（高分子化学与物理专业论文）丝素蛋白材料的生物降解性研究.pdf

复豆大学顽士论文学位论文摘要 硕士学位论文摘要 丝素蛋白材料的生物降解性研究 硕士生：黄训亭学号：0 4 2 0 4 4 0 1 7 院系( 所) ：高分子科学系专业：高分子化学与物理 指导教师：邵正中教授 蚕丝蛋白因其优异的综合力学性能、良好的生物相容性、细胞黏附性以及可 生物降解性成为生物医药等高新技术领域中极具应用潜力的一种天然高分子。丝 素蛋白作为手术缝合线、组织工程支架材料和药物缓释载体等的报道日渐丰富。 但是人们对丝素蛋白材料的降解行为尚缺乏细致深入的了解。 本论文采用淀粉液化芽孢杆菌蛋白酶和灰色链酶菌蛋白酶对生物医药领域 中经常使用的三种形态的丝素蛋白材料致密膜、多孔支架、丝纤维进行降解 实验，探索这些材料的生物降解性以及结构这一因素对降解行为的影响。借助扫 描电子显微镜( s e m ) 、x - 射线衍射( x r d ) 、近红外光谱( n 皿) 凝胶过滤色 谱( g f c ) 、电子拉力机( i n o n ) 、氨基酸分析等手段对酶促降解后材料的结构、 微观形貌，力学性能等进行分析，并对降解液组成进行了初步探索 结果表明，无论是何种形态的丝素蛋白材料在适当的蛋白酶作用下都能够被 最终降解而材料的微观结构是影响其降解速率快慢的一个重要因素。在丝纤维、 致密膜和多孔膜材料的酶促降解过程中，总是材料中规整性相对较差的区域优先 被进攻，无规部分溶失最快，s i l ki 结构( 分子链以螺旋构象为主) 次之，s i l k 结构( 分子链以b 折叠构象为主) 最不易被降解。尤其是s i l k 结构的增加， 可以明显减缓降解速率，提高材料的抗酶降解性能。因此，调节材料中s i l k 结构的含量可以成为调控丝素蛋白材料降解速率的有效途径。 对部分降解产物的分析表明。因非规整区域的优先溶失，降解残余材料中的 规整度有了进一步的提高，而材料的整体形貌随降解程度的深入受到越来越严重 的破坏。降解液中蛋白质分子量很小，均低于3k d a ，产物成分因丝索蛋白材料 中s i l ki 结构和s i l ki i 结构的含量不同而略有差异 关键词：丝素蛋白；结构；生物降解；b 折叠；蛋白酶 夏亘大学顼士论文 学位论文摘要 t h e b i o d e g r a d a t i o no f s i l k b a s e dm a t e r i a l s m a s t e rc a n d i d a t e ： s t u d e n ti d ： x u n t i n gh u a n g 0 4 2 0 4 4 0 1 7 d e p a r t m e n t ( i n s t i t u t e ) ：d e p a r t m e n to f m a c r o m o l e c u l a rs c i e n c e m a j o r ：p o l y m e rc h e m i s t r ya n dp h y s i c s a d 锄i cs u p e r v i s o r ：p r o f z h e n g z h o n gs h a o s i l kf i b r o i ni s p r o m i s i n gm m e r i n l si nm e d i c a la r e a , d u et o i t si m p r e s s i v e m e c h a n i c a lp r o p e r t i e s ，g o o db i o c o m p a t i b i l i t y , a n db i o d e g r a d a b i l i t y m o r ea n dm o r e r e s e a r c h e s 眦a b o u ti t s a p p l i c a t i o n s s u c ha s s u t u r e , p o r o u st i s s u em a t r i x , c o n t r o l l e d - r e l e n s e dm e d i d n ec a r r i e r , a n d o n h o w e v 瓯f e ws t u d i e sh a v eb e e n c a r r i e do u to i lt h d rd e g r a d a t i o nb e h a v i o r i nt h ep r e s e n tw o r k , w ei n v e s t i g a t e dt h eb i o d e g r a d a f i o no fv a r i o u ss i l k - b a s e d m a t e r i a l s ( f i l m ，p o r o u s ，s i l k ) c o m m o n l yu s e di nm e d i c a la r e ab yp r o t e a s eo r o t e a f r o mb a c i l l u sa m y l o l i q u e