（茶学专业论文）绿茶中非水溶性蛋白及酶解效果的研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 本研究首先以蒸青茶为原料制备茶渣，研究了非水溶性蛋白的最优提取参 数和初步纯化的方法；以蒸青茶和茶渣两种原料的提取液作为底物，分析比较 了不同种类的蛋白酶降解蛋白的酶解效果，筛选出一种能有效分解蛋白的酶， 探讨了这种酶的最佳反应参数；其次把这种酶应用于炒青绿茶和花茶，研究它 的广泛性；分析了蛋白酶的组合，纤维素酶和蛋白酶的组合，单宁酶和蛋白酶 的组合对茶中氨基酸含量的影响以及游离氨基酸分析；比较了蒸青茶和茶渣的 氨基酸组分区别。研究结果表明： 1 、通过单因素及正交优化实验，得到茶渣谷蛋白的最佳提取参数为：温度 9 0 ，提取时间2 h ，碱液浓度o 0 9 m o l 1 ，1 ：4 0 的固液比。其得率为4 2 5 4 。 2 、当乙醇浓度为7 0 ，初提时间为9 0 m i n ，1 ：3 0 的固液比，对茶渣连续 提取4 次，得到的蛋白质总量为3 5 2 。 3 、沉淀法纯化蛋白中，以盐析等电点的纯化效果最好。当溶液中硫酸铵 的饱和度达到6 0 ，调p h 到4 5 ，沉淀率达到9 2 2 9 ，而以乙醇沉淀法的效 果最不明显，7 0 的乙醇的沉淀率只能达到2 8 6 4 。 4 、不同种类的酶对蒸青茶和茶渣中氨基酸总量的影响是差异的，同浓度 ( o 0 5 ) 的木瓜蛋白酶，蛋白酶m ，鲜味强化酶，新脂肪酶f 3 g 和0 2 中 性蛋白酶处理，蒸青茶和茶渣l h ，提取液中氨基酸总量都有所增加。蒸青茶中 分别比对照提高了0 5 0 ，2 7 4 ，3 6 1 ，o4 5 和2 9 9 ，蒸青茶渣0 8 7 ， 2 2 4 ，3 5 5 ，o 8 5 和1 7 2 。 5 、通过单因素及正交优化实验，得到鲜味强化酶的最佳作用参数：p h 5 ， 酶解4 h ，酶浓度o 0 7 ，蒸青茶和茶渣中氨基酸增量分别为7 0 6 ，9 1 3 。 6 、中性蛋白酶和鲜昧强化酶的组合能有效降解茶渣和茶中的蛋白质，增加 氨基酸含量。处理后，其含量占茶干物重的1 3 0 4 。 7 、在鲜味强化酶的酶解条件下，同时加入0 0 3 的纤维素酶，蒸青茶中氨 基酸含量比单独使用鲜味强化酶的处理含量略高，增长了0 9 1 。 8 、炒青和花茶提取液在经过鲜味强化酶浓度为o 0 5 ，p h 5 5 ，酶解4 h 的处理后，茶提取液中的氨基酸总量明显增加，分别达到6 9 l ，7 7 6 。而 在加入0 0 5 的单宁酶后，炒青和花茶提取液中的氨基酸增加量反而有所下降。 9 、对3 个酶处理后的提取液进行游离氨基酸分析，发现o 0 5 的鲜味强化 酶浓度，在p h 5 5 下，酶解4 h 的处理，游离氨基酸的总量和组分组合比较合理 实用。其中天门冬氨基酸、谷氨酸、精氨酸、茶氨酸的增量明显，他们的总量 是茶和茶渣对照的3 7 5 倍，1 5 3 7 倍；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸， 1 v 浙江大学硕士学位论文 赖氨酸，苏氨酸这些必须氨基酸增量也较明显，总量占茶干物重的2 7 1 ，占 茶渣干物重的1 6 5 。 关键词：绿茶非水溶性蛋白质氨基酸酶 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h er e s i d u eo ft h es t r e a m e dg r e e nt e aw a st a k e nt os t u d yt h eo p t i m i z a t i o n e x t r a c t i n gp a r a m e t e ro fw a t e r - f a s tp r o t e i n sa n dt h em e t h o do fp r i m a r yp u r i f i c a t i o n t h ed i s t i n g u i s h e de f f e c t so ff i v ek i n d so fe n z y m et r e a t m e n tt h a td e c o n r p o s e d a l k a l i s o l u b l ep r o t e i ni nt h es t r e a m e dg r e e nt e aa n dt h er e s i d u eo fi tw e r ea n a l y z e d t h eo n eh a db e s te f f e c tw a sp i c k e do u t a l s ot h ee n z y m ew a st a k e nt os t u d yt h e o p t i m i z a t i o nf u n c t i o np a r a m e t e ro nt h es t r e a m e dg r e e nt e aa n dt h er e s i d u e ，a n dt h e n t h er o