（水生生物学专业论文）无抗性标记转基因蓝藻的研究.pdf

无抗件标记转皋闪蓝藻的研究 摘要 蓝藻是一类具有广泛适应性的光能自养型的原核生物，其所含营养丰富，是 人类未来理想的食品；同时，蓝藻作为基因工程受体具有许多优点；但转基因产 品中的标记基因的存在是多余的，甚至是有害的，因此要培育具有安全标记基因 或者去除选择标记基因的转基因产物；而增强型绿色荧光蛋白( e g f p ) 被证明是 一种安全标记基因，因此本研究以安全标记基因e g f p 为标记基因，去除抗生素 标记基因，并与流式细胞技术( f a c s ) 相结合，开发无抗性标记的转基因蓝藻。 本次研究的第一部分，设计引物用p c r 技术扩增得到钝顶螺旋藻( s p i r u l i n a p l a t e n s i s ) c p c b 基因的上游启动片段p 咖b ，将此片段插入载体p e g f p 中的5 7 m c s 中，成功构建p c e g f p 质粒，经过多步亚克隆成功地1 2 k b 大小的p 啦b 和 e g f p 片段，插入含有蓝藻内源小质粒p p b s 的穿梭质粒p p k e 2 中，并去除了质 粒上的抗性片段，利用多色分析和高速分选流式细胞仪( f a c sv a n t a g es e ) 分 选得到无抗性荧光菌，成功获得无抗性穿梭质粒p c g p ，利用自然转化法将该质 粒转化集胞藻s y n e c h o c y s t i ss p 。p c c 6 8 0 3 ，f a c sv a n t a g es e 分选转化成功的e g f p 标记的集胞藻6 8 0 3 ，通过荧光显微镜观察，成功获得e g f p 标记的无抗性标记集 胞藻s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3 。由于穿梭质粒在没有抗性压力下很容易丢失，因 此在第二部分采用基因整合系统，选用更有经济价值且已规模化养殖的螺旋藻作 为转化受体，进行无抗性转基因螺旋藻的研究。 本研究的第二部分，将1 2 k b 大小的p 嘟b 和e g f p 片段插入钝顶螺旋藻同源 重组质粒p k r e t 4 的e c o ri 位点，成功构建e g f p 标记的同源重组质粒p c g k t ， 将4 2 k b 大小的无抗性同源重组片段切下回收，该片段含有钝顶螺旋藻的同源片 段r ( r e c a 基因) 、p 饿b 启动子、e g f p 基因以及人源胸腺素t a l 表达盒，利用 超声转化法尝试将该片段转入钝顶螺旋藻中，荧光显微镜观察，由于各种因素的 影响，未能在显微镜下观测到转化成功的钝顶螺旋藻。 本研究首次将e g f p 基因和f a c s 技术相结合，构建无抗性穿梭质粒载体和 同源重组质粒，分别以集胞藻6 8 0 3 和钝顶螺旋藻为转基因受体细胞，并首次在 无抗生素选择压力下将e g f p 基因转入集胞藻6 8 0 3 中，筛选以e g f p 为标记的 无抗性标记的转基因藻株，对无抗性转基因蓝藻的转化及筛选方法进行了初步探 索，为进一步开发无抗性转基因蓝藻打下了一定的基础。 无抗性标记转基因蓝藻的研究 关键词：蓝藻，e g f p ，f a c s ，安全标记 无摭性标记转举闵蓝藻的研究 a b s t r a c t b l u eg r e e na l g a ea l ep h o t o a u t o t r o p h i co r g a n i s m sw i t hm a n ys p e c i a lp r o p e r t i e s ，i t h a sa b u n d a n tn u t r i t i o n ；m e a n w h i l e ，b l u eg r e e na l g a eh a v eu n i q u en a t u r eo nc e l l s o r g a n i z a t i o n 、m e t a b o l i z a b i l i t y 、h e r e d i t y , e t c ，a n di th a sal o to f a d v a n t a g e sa sg e n e t i c e n g i n e e r i n gr e c e p t o r h o w e v e rt h ee x i s t e n c eo ft h em a r k e rg e n e si nt h et r a n s g e n i c p r o d u c t i o na r es u r p l u s ，e v e nh a r m f u l ，e n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ( e g f p ) w a sc o n f i r m e dt ob es a f e i nt h i ss t u d yw er e s e a r c ht r a n s g e n i cb l u eg r e e na l g a e w i t h o u ta n t i b i o t i cr e s i s t a n c em a r k e r sb yu s i n ge g f pg e n ea n df a c sv a n t a g es e 。 