f a c i e n sa n dp r o t e a 辩t y p ex l v f r o ms t r e p t o m y c e sg r i s e c e s ) a m o n g t h em a n yf a c t o r sw ef o c u s e do i lt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ns 廿u e t u r eo ft h e s i l k - b a s e dm a t “a l sa n dt h d rd e g r a d a t i o nb e h a v i o r t h es t r u c r t r e s ，m o r p h o l o g i e sa n d m e c h a n i c a lp r o p e r t i e so fs i l k - b a s e dm a t e r i a l sb e f o r ea n da f t e rd e g r a d a t i o nw e r e e x a m i n e dt oc o n t r i b u t ef l e wi n s i g h ti n t ot h ed e g r a d a t i o np r o c e s sb ys c a n n i n ge l e c t r o n m i c r o s c o p y ( s e m ) , x - r a yd i f f r a c t i o no 口r d ) ，n e a r - i n f r a r e d ( n ：吣g e if i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y ( g f c ) ，i n s t r o n ，a m i n oa c i da n a l y s i s , a n ds oo n t h er e s u l t ss h o w e dt h a t , w h a t e v e rt h ef o r m a ti s ( f i l m , p o r o u s ，s i l k ) , s i l k - b a s e d m a t e r i a l sc o u l db ed e g r a d e df i n a l l yb ya p p r o p r i a t ep r o t e a s e m i e r o s u u c t u r ew a sa n e s s e n t i a lf a c t o r t oa l t e rt h er a t eo fd e g r a d a t i o n i nt h ed e g r a d a t i o np r o c e s s ，l e s s i r r e g u l a rd o m a i n sw o u l da l w a y sb ea t t a c k e dp r e f e r o n l i a l l y , a m o r p h o u sr e g i o n sf i r s t l y , t h e ns i l kis t r u c t u r e ( m a i n l yh e l i xc o n f o r m a t i o n ) 。a n ds i l ki is t r u c t u r e ( m a i n l yp s h e e t c o n f o r m a l i o n ) i nt h ee n d e s p e c i a l l yf o rs i l ki is t r u e l l l r e , t h er a t eo fd e g r a d a t i o nc o u l d 复豆大学顼士伦文学位论文摘要 b e c o m es l o w e rw i t ht h ec o n t e n to fs i l ki is t r u c t u r ei n c r e a s i n g t h e r e f o r e , w ec a l la l t e r t h er a t eo fd e g r a d a t i o ne f f e c t i v e l yb yc h a n g i n gt h ec o n t e n to fv a r i o u ss u u c t u r e e s p e c i a l l ys i l k v i aa n a l y s i so fd e g r a d a t i o np r o d u c t , w ef o u n dt h a tr e s i s t a n ts i l k - b a s e dm a t e r i a l s a f t e rd e g r a d a t i o nw e r em o l er e g u l a rt h a nb e f o r eb e c 觚s eo fi