a s t e d g r e e n t e aa n ds c e n tt e a t h e c o m p o u n d i n go fp r o t e a s e a n d c e l l u a s e u m a m i z y m e ，a n dt a r m a s e u m a m i z y m e a f f e c t e dt h ea m i n oa c i d sa n d d i s s o c i a t i v ea m i n oa c i d so ft h es t r e a m e dg r e e nt e aa n dt h er e s i d u e t h ed i s t i n c t i o n b e t w e e nt h es t r e a m e dt e aa n dt h er e s i d u ew a sd i s c u s s e d t h ed e t a i l e dr e s u l t sw e r ea s f o l l o w s ： 1 t h eo p t i m i z a t i o np a r a m e t e ro fe x t r a c t i n ga l k a l i - s o l u b l ep r o t e i nw a so b t a i n e d t h r o u g hs i n g l ef a c t o ra n do r t h o g o n a lt e s t ：w h e nt h er a t i oo f t e at ow a t e rw a s1 ：4 0 e x t r a c t i n ga t9 04 cf o r2h o u ra tt h el y ec o n c e n t r a t i o no f0 0 9 m o l 1 t h ee x t r a c t i n g r a t i oo fa l k a l i p r o t e i nw e r e4 2 5 4 2 t h ee x t r a c t i n gr a t i oo fp r o l a m i nt ow h o l ep r o t e i no ft h er e s i d u ew a s3 5 2 ， w h e ne t h a n o lc o n c e n t r a t i o nw a s7 0 ，r a t i oo fr e s i d u et oe t h a n o lw a s1 ：3 0a tt h e f i r s te x t r a c t i n gt i m ew a s9 0m i n u t e ，a n de x t r a c t i n gf o u rt i m e sc o n t i n u o u s l y 3t h em e t h o do fs a l to u t - i s o e l e c t r i ct op u r i f ya l k a l i s o l u b l ep r o t e i nw a st h eb e s t w h e n ( n h 4 ) 2 s 0 4 w a sa tt h ec o n c e n t r a t i o no f6 0 ，p h4 ，5 ，t h er a t i oo fd e p o s i t i o n w a st o9 2 2 9 a n dt h ee f f e c to fe t h a n o ld e p o s i t i o nw a st h ew o r s t ；t h er a t i oo f d e p o s i t i o nw a so n l yt o2 8 6 4 w h e ni tw a sa tt h ec o n c e n t r a t i o no f7 0 4 t h ee n z y m a t i ce f f e c t so ff i v es p e c i e so fe n z y m et r e a t m e n t so nt h es t r e a m e dt e a a n dt h er e s i d u ew e r eg r e a t l yd i f f e r e n t s i n c ep a p a i n ，p r o t e a s em ，u m a m i z y m e ， n e w l a s ef 3 gd e c o m p o s e df o r1h o u ra tt h es a m ec o n c e n t r a t i o no fo 0 5 a n d n e u t r a lp r o t e i n a s ea tt h ec o n c e n t r a t i o no f0 2 t h er a t i oo fa m i n oa c i d s i nt h e e x t r a c t i n gl i