f i r s tp a r to ft h i ss t u d y , t h eu p s t r e a ms e q u e n c ep c p c bo ft h ec p c bg e n ef r o m s p i r u l i n ap l a t e n s i aw a so b t a i n e db yp c ra n ds u b c l o n e di n t ot h e 5 m c so fp e g f p , t h u st h ep l a s m i dp c e g f pw a sc o n s t r u c t e d ，t h e1 2 k bf r a g m e n tc o n t a i n i n gp c p c ba n d e g f pg e n ew e r es u b c l o n e di n t op l a s m i dp p k e 2w h i c hc o n t a i n e ds m a l lp l a s m i dp p b s o fp l e c t o n e m ab o r y a n u ma n dt h es h u t t e rp l a s m i dp c g p k e 2w i t he g f pm a r k e rw a s c o n s t r u c e d , d i g e s tp c g p k e 2w i t h ： s tit oe x c i s ek a n a m y c i nr e s i s t a n c eg e n e ( k m ) ， f i n a l l yw eg o tt h es t r a i ni n c l u d i n gp c g pw h i c hd i d n tc o n t a i na n t i b i o t i cr e s i s t a n c e m a r k e rb yf a c sv a n t a n g es e t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d sw e r ed i r e c t l yt r a n s f o r m e d i n t os y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3r e s p e c t i v e l y , t h e nu s i n gf a c s v a n t a g es et op i c ko u t t h et r a n s g e n i c s y n e c h o c y s t i ss p 。p c c 6 8 0 3w i t he g f pm a r k e r , t h e no b s e r v et h e t r a n s f o r m a n tu n d e rt h ef l u o r e s c e n t m i c r o s c o p e ，t h e r e s u l ti n d i c a t e dt h a tw e s u c c e s s f u l l yo b t a i n e dt h et r a n s g e n i cs y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3 t h es e c o n dp a r to ft h i ss t u d y , t h e1 2 k bf r a g m e n t sf r o mp c e g f pw e r ec l o n e d i n t ot h eh o m o l o g o u sr e c o m b i n a n tp l a s m i dp k r e t 4 ，t h u st h ep l a s m i dp c g k tw i t h e g f pm a r k e rw a sc o n s t r u c t e d ，a n dt h e ng o t4 2 k bf r a g m e n t sw h i c hc o n t a i n e d h o m o l o g o u sr e c o m b i n a n tg e n er ( r e c ag e n e ) 、p 辫转a n de g f pm a r k e rg e n e ，t h e s e f r a g m e n t sw e r et r a n s f o r m e di n t os p i r u l i n ap l a n t e n s i st h r o u 曲u l t r a s o n i ct r e a t m e n t b e c a u s eo f t h ei n f l u e n c eo f v a r i o u sk i n d so ff a c t o r s 。