r r e g u l a rd o m a i n sl o s t p r e f e r e n t i a l l yi nt h ee n z y m a t i cd i g e s t i o n t h el o n g e rt i m eo fd e g r a d a t i o n , t h em o r e s e r i o u s l ys i l k - b a s e dm a t e r i a l sw e r er u i n e d t h em o l e c u l a rw e i g h to fs o l u b l ep r o t e i ni n t h ed e g r a d a t i o ns o l u t i o nw a sr e l a t i v d yl o w , l e s st h a n3kd a , a n dt h ec o m p o n e n to fi t f r o mv a r i o u sf i l m sw a ss o m e w h a td i i r e r e n td u et od i f f e r e n ts t r u c i a l l e si nt h em a t e r i a l s k e y w o r d s ：s i l kf i b r o i n ；s 缸u c t u r e ；b i o d e g r a d a f i o n ； 1 - s h e e t ；p r o t e a s e 论文独戗性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果论文中 除了特别加以标注和致谢的地方外不包含其他人或其它机构已经发表或撰写 过的研究成果其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确 的声明并表示了谢意 作者签名：童啦日期：掣 论文使用授权声明 本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定即：学校有权保 留送交论文的复印件。允许论文被查阅和借阅：学校可以公布论文的全部或部 分内容。可j ；l 采用影印、缩印或其它复制手段保存论文保密的论文在解密后 遵守此规定 作擞：遗塑2 壶导师辇名：幽堡日期：兰2 ：! ：! r 震显大学顼士论文绪论 第一章绪论 近年来，由于石油资源的日渐枯竭，人类寻找可持续新能源新材料的步伐逐 渐加快。动植物蛋白、纤维素、甲壳素等天然高分子材料日益受到科学家的关注。 目前，糖类、蛋白质和核酸等生物大分子的研究非常活跃，成为高分子学科中极 富挑战性的领域。 1 1 丝素蛋白 中国是蚕丝的生产大国，桑蚕的养殖在中国已经有好几千年的历史。蚕丝作 为一种性能优良的纤维，长期以来应用于纺织品工业，得到“纤维皇后”的美誉， 同时也成为最早被人类利用的天然蛋白质之一。随着科技的发展和人类社会的进 步，人们对于蚕丝及其蛋白质的应用也从最早的织物领域扩展到其他许多高附加 值的行业，如食品、精细化工、生物医用材料等【1 _ 叼 通过组装而形成蚕丝的丝素蛋白作为一种无明显生理活性的纤维状结构蛋 白，很适合从高分子材料的角度进行研究目前为止，科学家们对蚕丝的研究主 要集中在以下几个方面：丝素蛋白的化学结构( 包括其氨基酸组成与序列结构、 丝素蛋白分子量及其亚单元的分子量) 、丝索蛋白的链构象及其转变机制、丝素 蛋白的聚集态结构( 包括晶区、非晶区和织态结构) 、丝索蛋白的成丝机理、人 工仿生纺丝、丝素蛋白的模拟合成及其在生物材料领域的应用等【1 鼬1 1 1 1 蚕丝的组成和结构 蚕丝( 下文中若无特别指明，均为桑蚕丝) 由家蚕( b o m b y xm o r i ) 吐丝而 得，呈扁平椭圆型，由丝素蛋白和包覆其外的丝胶两部分组成。其中，丝素蛋白 占总重量7 0 左右，而丝胶约占2 5 ，其余5 为杂质 6 1 。丝胶蛋白可溶于热 水，力学性能极弱，通常人们可通过脱胶过程将其与丝素蛋白分离，蚕丝优异的 力学性能则基本来自以争折叠构象为主的丝素蛋白嗍以反平行p 晰叠结构为基 础的丝素蛋白首先形成直径大约为1 0n m 的微纤维，而后无数微纤维密切堆积组 成直径约为l m 的细纤维，大约1 0 0 根这样的细纤维沿长轴方向排列构成直径 约为1 0i i m 的单纤维，每两根这样的三角形单纤维被丝胶包裹最终成为单根蚕茧 丝1 3 ，q 。 复豆丈学顼士论文 绪论 丝素蛋白由十八种氨基酸组成，其中甘氨酸( g l y ) 含量大概占4 6 ，丙氨 酸( a l a ) 约占2 9 ，丝氨酸( s e t ) 约为1 2 ，这些取代基较小的氨基酸主要 位于丝素蛋白的结晶区，而取代基较大的氨基酸如苯丙氨酸( p h e ) 、酪氨酸( t y r ) 和色氨酸( t r p ) 等则主要位于非晶区【9 1 0 l 。表1 1 中归纳了天然蚕丝和再生丝素 蛋白中各种氨基酸的组成含量。 