q u i do ft e ai n c r e a s e db yo 5 0 ，2 7 4 ，3 6 2 ，o 4 5 a n d2 9 9 i n d i v i d u a l l y , a n dt h er e s i d u ei n c r e a s e db yo 8 7 ，2 2 4 ，3 5 5 ，o 8 5 a n d 1 7 2 i n d i v i d u a l l y 5 t h eo p t i m i z a t i o np a r a m e t e ro fa c t i o no f u m a m i z y m ew a so b t a i n e d ，t h a tw a sp h 5 4h o u r t h ec o n c e n t r a t i o no f0 0 7 t h er a t i oo fa m i n oa c i d si n c r e a s e db y v 1 一 浙江大学硕士学位论文 7 0 6 i ut h es t r e a m e dt e aa n d9 13 i nt h er e s i d u e 6t h ec o m b i n a t i o no fn e u t r a lp r o t e i n a s ea n du m a m i z y m ec o u l dd e c o m p o s et h e p r o t e i n so ft h es t r e a m e dt e aa n dt h er e s i d u ee f f e c t i v e l ya n di n c r e a s et h ea m i n o a c i d s a f t e rt h et r e a t m e n t ，t h er a t i oo fa m i n oa c i d st od r yw e i g h tw a st o130 4 i nt h es t r e a m e dt e a 7t h ee n z y m a t i ce f f e c to ft h ec o m p o u n d i n go f0 0 5 u m a m i z y m em a do 0 3 c e l l u a s et o g e t h e rt r e a t m e n to nt h es t r e a m e dg r e e nt e aw a sl i t t l eb e t t e rt h a no0 5 u m a m i z y m es i n g l et r e a t m e n t c o m p a r e dw i t l lt h es i n g l e o n e t h ec o m p o u n d i n c r e a s e d0 9 1 8t h ea m i n oa c i d si nt h er o a s t e dg r e e nt e aa n ds c e n tg r e e nt e ai n c r e a s e do b v i o u s l y u n d e rt h et r e a t m e n tt l l a ta tt h ec o n c e n t r a t i o no f0 0 5 u m a m i z y m ef o r4h o u ri n p h 5 5 t h eg r o s s e so fa m i n oa c i d sw e r es e p a r a t e l yt o6 9 1 ，7 7 6 w h i l et h e t e aa n dt h er e s i d u ew e r ei n t h et o g e t h e re f f e c to fo 0 5 u m a m i z y m ea n d t a n n a s e ，t h ei n c r e a s eo fa m i n oa c i d sd e c r e a s e di n s t e a d 9 c o m p a r e dw i t ht h r e ee n z y m et r e a t m e n t s u n d e r t h es i t u a t i o nt h a ta tt h e c o n c e n t r a t i o no fo 0 5 u m a m i z y m e ，西h5 5f o r4h o u r , t h eg r o s sa n d c o m p o n e n to fd i s s o c i a t i o na m i n oa c i d sw e r es u i t a b l ea n dp r a c t i c a l m e a n w h i l e t h eg r o s so fa s p a r t i ca c i d ，g l u t a m i ca c i d ，a r g i n i n e ，t h e