（微生物学专业论文）维生素b12高产菌的选育及其发酵工艺的研究.pdf

维生素b 1 2 高产菌的选育及其发酵工艺的研究 摘要 维生素b 1 2 作为动物和人体的一种必需维生素，广泛地用于治疗恶性贫血， 配制维生素复合制剂，动物饲料和食品的添加剂等方面。其应用前景广阔，需 求量巨大，虽然近年来全球产量有较大的提高，但仍供不应求。国内只有少数的 厂家生产且多为引进国外生产技术，但与国外先进水平相比仍有较大差距。因此 展开维生素b 1 2 高产菌株的选育和发酵工艺的研究，提高国内生产技术就显得非 常重要。 通过分离纯化，获得一株维生素b 1 2 产量为1 5 2 m e t e 的谢氏丙酸杆菌 ( p r o p i o n i b a c t e r i u ms h e r m a n i i ) ，命名为只s h e r m a n i i 一1 7 。利用亚硝基胍( n t g ) 、 紫外线( u v ) 和两者的复合诱变技术，结合丙酸和乙硫氨酸抗性筛选，选育出 一株维生素b 1 2 产量为2 4 2 m g l 的谢氏丙酸杆菌，命名为只s h e r m a n i i - n u 3 1 。 比出发菌株维生索b 1 2 产量提高4 9 。 利用单次单因子法确定了培养基成分种类、浓度和培养条件，在此基础上 再利用p l a c k e t t - b u r m a n 设计法、响应面法等统计方法进行进一步优化。在最优 发酵条件下，只s h e r m a n i i n u 3 1 静止发酵的维生素b 1 2 最高产量为3 0 3 m g l ， 比原始发酵条件下的维生素b 。2 产量提高2 5 。最优发酵培养基( 每1 l 自来水 中) 及其培养条件：葡萄糖4 4 9 ，玉米浆1 3 3 9 ，k h z p 0 4l g ，( n h 4 ) 2 h p 0 42 9 ， f e s 0 4 7 h 2 06 r a g ，c o c l 2 6 h 2 04 0 m g ，p h6 5 ，种龄4 8 h ，接种量2 0 ，装液量 3 0i n u l 0 0 m l ，于恒温培养箱3 0o c 静止培养4 天。 由于在谢氏丙酸杆菌发酵生产维生素b t 2 的过程中会产生丙酸，而高浓度的 丙酸又会在发酵后期抑制丙酸杆菌的生长从而抑制维生素b 1 2 的合成。根据真养 产碱菌能够利用丙酸的特性，为此研究了ps h e r m a n i i n u 一3 1 与真养产碱菌 ( r a b t o n i ae u t r o p h a ) 的混合培养生产维生素b 1 2 的发酵技术。得到一个摇瓶混 合培养的工艺条件：在3 0o c 恒温摇床上，装液量2 0m i _ l o o m l , 2 4 0 r p m 培养 冠e u t r o p h a2 4 小时，将3 m l r e u t r o p h a 培养基接入装液量3 0m l l o o m l ，3 0o c 静止培养2 8 小时的只s h e r m a n i i - n u 一3 1 发酵培养基中，将发酵培养基置于3 0o c 恒温摇床上，1 2 0 r p m 共同培养6 8 小时，最高维生素b 1 2 产量为4 9 1m g l 。比 相同混合培养条件下的只s h e r m a n i i n u 3 1 单独发酵的维生素b 1 2 产量提高2 5 。 由于混合培养需要维持一个低氧环境，但这是摇瓶混合培养工艺条件中的单 2 0 0 6 届中山大学硕士学位论文陈兆佳 一转速难以维持的，因此以摇瓶混合培养的工艺条件为基础，分别在混合培养的 2 8 小时、3 5 小时和5 7 小时将搅拌速度调到2 5 0 r p m 、3 0 0 r p m 和3 5 0 r p m ，以维持 低氧浓度。培养8 0 小时后最高维生素b 1 2 产量为6 4 9m g l ，比相同培养条件下 的只s h e r m a n i i n u 一3 1 纯种发酵的维生素b 1 2 产量提高4 3 。 关键词：维生素b 1 2 ，谢氏丙酸杆菌，p l a c k e t t b u r m a n 设计法，响应面法 真氧产碱菌，混合培养。 