t a b l e1 1 a m i n oa c i dc o n t e n t so f n a t i v ea n d r e g e n e r a t e db o m b y xm o r is i l k t i , 1 2 】 n a t i v e r e g e n e r a t e d n a t i v e r e g e n e r a t e d a i n i n oa c i db m o r i b m o r if l b r o i na m i n oa c i db m o r ib m o r if i b r o i n f i b r o i n ( )( )f l b r o i n ( )( ) a s p a s h 0 9 1 5m e t0 10 1 t h r 0 90 8l i e0 20 6 s e r1 2 11 0 8l e u0 10 4 g l u g l n 0 8 0 9 t y r 5 3 4 9 p r o0 3o 5p h e0 60 6 c _ d y 4 5 9 4 6 2 h i s0 1 0 2 a l a3 0 32 9 7 l y s 0 20 3 c y s o 1 - a r g 0 3 0 4 型! ：!：! 卫2 ；兰： 丝索蛋白的分子量测定一直是研究中的一个难点丝素蛋白的分子量很大， 由于其分子结构和分子间作用力极其复杂，采用不同的方法所测定的分子量差别 较大，所以各研究小组的结果都不尽相刚1 3 1 在研究早期，人们甚至对丝素蛋 白分子链是由单一分子链组成还是由多个亚单元组成的复合体都存在着不同的 意见。随着基因科学和测试技术的发展，现在得到比较统一的结论：蚕丝蛋白由 三个亚单元组成1 12 ，1 1 6 l ：1 重链( h 链) 蛋白亚单元，平均分子量为3 9 1k d a ； 2 轻链( l 链) 亚单元，分子量为2 5k d a ，与h 链以一个二硫共价键相结合；3 p 2 5 蛋白，平均分子量为2 8kd ，与l 链大小相近，但氨基酸组成则完全不同， 并且不与h 链共价结合，只是通过其他非共价键结合的方式作为丝素蛋白的微量 成分存在 在丝素蛋白的分子链中，轻链的氨基酸残基排列没有重复性。从侧链的疏水 性来看，丝素蛋白的重链和轻链的氨基酸疏水侧链和亲东侧链均非常规整地相间 2 复豆大学殒士论文绪论 排列。疏水嵌段由4 - 1 0 个丙氨酸残基通过单个丝氨酸残基连接构成，疏水程度 较小的嵌段含有高度集中的甘氨酸残基，长度较疏水嵌段长一些，而且在长度和 成分上更易变化，是结晶和半结晶区的主要成分【1 7 1 。 由于轻链和p 2 5 蛋白所占的比例很低，因此我们通常所讨论的大多是重链。 在丝素蛋白的重链中，9 4 的序列为重复度较高的。结晶区域”( c r y s t a l l i n e d o m a i n ) ，而剩余的部分由总序列的。头部”( h d 盯) 、1 1 个。结晶区”之间序 列相近的连接链( l i l l l c 盯) 和尾部c 端肽链组成。在结晶区域中，高度重复的六 肽氨基酸重复单元( g l y a l a - g l y - a l a - g l y s e r ) 形成反平行的b 折叠结构【硼，是 晶区的主要组成：而非晶区则主要由( g l y - a l a - g l y a l a - g l y - y ) 贡献，其中y 指 t y r 等其它氨基酸眦1 8 1 1 1 2 丝素蛋白的构象及聚集态结构 二悟a n t i - 呲p a r m 乩 f i g u r e1 1 t h em o d e lo fh y d r o g e nb o n d i n gs c h e m ef o rt w op a r a l l e lp o l y p e p f i d e c h a i n sa n dt w oa n t i - p a r a l l e lp o l y p c p f i d ec h a i n si nap - s h e e ts t r u c t u r e 蛋白质的构象主要可分为无规线团、a 螺旋( a - h e l i x ) 和p 一折叠( 争s h e e t ) 三种，其中争折叠构象又可分为平行p 哳叠和反平行争折叠两种( 图1 1 ) 反平 行争折叠构象因其分子链段问的组装( 氢键相互作用) 最好，能量处于最低状态， 因此也最稳定。此外，也有研究者认为动物丝中还存在p 一螺旋、b 一转角( b 咖m ) 甚至更为紧密的左手3 1 螺旋等构象【1 ”u ，但这些构象并未得到广泛的认可。而丝 3 e e l e r 一 b 、lrj 一 一 夏豆大学顼士伦文绪论 素蛋白分子链中存在许多无侧基或者侧基很小的氨基酸重复多肽片段 ( g a g a g s ) ，这些片段结构规整，通过氢键作用能够很好地紧密堆积形成稳定 的反平行b 折叠构象f 2 2 】。 多年的研究发现，丝素蛋白的结晶( 规整结构) 形态主要可分为两种：s i l k i 和s i l k s i l k 被认为是以氢键连接的反平行1 3 折叠结构( 2 3 1 而对于s i l ki 的 结构人们尚无定论，因为其容易转变成更为稳定的s i l ki i 结构1 2 4 , 2 5 1 ，难以得到完 善的晶体。