（生物化学与分子生物学专业论文）如皋火腿发酵菌群与火腿品质关系研究.pdf

潘明如皋火腿发酵菌群与火腿品质关系研究! 摘要 在我国传统发酵食品中存在着广泛的菌种资源，可以作为筛选发酵肉制品优良 菌种的来源。本文对我国传统发酵肉制品如皋火腿中的微生物构成进行了分 析，并对其中的微生物进行了分离、纯化、鉴定并加以应用研究。 通过微生物计数，对自然发酵火腿微生物构成进行了分析，结果表明球菌、杆 菌、酵母菌、霉菌在整个发酵过程中是优势菌群。在发酵初期，火腿中心部位有 细菌和酵母生长，它们之间的比例为1 7 ：1 ，细菌以球菌为主，球菌与杆菌数之比 为3 9 ：1 ；发酵后期细菌数与酵母菌数之比为1 6 5 ：1 。在整个发酵过程中，火腿表面 长有霉菌，但内部无霉菌检出。 以产鲜、产香作为筛选的主要标准，通过测定游离氨基酸、感官评价、g c m s 分析，从自然发酵的如皋火腿中，利用m s a 培养基，5 n a c l 培养基，y p d 培养 基，筛选到能够产鲜、产香的葡萄球菌5 株，即耳式葡萄球菌c m 、c 1 5 5 、c 1 5 6 ， 表皮葡萄球菌c 【4 【，木糖葡萄球菌c 2 m 杆菌2 株，即短杆菌属r 2 5 l ，芽孢杆菌属 r 1 3 2 。酵母菌l 株，即德巴利汉逊酵母y 1 6 3 。 通过对其生物学特性的研究，表明所筛选的菌株都有较好的耐盐性、耐亚硝 酸盐性，其中菌株c 1 3 l 、c 1 4 卜c 2 3 l 的耐盐性、耐亚硝酸盐性最好；菌株c 1 4 j 、c 2 3 1 既具有蛋白酶活性又具有脂肪酶活性，菌株c 1 3 i 、r 2 5 1 只具有脂肪酶活性无蛋白酶 活性，菌株r 1 3 2 只具有蛋白酶活性无脂肪酶活性，菌株y 1 6 3 蛋白酶活性较弱无脂 肪酶活性；所有菌株的最适生长温度在3 0 3 5 。c ：通过对所筛选菌株在模拟肉汤 中混合培养关系的研究，表明菌株间无明显拮抗。 以蛋白酶、脂肪酶活力大小为指标，从如皋火腿中筛得产蛋白酶、脂肪酶能力 强的菌株1 株p 川，初步鉴定为黄青霉。所筛选菌株经溶血性试验、动物试验，证 明都是无毒型菌株。 以优选出的菌株作为发酵剂发酵火腿，通过测定发酵火腿产品中的细菌总数、 葡萄球菌数、酵母菌数、p h 值、游离氨基酸和三甲胺一氮含量，对单一菌株影响 火腿的质量特性进行了研究。结果表明：各菌株对火腿中的p h 值、游离氨基酸 和三甲胺氮的含量具有显著影响。除菌株r 2 5 l 、c 1 4 l 外，其它菌株均可增加产品 扬州大学硕七学位论文 中游离氨基酸的含量，菌株y 1 6 3 可降低产品的p h 值，菌株r 1 3 2 可降低产品中的 三甲胺- 氮含量。综合各种因素，确定以菌株c 1 3 l 、y 1 6 3 、r 1 3 2 为组合菌株进行火腿 发酵试验。 采用四因素三水平( 四因素菌株c 1 3 l 、y 1 6 3 、r i m 空列；三水平1 1 0 7c f u g 、 2 x1 0 7 c f u g 、3 1 0 7e f u g ) 的正交试验，以p h 值、游离氨基酸和三甲胺氮含量为 测定指标，确定发酵菌株的最佳组合。结果表明在3 0 3 5 、火腿表面接种黄青 霉进行发酵时，当菌株c 1 3 l 、y 1 6 3 、r 1 3 2 之间的比例为3 ：3 ：2 ，接种量为3 x 1 0 7 e f u g 、 3 x 1 0 7 c f u g 、2 x 1 0 7 c f u g 时，火腿中的游离氨基酸含量和酸度最高，三甲胺氮的含 量最低，发酵效果最好。 关键词：如皋火腿菌群分离品质研究 潘明如皋火腿茇酵菌群与火腿品质关系研究 a b s t r a c t t h e r ew e r eal o to f b a c t e r i u mr e s o u r c e si nt h en a t u r a l l yf e r m e n t e df o o d ，f r o mw h i c h w ec a l ls e l e c ts t a r t e rc u l t u r e sw i t he x c e l l e n tc h a r a c t e r i s t i c sf o rf e r m e n t e dm e a tp r o d u c t s i nt h i sp a p e r , w ea n a l y z e dt h em i c r o b i a l c o m p o s i t i o no ft h e t r a d i t i o n a lf e r m e n t e d m e a t 一r u g a oh a m , a n da l s oc a r r i e do u ti s o l a t i o n ，p u r i f i c a t i o n , c h a r a c t e r i z a t i o na n d a p p l i c a t i o no f t h em i c r o b i a ls y s t e m i nt h ec o n s t i t u t e so f n a t u r a l l yf e r m e n t e