i i 维生素b ，2 高产菌的选育及其发酵工艺的研究 v i t a m i nb 1 2i sak i n do fe s s e n t i a lv i t a m i nf o ra n i m a l sa n dh u m a n i ti sw i d e l y u s e dt oc u r ep e r n i c i o u sa n e m i a ，m a k eu pm u l t i - v i t a m i np r e p a r a t i o n ，p r o d u c ea n i m a l f e e da n df o o da sa d d i t i v e i th a sav a s ta p p l i c a t i o np e r s p e c t i v e sa n di t sr e q u i r e m e n ti s h u g e t h o u g ht h eg l o b a lp r o d u c t i o no fv i t a m i nb 1 2i n c r e a s e dr a p i d l yi nr e c e n ty e a r s ， i t sd e m a n de x c e e d ss u p p l y a tp r e s e n to n l yaf e wd e m e s t i cc o r p o r a t i o n sp r o d u c e v i t a m i nb 1 2 b u tt h e i rp r o d u c t i o nt e c h n o l o g e sa r em a i n l yi n t r o d u c e df r o mf o r e i g n c o u n t r i e sa n da r ei n f e r i o rt ot h em o s ta d v a n c e dt e c h n o l o g yi nt h ew o r l d s oi ti s i m p o r t a n tt os e l e c ta n db r e e das t r a i nw h i c hh a sah i g hv i t a m i nb 1 2p r o d u c t i o na n d o b t a i na ne f f e c t i v ef e r m e n t a t i o nt e c h n o l o g y a f t e rt h eo r i g i n a lp r o p i o n i b a c t e r i u ms h e r m a n i iw a ss e p a r a t e d , as t r a i nw a s o b t a i n e dw h o s et h ep r o d u c t i v i t yo fv i t a m i nb 1 2 w a s1 5 2m g l , c a l l e dps h e r m a n i i - 1 7 am u t a n tw i t hh i g h e rv i t a m i nb x zp r o d u c t i o nc o u l db eo b t a i n e db yu s i n gn t g 、 i r r a d i a t i o no fu va n db o t ho ft h e ma sm u t a g e n sa n dp r o p i o n a t e 、e t h i o n i n ea s m e t a b o l i ci n h i b i t i o n ，c a l l e d 只s h e r m a n i i n u 一3 1 i t sp r o d u c t i v i 哆o fv i t a m i nb 1 2w a s 2 4 2m g 1 4 9 h i g h e rp r o d u c t i v i t yt h a nt h eo r i g i n a lo n e t h ec o m p o s i t i o na n dt h ec o n c e n t r a t i o no fm e d i u ma n dt h ec u l t u r ec o n d i t i o n s w e r e o p t i m i z e db yu s i n go n ef a c t o r - a t a t i m e m e t h o d b a s e do nt h e s e d a t a ， p l a c k e t t - b u r m a nd e s i g na n df a c t o r i a lc e n t r a lc