人们针对s i l ki 也曾提出过许多模型，如e r a n k s h m 模型【埘、松散四螺 旋模型【2 5 增，但是这些模型都不能完全解释所有的现象。近几年也有研究者提 出在水空气界面制备的丝素蛋白u 膜中存在所谓的s i l k 结晶结构，据报道这 是一种类似3 2 螺旋的左手甘氨酸1 i ( 1 e f t - h a n d e dp o l y g l y e i n ei it y p eo f3 2h e l i c a l c o n f o r m a t i o n ) 的结构1 2 6 - 拥。 在本论文中我们遵循最经典的分类，仅简单地考虑s i l ki 和s i l k1 i 两种结晶 结构，并且认为s i l ki i 的结构为反平行b - 折叠构象，s i l ki 则包含了无规、螺旋 等其他所有非b 折叠构象。 t a b l e1 2t h ec h a r a c t e r i s t i cb a n d so fs i l kf i b r o i n ! 竺竺i i 兰盘塑4 鲤型! )i 鉴坠) ! 竺竺竺 n m ra l ac b1 6 6p p m 1 9 9p p m 2 5 ，3 1 - 3 5 a l ac 口5 0 0p p m4 8 2p p m r a m a t l 1 6 6 0e m “( a m i d ei )1 6 7 0c m 1 ( a m i d ei ) 3 9 - 4 1 1 2 5 2 g i l l “( a m i d e ) 1 2 3 3g m 1 ( a m i d er r l ) 1 2 7 0 g i l l 1 ( a m i d e ) x p d 1 2 2 0 ( 7 2 5 a )9 1 0 ( 9 7 a ) 4 2 4 6 1 9 7 。( 4 5 a 、2 0 7 。( 4 3 a ) 2 82 0 f3 1 6 a 1 以前人们认为蛋白质的一级结构( 氨基酸序列) 决定了其功能与性质，现在 越来越多的研究表明动物丝中蛋白质的二级结构和聚集态形式对其性能( 尤其是 力学性能) 的贡献是非常卓越的【部0 1 。因此，从高分子材料的角度研究二级结 4 一 一一一一 翳一 一一 溅 复豆大学琐士论文绪论 构对丝素蛋白材料性能的影响非常重要。拉曼光谱( r a m a n ) 、x 射线衍射( d ) 、 红外光谱( f n r ) 、核磁共振( n m r ) 等方法都先后用来研究蚕丝及丝素蛋白的 构象及其转变机制，这些方法中，丝素蛋白的特征吸收如表1 2 所示。 1 1 3 蚕丝及丝索蛋白在生物医药领域的应用 丝索蛋白来源丰富、成本低廉、生物相容性和细胞黏附性好，无毒无刺激， 同时具有相当不错的力学性能以及良好的生物降解性【1 删。这些优点使丝素蛋 白成为一种极具应用前景的生物医用高分子材料。 蚕丝最早应用于医疗领域是作为手术缝合线嗍，已经有较长的历史。许多 实验证明，相比于其他纤维材料，蚕丝具有优异的综合力学性能( 表1 3 ) 。如果 将丝胶蛋白完全除去，也就能除去过敏性诱因，使其具有更好的生物相容性【” t a b l e1 3 c o m p a r i s o no f m e c h a n i c a lp r o p e r t i e so f c o m m o ns i l k st os e v e r a l 奠p ! ! 垡竖! 巴型重型垒! 笪! 磐! 垒：旦：竺尘巴! 型z 竺：塑! 鲤型 最m o r is i l k l 删 s p i d e rs i l k 5 0 l c o l l a g e n l 5 1 1 p l a ! ，2 1 t e n d o n l s 3 l b o n e i 韧 k e v l a r ( 4 9f i b e r ) t 】 丝索蛋白因其结晶方式多样化的特点，在可控的条件下能够方便地实现水溶 性与非水溶性的双向转化，通过调节这个转化程度即可调节丝素蛋白构象组成以 达到控制释放速度的目的，因此有学者通过将其与药物共混等，研究其在药物控 制释放中的作用【蚓 为了修复损坏的组织和器官，组织工程( t i s s u ee n g i n e e r i n g ) 作为一门集生 命科学、临床医学、生物工程、材料科学与工程等多学科为一体的交叉学科发展 起来了。它运用工程学与生命科学的基本原理开发能够恢复、维持或改善受损 组织或器官功能的生物替代物珏韧 8 8 倘 撕 ! ， l 2 稻o ) m 加 m l 盯 l o0 吣 暑： 沁 沁 瑚 一 一 一 啪 姗 姗 8 ( 复豆大学硕士论文 绪论 在组织工程中，支架材料占据着非常重要的地位，通常由天然或合成的高分 子制备而得。理想的组织工程材料应具备以下这些特点1 5 3 】： ( 1 ) 允许细胞的黏附、增殖、迁移与相互作用。 ( 2 ) 与宿主的免疫系统生物相容性好，植入后不会产生排异反应。 ( 3 ) 具有合适的生物降解速度能够与新组织再生速度相匹配，以便植入 体与周围宿主组织融为一体。 ( 4 ) 具有一定的力学性能，在植入初期可以支持细胞与新生组织在其之上 的生长。 ( 5 ) 制备工艺灵活，可根据需要调节材料的形态与结构。 在组织工程中，丝素蛋白成为一种新兴的材料受到越来越多科学家的青睐。 它可制备成许多形态，如膜、纤维、支架材料、凝胶等。m i n o u r a 等研究鼠细胞 l - 9 2 9 在丝素蛋白膜上的黏附和生长情况，表明丝素蛋白和胶原蛋白一样能够促 进细胞的生长 5 9 , 6 3 1 。吴海涛等采用蚕丝与软骨细胞进行复合培养，探索了蚕丝作 为软骨细胞体外培养支架的可行性，发现蚕丝对软骨细胞具有良好的吸附作用并 能维持软骨细胞正常形态和功能，是适合软骨细胞立体培养的良好天然支架嗍 a l t m a n 等直接将蚕丝纤维用于人工十字韧带的制作，证明了蚕丝纤维具有良好的 力学性质、生物相容性以及缓慢的生物降解性，是制备人工韧带的良好支架材料 1 9 9 s o f i a 等研究了成骨细胞在蚕丝蛋白上的生长情况，发现a 唱g l y a 印基质从 各方面更能促进骨细胞的生长【1 叫丝素蛋白还被用做许聚合物支架材料的涂覆 材料，以便增加支架材料的细胞黏附和生长能力懈酬。表1 4 中列出了各种形态 的丝素蛋白材料在生物医药领域的若干应用网。 此外，丝素蛋白还被应用于食品、化妆品、保健品方面。丝素蛋白具有天然 的护肤美容效果，其中含量最高的几种氨基酸恰是皮肤胶原蛋白的主要成分，与 皮肤有很好的亲和性，极易被皮肤吸收。同时丝素蛋白中含有大量的亲水基团， 可发挥天然保湿因子的作用。而且丝索蛋白中含有相当数量的酚羟基，具有吸收 紫外线、抗氧化和防止或减缓皮肤黑色素形成的作用 4 1 。目前日本及国内市场都 出现了一些添加了可溶性蚕丝蛋白( 如丝索肽、丝素氨基酸) 的化妆品。日本学 者平林洁教授还对丝素蛋白的可食性进行了研究，现在日本已经出现加入经裂解 的蚕丝粉末制成的食品，如蛋糕和饼干等，并且受到消费者的欢迎。 6 复豆大学顽尘伦文绪论 t a b l e1 4 p r o c e s s i n go f r e g e n e r a t e ds i l kf i b r o i na n dr e l a t e db i o m e d i c a l ! ! ! 型竺! m 删8 1 p ：等鸣 f e a t u r e s applicafionsfo r m a tm e i l l o d 4 1 2 丝素蛋白降解性的研究进展 1 2 1 蛋白质的水解1 3 , 1 0 q 蛋白质可以被酸、碱或蛋白酶催化水解，在水解的过程中，逐渐降解成分子 量越来越小的肽段( p e p l i d ef r a g m e n t ) ，直到最后成为氨基酸的混合物这三种 水解方式各有其优缺点： 酸水解通常使用硫酸或者盐酸进行。使用浓度盐酸为6m o l l ，硫酸则为4 m o l l ：回流煮沸2 0 小时左右可使蛋白质完全水解。酸水解的优点是不引起消旋 作用( r a c e m i z a f i o n ) ，得到的是l 氨基酸。缺点是色氨酸完全被沸酸所破坏， 羟基氨基酸( 丝氨酸及苏氨酸) 有- - , j , 部分被分解，同时天冬酰胺和谷胺酰胺的 7 夏豆大学顼士伦文 绪论 酰胺基被水解下来。 碱水解一般与5m o l l 氢氧化钠共煮l o 2 0 小时，可使蛋白质完全水解。水 解过程中多数氨基酸遭到不同程度的破坏，并且产生消旋现象，所得产物是d 型和l 型氨基酸的混合物，称消旋物。此外，碱水解引起精氨酸脱氨，生成鸟 氨酸和尿素。但是在碱性条件下色氨酸是稳定的。 酶水解不产生消旋作用，也不破坏氨基酸。然而使用一种酶往往水解不彻底， 需要几种酶协同作用才能使蛋白质完全水解。此外，酶水解所需时间较长。因此 酶法主要用于部分水解。 1 2 2 丝素蛋白的水解 在丝素蛋白中经常采用的水解方法为酸水解法和酶解法。酸水解时先采用盐 酸水解，再以氢氧化钠中和，随后进行脱盐处理，在盐分及杂质被完全脱除的情 况下，经浓缩、冷冻干燥，制备成黄褐色粉末，这种粉末略带甜味，其中约有 6 0 左右的氨基酸和4 0 的低聚肽但此法水解条件剧烈，水解度难以控制， 产率也较低酶解法则是采用合适的蛋白酶分解丝素蛋白，水解条件温和，效率 高，可以模拟人体环境，得到的低聚肽、氨基酸粉末无色无味，丝素蛋白的功能 亦无改变。也有报道称c a c l 2 ，乙醇水溶液三元体系对丝素蛋白也有一定的降解 作用1 叼，但是只能使丝素蛋白的分子量下降到几万，得到的产物仍然属于蛋白 质大分子。 对于酶解丝素蛋白的研究，主要可分为两个阶段国内外早期利用酶来水解 丝素蛋白的研究主要集中在丝素蛋白溶液方面，其目的一方面是为了了解丝素蛋 白的氨基酸组成，另一方面则是为了丝素蛋白在食品工业和精细化工行业的应用 寻找最佳条件。近年来随着组织工程的发展以及丝素蛋白在生物医药领域的应用 潜力，才出现了一些针对丝素蛋白材料进行的生物降解性研究 在丝素蛋白降解的研究报道中用到较多的蛋白酶为胰蛋白酶( t i y p s i n ) 、1 2 - 胰凝乳蛋白酶( o - o h y m o t r y p s i n ，又称靡蛋白酶) 、灰色链酶菌蛋白酶、弹性蛋白 酶。这些蛋白酶对丝素的作用各不相同。 