a n i n ew a s3 7 5t i m e so ft h e c o n t r o l l e ds t r e a m e dg r e e nt e aa n d1 5 3 7t i m e so f t h ec o n t r o l l e dr e s i d u eo f i t a n d v a l i n e ，i s o l e u c i n e ，i l e u c i n e ，p h e n y l a l a n i n e ，l y s i n e ，t h r e o n i n et h a tw e r en e e d e d a m i n oa c i di n c r e a s e do b v i o u s l y t h e i rg r o s se x t r a c t i n gr a t i o so f d r yw e i g h to f t h e s t r e a m e d g r e e n t e aa n d t h er e s i d u e w e r e2 7 1 a n d1 6 5 k e yw o r d s ：g r e e nt e a ；w a t e r - f a s tp r o t e i n ；a m i n oa c i d ；e n z y m e 浙江大学硕士学位论文 图标索引 图2 1 提取时间对谷蛋白提取率的影响1 5 图2 - 2 提取温度对谷蛋白提取率的影响1 6 图2 3 碱液浓度对谷蛋白提取率的影响1 6 图2 4 固液比对谷蛋白提取率的影响1 7 图3 l 纤维素酶鲜味强化酶对蒸青茶中氨基酸含量的影响3 2 图3 - 2 酶处理对炒青及花茶中氨基酸总量的影响一3 2 图3 3 不同酶处理对茶渣中氨基酸总量的影响一3 3 图3 4 酶浓度对茶渣中氨基酸总量的影响3 4 图3 5 酶解时间对茶渣中氨基酸总量的影响3 4 图3 - 6p h 对茶渣中氨基酸总量的影响3 5 表2 - l 蒸青绿茶的主要理化成分1 2 表2 - 2 谷蛋白提取的正交试验因素与水平表头设计1 3 表2 - 3 正交实验结果17 表2 - 4 初提时间、提取液浓度、提取次数对醇溶蛋白提取量的影响一1 8 表2 - 5 等电点沉淀1 8 表2 - 6 硫酸盐沉淀1 9 表2 7 乙醇沉淀1 9 表3 1 炒青的主要理化成分2 1 表3 - 2 花茶的主要理化成分2 l 表3 - 3 鲜味强化酶正交实验因素与水平表头设计。2 3 表3 - 4 不同的酶处理对蒸青茶中氨基酸总量的影响2 5 表3 - 5 木瓜蛋白酶处理后茶中氨基酸总量的方差分析表2 5 表3 - 6 中性蛋白酶处理后茶中氨基酸总量的方差分析表一2 6 表3 7 蛋白酶m 处理后茶中氨基酸总量的方差分析表2 6 表3 - 8 鲜味强化酶处理后茶中氨基酸总量的方差分析表。2 6 表3 - 9 新脂肪酶f 3 g 处理后茶中氨基酸总量的方差分析表2 6 表3 一1 0 酶浓度对茶提取液中氨基酸增量的方差分析表2 7 表3 - 1 1 酶浓度对茶提取液中氨基酸增量的多重比较表2 7 表3 一1 2 酶解时间对茶提取液中氨基酸总量的影响( 对照组) 2 8 表3 一1 3 酶解时间对茶提取液中氨基酸总量的影响的方差分析表( 对照组) 2 8 表3 1 4 酶解时间对茶提取液中氨基酸总量的影响2 8 表3 - 1 5 酶解时间影响茶提取液中氨基酸总量的方差分析表2 8 表3 一1 6 酶解时问对茶提取液中氨基酸总量的影响的多重比较表2 9 表3 一1 7p h 影响茶提取液中氨基酸总量的方差分析表( 对照组) 2 9 4 4 浙江大学硕士学位论文 表3 1 8p h 对茶提取液中氨基酸总量的影响的方差分析表2 9 表3 1 9p h 对茶提取液中氨基酸总量的影响的多重比较表3 0 表3 2 0 蒸青茶鲜味强化酶的正交实验结果3 0 表3 - 2 1 酶组合对蒸青茶中氨基酸含量的影响3 l 表3 2 2 茶渣中鲜味强化酶的正交实验结果。3 5 表3 - 2 3 酶处理后蒸青茶中游离氨基酸组分分析3 6 表3 - 2 4 酶处理后蒸青茶渣中游离氨基酸组分分析3 7 4 5 浙江大学硕士学位论文 第1 章文献综述 1 1 茶叶蛋白的研究近况 到目前为止，茶叶中经分离、鉴定的已知化合物有7 0 0 多种，蛋白质是茶 叶的重要组成成分，占茶鲜叶干物质的2 0 3 0 。根据其溶解性可分为清蛋 白( 水溶性) ，盐溶蛋白，醇溶蛋白，谷蛋白( 碱溶蛋白) ，精蛋白，组蛋白。其 中水溶性蛋白质只占1 2 ，绝大部分是非水溶性蛋白质，其中干茶中碱溶 蛋白占茶叶总蛋白的8 0 左右，醇溶蛋白占总蛋白的1 3 6 。进入茶汤的主要 是水溶性蛋白，这部分蛋白只占蛋白总量的3 4 7 ( 茶叶化学，2 0 0 2 ) 。近年来， 国内外比较注重水溶性蛋白质的研究，而非水溶性蛋白质的研究鲜有涉及。茶 叶蛋白中的氨基酸组成丰富合理，必需氨基酸齐全，是一种很好的蛋白资源。 茶鲜叶在加工成绿茶的过程中，茶叶中的蛋白质发生了变性，蛋白质的构象发 生改变，有可能产生断链等现象。