o m p o s i t ed e s i g nw e r ef u r t h e ru s e dt o o p t i m i z et h em e d i u m i nt h eo p t i m i z e df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ，rs h e r m a n i i n u 一3 1 s h i 曲e s tp r o d u c t i v i t yo fv i t a m i nb 1 2w a s 3 0 3m g 仉w h i c hw a s2 5 h i g h e r p r o d u c t i v i t yt h a nt h a ti nt h eo r i g l n a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s f i n a l l y , ao p t i m i z e d m e d i u ma n dc u l t u r ec o n d i t o n sw e r ea sf o l l o w s ( i n1 lr u n n i n gw a t e r ) ：g l u c o s e4 4 9 ， c o r n - s t e e pl i q u o r1 3 3 9 ，k h 2 p 0 4l g ，( n h 4 ) 2 h p 0 42 9 ，f e s 0 4 。7 h 2 06 r a g , c o c l 2 6 h 2 04 0 m g ，i n i t i a lp h6 5 ，i n o c u l u ma g e4 8 h ，i n o c u l u m2 0 ，i n c u b a t e d s t a t i c a l l yi na1 0 0 m le r l e n m e y e rf l a s kc o n t a i n i n g3 0m l m e d i u mf o r4 d a y sa t3 0o c p r o p i o n b a c t e r i ap r o d u c ev i t a m i nb 1 2i n t r a c e l l u l a r l ya n de x c r e t em a i n l yp r o p i o n i c a c i de x t r a c e l l u l a r l yi nt h e p r o c e s so ff e r m e n t a t i o n t h e1 1 i g hc o n c e n t r a t i o no f p r o p i o n i ca c i dc o u l di n h i b i tt h ec e l lg r o w t ho fp r o p i o n b a c t e r i a ，a n dt h u s ，i n h i b i tt h e 1 1 1 2 0 0 6 届中山大学硕士学位论文陈兆佳 p r o d u c t i v i t yo fv i t a m i nb 1 2 b e c a u s et h er a l s t o n i ae u t r o p h a c a l la s s i m i l a t e st h e p r o p i o n i ca c i d ，s ot h em i x e dc u l t u r eo fr a l s t o n i ae u t r o p h aa n d 只s h e r m a n i i - n u - 3 1 h a db e e nr e s e a r c h e d t h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n so fm i x e dc u l t u r ei nt h ee r l e n m e y e r f l a s kw a s ：兄e u t r o p h aw a sp r e c u l t u r e di na1 0 0 m l e r l e n m e y e rf l a s kc o n t a i n i n g2 0 m l m e d i u mf o r2 4h o u ra t3 0o cb y2 4 0 r p m t h e np u t3m l r e u