dh a m ，c o c c i 、b a c i l l u s 、y e a s t sa n dm o l d sa r e t h em a i n l ym i c r o b i o l o g y d u r i n gt h ef i r s tp e r i o do ff e r m e n t a t i o n , t h e r ea r eal o to f b a c t e r i u ma n dy e a s t si nt h ec e n t e ro fh a m ，w i t har a t i oo f1 7 ：1 ，a n dw i t h i nt h e b a c t e r i u m ，c o c c ii sp r i m a r yc o m p a r i n gt ob a c i l l u s ，w i t har a t i oo f3 9 ：1 ；b u ti nt h e a n a p h a s eo f f e r m e n t a t i o nt h er a t i oo f b a c t e r i aa n dy e a s t sg o tt o1 6 5 ：1 b e s i d e s ，t h e r ea r e a l s om o l d sg r o w i n go nt h es u r f a c eo fh a md u r i n gt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s s ，b u tn o n e w a se x a m i n e di n s i d e w es e l e c t e df a v o r a b l em i c r o b e sa c c o r d i n gt ot h ec a p a b i l i t yo fp r o d u c i n gf l a v o ra n d a r o m at h r o u g hs e n s o r ye v a l u a t i o na n dg c m sa n a l y s i s f r o mr u g a oh a mf i v es t r a i n so f s t a p h y l o c o c c iw e r es e l e c t e do u t w h i c hw e r es e p i d e r m i d i s c t 4 1 、a u r i c u l a r i sc t 3 1 、 c m 、c 1 5 6 ，s x y l o s u sc 2 3 1 ；t w os t r a i n so f b a c i l l n sw e r ec u r t o b a c t e r i u mr 2 5 l ，b a c i l l u s r 1 3 2 ；a n do n es t r a i no fy e a s tw a sd a b a r y o m y c e sh a n s e n u l ay 1 6 3i s o l a t e dw i t hm s a m e d i u m 、5 n a c lm e d i u ma n dy p dm e d i u mw e r eu s e d t h eb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ft h es t r a i n sw e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h es t r a i n sa b o v ea l lh a ds t r o n gt ot o l e r a n c et os a l ta n dn i t r i t e ，a n dc 、。南、c 2 3 1w e r e t h eb e s to n e s ；c 1 4 1 a n dc 2 3 1h a db o t hp r o t e o l y t i ca n dl i p l o l y t i ca c t i v i t y ；c ma n dr 2 5 1 o n l yh a dl i p l o l y t i ca c t i v i t y ；r 1 3 2o n l yh a dp r o t e o l y t ! ca c t i v i t y ；y 1 6 3o n l yh a dw e a k p r o t e o l y t i ca c t i v i t y t h e i ro p t i m a lt e m p e r a t u r ew a sf r o m3 0t o3 5 1 2 w ba l s os t u d i e dt h e r e l a t i o n s h i po ft h o s es t r a i n sc u l t i v a t e di nt h es t i m u l a t e dm e a ts o u p ，a n dr e s