w ed i d n t 曲t a i nt h et r a n s f o r m a n t i nt h i ss t u d yw ec o m b i n e de g f pm a r k e rg e n ea n df a c st e c h n o l o g yf o rt h ef i r s t t i m e , w ec o n s t r u c t e dt h es h u t t e rp l a s m i da n dh o m o l o g o u sr e c o m b i n a n tp l a s m i d w i t h o u ta n t i b i o t i cr e s i s t a n c em a r k e rg e n e ，t h e s et w op l a s m i d sw e r et r a n s f o r m e di n t o i i i 无抗性标记转基因蓝藻的研究 s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3a n ds p i r u l i n a p l a t e n s i ss e p a r a t e l y , t h e nb yf a c sv a n t a g e s ea n dt h ef l u o r e s c e n tm i c r ot oo b t a i nt h et r a n s f o r m a n tw i t he g f pm a r k e r i t st h e f i r s tt i m et og e tt h et r a n s g e n i cs y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3w i t h o u ta n t i b i o t i cr e s i s t a n c e m a r k e r t h i sr e s e a r c hc o u l dp r o v i d ee x p e r i e n c et oo t h e rr e s e a r c h e r e st od e v e l o p t r a n s g e n i cb l u eg r e e na l g a ew i t h o u ta n t i b i o t i cr e s i s t a n c em a r k e ra n dl a yac e r t a i n f o u n d a t i o nf u r t h e r k e y w o r d ：b l u eg r e e na l g a e ，e g f p ，f a c s ，s a f e t ym a r k e r i v 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在 文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文产生的权利 和责任。 声明人( 签名) ： 壶磊 一年 月7 日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门 大学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版 和电子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文 进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文 在解密后适用本规定。 本学位论文属于 保密() ，在年解密后使用本授权书。 不保密( ( 请在以上相应括号内打“ ) 日 月 月 7广 年 年 广渺砷 期 期 务虞节 、及玄岸f 名 名 签 签 者 师 作 导 无抗忡标记转皋【大j 蓝藻的研究 1 前言 1 1 转基因作物的研究现状 据联合国人口基金会发布的2 0 0 6 年世界人口现状报告显示，世界人口已经 突破6 5 亿，同时联合国预测报告显示，到2 0 5 0 年由于发展中国家的人口激增， 届时全世界人口数量将从目前的6 5 亿猛增至9 1 亿。 人口的快速增长无疑对食物、穿衣和居住等一系列基本生活必需品的需要 猛增。经济的发展、社会的进步和生活水平的提高也对生活质量提出了越来越高 的条件；而人类生存环境的日益破坏和恶化、能源短缺、水土流失、生态平衡破 坏和环境污染等要求社会发展持续性的呼声日益高涨。而以上所有问题中最关键 的是如何解决人们的生存问题即粮食的问题。据联合国粮农组织发布的2 0 0 6 年 世界“农业收成预计和粮食现状 报告显示，全球面临巨大的粮食危机，有4 0 多个国家急需国际粮食援助。同时随着世界人口数量的不断增长以及建设用地的 增多，必然导致人均耕地面积的逐日减少，要使逐日减少的人均耕地产出充足的 粮食，靠传统的方法和技术显然力不从心。 为了解决粮食不足的问题，转基因植物得到了长足的发展，自第一株转基 因植物诞生以来，人们已经能用多种方法将外源基因导入植物基因组内。