t r o p h ac u l t u r em e d i u m i n t ot h eps h e r m a n i i n u - 3 1f e r m e n t a t o nm e d i u mi nw h i c h 只s h e r m a n i i n u - 3 1w a s c u l t u r e ds t a t i c a l l yi nal o o m l e r l e n m e y e rf l a s kc o n t a i n i n g3 0 r a lm e d i u m f o r2 8h o u r a t3 0o c t h e nt h em i x e df e r m e n t a t i o nm e d i u mw a sc u l t u r e df o r6 8h o u ra t3 0 0 cb y 1 2 0 r p m ，t h eh i g h e s tp r o d u c t i o no fv i t a m i ns 1 2w a s 4 9 1m 如w h i c hw a s2 5 h i g h e r p r o d u c t i v i t yt h a np u r er s h e r m a n i i - n u - - 3 1f e r m e n t a t i o nu n d e rt h es a m ec o n d i t i o n so f m i x e dc u l t u r e b e c a u s em i x e dc u l t u r en e e d st om a i n t a i nal o wc o n c e n t r a t i o no fo x y g e n , i ti s h a r dt om a i n t a i nt h a ti ne r l e n m e y e rf l a s kb yas i n g l er o t a t i o n s ob a s e do nt h e c o n d i t i o n so fm i x e dc u l t u r ei ne r l e n m e y e rf l a s k , a d j u s t i n gs t i r r i n gs p e e dt o2 5 0 r p m 、 3 0 0 r p ma n d3 5 0 r p ma t2 8h o u r 、3 5 h o u ra n d5 7 h o u r , t h eh i g h e s tp r o d u c t i o no f v i t a m i n b 1 2o f6 4 9m g lw a so b t a i n e da f t e r8 0h o u r sf e r m e n t a t i o n ，w h i c hw a s4 3 h i g h e r p r o d u c t i v i t yt h a np u r e rs h e r m a n i i - n u - 3 1f e r m e n t a t i o nu n d e rt h es a m ec o n d i t i o n s o fm i x e dc u l t u r e k e y w o r d s ：v i t a m i nb 1 2 ，p r o p i o n i b a c t e r i u m f a c t o r i a lc e n t r a lc o m p o s i t ed e s i g n ， i v s h e r m a n i i , p l a c k e t t b u r m a nd e s i g n ， r a l s t o n i ae u t r o p h a ，m i x e dc u l t u r e 第1 章前言 1 1 维生素b 1 2 的结构特征 1 9 5 6 年h o d g l d n 及其小组通过对维生素b 1 2 结晶物大量数据和图表的研究， 并用x 射线技术确定了其空间结构1 1 1 。维生素b 1 2 的空间结构【2 】如图1 - 1 ，维生素 b 1 2 分子式为c h 9 0 c o n l 4 0 1 4 p ，是以钴原子为中心离子的鳌合形化合物。主要由 可啉环和核苷基两部分组成，其中核苷基包括5 ，6 一二甲基苯并咪唑、核糖部分 和磷酸部分。