与鲜叶中的蛋白质有着显著的差别，有必要 对它进行研究。 1 1 1 蛋白的提取和纯化分离 植物中蛋白的提取方法大致有二种：一是水溶液提取法，稀盐和缓冲系统 的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大，是提取蛋白质最常用的溶剂。二是有 机溶剂提取法。一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和 酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机试剂 来提取。因这些有机溶剂具有一定的亲水性，还有较强的亲脂性，是理想的提 脂蛋白的提取液。但是会引起蛋白质的变性，所以必须在低温下操作。 植物蛋白质的分离纯化方法有很多，主要有：( 1 ) 根据蛋白质溶解度不同的 分离方法。a ：蛋白质的盐析；此法沉淀蛋白后，需要将蛋白质中的盐除去， 常用的办法是透析，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行，此外也可 用葡萄糖凝胶g 2 5 或g 5 0 过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。b ：等电 点沉淀法；蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小， 各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的p h 达到某一蛋白质的等电点 使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。c ：低温有机溶剂沉淀 法；此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行；其他沉淀法 ( 如选择性沉淀法，水溶性非离子聚合物沉淀法) 。( 2 ) 根据蛋白质理化性质的 浙江大学硕士学位论文 分离方法：色谱法。柱色谱法是蛋白质分离纯化过程中最有效的方法之一，他 在现代生化制备技术中占有核心位置。( 3 ) 根据蛋白质分子大小的分离方法：透 析和超滤，凝胶过滤法。“) 根据蛋白质带电性质的分离方法：电泳法。 国内研究者对植物蛋白的提取和纯化做了相当多的工作。杨丽娥、胡雪华、 安渊等以紫花苜蓿、苦荬菜为材料，研究了不同p h 条件下热提法和乳酸发酵 酸法对叶蛋白得率的影响。贺新强，宋葆华，倪陈凯，李法曾( 1 9 9 9 ) 用藜 ( c h e n o p o d i u m 口f 6 脚l ) 、中亚滨藜( a t r i p l e xc e n t r a l a s i t i c ai l j i n ) 、紫花苜蓿 ( m e d c a g os a t i v al ) 作为实验材料，分别用加热处理法、酸处理法、酸加热处 理法、碱处理法、碱加热处理法、絮化剂处理法和絮化剂加热处理法处理，比较 不同处理的提取效果，以探求提取叶蛋白的最佳方法。荣建华，许金东( 2 0 0 6 ) 以 小麦粉为原料，对小麦粉中醇溶蛋白的提取条件及一些理化性质进行了研究。 王洪新和胡昌云( 2 0 0 4 ) 以提取温度，提取时间，料液比，离子浓度，p h 作为单因素实验条件，并设计正交实验，得到优化的茶蛋白提取条件：用含 o 2 0 m o 1n a c l ，p h 3 0 的水溶液，料液比( w ，v ) 1 ：5 ，温度2 5 ，时间4 o h ，搅 拌( 6 0 r m i n ) 提取，提取率约为3 6 8 。随后，分别用加热沉淀法，等电点沉淀 法，盐析法纯化蛋白，实验结果表明：盐析法与等电点一盐析联用法的蛋白质析 出率均较高，分别达到9 4 和9 6 。而后者得到的蛋白沉淀呈易于脱除的绿色。 通过上述盐析一丙酮脱色超滤脱盐真空干燥的初步纯化，可得到浅灰白色的茶 蛋白粉。以原料计茶蛋白的提取率为3 6 8 ，初步纯化得率为9 l 。产品为浅 狄白色，经测定含蛋白质8 1 5 。 张晓晖等( 2 0 0 5 ) 采用碱液法提取茶叶蛋白方法，得到最佳提取工艺为固液 比l ：4 0 、提取温度9 0 、提取时间3 0 m i n 、碱液浓度为o 0 7 m o l 1 ，茶叶蛋白 提取率为6 1 1 。通过常用的乙醇沉淀法，硫酸铵沉淀法，丙酮沉淀法以及调 节p h 沉淀法四种化学方法分离茶叶蛋白并进行比较，以p h 沉淀法沉淀茶叶蛋 白为最佳的沉淀方法，在p h 4 5 时沉淀效果为最好。其粗蛋白浓度为5 4 5 。 1 1 2 蛋白的定量方法 其方法主要有：( 1 ) a 2 8 0 光吸收法，这一方法可用来快速检测溶液中是否 含有蛋白质成分。通常用于柱层析过程中检测蛋白质的洗脱峰。( 2 ) b r a d f o r d 检测法( 考马斯亮蓝法) ，是一种快速可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质的方 法。