由于推 广的转基因作物具有优良的农艺性状，如抗除草剂、抗病、抗虫、丰产等，使得 全世界范围内转基因作物的种类和产量都迅速增加。仅中国就有5 0 余种植物及 1 2 0 多个功能基因被科学家用于基因工程研究中【1 1 ，1 9 9 6 年全世界转基因作物的 种植面积约为1 7 0 万公顷，2 0 0 1 年底达到5 2 6 0 万公吲厶引，而2 0 0 6 则达到突破 性的1 亿公顷。可以说，转基因生物技术为人类生存发展带来了新的曙光。同时， 利用转基因技术产生新的动植物会在一定程度上打破自然界世代沿袭的基因平 衡，这一变化是否会给人类带来新的问题，其安全性如何评价【4 】，这些已经成为 人们日益关注的焦剧5 9 1 。最主要的问题是大多数转基因系统使用抗生素基因、 抗除草剂基因等作为选择标记。这些选择标记基因导入植物体内，赋予转化细胞 对没中选择剂的抗性，在选择剂的作用下，非转化细胞被杀死，而转化细胞由于 获得标记基因所赋予的抗性而成活下来，并进一步增殖和分化，形成转基因植物。 选择标记基因的存在方便了植物的遗传转化，但一旦获得转化植株后，特 别是在转基因产品的产业化过程中，标记基因的存在是多余的，甚至是有害的。 无抗性标记转基因蓝藻的研究 其潜在的危险主要有几个方面 4 , 6 , 1 0 1 1 、转基因作物本身有可能变为杂草或通过 杂交等方式使野生近缘种变为杂草。2 、标记基因可能扩散到物种中而造成生态 失衡，如产生超级病虫害等。3 、在健康领域，人们担心转基因食物的标记基因 及其产物可能对人或动物健康有害【l l 】。4 、标记基因可能被转移到人或动物肠道 寄生菌中而产生耐药性，降低或丧失某种抗生素的治疗作用。另外，由于转基因 植物中标记基因的存在，若要对该植物进行多次遗传操作则将会受到一定的限 制，若标记基因与目的基因由同一启动子启动，还可能造成目的基因的失活【1 2 】。 虽然有的抗生素基因如n p t i i ，已通过安全性评价【1 3 】，但还是不能彻底消除人们 对转基因植物的担忧。于是，许多研究人员开始研究采用安全选择标记的转基因 生物，借以消除转基因作物带来的可能的危害，而采用绿色荧光蛋白作为筛选标 记就是其中的策略之一。 1 2 绿色荧光蛋白在生物学上的应用 绿色荧光蛋i 兰i ( g f p ) 来源于海洋生物水母，近年来在生物化学和细胞生物学 中成为广泛应用的标记性蛋白质之一。早在1 9 6 2 年，s h i m o m u r a 等就发现在多 管水母中存在绿色荧光蛋白【1 4 j ；后来，m o r i s e 等( 1 9 7 4 ) 纯化出g f p 并得到其晶 体【1 5 】；w a r d 和b o k m a n ( 1 9 8 2 ) 对其结构和性质进行了深入研究【1 6 l ；而取得突破 性进展的是p r a s h e r 等( 1 9 9 2 ) 克隆到g f p 基因c d n a 1 7 】；c h a l f i e 等( 1 9 9 4 ) 首次 对其进行了异源表达【1 8 】。近几年又从其他海洋生物体中克隆到一系列g f p 基因， 如s t e w a r ( 2 0 0 1 ) 从r e n i l l a s 中克隆到g f p 基因【1 9 】；k e l m a n s o n 和m a t z ( 2 0 0 3 ) 从m o n t a s t r e ac a w e r n o s a 中也克隆到g f p 基因【2 0 1 。研究表明，从不同动物体内 提取的荧光蛋白的结构、性质不尽相同。 g f p 由3 个外显子组成，长2 6k b 1 7 】；g f p 是由2 3 8 个氨基酸所组成的单 体蛋白，相对分子质量为2 7 0k m r ，其蛋白性质十分稳定，能耐受6 0 处理。用 6 m o l l 盐酸胍9 2 ，2 m i n 或酸处理0 h 2 ) ，5 m i n 变性后，g f p 仍能复性恢复荧光， 其半复性时间少于5 m i n ，在p n 7 0 时重新复性的g f p 最大激发峰为3 9 8 n m ， 发射峰为5 0 8 n m ，与天然g f p 一样，抗胰蛋白酶水解处理【1 6 2 1 1 。g f p 的发光机制 是g f p 表达后折叠环化，在氧气存在的条件下，由6 5 - - 6 7 位的氨基酸残基 ( s e r - t y r - g l y ) 环化，形成发色团( c h r o m o p h o r e ) 【2 2 】，所以g f p 基因表达后，一般有 几小时的延迟期，才能观察到绿光。在紫外光激发下，g f p 发出绿色荧光：其最大 2 无抗性标记转基因蓝藻的研究 吸收峰在3 9 5 a m ，另一小吸收峰在4 7 0 n m ；最大发射峰为5 0 9 n m 。在不同的绝对温 度下研究g f p 的构象变化时发现，g f p 存在高能量的b 态和低能量的a 态，t y r 6 6 与a 态有关，s e r 6 5 与b 态有关 2 3 】。p c r 突变的方法研究时也发现 g f p 形成发色团的最小结构域，必须具备第2 2 3 2 位的氨基酸残基【2 4 1 。目前仍 不清楚发色团发光的机制，g f p 上仅第5 6 位有t r p 残基，能自发荧光，可能存在 m 和发色团之间的能量转移效应【l5 1 。