u l t ss h o w e d t h a tt h o s es t r a i n sd i d n tr e s i s to b v i o u s l y a c c o r d i n gt ot h ea c t i v i t yo fp r o t e a s ea n dl i p a s e ，o n es t r a i nw a s s e l e c t e do u tf r o m 4 扬州大学硕士学位论文 r u g a oh a m ，w h i c hw a sp r e l i m i n a r i l yi d e n t i f i e da sp c h r y s o g e n u m h e m o l y s i s sa n d a n i m a le x p e r i m e n t a t i o ns h o w e dt h a ta l ls t r a i n sw e r en o n t o x i c w es t u d i e dt h eq u a l i t yo fh a mw h i c hw a sf e r m e n t e dr e s p e c t i v e l yb yd i f f e r e n ts t r a i n s t h eq u a l i t ys t a n d a r d si n c l u d e dt h ea m o u n t so fb a c t e r i a , s t a p h 7 l o c o c c ia n dy e a s t ，p h ， f r e ea m i n oa c i da n dt r i m e t h y l a m i n e n r e s u l t ss h o w e dt h a ta l ls t r a i n sc o u l do b v i o u s l y a f f e c tp h ，t h ec o n t e n to ff r e ea m i n oa c i da n dt r i m e t h y l a m i n e - n e x c e p tr 2 5 ta n dc m ， t h eo t h e rs t r a i n sc o u l di n c r c a s et h ec o n t e n to ff r e ea m i n oa c i d ；y 1 6 3c o u l dr e d u c ep h ； r t 3 2c o u l dr e d u c et h ec o n t e n to ft r i m e t h y l a m i n e - n a n dc o n s i d e r i n ga l lt h ef a c t o r s ， c i 3 t 、y t 6 3a n dr t 3 2w e r ep r o v e dt ob ea p p r o p r i a t e t om a k ec e r t a i nt h eo p t i m a lp r o p o r t i o no f c l 3 1 、y t 6 3a n dr 1 3 2 ，o r t h o g o n a lt e s tl 9 ( 3 ) 4 w a sc o n d u c t e d ，w i t hp h ，t h ec o n t e n to ff r e ea m i n oa c i da n dt r i m e t h y l a m i n e n 弱 s t a n d a r d s t h er e s u l t ss h o w e dt h a t w h e nf e r m e n t e da t3 0 3 5 a n di n o c u l a t e d p c h r y s o g e n u so nt h es u r f a c ea n dt h ep r o p o r t i o no fc t s t 、y t 6 3a n dr t 3 2w a s3 ：3 ：2 ，t h e q u a l i t yo fh a mw a st h eb e s tw i t ht h eh i g h e s tc o n t e n t so ff r e ea m i n oa c i da n da c i d i t ya n d t h el o w e s tc o n t e n to f t r i m e t h y l a m i n e - n ， k e yw o r d s ：r u g a oh a m ，s t r a i n s ；s e p a r a t i o n ；q u a l i t y ；r e s e a r c h 潘明如皋火腿发酵菌群与火腿品质关系研究! 第1 章绪论 1 1 发酵肉制品的种类和特点 发酵肉制品是指盐腌肉在自然或人工条件下，经过微生物的发酵作用，形成 的具有特殊风味、色泽和质地并具有较长保质期的一类肉制品。