是目前应用最广泛的微量蛋白定量方法，其原理是根据染料考马斯亮蓝 ( c o o m a s s i e b r i l l i a n t b l u e ，c b b ) 与蛋白分子结合形成特异的吸收峰，并在一定的 蛋白浓度范围内，吸收峰值的大小与蛋白含量成正比来定量溶液中的蛋白质该 方法灵敏度高，分析快速。但是c b b 与蛋白结合形成的蓝色复合物，随反应时 浙江大学硕士学位论文 间延长，易发生沉淀反应。进一步研究证实，单宁能与蛋白质发生沉淀反应。 同时单宁还能与c b b 发生明显的颜色反应和沉淀反应，并且随单宁分子量增加 反应更剧烈。茶叶中次生代谢产物茶多酚和咖啡因含量较高，若直接将茶汤与 c b b 试液混合会出现沉淀而影响蛋白含量分析。陆建良、梁月荣、张凌云对考 马斯亮蓝染色测定茶汤蛋白含量的方法进行了改良，在蛋白染色前增加三氯乙 酸( t c 舢沉淀蛋白步骤，在染色后增加背景脱色、c b b 蛋白复合物转溶和重新 显色步骤；同时以牛血清白蛋e t ( b o v i n es e r t l l na l b u m i n ，b a s ) 为标准蛋白，对 影响分析效果的重要参数进行了研究结果表明，b s a c b b 复合物与茶汤可溶 性蛋白一c b b 复合物具有相似的紫外可见吸收图谱，分别在2 0 5 u r n 、2 6 0 r t m 、 3 0 5 n m 和5 9 0 n m 处出现了4 个吸收峰：在茶汤用量2 5 5 o r a l 、4 0 染色 3 0 m i n 、转溶液体用量1 4 4 m l 试验条件下，可获得良好的分析效果。应用本方 法，炒青绿茶和红碎茶茶汤( 茶水比为1 5 9 2 5 0 m 1 ) 可溶性蛋白含量分别为 1 9 3 7 g m l 和1 8 4 5 g m l ，分析结果的变异系数分别为0 5 4 和1 0 5 ( 陆建 良，梁月荣，张凌云2 0 0 2 ) ( 3 ) l o w r y 检测法( f o l i n - 酚试剂法) ，也是一种可靠 的蛋白质定量方法。灵敏度在5 “虮n j 1 0 0 肛g m l 。二喹啉甲酸( b c a ) 检测法， 它是近年新研制的一种改进的l o w r y 测定法，反应简单而且几乎没有干扰物质 的影响。但是反应时间长，蛋白质发生不可逆的变性。灵敏度在0 5 删 l o i _ t g r n t 。斑点滤膜结合法。是一种初步测定蛋白质含量的快速方法。 在本实验中采用的是考马斯亮兰法测定蛋白含量。因为用于测定蛋白质含 量的材料是茶渣提取液。在茶渣的制备过程中，茶多酚和咖啡因等干扰物质皆 己提取出去，在茶渣中的含量所剩无几。用此法比较准确，灵敏。 1 1 3 茶叶蛋白的定性方法 双向电泳是分析和鉴定生物体蛋白的常用手段，自o f a r r e l l 提取该技术方 案以来，针对应用中常见的问题，前人进行不断改进，使蛋白质双向电泳分辨 率和稳定性有了极大提高。由于植物组织中含有很多干扰因素，双向电泳往往 得不到满意的结果。经研究者们不断的探索试验，所得到的改良方法已能分别 适用于荔枝胚胎、水稻、小麦、玉米，摩擦禾等植物材料。而对于色素和酚含 量较高的植物，尚未研究出有效的蛋白质双向电泳技术。茶叶中的多酚类含量 高，约占干物质的1 8 3 6 ，在研磨过程中，酚类物质氧化生产的物质严重 干扰电泳技术。林金科( 2 0 0 3 ) 等研究了茶树蛋白质提取及双向电泳的改良方法， 在样品制备、电泳及染色等方面进行了技术改进，解决了茶树茶牙中富含色素、 多酚类化合物及其氧化产物等对双向电泳严重干扰的问题，探索出一种获得重 复性好，清晰度高的蛋白质双向电泳图谱技术；电泳图在1 4 o 6 7 0 之间；等 浙江大学硕士学位论文 电点约在4 9 ，5 范围内，主要分布在4 6 5 。 1 1 4 茶叶蛋白的生理功能 据一些零星研究报道，茶叶蛋白和茶多酚一样具有一定的保健功能。李燕 和肖作乎( 2 0 0 6 ) 等用小鼠进行了茶叶蛋白预防辐射研究并发现茶叶蛋白具有清 除超氧阴离子功能，可抵抗电离辐射所引起的致突变效应。活泼和黄光荣( 2 0 0 5 ) 等采用碱液法提取茶叶粗蛋白对大鼠进行了茶叶蛋白降血脂功能的研究，结果 表明，非水溶性茶叶蛋白能明显降低高血脂症大鼠血清t c ，t g 和l d l c 的 水平，对h d l c 有一定的升高作用；通过对动脉粥样硬化指数a i 和冠心指 数r - c h r 的研究，发现非水溶性茶叶蛋白可显著降低动脉粥样硬化指数a j 和 冠心指数r - c h r 。日本九州大学研究生院立花宏文副教授于2 0 0 4 年3 月中旬 发现了绿茶e g c g 发挥抗癌作用的中介蛋白质，试验过程中，研究人员发现在 人的肺癌细胞中单独注入e g c g 没有抑止癌细胞增殖的效果；而利用生物技术 让癌细胞合成6 7 u t 之后，再给癌细胞注入e g c f ，发现癌细胞的增殖率减少 4 0 。因此研究人员认为，6 7 l r 是使e g c g 发挥抗癌作用的中介物质。立花 宏文认为如果将来对于6 7 l r 与儿茶酸的关系研究取得更大进展，就可以应用 这成果开发抗癌新药。 1 2 外源酶在茶提取液中的应用研究 伴随茶叶深加工的不断发展和酶制剂领域的拓展，外源酶应用于茶叶深加 工上的技术正在不断改进，有望突破内源酶在茶叶品质控制上的瓶颈。