可啉环由四个吡咯环结合而成，中心的二价钴原子的其中一个键和 5 ，6 二甲基苯并咪唑的n 相连接，其余三个键具有配价性质。 自然界中的维生素b - 2 有四种结构类似物 3 1 ，主要是其分子中与钴离子连接 的基团( x 基团) 不同，分别为一o h 、c h 3 、- n 0 2 和h 2 0 ，但它们具有相同的 生理活性。自然界合成维生素b 1 2 的终产物是5 一脱氢腺苷酸钴胺素和甲基钴胺素。 工业生产的维生素b 1 2 叫做氰钴胺素：c y a n o c o b a l a m i n ( c n c b l ) ，它是在提取细菌 体内的维生素b 1 2 过程中，由提取物的氰基取代x 基团而得到的性状稳定的维生 素b 】2 。 图卜1 维生素b 1 2 的空间结构 f i g 1 1s p a c es t r l i c t u r eo fv i t a m i nb 1 2 2 0 0 6 届中山大学硕士学位论文陈兆佳 1 2 维生素b 1 2 的理化性质 维生素b ，2 又称钻胺素，是b 族维生素之一，为深红色针状结晶或结晶粉 末，无一定熔点，在3 0 0 至3 2 0 分解；无臭无味，溶于水、乙醇和丙酮，不溶 于氯仿和乙醚。其水溶液为中性，具左旋光性，在波长2 7 8 、3 6 1 和5 4 8 处有最 大吸收。维生素b 1 2 的结构性质相当稳定，在弱酸性溶液和中性溶液中耐热，p h 值3 以下和9 以上则易分解，目光、氧化剂和还原剂均能破坏维生素b 1 2 的活性 【4 】。 1 3 维生素b 1 2 的生物学功能 维生素b 1 2 参与细菌中重要的生物代谢途径1 6 1 。人和动物的肠道细菌中也存 在着依赖维生素b 1 2 的发酵过程，除了大肠杆菌，几乎所有的肠道细菌在厌氧条 件下，其丙二醇、乙醇胺和甘油的代谢过程都需要腺苷酸钴胺素作为辅酶。图 1 2 描述了细菌中依赖脱氢腺苷酸钴胺素的生物反应，及其能量产生、碳代谢和 还原型等价物再生所需要的步骤吼 塑涎亚翊 r 。掣f i 翻 l 如 e f 0 1 m l 赫 m q l d 幽p 阳喇蝌- o 蚺 i m ， d 舡蝌i - 嗡 图1 2 细菌中依赖脱氢腺苷酸钴胺素的生物反应示意图 f i g 1 2a d e n o s y l c o b a l a m i n - d e p e n d e n tr e a c t i o n sk n o w n i nb a c t e r i a ： 譬 零 第1 章前言 维生素b 1 2 是一种人体和动物必需的维生素，作为辅酶参与体内许多生化代 谢反应1 8 1 。人体正常每天从食物中摄入大概4 m g 维生素b 。2 ，但是每天只能吸收 其中约舡g 。动物和人体内有两种酶需要维生素b - 2 作为辅酶，它们分别是甲基 丙二酰辅酶a 变位酶和甲硫氨酸合成酶，其相关代谢过程【7 】如图1 - 3 所示。 t i o 咖c m i t l 扛n v 耻 d s t m b e # h d 隧匦黧潮一 t n k h o m k a 嘲 + 虹0 - r 豳夔避幽 l * 一每幕a c b l “o 。 k o 一w _ + i 岫h”_ 、 “ o 卧“啵唑时”3 s - c 蛆 懈m 目“刚“s y m h t - mh m m i * h 。m i w “0 、矿”。焉嚣一- 坳矿。：黼鬈需 t ，。、一， b n h t w 八人w b 下氓s 八又m 7 弋一，旷、人m l 型塑刭t h fn 弗睇b n 幽” l “姆一 图1 - 3 人体中依赖于维生素b 1 2 的生物反应 f i g 1 3c o b a l a m i n - d c p c n d e n tr e a c t i o n si nh u m a n s 1 4 维生素b 1 2 的应用 最初，人们发现食用动物肝脏对恶性贫血有治疗的作用。二十世纪四十年 代，两家大型制药公司的研究小组：一个由美国m e r k 公司的f o l k e r s 领导，另 3 2 0 0 6 届中山大学硕士学位论文陈兆佳 一个由英国g l a x o 公司的s m i t h 领导。这两个小组几乎同时从肝脏中分离得到一 种红色晶体复合物，它能抗恶性贫血并被命名为维生素b 1 2 【8 】。接着，在牛奶粉， 牛肉浓缩物和许多细菌的培养基中都发现了维生素b 。