阑之外，如图3 - 2 ( b ) 所示，使此针孔光阑后面的探测器上的接收 信号的幅值将迅速的减小，从而使获得的图像具有好的对比度和高的分辨率。 第3 章双光子激光扫描共聚焦显微镜的成像原理 。回 发射滤片三；三一 检测针孔b照明针孔光阑 3 r 一 照明针孔光阑 ( a ) 扫描对象位于伟平面上 ( b ) 扫描对象位于焦平面外 图3 2 激光扫描共聚焦显微镜工作原理示意图 f i g 3 2s k e t c hm a po f p r i n c i p l eo f l a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p y 光的衍射极限决定了显微镜最大可能之横向分辨率，根据r a y l e i g h 条件，a i r y 光斑 决定了可解析的距离，所以传统显微镜之横向分辨率为 w - o 朋击( 3 - - 2 ) 而共焦扫描显微镜由于有了针孔以行空间滤波，因此其横向分辨率比传统显微镜稍加 优越，为 r ：0 5 鱼一 ( 3 3 ) j w ， 在纵向分辨率上，共焦显微镜的优点则显露无疑，其纵向分辨率可表示为 2 南( 3 - - 4 ) 其e e n 为聚焦面介质的折射率。 由于共焦小孔的存在，探测器只接收来自物镜焦点处的信息，焦点以外的光将全被共 焦小孔屏蔽。因而激光扫描共焦显微镜要比常规光学显微镜的分辨率要高些，且图像清晰 度也有所增强。而且正是由于共焦小孔的存在使之具有三维成像的特点，这是常规光学显 微镜所不能比拟的。但由于光损害、光降解、光漂白等原因，以及显微镜本身复杂的紫外 祸建师范大学刘嫩容硕士学位论文 光学元件的限制，激光扫描共焦显微镜不能得到更广泛的应用，其特点和潜力没有完全发 挥出来。直至1 9 9 0 年美国康奈尔大学的d e n k 和w e b b 等人提出将双光子技术应用到激光扫描 共焦显微镜中“1 ，从而为激光扫描共焦显微镜的更广泛应用开辟了道路。 双光子激光扫描显微术一经问世，很快被应用于神经信号传导、生物代谢过程及其药 物研究等生物医学领域，取得了显著的成果“1 ”删。二次谐波的产生是二阶非线性光学过 程，因此与双光子激发荧光( t p e f ) 有许多相同的特性“”“，s h g 技术是t p e f 的有力补 充。因此，有必要简要阐述双光子荧光的产生过程。 3 3 2 单、双光子荧光产生过程 在激光照射下，基态分子或原子吸收一个光子后跃迁到激发态，随后又弛豫到某一基 态，同时以光予形式释放能量而发出荧光，这一过程就是通常的单光子激发情况。1 9 3 1 年， m a r i ag o p p e r t m a y e r 就曾在她的博士论文中从理论上预言一个分子或原子可以在同一个 量子事件中同时吸收两个光子而成激发态。“。单、双光子荧光产生过程如图3 3 所示，基 态分子或原子同时吸收两个光子后跃迁到激发态，随后又弛豫到某共振能级态，然后跃迁 到某一基态，以光子形式释放能量而发出荧光，这种情况就是双光子激发荧光过程，但因 同时需两个光子激发，故其跃迁率( t r a n s i t i o nr a t e ) 正比于入射光强度的平方，因双 光子吸收截面极低，所以需要极高的瞬间功率，才能有效地产生激发。 激发态 基态 激发态 单光子激发 双光子激发 图3 - 3 单、双光子激发荧光过程示意图 f i g 3 - 3 s k e t c h m a p o ff l u o r e s c e n c ee x c i t a t d d b ys i n g l e - p h o t o n a n d t w o - p h o t o n 由于双光子激发所产生的荧光强度与激发光的光强平方成正比，因而与单光子激发的 线性过程相比，双光子激发就需要很强的激发光强，这就使双光子激发具有很高的空间局 域特点。由于单光子激发是非阈值过程，在整个激发光路里的样品都由于被激发而发出荧 第3 章双光子激光扫描共聚焦显微镜的成像原理 光，而对于双光子激发而言，只有在焦点处的微小区域内样品才能吸收足够的双光子而发 出荧光。如图3 4 所示。 ( a ) 物镜 焦平面 图3 - 4( a ) 在单光子激发下，样品中光所经之处皆受到激发 ( b ) 在双光子激发下样品中仅在光束聚焦面上的受到激发 f i g 3 4 ( a ) s a m p l ea l li nl i g h tb ee x c i t a t e db yo n e - p h o t o n ( b ) o n l yi nf o c a ls a m p l eb ee x c i t a t e db yt w o p h o t o n 3 3 3 双光子激光扫描共焦显微镜原理简介 品 自2 0 世纪9 0 年代双光子激光扫描荧光显微镜出现之后，已经在生物医学领域得到广 泛的应用。 双光子激光扫描共聚焦显微镜原理与单光子激光扫描共焦显微镜相似，区别在于：它 采用钛宝石飞秒激光器作为激发光源，利用波长更长的近红外激光激发荧光效应进行成 像，具有高于单光子激光扫描共焦显微镜的横向分辨率和纵向分辨率呲1 ：由于激发效率与 激光光强的平方成正比，双光子荧光只发生在焦点附近的极小区域，因此，它不需要共焦 小孔就可实现三维高分辨，信号收集效率高，而且降低了对焦点以外染料的漂白，减少光 化学毒性，能对细胞和组织做光学上的切片：所采用的激发光源是近红外的超快激光，对 生物样品的光损伤小，并且近红外光散射效应小，在介质中的穿透深度大，因此成像深度 比较大。 福建师范大学刘嫩容硕士学位论文 3 4t p e f 成像和s h g 成像 3 4 1s h g 的j a b l o n s k i 示意图 e f l 3 - 5 为s h g 产生过程的j a b l o n s k i 示意图“”。如图所示，s h g 的的产生并不是双光子吸 收过程，而是在强激光场的作用下，介质体系内部分子的取向极化，即产生非线性的二阶 极化强度，从而辐射倍频的相干光。和图3 - 3 中双光子荧光的产生进行比较，可得s h g 和t p e f 的光谱和时间特性是不同的，后者，带宽是由基态和激发态的能级宽度决定的，荧光发射 响应时间是与振荡能级相关，为r l s 数量级；相反地，s h g 的光谱和时间特性与激发光密切 相关，光谱带宽为激发光的i 2 ，s h g 是由电子云畸变产生的，响应时间约为1 0 “6 s ，对l o o f s 脉冲是瞬间响应。 图3 - 5 二次谐波产生过程示意图 f i g 3 5s k e t c hm a po f s e c o n dh a r m o n i cg e n e r a t i o n s h g 除了具有t p e f 的特性外，还具有如下独特的优点”1 ：( 1 ) 由于s h g 产生过程中并 没有光场能量转移给相互作用的分子( 即相互作用结束后，分子的量子力学状态回复到原 来的状态，其能量和动量并没有改变) ，不会对生物组织产生破坏，是一种非侵入式的探 测成像技术：( 2 ) s h g 成像过程无需对细胞进行染色，因此，不会对活性细胞产生毒害， 也不会产生荧光漂白，因此，s h g 成像技术对活性细胞进行层析成像和三维成像是一种非 常理想的工具；( 3 ) s h g 成像技术可以获得全新的有关细胞结构的图像信息。 第3 章双光子激光扫描共聚焦显微镜的成像原理 3 4 2 双光子荧光成像和s i t g 成像 由于二次谐波成像技术利用的是物体的非线性效应，它继承了双光子荧光显微镜的大 部分优点，二次谐波成像与双光子荧光成像在装置上几乎完全相同，只是采用不同的滤波 片。已有许多作者对双光子荧光成像理论。”1 和s h g 成像理论“3 1 做了系统的研究。 根据文献”蚓中推导的双光子荧光成像系统的三维光学传递函数和s h g 成像系统的三 维脉冲响应函数，可以发现s h g 成像过程与双光子荧光成像过程是完全不同的，第一，s h g 具有很好的相干性，其成像过程属于两次相干光成像过程，而双光子荧光因为完全没有相 干性，其成像过程属于非相干光成像过程：第二，s h g 的波长与双光子荧光的波长并不相 等( 因为荧光的波长存在红移) ，这导致它们具有不同的三维脉冲响应函数，因此，s h g 具 有与双光子荧光不同的成像特性。 s h g 成像实质上是利用介质的二阶非线性极化率z ( 2 ) 的空间分布进行成像，而双光子 荧光成像是利用介质的双光子吸收系数的空间分布进行成像，由于介质的非线性极化率和 介质的多光子吸收系数( 正比于多光子跃迁概率) 是完全不同的物理量，因此，从物理本 质上来说，这两种成像方式是完全不同的，它们获取的介质空间结构信息也不相同。