现在应 用较多的酶主要是单宁酶，多酚氧化酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、淀粉酶 ( 肖文军等，2 0 0 3 ) 。而在食品饮料工业中应用最多的蛋白酶是植物蛋白酶中的 木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶。它们的优点是：获取相对容易，价格也相对便宜。 在茶饮料工业中的浑浊物质主要由蛋白质和多酚类化合物构成，通过添加 一定量的木瓜蛋白酶分解蛋白质，在一定程度上减少了蛋白质与多酚类形成络 合物的机会，增加了茶汤中氨基酸含量，有利于茶饮料鲜爽滋味的形成。谭淑 宣( 1 9 9 1 ) 等研究报道，加入0 8 蛋白酶液的红碎茶、绿茶提取液中氨基酸 含量增多，氨基酸提取率分别比对照高1 9 6 8 和7 2 8 ，而且随蛋白酶浓度 增大，氨基酸含量也呈增加趋势。郑宝东等的研究结果表明经木瓜蛋白酶处理 后，茶汁的可溶性蛋白质被分解，氨基态氮含量增加了1 3 3 9 ，品尝茶汁 时，有明显的鲜味感，改善了茶汁的风味。 学者们还研究了蛋白酶与其它酶的组合应用技术。c h o k ok a w a b a t a 等 浙江大学硕士学位论文 ( 2 0 0 4 ) 用蛋白酶和单宁酶一起处理绿茶浸提液，得到的茶汤中不仅氨基酸含 量和鲜爽味有所提高，而且香气也得到了提高。据郑宝东等研究，用果胶酶与 木瓜蛋白酶混合处理效果比单一酶处理好，不仅茶浸提液的粘度降低，氨基态 氮含量增加，而且茶汁膜过滤通量比未经酶处理的茶汁要提高2 1 4 0 ；而 单一木瓜蛋白酶仅为9 1 0 。x uh a i r o n g 等( 2 0 0 4 ) 研究指出：木瓜蛋白 酶可以水解鲜茶汁中的可溶性蛋白，释放游离氨基酸，改善和提高了鲜茶汁的 香气和滋味；而且单宁酶+ 木瓜蛋白酶+ 果胶酶混合使用，还可以阻止茶乳产生， 稳定茶汁，改善鲜茶汁的品质。 蛋白酶在茶饮料中应用也存在一定的问题。由于蛋白酶本身也是一种蛋白 质，容易与茶多酚类物质发生络合及沉淀作用。在实际应用中，若处理不当易 促进沉淀的产生，影响酶的活性。据高碧穗研究，用木瓜蛋白酶处理乌龙茶汤， 茶汤比离心处理更加混浊。谭淑宜等的研究结果显示，当蛋白酶液浓度超过一 定量时，虽然氨基酸含量继续增加，但茶多酚及水浸出物提取率却下降了。黄 惠华等研究了茶多酚对菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶、木瓜蛋白酶、大豆分 离蛋白、酪蛋白等蛋白质的络合、沉淀及回收，发现茶多酚与这些蛋白质均表 现出混活性。不同蛋白质的起混作用也存在较大差别，多酚类与蛋白质的结合 能力也是千差万别的，这主要体现在不同多酚类对于不同蛋白质的亲和力差异 上。a s q u i t h 认为多酚类亲和性高的蛋白质的特征为：分子量较大，结构开放 松散，脯氨酸或其它疏水性氨基酸含量较高。a s o n o 等也指出，含有脯氨酸残 基的蛋白质在与多酚类化合物络合时容易产生浑浊。如木瓜蛋白酶含有大约5 的脯氨酸，因此这种酶具有较强的起混活性( 孙素，须海荣，2 0 0 5 ) 。 1 3 茶叶氨基酸检测方法的研究近况 茶叶中的氨基酸丰富合理，其中必须氨基酸就含有1 6 种。氨基酸是构成茶 叶滋味的重要组成部分。其含量的多少，成分的组合直接影响茶汤的品质。这 就需要准确快速的氨基酸的检测技术。近几年，许多学者致力于此项技术，对 氨基酸的测定方法进行了改进，得到一系列适合茶叶氨基酸的检测法。 1 3 1 氨基酸总量的测定方法： 氨基酸总量的经典方法有酮量法和茚三酮比色法。通常，我们采用茚三酮 比色法，实验中发现，此法得到的数据重复性不高。夏静和罗守进( 1 9 9 7 ) 通过 对影响氨基酸测定的提取参数( 茶叶粉碎细度，浸提温度，浸提时间) 进行正 交试验，改进了氨基酸的提取方法。该方法提高了结果的稳定性，重复性，同 5 浙江大学硕士学位论文 时比原来的提取方法节省时间，其最佳浸提方案为：4 0 目( 0 4 5 r a m ) 粉碎细度、 1 0 09 c 水、3 0 m i n 浸提。与此同时，他们对游离氨基酸组分做了测定，发现此法 也适用于测定氨基酸组分。 1 3 2 氨基酸组分的分析方法 氨基酸组分分析方法有很多，就茶氨酸而言，已出现碱式碳酸铜沉淀法、 强酸性阳离子交换树脂层析、柱上层析、薄层扫描、紫外光吸收光谱法、凝胶 电泳和质谱，毛细管电泳等纸层析法。总的来说，目前最常用的分析氨基酸组 分的方法有以下三种： 1 3 2 1 氨基酸自动分析仪法 氨基酸自动分析仪的测定分析程序可分为两种，首先是采用测定茶氨酸的 专用测定程序，这一测定方法最为常用。其优点是：所用的n a + ，盐洗脱缓冲 液价格便宜，而且国内有售，其分析结果可以满足一般工作，缺点一是不能一 次性分离茶氨酸和其他1 8 种氨基酸，需采用二次分离( 郭升平，1 9 9 6 ) 。二是不能 分离检测出包括谷氨酰胺，天门冬酰胺在内的酰胺类物质。其次是生理体液法。 