2 吼 关于维生素b 1 2 的功能研究已经非常清楚，它在医药、人体和生物营养上具 有重要应用价值【8 l o 临床上主要用于因维生素b 1 2 缺乏所致的疾病，如恶性贫血、白细胞减少症、 吸收不良等疾病的预防和治疗吼随着对维生素b 1 2 药理的深入研究，近年来又 发现了其许多新的用途，如维持神经组织的正常功能，在临床上用于治疗三叉神 经痛、肩周炎、皮炎、舌炎、慢性皮肤溃疡、扁平疣和偏头痛等疾病。最新的医 学观点认为，哺乳、妊娠、长期素食者、吸收不良综合症、肝脏疾病、反复发作 的溶血性贫血、甲状腺机能亢进、慢性感染、胰及肠道癌肿、严重肾病等都应该 适当补充维生素b 1 2 。它还和其它维生素一起构成多种维生素制剂，作为非处方 类药物而广为销售。 维生素b t 2 也广泛用于饲料工业上，它可用于动物饲料添加剂、营养补充以 及食品加工等方面，如维生素b t 2 强化面粉、婴儿食品等。 1 5 维生素b 1 2 的发展前景【1 0 】1 1 3 】 维生素b 1 2 已列入我国基本医疗保险药品目录中的甲类品种，它在我国大城 市医院的用药普及率己达到9 0 以上。根据国家药监局南方医院经济研究所分析 1 1 1 1 ，近年来，我国市场对维生素b 1 2 的需求转旺，平均年增幅超过1 0 ，1 9 9 1 年进口量为1 5 0 公斤，n - 十世纪九十年代中期，全国每年消耗量达6 0 0 公斤左 右。到上世纪末，国内市场用量已达1 0 0 0 公斤。近几年，又有较大增长，2 0 0 3 年用量达1 2 0 0 公斤。 国际市场对维生素b 1 2 的需求强劲增长，拉动了我国的出口连年大幅增加， 增长速度惊人。1 9 9 6 年出口突破1 吨，1 9 9 7 年出口量达1 5 吨，1 9 9 8 年为1 9 吨，1 9 9 9 年又突破2 吨，达到2 4 吨，2 0 0 1 年出口量又创新高，达到4 9 吨，2 0 0 3 年出口量达到5 5 吨左右。 长期以来，国际市场上维生素b ，2 的需求一直较旺，但因其产量较少，导致 其价格长期坚挺，稳步上扬。虽然维生素b 1 2 产量在维生素家族中排名倒数第一， 但售价遥遥领先于其它维生素产品。上世纪九十年代初，国际市场上每公斤维生 4 第1 章前言 素b 1 2 的价格为5 0 0 0 至5 5 0 0 美元，到九十年代中期，上升到6 5 0 0 至7 0 0 0 美元。 在2 0 0 2 年春季广州交易会上，我国维生素b 1 2 出口价为每公斤7 5 0 0 美元左右。 今后几年，我国经济还将快速发展，人民的生活水平不断提高。一方面，对 维生素b 1 2 以及添加各种维生素b - 2 的营养食品、保健品的需求日益增大；另一 方面，对肉类、家禽、蛋类等食物的消耗将持续增长。而维生素b 1 2 是重要的饲 料添加剂，它是畜禽生长发育必需的生物催化剂，对畜禽生长发育过程中的很多 因素，如增重、产肉、肉的品质、皮毛、生殖能力以及运动系统等都有影响。以 前我国这方面用量很少，今后市场需求将是巨大的。 国际市场对维生素b 1 2 的需求将继续保持稳步增加的发展趋势。发达国家人 们越来越注重身体健康，预计未来若干年内，对添加各种维生素b 1 2 的食品的需 求将不断增加。作为o t c 药物的多种维生素产品在国外的应用已相当普遍，今 后还会稳步上升。另外，由于欧洲等发达国家受到动物疯牛病的巨大冲击，目前 欧洲、北美、日韩等发达国家的饲养场都纷纷采用维生素b 1 2 作为添加剂以取代 危险的“肉骨粉”。今后还将开发越来越多的维生素b 1 2 系列产品，目前市场上 除氰钴胺( 即通常指的维生素b - z ) 外，还有氯钴胺、羟钴胺、腺苷辅酶维生素 b 。2 等诸多系列产品。它们在临床上各有特色，现在临床用量在不断增加。这些 都导致未来国际市场对维生素b 1 2 的需求持续增长。 总之，不管是从维生素b ，2 近几年的市场销售情况还是未来几年的发展趋势 来看，它都是一种具有巨大发展潜力的产品，而我国仅有华药集团和石药集团生 产维生素b 1 2 的规模稍大之外，其余厂家产量都很小，远远未能满足市场的需求， 今后的发展空间将很大。 1 6 维生素b 1 2 的生物合成途径 维生素b 1 2 存在于动物性食品中，植物中不含维生素b 1 2 ，而且其合成只限 于原核生物界中某些成员，放线菌、人和动物的肠道菌都能合成维生素b m 自然界存在着两种不同的维生素b 1 2 合成途径【1 2 】：一种是由法国r h o n e p o u l e n c r o r e r ( r p r ) 公司的b l a n c h e 和他的同事们，联合英国剑桥的化学研究机构， 在p s e u d o m o n a sd e n i t r i f i c a n s ( 脱氧假单孢杆菌) 这类细菌中发现的好氧途径；另 一种是在b a c i l l u sm e g a t e r i u m ( 巨大芽孢杆菌) 和p r o p i o n i b a c t e r i u ms h e r m a n i i ( 谢 氏丙酸杆菌) 中发现的厌氧途径。 