作为一个报告基因，尤其是活体组织中的 标记基因，g f p 具有很多优良特性：如g f p 的表达与种属无关，不管细胞的种类 和位置如何，都能够在细胞内自主表达；其荧光机制是自身含有的，绿色荧光的发 射仅需分子氧的存在，而无需其它外源的辅因子：g f p 对细胞、组织是无毒的， 不能扰乱细胞的正常生长和功能；g f p 还能克服穿透、毒素、光漂白等不利因 烈8 】。g f p 的荧光可以耐受福尔马林的固定，因而可以制成长期保存的标本：另 外对细胞内g f p 的检测非常简单，用显微镜、荧光计、荧光激活细胞分选仪等就 可以实现等等。 野生型g f p 在室温或低于室温下表达时，g f p 几乎都能正确而快速地折叠， 但高于室温时，折叠速度却剧烈下降，这种温度的敏感性无碍于水母，因为在它们 的生活环境中是不可能遇到温水的，但g f p 折叠受温度影响却限制了g f p 的应 用：另外，野生型g f p 具有两个激发峰的光谱，在应用中也是弊大于利。因此，为 拓宽g f p 的应用，有必要根据不同的用途，对野生型g f p 进行适当的改造。 目前主要通过以下几个途径得到突变体g f p t 2 5 1 ：更换g f p 生色团氨基酸：改 变碱基组成：除去g f p 基因中隐蔽剪接位点：插入植物内含子：更换强启动子等。 突变体g f p 增加了荧光强度和热稳定性，促进了生色团的折叠，其荧光特性也得 到了改善，甚至出现红色、黄绿色、蓝色等多种颜色的荧光蛋白，大大拓宽了g f p 研究的领域。以下是g f p 突变体的部分典型代表。( 1 ) 增强型g f p ：g u o h o n 等 将s e r 6 5 用t h r 替代，p h e 6 4 用l e u 替代，使g f p 的荧光强度提高了3 5 倍，而 且激发后1 6 - 2 4 h 后仍可稳定地测定荧光：( 2 ) 人工g f p ：z o l o t u k h i n 等i z 6 j 改变了 野生型g f p 基因编码区中8 8 个密码子中的9 2 个碱基而用人类基因组中常用的 密码子代替，将g f p 的荧光强度提高2 2 倍，适合在哺乳动物细胞中高效表达：( 3 ) 红移荧光蛋白( r s f p ) ：h e i m 等【m 2 3 1 将野生型g f p 中的s e r 6 5 用t h r 替代，得到突 变体s 6 5 t g f p ，激发谱中只有一个峰，且红移至4 9 0 n m ，用蓝光即可激发r s f p ， 3 使之更适于普通荧光显微镜( f r r c ) 观察：( 4 ) 蓝色荧光蛋白0 3 f p ) ：双突变体 y 6 6 h y 1 4 5 f t 2 7 1 能在3 8 1 n m 光的激发下产生4 4 5 n m 的蓝光，这种蓝光还能进一步 激发g f p 产生绿光，即发生荧光共振能量转移呷砸t ) 现象，为不同蛋白质之间 及细胞器之间的相互作用研究开辟了更为广阔的视野。目前作为标记基因应用较 多的是g f p 两个突变体，$ 6 5 t ( 6 5 位丝一苏) 和e g f f ( 6 4 位苯丙一亮) ，它们的 激发峰波长可偏移到4 8 8 n m ，发射出的荧光强度要比野生型大6 倍以上。这主要 是突变型的蛋白表达量增加及有效的蛋白折叠，使它能很快形成发色基因构型， 所以$ 6 5 t 和e g f p 比野生型g 】阳更适合作为一种报告基因来研究基因表达、 调控、细胞分化及蛋白质在生物体内定位和转运等。 g f p 作为一种新型的报告基因，它吸引了从生命科学( 包括细胞生物学、分 子生物学、发育生物学、遗传学及生物技术等) 到生物医学及农学等许多领域研 究者的兴趣。其主要应用领域为：( 1 ) g f p 在建立基因转化技术及在研究基因表 达方面的应用【2 8 铘】，但g f p 在许多植物和一些丝状真菌中表达不出有功能的 g f p 3 4 1 ，或仅能观察到g f p 的瞬间表达，而观察不到绿色荧光的稳定表达【3 5 】( 2 ) g f p 在基因产物及基因定位研究中的应用【3 6 4 6 】( 3 ) 在研究病原物与宿主相互 关系中的应用【4 7 。5 2 】其它的应用还有如用g f p 标记抗原，从而建立简便、灵敏、 快速的免疫诊断新技术 4 0 - 5 3 1 ，用于筛选药物【溺5 1 ，用于癌细胞复制过程的研究 5 6 1 ，蛋白质与蛋白质的相互作用【5 7 1 ，甚至作为活细胞内p h 值的指示剂来进行 细胞生理生化的研究嗍及用于污水处理【5 9 1 等方面 目前，g f p 也渐渐被用于蓝藻生物学的研究中。a 坷a 等用g f p 和l u x a b 构建应用于集胞藻s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3 的启动子探针载体1 6 0 1 ；y o n g z h o n gl u 等利用不同光强条件下，e g f p 在聚球藻s y n e c h o c o c c u ss p p c c 7 9 4 2 中不同的表 达，来研究螺旋藻藻蓝蛋白口亚基基因的上游序列【6 i 】；c l a u d i a 等构建和应用g f p 报告载体来分析丝状蓝藻n o s t o c p u n c t i f o r m e 中特定细胞类型的基因表达【6 2 1 。 