因在加工过程中 经过了微生物发酵，形成了各种酸或醇，使肉的p h 值降低，并经低温脱水使a w 下降，所以准确的讲发酵肉制品应称为干燥肉制品【l 。 发酵肉制品主要包括发酵香肠和发酵火腿，其中发酵火腿是发酵肉制品中具 有代表性的一大类产品。发酵肉制品主要具有以下特点： ( 1 ) 感官品质良好，消费者易于接受 由于微生物和酶的作用，肉制品发色充分，具有鲜亮的玫瑰红色；发酵后肉 质嫩化，质构变好；微生物作用除去原料肉本来的腥、膻等不良风味，同时产生 大量挥发性物质，赋予产品独特的风味。 ( 2 ) 微生物安全性 因为低a w 和低p h 值抑制了肉中病原微生物的生长繁殖，所以一般认为发酵 肉制品是安全的。 ( 3 ) 稳定性 发酵肉制品是一类性质非常稳定的产品，货架期一般较长，这种稳定性是下 列多种因素组合的结果：低水分活度、低p h 值、高浓度食盐和一定量亚硝酸盐。 ( 4 ) 营养特性 发酵肉制品中大量乳酸菌的存在增加了其营养价值，如乳酸菌代谢产生大量 维生素。它还可以降低转化前体物质生成致癌物的酶的活性，如细菌酶，因此可 减少致癌物质污染的危害。发酵过程中，肌肉蛋白质被分解成肽和游离氨基酸， 使消化率增加。 1 2 发酵肉制品的发展状况及存在问题 1 2 1 国外发酵肉制品发展状况及存在问题 在肉制品产业发达的国家，发酵肉制品是一类重要的深加工肉制品。以前国 6 扬州人学硕七学位论文 外也是采用传统方式生产，可是人们从这类传统产品中分离得到了性能优良的优 势微生物菌株，并对其进行了充分的研究，开发出了可以用于标准化生产的工业 微生物发酵剂，从而实现了产业升级。现在采用标准化工业生产模式，生产完全 建立在物理学、化学和其它相关科学的基础上，工艺参数可以做到完全量化，生 产工艺成熟，产品质量稳定。同时，拥有完善的加工设备，便于实现工业化生产， 产品生产周期短，消费量呈上升趋势。如荷兰发酵肉制品的销量最初为o 2 万吨， 年，近1 5 年提高到2 万口屯年的水平 “。意大利生产帕尔玛火腿的公司有2 0 0 多家， 年产量可达9 0 0 多万只，其中1 3 0 万只出口到法国、德国、比利时、美国等4 0 多 个国家，优质的帕尔玛火腿每公斤的价格在1 0 0 美元左右，产品附加值高f ”。发酵 香肠也已完成了从传统的自然发酵向定向接种发酵的工业化生产的转变。有资料 显示，1 9 9 5 年欧盟范围内香肠的产量估计约为7 5 万吨，在德国，每年人均消费发 酵香肠约为4 5 k g ，约占肉类总消费量的7 。西班牙1 9 9 2 年发酵香肠的产量为 1 7 万吨，占肉类总产量的1 8 f 引。但是在国外工业化发酵肉制品生产中也存在一 定问题。由于采用快速酸化和缩短成熟时间等加工工艺可以减少库存量，降低生 产成本，但是加工时间变短也导致了一些缺陷的产生，如风味不足，因此如何解 决工业化产品风味方面的问题是现代工业化发酵肉制品生产的关键。 1 2 2 国内发酵肉制品发展状况及存在问题 我国发酵肉制品有着悠久的历史，因其颜色、香气、味道和造型独特而著称 于世，是中国肉制品几千年制作经验与智慧的结晶，是中国也是世界珍贵饮食文 化遗产的重要组成部分。金华火腿、宣威火腿和如皋火腿等产品都拥有悠久的历 史和文化背景，对世界肉制品加工技术和加工理论的发展做出过杰出贡献。目前 欧洲最为著名的帕尔玛火腿就是以1 3 1 4 世纪以意大利旅行家、传教士马可啵罗 从中国带回的金华火腿加工技术为基础而发展形成的。现代肉品贮藏理论李 斯特博士的栅栏效应理论也是在研究中国腊肠的菌相构成后得以证实和丰富起来 的1 9 。但随着社会及加工技术的飞速发展，这些传统产品逐渐与当今社会不相适应， 特别是近十余年来，西式肉制品的冲击，更使其生存和发展举步维艰。为使这些 产品再度辉煌，就必须正确分析其存在的问题，制定行之有效的对策【l o j 。 潘明如皋火腿发酵菌群与火腿品质关系研究 ! 我国发酵肉制品的生产普遍存在以下问题： ( 1 ) 加工工艺落后，卫生条件差。我国传统发酵肉制品技术靠师徒间言传口授， 凭经验和感觉控制产品质量，没有明确的技术指标、标准和可靠的质量检测手段， 许多产品的加工过程至今仍然是知其然而不知其所以然，致使其加工工艺不规范。 ( 2 ) 加工设备简陋，手工作坊式生产，生产周期长，产量低，生产成本高，阻碍 了工业化生产的步伐。 ( 3 ) 受气候和地区特殊条件制约，严重限制了我国传统发酵肉制品的产量和市场 影响力( 9 - 1 2 】。 由于以上原因，导致我国传统发酵肉制品质量不稳定，产品附加值低。 1 3 肉制品发酵剂 1 3 1 发酵肉制品中的微生物及所起的作用 从发酵和腌制肉制品中分离到的微生物区系来看，主要涉及到细菌、酵母菌、 霉菌 1 3 - 1 7 1 见表1 。 