如图1 - 4 ，维生素b 。2 的生物学功能和从头合成途径已经被阐明1 1 4 】。其合成 2 0 0 6 届中山大学硕士学位论文陈兆佳 分别由呼吸链中的c 5 和c 4 途径开始，生成主要中间代谢物5 氨基酮戊酸 ( 5 - a l a ) 、原尿卟啉i i i ( u r o p o r p h y r i n o g e n m ) 和前钴啉环一2 ，在前钴啉环一2 时分 支成好氧途径和厌氧途径。好氧途径需要a t p 并生成副产物乙醛，厌氧途径不 需要a t p 并生成副产物乙酸。最后好氧和厌氧两个分支都会生成腺苷钴啉胺酸， 最后合成腺苷钴胺素。谢氏丙酸杆菌已被证实是从c 5 途径开始合成维生素b ，2 【6 】。 因为维生素b 1 2 的结构复杂性，其从头合成需要多于3 0 个基因的参与，占一 个典型细菌基因总数的约1 【“j 。另外在维生索b 1 2 的生物合成过程中，会同时 生成多种具有u r o p o r p h y r i n o g e n n i 的结构类似物，如细菌叶绿素、血红素以及链 亚铁血红素等【1 6 1 。 十 ， 、i 洲 蛐 菸 奴 图1 - 4 维生素b 1 2 生物合成的好氧和厌氧途径 f i g 1 4 t h ea e r o b i ca n da n a e r o b i cc o b a l a m i nb i o s y n t h e t i cp a t h w a y s 第1 章前言 1 7 维生素b 1 2 的生产技术 1 7 1 维生素b 1 2 的来源 维生素b 1 2 的来源1 1 9 1 1 1 主要有以下三种：从污泥和下水道中提取，但由此 获得的维生素b - 2 并不能直接进入食品或药品级产品，通常只局限于饲料添加剂。 从工业废液中提取，如酒精、丙酮、丁醇、造纸及乳制品工业废液，柠檬酸发 酵后的废液都是生产维生素b 1 2 的原料，生产上一般是用抗菌素工业废液，绝大 多数是从链霉素废液中提取，近年来有发现庆大霉素发酵液中含维生素b 1 2 较高。 微生物纯种发酵，如丙酸发酵、巨大芽孢杆菌生产以及采用转基因大肠杆菌 发酵生产维生素b 1 2 。 1 7 2 维生素b 1 2 的合成方法 w o o d w a r d 和e s c h e n m o s e r 分别于二十世纪六十年代和七十年代完全用化学 方法合成维生素b 1 2 【1 8 1 。这项研究历经1 1 年，涉及1 0 0 多名科学家。但维生素 b 1 2 是自然界已知结构中较复杂的非聚合有机化合物，其化学合成总共有7 0 个合 成步骤，这种高度复杂性使得工业生产成本太高，所以迄今尚无法借助化学手段 来实现工业化生产维生素b 1 2 。 因为只有微生物能进行维生素b 1 2 的生物合成，长期以来人们只从陆源或淡 水微生物中筛选到有限的生产菌株以发酵法生产维生素b 1 2 【1 5 】。 1 7 3 维生素b 1 2 的生产菌种 能够产生维生素b 1 2 的微生物主要为放线菌和细菌【冽。放线菌中链霉菌属的 主要有：a u r e o f a c i e n s ( 金色链霉菌) ，g r 括e u s ( 灰色链霉菌) ；细菌主要包括有： a e r o b a c t e ra e r o g e n e s ( 好氧产气杆菌) ，b a c i l l u sm e g a t h e r i u m ( 巨大芽孢杆菌) ， e s c h e r i c h i ac o l i ( 大肠艾希氏菌) ，p r o p i o n i b a c t e r i u m f r e u d e n r e i c h i i ( 费氏丙酸杆 菌) ，p r o p i o n i b a c t e r i u ms h e r m a n i i ( 谢氏丙酸杆菌) 等。另外，米根霉的一些种 也可合成维生素b 。2 。 早期人们是从天然肥料或土壤中分离出能合成维生素b 1 2 的菌株。如1 9 9 1 7 2 0 0 6 届中山大学硕士学位论文陈兆佳 年l n o u e 等【1 9 1 从海底沉积物中分离出一种厌氧性乙酸杆菌属菌株，可以产生胞内 维生素b 1 2 ；1 9 9 2 年k o j i m a 等【2 0 】从土壤样品中分离到能够消解异丙醇并产生维 生素b ，2 的微生物。 