1 2 ，2 1 丝索蛋白溶液的水解 一般认为丝素肽分子量在1 5kd a 之间最有利于透过细胞膜而被皮肤充分 0 夏豆丈掌顼士论文 绪论 吸收，并且对皮肤中黑色素生成的抑制作用最为有效。而且较小分子量的丝素肽 在某种程度上能够有效控制体内血糖水平、降低胆固醇和促进酒精分解代谢的作 用，而分子量稍大的丝素肽对自身免疫性疾病则有很好的防止作用，可作为功能 性食品配料因此，丝素肽在食品、化妆品等方面都有较大的应用前景。但是天 然丝不溶于水而难于被酶水解所以前期的研究大多从丝素蛋白溶液开始水解丝 素。通过中性盐溶解法可以使丝素蛋白分子量适当降低，同时暴露出部分可被酶 切的位点，使丝素蛋白酶降解率大大提高加鲥。相比于酸、碱水解的方法，使用 酶水解法除了高效温和等优点，还有一个最突出的优点就是产物中的含盐量低， 方便于后期的纯化与应用。 六十年代s h a w 等【1 0 4 1 研究了纯胰蛋白酶和小胰凝乳蛋白酶水解经过硫氰酸盐 处理后的丝素，发现丝素蛋白的非晶区能够被降解而结晶区则不被破坏，酶解产 物可分为沉淀部分( c d ) 和水溶性清液部分( c i ) 其中沉淀部分来自丝素蛋白 的结晶区，而水溶性部分则来自无定形区，两者的重量比大约为6 0 ：4 0 研究 表明这两部分中的氨基酸组成也不尽相同，c 。部分含有较多简单侧基氨基酸( 如 g l y 、a l a 、s e r ) ，而侧基较大的氨基酸( 如t y r 、p h e 等) 的含量较少与之相比， c - 中简单侧基氨基酸的含量降低了而侧基较大氨基酸的含量增加了 从灰色链酶菌( s t r e p t o m y c e s g r i s e u s ) 中培养得到的两种蛋白酶a c t i n a s e 和 p r o t e a s e - e 也被用做丝索蛋白降解的研究 t 0 5 | ，并发现它们对丝索蛋白的水解作用 比常规的胰蛋白酶和弘胰凝乳蛋白酶强。它们不仅对丝索蛋白的非晶区有作用， 对结晶区也有一定的水解作用，得到的水溶性丝肽分子量大约为几百至几千道尔 顿( 凝胶色谱法测定) 弹性蛋白酶也被一些研究者用以水解丝素蛋白。该酶的水解能力明显高于胰 蛋白酶和小胰凝乳蛋白酶，水解产物主要是可溶性的c i 部分( 占整个酶解产物9 0 以上) ，分子量分布为o 2 4kd a c l 0 6 l 。 除此之外，还有少量关于肌动蛋白酶、木瓜蛋白酶、微生物蛋白酶a l c 冱l a s e 、 复合蛋白酶p r o t a m e x 的研究报道。其中复合蛋白酶因为特异性弱、进攻位点多、 作用范围广，因此水解度高，分子量低。木瓜蛋白酶的作用效果相对比较小，因 而水解效果相对较差f 1 竹1 1 0 1 1 2 2 2 丝素蛋白材料的降解 9 夏置大学顼士论文绪论 蚕丝作为缝合线的应用已经有较长的历史嗍，但是长期以来人们对于蚕丝 是否属于可降解材料一直存在一种误解。根据美国药典，材料是否可生物降解的 划分标准是：材料植入体内6 0 天以后丧失其5 0 以上的力学性能。由于丝素蛋 白纤维很难被吸收，在体内大概需要一年的时间才能丧失其大部分机械强度，因 此被列为不可降解材料。但是近几年的科研结果表明，丝素蛋白作为一种蛋白质， 是可以被某些酶降解，并且植入人体内也会最终被吸收，只是所需要的时间比一 般意义上的可降解材料要长1 1 , 4 7 1 许多体外研究结果表明，多种蛋白酶对丝索蛋白具有良好的降解效果。泓 胰凝乳蛋白酶可以水解丝素蛋白非晶区，所形成的多肽片段很容易被巨噬细胞吞 噬并进一步降解。丝素水溶液降解中常用的弹性蛋白酶、放线菌蛋白酶以及胶原 蛋白酶等对各种形态的丝素蛋白材料都有不错的降解效果 2 5 , 1 0 5 。 丝素蛋白在体内的降解吸收受很多因素的影响，包括植入体内的部位、组织 周围的受力情况、以及整个生物环境和降解条件等；另外还与丝素蛋白材料的结 构( 结晶区、非结晶区) 、形态( 膜、多孔支架、凝胶、纤维) 、制备工艺( 甚至 处理过程中导致的丝索蛋白构象变化) 等都有密切的关系但是，到目前为止人 们对这些参数影响降解行为的具体效果还没有太多的研究。因此，人们对丝素蛋 白材料制备方法、结构与降解性能之间的关系尚无足够的了解f u n ! 这几年随着组织工程的兴起，丝素蛋白成为一种受人关注的生物医药材料， 随着各种形态的丝素蛋白材料的制备工艺日趋成熟，人们对丝素蛋白降解性的研 究也逐渐从溶液转移到丝素蛋白材料方面。 李明忠 4 3 1 等人对比了伍胰凝乳蛋白酶( a - c h y m o t r y p s i n ) 、胶原蛋白酶n ( c o l l a g e n a s ei a ) 以及灰色链酶菌蛋白酶x i v ( p r o t e a s ex i v ) 对所制备的丝素蛋 白多孔材料的生物降解性的效果。结果发现，蛋白酶x i v 的降解效果最显著，胶 原蛋白酶l a 的效果其次，二者都能令多孔支架的结晶区遭到不同程度的破坏。而 且非常有趣的是，作者经过观察认为：多孔支架的整体结晶度随着支架的降解不 降反升，其原因是s i l k 结构的破坏和部分s i l k i 结构的形成。f t - 胰凝乳蛋白酶 对丝素多孔支架材料的降解非常不明显，但是它却能降解多孔材料溶于水中的那 部分丝素蛋白。