1 3f a v a n t a g es e 系统 f a c s v a n t a g es e 的中文全名为多色分析和高速分选流式细胞仪，其新功能 和新配置通过与标准多激光多荧光系统以及数据处理系统的完美整合，速度更 快，功能更强，是当今流式技术的最卓越体现。其主要特点为： ( 1 ) 完美的六色荧光分析系统：b d 专有的立体空间激发系统实现多色分析， 4 无抗性标记转基因蓝藻的研究 可最大程度地减少荧光信号之间的补偿，提高检测灵敏度( 1 0 m e s f l 。b d f a c s v a n t a g es e 整机设计的灵活性使用和可根据实际应用的需要选择不同的激 光组合，最多可选配三根激光( 包括染料头激光器) 实现八参数六色荧光分析。激 光光谱谱线的连续变换可满足尖端科研的需要。 ( 2 ) 分析速度快：高速度的数据处理电子系统，配合高效的液流控制系统， 有力的保证了b df a c s v a n t a g es e 的检测功能。b df a c s v a n t a g es e 准确分析 速度为2 0 ，0 0 0 秒，最大分析速度可达6 0 ，0 0 0 秒。 ( 3 ) b df a c s v a n t a g es e 具有多能、高速、自动化的分选功能；b d 独有的 a u t o s o r t 、m a s t e r s o r t 从计算到独立设立多种分选模式，使分选操作一举脱离以 往的繁复，简单易行，功效显著。最新的a c c u d r o p 功能选项可以根据分选结果 直接调出实际延迟时间，保证了最大的分选纯度和回收率。 ( 4 ) 脉冲处理系统：b d 革新化的脉冲处理技术分析信号的面积、宽度、区分 实际组织标本中的粘连细胞群体，最大程度地减少假阳性，是实体组织d n a 分 析的解决之道；对两种荧光信号比率的计算亦可用于钙离子流动的检测。 ( 5 ) 最新的f a c sd i v a 功能选择：f a c sd i v a 使b df a c s v a n t a g es e 成为唯 一真正的数字化流式细胞仪。其数字化系统可实现1 0 个参数( 两个散射光信号和 八个荧光参数) 分析，并提供全面荧光补偿网络，即任何激光的任何参数都可以 相互补偿。q u a d r a s o r t 功能实现四通道分选，使强大的分选功能更上一层楼。 ( 6 ) f a c s t a t i o n 数据处理系统：采用最先进的m a c i n t o s h i 计算机系统，用户友 好界面设计，易学易操作，同时图形处理功能极佳，是处理流式数据的最佳选择， 而且硬件配置灵活，具有极佳的可扩展性和升级功能。f a c s t a t i o n 主软件 c e l l q u e s t 具有完成所有流式实验的仪器设置、数据获取和统计分析等功能。 软件专为方便用户使用而设计简单自由，操作灵活。数据设门的逻辑组合、多色 显示以及实时的统计分析，可以快速获得更多的实验信息，收集多个参数，并可 用多种图形显示( 如直方图、直方图重叠、点图、等高线图、密度图、三维立体 图等) ；可自动批处理成套的系列数据，保证分析结果的可重复性。 b df a c s v a n t a g es e 可以用于多种传统分选系统无法实现的新研究应用领 域，包括遗传学、动力学及多色分析。此外，b d 的多种可选激光器，先进的光 学系统和信号处理系统，增强的自动化功能，都使您有可能进行从分子生物学到 无抗性标记转基因蓝藻的研究 大颗粒细胞的多种研究，如郎罕式细胞，精子及植物细胞。例如：b df a c s v a n t a g e s e 强大的多色分析能力使新亚研究成为可能。在动力学研究方面，b d f a c s v a n t a g es e 可以记录每一个事件发生的时间，其可以进行的动力学研究包 括：分子物质经胞膜内流外流的速率、胞内钙的结合配体、p h 值、对各种刺激 的膜电位反应。 1 4 蓝藻的生物学性质 蓝藻( c y a n o p h y t a ) ，又称蓝绿藻( b l u eg r e e na l g a e ) 或蓝细菌( c y a n o b a c t e r i a ) ， 归属于藻类中的蓝藻f 3 t 6 3 1 。蓝藻是一类特殊的原核生物，缺双层膜的细胞器( 叶 绿体、线粒体和细胞核) 。它没有确定的染色体，d n a 纤丝没有与蛋白质( 组 蛋白) 结合。其细胞壁构造与g 一细菌极其相似，其外层为脂多糖层，内层为肽 聚糖( m u c o p e p t i d e s ) 层，因此微生物学家又把它归为细菌，称为蓝细菌 ( c y a n o b a c t e r i a ) 。蓝藻细胞中的色素有叶绿素a 、口一胡萝卜素、蓝藻黄素、玉 米黄素和藻胆素( c 一藻红蛋白、c 一藻蓝蛋白、别藻蓝素) 。它具有类似于真核 藻类和高等植物的光合系统i ( p si ) 和光合系统i i ( p si i ) ，能够利用类囊 体( t h y l a k o i d s ) 膜进行光解水放氧的高等植物类型的光合作用，其光合作用的 产物为蓝藻淀粉和一种称为蓝藻颗粒体( c y a n o n p h y c i n ) 的蛋白质物剧6 4 1 。