表1 - 1 发酵肉制品中的微生物 t a b l el - 1t h em i c r o b i o l o g yo f f e r m e n t e dm e a tp r o d u c t s 菌属菌种 微球菌属( m i e r o c o c c u s )变异微球菌( m v a r i a n s ) 木糖葡萄球菌( s x y l o s u s ) 肉糖葡萄球菌( s c a r n o s u s ) 松树葡萄球菌( s s c i u r i ) 耳式葡萄球菌( s a u r i c u l a r i s ) 腐生葡萄球菌( s s a p r o p h y t i c u s ) 植物乳杆菌( l p l a n t a r u m ) 清酒乳杆菌( 上s a k e ) 嗜酸乳杆菌( l a c i d o p h i l u s ) 干酪乳杆菌( c a s e d 弯曲乳杆菌( l c u r v a t u s ) 发酵乳杆菌( 三f e r m e n t u m ) 双发酵乳杆菌( h b i f e r m e n t a n s ) 短乳梓蓝( b r e v i s ) 瑞士乳杆菌( l h e l v e r i c u s ) 保加利哑乳杆菌旺b u l g a r i c u s ) 扬州大学硕士学位论文 链球菌属( s t r e p t o c o c c u s ) 乳链球曲( s 1 a c t i s ) 乳酸链球蓝( s a c i d i l a c t i s ) 丁二酮乳酸链球菌( s d i a c e t i l a c t i s ) 片球菌属( p e d i o c o c c u s ) 乳酸片球菌( p a c i d i a l a c t i c i ) 戊糖片球菌( p p e n t o s a c e u s ) 啤酒片球菌( p c e r s e v i s i a e ) 汉逊酵母菌属( h a n s e n i i ) 德巴利汉逊酵母( d a b a r y o m y c e sh a n s e n i o 法马塔假丝酵母( c a n d i d az e y a n o i d e s ) 季也蒙假丝酵母( c a n d i d ag u i l l i e r m o n d i t ) 青霉属( p e n i e i l l i u m ) 产黄青霉( t ! c h r y s o g e n u s ) 纳地青霉( p n a l g i o v e n s e l 娄地青霉( p r o q u e f o ，价 1 3 1 1 发酵肉制品中的微生物 1 3 1 1 1 细菌 ( 1 ) 葡萄球菌和微球菌 在肉制品发酵过程中，加入微球菌的目的不是为了快速产酸，这是因为微球 菌在发酵过程中产酸较慢，所以美国通常不采用微球菌，但是微球菌对肉的腌制 有促进作用，可以利用它分解蛋白质、脂肪及还原硝酸盐的能力，使产品形成腌 制色泽和特征风味 1 8 , 1 9 。微球菌科包括微球菌属、葡萄球菌属和动性球菌属。 ( 2 ) 乳酸菌 乳酸菌是指一类能利用可发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。在发酵肉制品中， 乳酸菌的应用是发酵过程成功的重要因素，乳酸菌可用于各种发酵香肠，并能满 足加工过程中的许多要求。片球菌m 5 5 是最早应用于商业的发酵剂，n i n i c a a r a 认 为片球菌m 5 5 作为细菌发酵剂的商业化应用，其作用首先是提高颜色的形成速度， 降低口h 值，在较短的时间内达到产品所要求的组织特性；其次，可降低生产成 本，控制病原微生物和腐败微生物的生长；啤酒片球菌( 后来鉴定为嗜酸片球菌) 于1 9 9 5 年首先在美国得到应用，随着这种微生物作为发酵剂的成功应用，开发出 了夏季发酵香肠。啤酒片球菌的最适生长温度为4 2 c ，通过控制加工过程，添加 亚硝酸盐，3 7 。c 发酵可缩短产品的成熟时间【2 0 2 1 盈1 。此外，戊糖片球菌的最适生 长温度为3 5 c ，可作为低温条件下加速制品成熟的发酵剂。在欧洲首先作为发酵 潘明 如皋火腿发酵菌群与火腿品质关系研究 ! 剂使用的是植物乳杆菌。植物乳杆菌和片球菌一直是商业发酵剂中的必要成员。 后来弯曲乳杆菌和米酒乳杆菌被共同作为肉制品发酵剂。这两类微生物通常在未 加控制的肉制品发酵过程中成为优势的微生物类群。它们具有较高的竞争性和较 好的环境适应性，作为肉制品发酵剂使用，从开始接种到产品消费，它们都是优 势微生物2 3 2 4 1 。 1 3 1 1 2 酵母菌 发酵肉制品生产中使用酵母主要是用来改善产品的感官质量，它们可使产品 具有特征性的酵母味，对提高发色过程的稳定性也有好处。酵母菌作为发酵剂主 要适合于干的发酵香肠。汉逊氏酵母是常用的酵母菌，这种菌具有较高的耐盐性、 好气性以及较弱的发酵性，一般生长在香肠表面。通过添加此菌，可提高香肠的 风味，它没有硝酸还原作用，但是可以通过与乳酸菌、微球菌的联合作用，提高 产品品质。l e i s t e r 和b e m 进一步研究发现，此酵母菌在发酵香肠中对由微球菌引 起的硝酸盐还原有轻度抑制作用【9 l 。此外，在干腌火腿产品中也发现有酵母。陈士 怡等人在对常规生产的金华火腿进行微生物分析时，就曾从火腿表层微生物鉴定 获得酵母菌【2 5 1 。l a r s h i n r i c h s e n i 等人也曾从意大利传统火腿中分离到酵母菌。但 是研究发现，与细菌相比，酵母在发酵肉制品中的数量很少，因此推测在其中所 起的作用也可能最小1 6 1 7 1 。 1 3 1 1 3 霉菌 在亚洲，霉菌发酵食品主要是以植物为原科，如大豆，而在欧洲，有许多以 动物为原料的霉菌发酵食品，如奶酪、发酵香肠和火腿。