降解后产物的平均分子量大小顺序与所使用蛋白酶之间的关系 为：蛋白酶x i v 胶原蛋白酶i a c t 胰凝乳蛋白酶。 夏豆大学顼士伦文 绪论 a 一1 l 等人对5 0 ( v v ) 甲醇处理过的丝素蛋白致密膜以及天然蚕丝的体 外降解进行了研究，使用的是胶原蛋白酶f ( c o i l a g e n a s et y p e f ) ，q 胰凝乳蛋白 酶i s ( o 【- c h y m o t r y p s l nt y p ei - s ) 以及灰色链酶菌蛋白酶x x ( p r o t e a s ex x i ) 。结 果表明，蛋白酶) a 对致密膜的降解效果明显，另外两种酶对膜造成的失重则很 小而且降解的速度对所用蛋白酶的浓度有依赖性，浓度大则降解快，但两者不 成线性关系。降解产物中，可溶于水的部分是分子量分布很宽的多肽，残余丝素 膜上的部分则是富含甘氨酸和丙氨酸的结晶规整区。这三种酶对蚕丝纤维的降解 不是非常明显，失重上几乎没有变化，但是纤维的表面略变粗糙，而且纤维的机 械强度降低了很多。因此作者提出：对于蚕丝纤维，以机械强度的下降作为降解 的起始点较之失重要灵敏许多 此后，h o r a n 使用灰色链酶菌蛋白酶v ( p r o t e a s e x i v ) 对蚕丝纤维的降解 进行了专门的研究伟】。通过重量改变、形貌观察、光谱学研究、机械性能测定、 s d s - p a g e 凝胶电泳对蚕丝纤维的体外降解过程进行了讨论，结果表明，蚕丝是 一种机械性能很好的生物材料，并且需要较长的时间才能被降解。降解过程中， 蚕丝的直径减小，失重增加，断裂强度和疲劳周期下降，同时纤维表面粗糙，重 链和轻链的分子都在减小或下降 此外，t a d d e i 等人也使用灰色链酶菌蛋白酶x x i ( p r o t e a s e ) o l ) 对柞蚕 ( a n t h e r a e a p e r n y i ) 丝蛋白膜材料的生物体外降解进行了研究发现该丝素膜的 酶降解效果也很明显，产物中可溶性多肽片段的分子量随降解时间的增加而降 低。酶在作用于材料时优先进攻甘氨酸富集的片段，残余膜内丙氨酸的含量增加， 同时残余膜的结晶性增强。与家蚕( b o m b y x m o r i ) 丝素蛋白不同的是，柞蚕丝 素蛋白膜中旺螺旋结构是最不易被酶降解的【1 埘 1 3 课题的提出以及主要研究内容 蚕丝及其丝索蛋白材料因其优异的力学性能、良好的生物相容性与可生物降 解性在生物医药等高新技术领域的应用潜力日益受到重视，成为一类新兴的生物 医药材料丝素蛋白作为手术缝合线、组织工程以及药物缓释材料的报道也日益 增多1 1 鸬1 1 3 作为生物医药材料，其生物降解性是一项很重要的性能指标。例如，组织工 夏豆丈学顼士伦文 绪论 程中的支架材料，不仅要求生物相容性好，更希望其降解速度与组织的再长速度 相匹配，方可达到良好的修复效果【i , 5 6 3 。因此，如何能够控制丝素蛋白材料在体 内的降解速度是许多研究者关心的问题。然而，相比于大量有关丝素蛋白性能及 材料制备方法方面的研究，人们对丝素蛋白( 尤其是丝素蛋白材料) 生物降解性 方面的报道显得极为缺乏因此，有必要对其进行更为深入的研究。 影响材料降解性能的因素有很多，如材料的结构、形态、降解条件、生理化 学环境等1 1 以1 0 习，只有对降解的过程、机理、影响因素等有充分的了解，才能达 到有效控制材料降解行为和降解速度的目的。我们曾对丝素蛋白构象及其在各种 外源性因素影响下的转变等方面进行过大量的探索1 3 7 , 3 s 6 8 , 1 1 4 , 1 1 5 ，并利用这些结果 对丝素蛋白膜的构象进行调控，制备出一种丝素蛋白多孔膜【1 1 6 1 。 基于以上的研究背景与趋势，本文采用灰色链酶菌蛋白酶和淀粉液化芽孢杆 菌蛋白酶对丝素蛋白致密膜和多孔膜的生物降解性进行了探索，并与天然蚕丝进 行比较。在影响降解性能的众多因素中着力研究此类蛋白质材料的结构对其降解 行为的影响，探索了丝( 蛋白多孔膜) 材料中的构象含量( 尤其是s i l k 结构) 对降解速度的影响，并借助扫描电镜( s e m ) 、x - 射线衍射( ) 承d ) 、凝胶过滤 色谱( g f c ) 、电子拉力机( i n s t r o n ) 等手段对降解后产物的微观形貌、结构、 分子量分布、力学性能等进行初步研究，以此希望为动物丝及丝素蛋白材料在生 物医药领域的应用提供有用信息。 参考文献 1 a l t m a n , gh ；d i a z , f ；j a k u b a , c ；c a l a b r o ，t ；h o r a n ，r ，l ；c h v n , j s ；l u , h ； 础c h m o n d ，j ；k a p l a a , d l b i o m a t e r i a l s2 0 0 3 ，2 4 , 4 0 1 2 许才定；杨建康；陈寿菊；邬明芳：孔育国；王明明国：移丝匆1 9 9 9 ，2 8 3 胡玉洁无群蔚分于：彩彤或拦与应用2 0 0 3 年第1 版 4 王佳培：胡建恩；白雪芳：杜昱光精勿与专劈纪号等晶2 0 0 4 ，1 2 ，1 3 5 a n d e r s o n , j