蓝藻 细胞没有鞭毛，生殖方式为无性繁殖，主要是断裂生殖和孢子生殖。 蓝藻不仅能光合放氧，在地球大气从还原型向氧化型转化中扮演着重要角 色，而且它的生物固氮作用推动着地球上氮素的循环。据估计，地球上固氮生物 所固定的氮近2 0 ( 约3 5 x 1 0 6t ) 是由固氮蓝藻所完成的。固氮蓝藻利用其异 形胞( h e t e r o c y s t s ) 中固氮酶( n i t r o g e n a s e ，简写n 2 a s e ) 在还原剂和能量辅助下， 将n 2 还原成n i - 1 3 ，同时放出h 2 0 。固氮蓝藻不仅可以增加土壤肥力，分泌的藻 促长素( a l g o p r o n ) 可以促进农作物种子萌动，提高农作物产量，而且蓝藻固氮 放氢已成为了研究开发清洁能源的一个新热点【6 5 】。 蓝藻所含营养丰富，蛋白质含量可达6 0 左右，相当于牛羊肉的3 4 倍， 小麦、大米的8 1 0 倍。特别是蓝藻中的螺旋藻，其蛋白质含量甚至最高可达 7 5 ，而且其氨基酸组成比例十分理想，其中8 种必须氨基酸含量接近或超过联 合国粮农组织( 岫) 推荐的标准。同时，还含多种维生素、色素、特殊种类脂 肪酸、多糖以及其他动物必需的营养物质，而且纤维素少、容易消化是人类未来 6 无抗性标记转基因蓝藻的研究 理想的食品，并被f a o 向全世界推荐发展螺旋藻。因此，开发蓝藻特别是螺旋 藻越来越引起生物工作者的兴趣和重视。 1 5 蓝藻的基因工程研究 蓝藻的基因工程研究可以追溯到2 0 世纪6 0 年代，已经有将近半个世纪的历 史。蓝藻的生物多样性和独特的遗传特性，使其成为基因工程研究的理想材料。 蓝藻在食品、环境和健康方面的作用越来越受到人们的重视，其应用前景十分看 好。蓝藻作为基因工程受体具有以下几个优点：( 1 ) 基因组为原核型，除了裸 露的染色体d n a 外，不含叶绿体和线粒体d n a ，遗传背景简单，便于基因分析 和检测外源d n a ；( 2 ) 某些模式藻的遗传背景清晰，基因工程技术成熟，可被 其他藻类所借鉴；( 3 ) 细胞壁主要由肽聚糖组成，无高等植物坚硬细胞壁纤维 素成分，便于外源d n a 的转化；( 4 ) 蓝藻营光合自养生长，培养条件简单， 成本低廉，只需光、c 0 2 、无机盐、适当温度就可以获得稳定生长，适于连续、 静止等多种方式培养，适合大规模生产；( 5 ) 细胞体积较大，内源蛋白更新速 度低，对外源蛋白质的容受力较高，能耐受高浓度( 总蛋白的2 5 ) 的单一蛋白； ( 6 ) 多数种类含有内源质粒，为构建适用于蓝藻的穿梭质粒载体提供了极好的 条件；( 7 ) 蓝藻富含人体和动物所必需的氨基酸和生理活性物质或前体，并且 多数是无毒的，是食物及药物的重要来源，为基因工程产物直接食用提供了可能。 ( 8 ) 有些蓝藻已有相当规模的培养或养殖，转基因蓝藻具备产业化的条件；( 9 ) 产业化封闭式培养条件，容易控制转基因蓝藻，易于防止基因的外泄。正是由于 蓝藻具有的这些诸多的遗传操作便利条件以及产业化的应用，进入2 0 世纪9 0 年代后，蓝藻基因工程发展更加迅速，成为藻类基因工程中极具生命力的领域 6 6 - 6 7 1 o 蓝藻作为表达外源基因受体已有诸多成功报道。t a n d e a ud em a r s a c ( 1 9 8 7 ) 以 p u c 3 0 3 为载体，在单细胞蓝藻s y n e c h o c o c c u ss p p c c7 9 4 2 中表达了原核基因芽 孢杆菌杀幼蚊毒素基因惭】。a n g s u t h a n a s o m b a t 等( 1 9 8 9 ) 在a g m e n e l l u m q u a d r u p l i c a m mp r 6 中和c h u n g j a t u p o m c h a i 等( 1 9 9 0 ) 在s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3 中分别表达了苏云金杆菌杀幼蚊毒素c r y l v a 和c r y i v b 基因【6 8 ，6 9 1 。m u r p h y 等( 1 9 9 2 ) 将杀幼蚊毒素c r y i v d 基因与蓝藻藻蓝蛋白基因c p c b 进行融合，利 用c p c b 启动子和核糖体结合位点、起始密码子在s y n e c h o c o c c u ss p p c c 7 0 0 2 中 7 无抗性标记转基因蓝藻的研究 表达，首次报道了蓝藻完整生活细胞的杀蚊幼活性【7 0 1 。s a n g t h o n g p i t a g 等( 1 9 9 7 ) 以蓝藻r b e l 启动子装置于来自b s 2 3 6 2 株的5 1 k d a 和4 2 k d a 蛋白基因上游，在 单细胞蓝藻s y n e c h o c o c c u ss p p c c 6 3 0 1 表达，检测到生活细胞对库蚊幼虫4 8 h 半 致死量为2 1 1 0 5 c e l l s m l | 7 1 1 。国内徐旭东等( 1 9 9 3 ) 在鱼腥藻a n b a e n a s p p c c 7 1 2 0 中表达b s 基因取得活细胞高杀幼蚊毒效，后来尝试了在多株鱼腥 藻或念珠藻中表达b s 基因，获得的工程藻干粉亦保持高杀蚊毒效【谢。