特别 对于具有中心对称的介质，是很难利用s h g 进行成像的，因为其二阶非线性极化率z 【2 ) 为 零，而选择合适的激发光波长，则可以获得其双光予荧光图像。 3 5 小结 本章简要阐述了双光子吸收理论；介绍t b 光子激光扫描共聚焦显微镜原理；阐述了 双光子荧光成像和s h g 成像理论，指出s h g 的产生并不是双光子吸收过程，而是在强激光 场的作用下，介质体系内部分子的取向极化即产生非线性的二阶极化强度，从而辐射倍频 光；阐明了s h g 成像实质上是利用介质的二阶非线性极化率z ( 2 ) 的空间分布进行成像，而 双光子荧光成像是利用介质的双光子吸收系数的空间分布进行成像，它们获取的介质空间 结构信息并不相同。 第4 章生物组织二次谐波的实验研究及其产生机制的理论解释 第4 章生物组织二次谐波的实验研究及其产生机制的理论 解释 4 1 引言 不同生物组织具有不同的组织结构，在相同的激发光作用下所产生的二次谐波具有不 同的特点，对样品进行扫描，根据不同生物组织产生的光学二次谐波图像，就可以实现对 其细微结构的观察。关于生物组织的二次谐波效应已有许多研究小组进行了大量的实验研 究以及产生机制的一些理论解释，并取得了一定的成果。但是，由于生物组织结构的复杂 性和多样性，加之样品的制备方法、激发光波长、激发光功率等条件各不相同，实验结果 差异较大；有关二次谐波效应产生的影响因素还做得不够完善，对生物组织二次谐波产生 机制的现有理论解释在一定程度上带有猜测性，对其产生机制的解释还有待进一步的研 究。本章将通过对小鼠尾巴等生物组织在不同条件下的二次谐波效应进行实验，并结合非 线性光学理论，对生物组织二次谐波效应的各种影响因素进行分析比较，并尝试对生物组 织s h g 的产生机制作出较合理的解释。 4 2 实验材料与方法 4 2 1 样品制备 从福建医科大学购得健康的雄性小鼠，年龄约3 个月，体重约3 0 0 9 ，将其麻醉后，对 其进行局部脱毛，用生理盐水清洗干净后，取下几段尾巴( 约l c m ) 和腹部皮肤( 约i c m x 0 5 c m ) ，放k 2 0 福尔马林固定液中。固定3 d 后，送福建医科大学附属协和医院病理科 制成石蜡切片，尾巴石蜡切片共分为横向未染色、横i f i - h e 染色和纵向未染色、纵向h e 染色 四组。 4 2 2 实验仪器 1 、美国相干公司( c o h e r e n t ，i n s ) 的钛宝石飞秒激光器( t i ：s a p p h i r ef e m t o s e c o n d l a s e r ) ， 由半导体激光器v e r d iv - l o 泵浦，波长可调谐范围为7 0 0 9 8 0 n m ，输出功率在8 0 0 h m 时可达 1 9 w ，脉宽 1 3 0 f s ，重复频率为7 6 m h z 。 2 、德国蔡司公司( z e i s s ) 的l s m5 1 0 多光子激光扫描共聚焦显微镜，配套有o b j e c t i v e p l a n - n e o f l u a r1o x o 3 ，o b j e c t i v el dp l a n n e o f l u a r2 0 0 4 ，o b j e c t i v ep l a n - n e o f l u a r4 0 x l o 7 5 ， o b j e c t i v ep l a n a p o c h r o m a t6 3 x 1 4 0o i ld i c ，o b j e c t i v eb i p l a n5 0 x o 7 ，带有两个单道探测 福建师范大学刘嫩容硕士学位论文 器和一个多色多道探测器的m e t a 扫描模块，自带有v i s 激光模件：a r 激光( 4 5 8 ，4 7 7 ，4 8 8 ， 5 1 4 n m ) 3 0 m w ，h e n e 激光( 5 4 3 n m ) l m w ，h e n e 激光( 6 3 3 n m ) 5 r a w ，可利用钛宝石飞秒激光 器作为多光子激发光源。横向分辨率可达0