根据夏静，李布青( 1 9 9 0 ) 的实验报道，采用生理体液改进程序，在氨基酸自动 分析仪上测定茶叶中游离氨基酸，不仅分离检测出2 8 种氨基酸，而且很好的分 离了茶氨酸和谷氨酰胺。但是，此法试剂昂贵，检测过程中手续较繁锁，适用 于有特殊需要的科研课题。关于生理体液法，至今只此一篇，尚无其它相关研 究。 目前，在中国市场上销售的氨基酸分析仪主要是日本的日立公司和英国的 安玛西亚公司生产的产品。王宝碹和张金龙( 2 0 0 5 ) 等人使用日立公司生产的氨 基酸分析仪8 8 0 0 和英国安玛西亚公司生产的3 1 系列氨基酸分析仪这两种仪器 对同一种样品在不同的实验室进行氨基酸分析对比，得到的数据运用t 检验， 结果表明两种仪器测的值不存在显著性差异。因氨基酸自动分析仪法不必采用 氨基酸衍生的方法，而是直接用离子交换柱对其分离，从而避免了由于衍生所 造成的测定误差，所以能较好地分析茶叶中氨基酸组成。 总的来说，氨基酸自动分析仪法结果准确，快速，但是仪器比较昂贵，分 离时间长、试剂消耗较大。 1 3 2 2 高效液相色谱法( 肿l c ) 此法的基本原理是利用预柱衍生试剂将氨基酸衍生为具有荧光性的衍生 物，再通过检测器来测定氨基酸。该技术的关键是选择有效的衍生试剂。由于 不同氨基酸的结构和化学性质有较大的差异，因此要定量制备适于荧光分析的 所有氨基酸衍生物有一定困难。7 0 年代末8 0 年代初期较为普遍使用的衍生试 岳 浙江大学硕士学位论文 剂为丹黄酰氯( d n s c l ) 和邻苯二甲醛( o p a ) ( ：f t 林，张峻松等，2 0 0 1 ) ，这 2 种方法均有不同的优缺点。d n s c l 对胱氨酸及含胱氨酸的短肽检测较好， 缺点是衍生化的时间长，操作过程中应注意衍生产物严密避光，以消除紫外线 的干扰( 杜文力，孟冲，史志军，2 0 0 4 ) ；当某一氨基酸的浓度较低时，不能有 效进行衍生反应，从而使一些氨基酸的检测结果严重失真。而o p a 作为衍生试 剂时，虽然衍生反应非常快速，但有较强的选择性，只能用于一级氨基酸的衍 生，且衍生物的稳定性较差。1 9 8 3 年，s e i n a r s s o n l 引入了氯甲酸芴甲脂 ( f m o c ) 预柱衍生试剂，此衍生剂的最大优点是一级和二级氨基酸均可有效 地被衍生，衍生物有很强地萤光性和稳定性( 在室温下能存放1 3 天不被分解) ， 同时在缓冲液衍生时间不到l m i n ，过量的衍生试剂可用乙醚或戊烷去除，对测 定无干扰。此法的缺点是：操作略繁，需用戊烷提取f m o c a a ，以避免自发 性水解。 随着氨基酸专用衍生剂和专用分析柱的发展，h p l c 测定法发展较快。其 中a c c q t a g 方法是w a t e r s 公司1 9 9 4 年专为柱前衍生h p l c 分析氨基酸而开发 的创新方法，是目前最优秀的衍生剂。因其具有衍生步骤简单、操作方便、生 成的衍生物稳定等特点，得到广泛应用。该法适应于氨基酸注射液、口服液及 各种水解氨基酸样品的分析。朱旗，施兆鹏等人首次把此法应用于茶叶氨基酸 的测定。从其测定的图谱看，该方法能够较好地分离茶叶氨基酸组分，色谱图 形较好。但该方法有两个方面不同于氨基酸自动分析仪的分析结果。一是氨基 酸出峰顺序。氨基酸自动分析仪分析茶叶氨基酸的出峰顺序为：天苏一丝一谷一 脯一甘丙半胱缬蛋异亮亮酪苯丙赖氨组一精，而由a c c q t a g 法分析氨基 酸的出峰顺序为：天丝谷甘组精苏丙脯茶胱酪一缬一蛋一赖异亮一亮苯丙； 二是氨基酸组分的含量有所不同，在a c e q t a g 方法的检测中，含量较高的五 种氨基酸为：茶蛋一谷天丝，而氨基酸自动分析仪的检测结果为：茶一谷一天一 精一丝。这种现象出现的具体原因还有待今后研究。 陈悦娇等研究了邻苯二甲醛( o p a ) 衍生荧光光度计测定游离氨基酸量的检 测方法，o p a 在p 巯基乙醇( p m c e ) 存在下与第一级氨基酸迅速反应生成1 硫 代2 烷基异吲哚，此生成物具有荧光，从而利用荧光光度法测定游离氨基酸含 量。实验工艺条件简单，容易控制，灵敏度高。其结果表明其相对荧光强度与 浓度有较显著的线性关系，同时也有较好的精密度和准确性。o p a 衍生法存在 一定的缺点：不能与带有仲胺基团的脯氨酸或羟脯氨酸反应，必要时需配合其 它技术( 如与f m o c 等衍生剂连用) 。此后，朱松，王洪新研究了o p a 柱前自动 衍生紫外检测茶氨酸的h p l c 法。条件为：h y p e r s i lo d sc 1 8 柱，洗脱液为醋 酸钠和甲醇混合液，梯度洗脱，检测波长3 3 8 n m ，茶氨酸在o 0 5 1 0 0 m g m l 范 围内浓度与峰面积线性相关系数达到o 9 9 9 8 ，平均回收率为9 8 5 。该法处理简 7 浙江大学硕士学位论文 单、快速、定量准确和重复性好，对操作无特殊要求。 随着检测器的发展和研究技术的进步，纷纷有研究者建立了不经衍生的 h p l c 测定茶氨酸的方法。 2 0 0 5 年，李银花，刘仲华等建立未衍生化高效液相色谱蒸发光散射检测器 ( e l s d ) 测定茶叶中茶氨酸的方法。e l s d 作为通用型检测器克服了h p l c 常 碰到的问题，消除了溶