转杀幼蚊 毒素基因的藻株普遍具有良好的杀幼蚊毒性，这为蚊虫的生物防治开辟新径。 除了转杀幼蚊毒素基因外，国内外的专家还致力于转其它基因蓝藻的研究。 r e d d y 等( 1 9 9 3 ) 在鱼腥藻a n b a e n as p p c c 7 1 2 0 中表达了s y n e c h o c y s t i s s p p c c 6 8 0 3 脱饱和酶基因，表达产物r 亚麻酸( g l a ) 已开发用于医药保健 和研制新型化妆品。f u k u d a 等人( 1 9 9 4 ) 以p u c 3 0 3 为载体在s y n e c h o c o c c u s s p p c c 7 9 4 2 中表达了植物的乙烯合成酶基因【7 3 l 。t a k e s h i m a ( 1 9 9 4 ) 在 s y n e c h o c o c c u ss p p c c 6 3 0 1 中表达了人超氧化物歧化酶( c r yz 1 1 一s o d ) 基因， 强光下培养，表达产物达总可溶性蛋白的3 ，并在胞内具有良好的生物活性【7 4 】。 e r b e 等( 1 9 9 6 ) 在聚球藻s y n e c h o c o c c u ss p p c c 7 9 4 2 成功的表达来自小鼠的金 属硫蛋白基因。王捷等( 1 9 9 8 ) 通过三亲结合的转移方式将t n f 2 基因转入鱼 腥藻a n b a e n as p p c c 7 1 2 0 中并得到表达，其表达量约占藻体蛋白的1 6 左右 【7 5 1 。罗娜等( 2 0 0 0 ) 将人尿激酶原( p r o - u k ) 基因转入聚球藻p c c 7 0 0 2 7 6 1 。北 京大学茹炳根等与中科院植物所、青岛海洋大学以及华东理工大学合作从1 9 9 4 年至今，以鱼腥藻p c c 7 1 2 0 、集胞藻s y n e c h o c y s t i ss p p c c 6 8 0 3 、聚球藻p c c 7 9 4 2 和p c c 7 0 0 2 四种模式蓝藻为受体转入人肝及小鼠金属硫蛋白基因及其突变体， 获得了1 5 个转基因藻株【7 7 。8 2 1 。 近年来，中科院植物所与中科院海洋所、中国科技大学、北京大学、中国人 民解放军3 0 1 医院合作，分别获得转肿瘤坏死因子a ( h n 吓) 基因鱼腥藻 p c c 7 1 2 0 ( 窦利红等，1 9 9 9 ) ，转黄瓜花叶病毒外壳蛋白( c c p ) 基因集胞 藻p c c 6 8 0 3 ( 王春梅等，1 9 9 9 ) ，转人皮生长因子( h e g f ) 基因( 戴激等，1 9 9 9 ) 和转人小肠三叶因子( 1 l r r f ) 基因鱼腥藻p c c 7 1 2 0 ( 罗娜等，1 9 9 9 ) ，并对转 基因蓝藻的光合与生长特性的改变作了初步研究。其中转基因鱼腥藻中表达 h t n f 0 f 已进行了初步的毒性及药效学实验( 邵宁等，1 9 9 9 ) ，但转基因模式藻 8 无抗性标记转基冈蓝藻的研究 培养仍处在实验室阶段【8 3 1 。 本实验室在章军老师的带领下，在2 0 0 1 年利用整合平台系统在蓝藻 s y n e c h o c o c c u ss p p c c 7 9 4 2 中表达了胸腺素d 1 ，表达量达可溶性蛋白的 4 8 【8 4 1 ，2 0 0 3 年在s y n e c h o c o c c u ss p p c c 7 9 4 2 中成功表达乙肝表面抗原$ 2 s 基因 【8 5 】，2 0 0 5 年又成功的在钝顶螺旋藻( s p i r u l i n a p l a t e n s i s ) 中表达了胸腺素a 1 和乙 肝表面抗原$ 2 s 1 基因1 8 6 - 8 7 。 1 6 蓝藻转基因载体系统及转化方法 1 6 1 蓝藻外源基因载体系统 蓝藻外源基因载体系统是指携带外源基因并导入到受体细胞中的中间介质， 它是影响外源基因表达效果及表达稳定性的重要因素，也是基因工程的关键所 在。藻类基因工程中，常用的载体有两类，穿梭质粒载体系统和基因整合平台打 靶载体。 1 6 1 1 穿梭质粒载体( s h u t t i ev e c t o r ) 蓝藻穿梭质粒载体是指兼有蓝藻内源性质粒和大肠杆菌源质粒复制起始位 点及其相关序列构建而成的杂合质粒，能在细菌和蓝藻中复制，实现外源基因在 蓝藻细胞中的表达。自从a s a t 0 1 9 7 3 年发现蓝藻质粒以来，已在5 0 余株单细胞 及丝状蓝藻中证明了内源性质粒的存在，质粒数目从l l o 个不等，大小在 1 3 1 3 0 k b 之间，分子量是1 - - 8 0 m d ( 百万道尔顿) 。人们已经检测到一些质 粒体内、体外转录和翻译的产物，如g r u b e r 等( 1 9 8 7 ) 以检测到a n a b a e n an i d u l a n s r 2 的内源质粒p a n s 编码的3 0k d 的蛋白；s c h w a b e 等( 1 9 9 0 ) 将铜锈微囊藻 m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a 的内源质粒p m a