在北欧，烟熏香肠最为 流行，而在地中海和东南欧国家，霉菌发酵香肠是古老传统且品质上乘的发酵肉 制品。霉菌发酵肉制品具有独特的表面特性和风味，其后期变化主要来自于霉菌 引起的蛋白质和脂肪分解。霉菌生长对产品的进一步影响是阻止氧气的渗入，防 止产品发生哈喇昧和颜色变化。然而，如果感染了产毒霉菌，就会导致不合格的 产品，增加了毒素形成的危险。l e i s t n e r 等人对发酵火腿进行了大量分析，结果证 实了香肠中的霉菌大多数属于青霉属和帚霉属，许多青霉属中的菌种有产毒素的 扬州大学硕士学何论文 可能性，短柄帚霉能使皮肤和指甲感染。他们从自然发酵肉制品中分离的青霉菌 有8 0 能产生毒素，而1 7 种毒素中有1 1 种已经在肉制品中检测出来。因此，筛 选不产毒素的霉菌是十分必要的 1 5 , 1 7 1 。 1 3 1 2 微生物在发酵肉制品中的作用 ( 1 ) 促进发色和防止氧化变色 肉制品在成熟过程中，微球菌可将n o r 还原为n 0 2 。而乳酸菌在成熟时可利 用碳水化合物产生乳酸，降低肉制品中p h ，有利于n 0 2 分解为n o ，丽n o 可与 肌红蛋白结合生成亚硝基肌红蛋白，从而最终使肉品具有特有的腌制颜色。其发 色机理见图1 。此外，在肉制品中接种发酵剂，可利用其优势地位的抑制作用，控 制杂菌的生长，还可以将杂菌产生的h 2 0 2 还原为h 2 0 ，防止氧化变色。 园 己糖 啦一还融抗坏血醐 1 稍酸盐还原酶，2 亚硝酸盐还原酶，3 乳酸氧化酶，4 e m p 途径的酶 图1 - l 肉制品发酵期间的颜色变化机理 f i g 1 - 1m e c h a n i s m o f c o l o rc h a n g e o f m e a t d u r i n g f e r m e n t a t i o n 潘明 如皋火腿发酵菌群与火腿品质关系研究旦 ( 2 ) 降低p h ，减少腐败，提高产品安全性 乳酸菌可以利用碳水化合物，如葡萄糖产酸，从而使肉制品的p h 下降，赋予 其特有的风味。此外在酸性条件下，病原菌和腐败菌的生长得以抑制，大大提高 了发酵肉制品的安全性。 ( 3 ) 减少亚硝胺的形成 亚硝胺是公认的致癌物质，因此肉制品中亚硝酸盐残存量是食用安全性的一 个重要指标。如果在肉制品中加入乳酸菌，使其产生乳酸降低p h 值，促使亚硝酸 盐分解，则可减少残留的n 0 2 , 提高肉制品的安全性。 ( 4 ) 提高制品的营养价值 乳酸菌和葡萄球菌在肉制品中生长，可使肉中的蛋白质分解为肽和氨基酸， 同时产生大量风味物质，提高产品的营养价值f 摇r 3 0 j 。 1 3 1 3 微生物与火腿风味的相关性 1 3 1 。3 。l 微生物对火腿风味的有益影响 金华火腿表面霉菌中，最常见的是青霉和曲霉p “。陈士怡在金华火腿微生物 的人工接种及缩短生产周期的初步试验表明：以分离到的青霉4 号接种和以1 苯 甲酸抑菌的两组质量较好：缩短火腿生产周期的模拟试验有一定成效，由原来的8 l o 个月缩短到4 个月；经火腿的感官评定和游离氨基酸分析表明，质量与常规生产 的相比无显著差异p ”。 l a r h i n r i c h s e ne t a l 于1 9 9 5 年取了2 9 个分别代表6 个不同加工阶段的帕尔玛火 腿作为样品考察微生物与火腿风味形成之间的关系口3 1 。大量的挥发性物质，化学 变化，感官评定数据以及分离到的微生物数量显示火腿风味形成分为两个阶段：第 一阶段包括腌制、干制及成熟初期，主要发生自动氧化；第二阶段包括火腿成熟及 后熟过程，主要是微生物的发酵产物特别是氨基酸产生过程，包括风味物质形成， 如带甲基分支的醛、次级醇、甲基酮、乙基酸、二甲基三硫化合物【3 4 1 。传统火腿 加工中最显著的变化是：产品水分下降，盐分上升；相比之下，硝酸盐、亚硝酸盐、 d h 值的变化很少。但也有例外，如h u e r t ae t a l 在西班牙干腌火腿中就观察到了硝 里扬州大学硕士学俺论文 酸盐及亚硝酸盐浓度上升1 2 ”。在帕尔玛火腿没有这种现象是由于肉中硝酸还原细 菌作用的结果，并且很多人在其它干腌火腿研究中也得出了同样结论1 2 7 】。 微生物对帕尔玛火腿的风味形成起重要作用。因为几乎所有与火腿风味有关 的物质都可由微生物代谢产生( 特别是氨基酸代谢) 。在试验中已被观察到的硝酸盐 还原活性证明火腿中的微生物确实有活跃的代谢作用。另外，自动氧化似乎并不 重要，因为它所产生的物质对火腿风味贡献不大。目前微生物在帕尔玛火腿风味 形成中所起的作用机理尚不清楚。l a r s h i n r i c h s e ne t a l 在处于不同加工阶段的帕尔 玛火腿中分别检测出几种不同的微生物菌落，其中大部分是微球菌。微球菌在很 多发酵肉制品中都是优势菌，对肉制品风味的形成起着重要作用，在以往的研究 中是重点研究对象3 0 1 。然而，我们却无法判断出，究竟是o g - - 种微生物起主要作 用。 大量事实表明火腿发酵过程中不仅内源酶起作用，火腿附着微生物产生的酶 对火腿风味形成影响也极大，所以倾向认为火腿的成熟是两者共同作用促进的结 果。 1 3 1 3 2 微生物对火腿风昧的有害影响 研究表明大多数霉菌有产生毒素的能力，真菌产毒素的潜力随生产的进行而 增大。n u n e z - f 等检测了三个不同地点的伊比利亚火腿在成熟期间的真菌种群。选 择分离菌种中的5 9 种，使用氯仿萃取后对卤虫幼虫和v e r o 细胞进行毒性试验， 使用艾姆斯氏试验检测其诱变性，以及对金黄色葡萄球菌的抗菌性。通过对5 9 种 霉菌测试，表明大多数霉菌有产生毒素的能力，真菌产霉素的潜力随生产的进行 而增大【3 5 】。r o j a s f j 等分析了6 5 条干腌火腿，曲霉属和青霉属为优势菌属3 6 1 。通 常霉菌区系中主要为曲霉属，主要包括a g l a u c u s ，a f u m i g a t u s a n i g e r 和a f l a v u s o 。 1 6 条腿中发现a f l a v u s ，1 6 个菌株中的9 个在体外试验中产生黄曲霉素。a p a r a s i t i c u s n r r l 2 9 9 9 可接种在火腿表面生长并在2 5 和3 0 产生少量黄曲霉素。 在s e t r a n 火腿中微球菌是普遍存在的菌落，葡萄球菌处于主导地位，通常我 们把肠细菌科作为卫生指标菌，m e m a t i ne t a l 考察了肠细菌在传统火腿的演变， 以评价加工过程及产品的卫生状况。肠细菌在低温、逐渐脱水及盐浓度增加的腌 潘明如皋火腿发酵菌群与火腿品质关系研究 坚 制过程中至少下降了两个数量级，需氧嗜温菌在腌制过程中有所上升，腌制过后 肠细菌菌落数下降到1 0 c f u g 以下，成品中嗜温菌菌落数为1 0 4 c f l d g 。不恰当的腌 制方法会使火腿滋生腐败肠细菌，最终导致火腿在腌制结束前发生腐败p 7 1 。 1 3 2 发酵剂菌种的研究进展 1 3 2 1 发酵剂的起源及发展 h a m m e r s1 2 4 对发酵剂作了如下定义：是指含有活的或休眠的微生物，能够在发 酵基质中进行理想的新陈代谢活动。 发酵剂的筛选和添加决定着发酵成品的特性，因为不同的发酵剂代谢产物不 同，对肉制的影响也不同，微小的代谢物含量就可以影响到产品的品质。 国外肉品发酵剂的使用主要集中在发酵香肠的生产。如果使用得当，肉品发 酵剂可以提高制品的卫生安全性、风味和感官质量，延长货架寿命。反之，则可 能导致发酵过程的失败，并可能产生一些有毒物质。 早在2 0 世纪3 0 年代后期，发酵香肠的生产是通过加入小块己经发酵过的产 品作为发酵引子或加入一些促进原料中存在的、对产品发酵有利的物质的方法来 完成的。同其它发酵食品一样，这些产品的制作技巧超过科学性3 引。靠原料肉微 生物区系中的乳酸菌与杂菌的竞争作用，如原料配方及制作中各种条件适宜乳酸 菌生长时，则乳酸菌占优势，把糖转化为乳酸，降低了p h 值、改变了肉的质地， 使产品具有良好的风味：而当杂菌生长占优势时，则质量下降，甚至完全腐败变质， 不能食用【3 9 1 。 正是由于自然发酵过程存在着不可靠性和不可控性，人们越来越倾向于在现 代加工工艺中采用微生物纯培养物，即发酵剂来实现对发酵过程的有效控制，保 证产品的安全性和产品质量的稳定性。 纯发酵剂的使用，不但可以缩短生产时间，而且可生产更为安全、标准，更 为一致的产品 4 0 l 。虽然，事实上发酵剂在乳品工业中已经使用多年，但在全世界 范围内，他们在许多非乳品制品中的普遍应用还是近年来的事。发酵剂是确保发 酵香肠稳定性和安全性的重要因素2 4 ”。1 9 4 0 年，j e n s e n 和p a d d o c k 首先应用乳 1 4 扬州大学硕士学位论文 酸杆菌制作干香肠，可缩短成熟时间，改善产品的风味，从而开始了使用纯培养 的微生物发酵剂生产发酵香肠的第一步；1 9 5 5 年，n i v e n 等在美国最早采用乳酸片 球菌做发酵剂生产夏季香肠；d e i b e l 等发现片球菌可用作半干香肠发酵剂的菌种； 与此同时，对其它菌种，如微球菌，链球菌以及乳酸菌与其它菌作混合发酵剂的 研究和应用也有所发展。n i i a i v a a r a 于1 9 5 5 年首次将一株微球菌( m i c r o c o c c u s ，) 作为发酵剂，之所以选择这一菌株是因为它可以快速还原硝酸盐，改善色泽和风 味。后来这一菌株被p o h j a 分离的其它的过氧化氢酶阳性球菌所取代。n u r m i 在研 究中发现，单独接种乳酸杆菌能快速降低产品的p h 值，但产品的褪色现象严重， 单独接种微球菌能改善产品的颜色，遗憾的是p h 值的下降速度较慢。乳酸杆菌和 过氧化氢酶阳性球菌混合使用效果好，p h 值降低迅速，又不抑制颜色和风味的形 成。从此乳酸菌和微球菌或非致病性葡萄球菌混合作发酵剂的研究和应用获得了 快速发展，在欧洲已得到广泛的应用 4 2 1 。许多研究也表明，两种或两种以上乳酸 菌混合培养有保护菌种，避免噬菌体侵袭和产品风味优于单独培养等优点”6 , 4 3 , 4 4 。 1 9 5 7 年，冷冻发酵剂被允许使用，用于控制发酵过程。单一菌株和混合菌株 的冷冻商品发酵荆的开发，更加快了发酵剂在干或半干香肠中的广泛使用【4 5 1 。现 在，欧洲生产的大部分发酵肉制品都采用发酵剂。 目前，用于肉制品的发酵剂均以乳酸菌为主，通过不同乳酸菌以及同其它微 生物如微球菌或葡萄球菌之间的复配，生产混合发酵剂。 1 3 2 2 发酵剂的研究现状 选育优良的微生物菌种作为发酵剂是发酵肉制品加工的关键，从传统发酵食 品中筛选和通过微生物育种改造菌种是研究的中心目标。当今的欧美国家，通过 对微生物发酵肉制品的特性进行了较为深入的研究，己经完成了从传统的自然发 酵向微生物定向接种发酵的工业化生产的转变，发酵肉制品的生产己具备相当成 熟的生产工艺。 为了挑选合适的菌株作为发酵荆，国外研究人员对传统发酵香肠中的主要微 生物的特性作了大量研究。l a b a n 等研究了分离自f r e n c hs a u s a g e 的1 9 0 株乳酸菌 的发酵特性，他们认为来源于发酵肉制品中自然存在的菌株比来源于奶制品的乳 潘明如皋火腿发酵菌群与火腿品质关系研究 竖 酸菌更适合肉制品的生产娜1 。h o u l e 探讨了混合乳酸菌发酵剂的筛选方法【4 7 1 。 s a m e l i s 对自然发酵肉制品中分离的乳酸菌的特性研究表明，同型发酵乳酸菌占绝 对优势【4 8 】。g a r r i g a 认为产酸速度是筛选乳酸菌的重要指标 4 9 1 。c o p p o a 从 s o p p r e s s a t am o l i s a n a ( - - 种意大利莫利塞干香肠) 分离了1 8 3 株乳酸菌，其中1 2 5 株 为米酒乳杆菌，所有菌株具有较好的耐盐性( 6 n a c i ) 和耐硝性( 1 5 0 p p m n a n 0 2 ) ， 很少菌株产粘液和产h 2 0 21 5 0 l 。s a n t o s 从c h o d z o ( - - 种西班牙发酵肠) 中分离了5 1 6 株乳酸菌，其中米酒乳杆菌占6 8 6 ，所有菌株都不产气，能耐受7 n a c l ，大 部分不产h 2 0 2 和h 2 s 1 5 1 1 。s a s a n n a 将一株原生菌l a c t o b a c i l l u sr h a m a n o s u s ( 该菌在 乳品中己成功应用) 应用于发酵肠，结果表明该菌可以作为肉品发酵剂菌种。 k o m p r d a 研究表明，菌株的脱羧酶活性直接影响产品的生物胺含量1 5 2 1 。k o m p r d a 研究认为，发酵剂通过抑制具有脱羧酶活性微生物的生长，可以降低产品的生物 胺含量【5 2 1 。 在不添加发酵剂的传统方式加工的发酵肉制品中，总是存在一定数量的葡萄 球菌和微球菌，因此使人们认识到葡萄球菌和微球菌在发酵肉制品中的重要作用 5 3 1 。m i r a l l e s 认为硝酸盐还原能力应作为筛选微球菌和葡萄球菌的第一指标5 4 1 。 g a r c i a - v a r o n a 从c h o r i z o 中分离了4 2 6 株微球菌和葡萄球菌，认为具有较高硝酸盐 还原酶，适量的蛋白酶和脂肪酶活性的菌株适合作为发酵剂5 鄄。p a p a m a a o l i 从两 种自然发酵肉制品中分离到微球菌和葡萄球菌1 0 0 多株，其中大部分菌株在1 8 c 可以降解硝酸盐，能够降解酪蛋白和三丁酸甘油酯p 6 】。 国内有关发酵剂菌种的研究并不多，张红城采用模拟肉汤烧杯实验法，比较4 株乳酸菌的产酸性能钮。徐为民等用5 株乳酸菌和1 株葡萄球菌作发酵剂制作发 酵肠，通过测定产品质量选择发酵剂【5 8 】。李凤彩等探讨了发酵香肠菌种筛选标准 1 5 9 。 筛选具有不同作用和功效的微生物菌种，如产香菌、产细菌素菌、非产胺菌 等是研究的重点，通过这些发酵剂菌种的应用来抑制病原微生物的生长和产毒， 控制生物胺的形成、防止氧化变色、改善组织与风味、延长食品的货架期。 为了达到理想的效果，人们希望通过遗传育种研究获得性能更加优良的发酵 1 6 扬州大学硕士学位论文 剂，用传统的诱变筛选的方法进行育种很费时，效果也不太理想。采用遗传工程 技术可以把其它微生物中一些具有优良特性的基因直接导入发酵剂菌株中，获得 我们所需要的优良性状。目前己经将乳杆菌中的乳糖基因、过氧化氢酶基因、细 菌素基因克隆出来，这些基因可改善菌株的品质。g a i e r 将s s t a p h y l o l y t i c u s 中的溶 葡萄球菌素基因转移到乳杆菌中，抑制金黄色葡萄球菌的生长，提高了产品的安 全性。在肉品发酵剂中，肉糖葡萄球菌也是很重要的，对其遗传工程研究方面也 进行了大量的工作【2 4 】，见表1 2 。 表1 2 肉糖葡萄球菌已克隆的基因 1 h b l e1 2g e r i ec l o n e do f s c a r n o s l 4 s 1 3 3 发酵剂菌种的筛选标准 一般发酵剂的菌种是从相应的自然发酵的产品中分离出来的，由于原料配方 和生产条件不同，分离出来的微生物也不相同。无论哪种菌种，在肉品发酵条件 ( p h ，a w ，温度，腌制剂) 下，发酵剂在经历尽可能短的停滞期后，应该能够以适 当的速度发挥它们理想的活性删。因此作为肉品发酵剂应满足以下条件 5 0 , 5 9 , 6 1 】。 ( 1 ) 符合食品安全性要求 作为发酵剂菌种，必须对人体无害，因此菌种必须无致病性，不得产生细菌 毒素，尤其在葡萄球菌的筛选中，必须是凝固酶阴性。 ( 2 ) 具