不同菌合成维生素b 1 2 的能力也不同，因为p r o p i o n i b a c t e r i u ms h e r m a n i i 和 p s e u d o m o n a sd e n i t r i f i c a n s 高产维生素b 1 2 的能力及其快速的生长能力，如今，这 两个菌被广泛用于工业生产维生素b 1 2 【”】。 一般常用的p r o p i o n i b a c t e r i u ms h e r m a n i i 菌株被美国食品和药品组织认为是 安全菌株，另外丙酸菌发酵还具备多种优点【捌：培养基在发酵过程中，产生 丙酸使得培养基p h 值下降，从而避免杂菌的污染；丙酸杆菌常采用厌氧发 酵，无须设计供氧系统和搅拌系统，可减少设备投入和节约能耗；发酵过程 中能产生丙酸钙，而丙酸钙通常是用作防腐剂的，从而可以进一步降低染菌的可 能。 然而，p s e u d o m o n a sd e n i t r i p c a n s 仍然被法国的r p r 公司用于工业生产维生 素b 1 2 ，该公司联合运用随机诱变和基因工程的方法，得到一个高效生产维生素 b 1 2 的菌株。 1 8 微生物合成维生素b 1 2 的国内外发酵水平 国内筛选到具有工业生产价值的维生素b 1 2 的产生菌，如p r o p i o n i b a c t e r i u m s h e r m a n i i 和p r o p i o n i b a c t e r i u mf r e u d e n r e i c h i i 合成维生素b 1 2 可达2 3 到2 5 m e c l ( 厌氧，3 0 培养8 0 到1 3 2h ) 。进一步从各种生产菌中选择生长快、产量高的 菌株，维生素b 1 2 的产量可达5 9m g l ，可作为工业生产菌株l ：z 3 。近两年通过技 术引进，已有采用丙酸杆菌发酵的企业，如华北制药集团威可达公司、石家庄 华荣联合制药厂等，但发酵水平与国外先进水平仍有不小的差距，发酵液中维 生素b 1 2 的浓度一般只有4 0 到8 0 m g ，l 。 表1 - 1 列举了不同的菌种，不同的发酵工艺，其合成维生素b ，2 的能力也不 同1 2 1 j 。其中，p r o p i o n i b a c t e r i u ms h e r m a n i i 和p r o p i o n i b a c t e r i u m f r e u d e n 驴c 口邶，是 目前国际上常用的工业生产菌株，其维生素b 1 2 的产量也相对较高，而r h o d o p s e u d o m o n a sp r o t a m i c u s 是由r h o d o p s e u d o m o n a ss p h e r o i d s 与p r o t a m i n o b a c t e r r u b e r 二者原生质体融合而得到的工程菌。从表1 - 1 可以看出，高产维生素b 1 2 的菌株大都采用葡萄糖作为主要碳源，加入前体物5 ，6 一二甲基苯并咪唑 8 第1 章前言 ( d m b i ) 有利于真正维生素b 1 2 的合成，丙酸杆菌多采用纯厌氧发酵工艺。目 前，美国施宝来公司、礼来公司、普强公司和雅培公司都在生产维生素b 1 2 ，其 发酵水平都达1 0 0m g l 以上。法国的r p r 公司联合运用随机诱变和基因工程的 方法，使合成维生素b 1 2 的关键基因得到高效表达，得到一个高产维生素b 1 2 的 菌株，其维生素b 1 2 的产量高达1 0 0 到2 0 0m g e 【矧。 为了提高维生素b 1 2 的产量，在微生物合成维生素b 1 2 的过程中，人们除了 加入谷氨酸、苏氨酸、d 一氨基乙酰丙酸和氨基丙醇等前体物外，还需要补充钴 盐和d m b l l 2 6 1 。 表1 - 1 不同菌种合成维生素b 1 2 能力的比较 t a b l e l 一1s p e c i e so fm i c r o b i a lp r o d u c e r sa n dm i c r o b i o l o g i c a lp r o c e s sr e c o m m e n d e d f o rp r o d u c i n gv i t a m i nb 1 2 2 0 0 6 届中山大学硕士学位论文陈兆佳 1 9 工业发酵菌种的选育技术 工业发酵的基础是获取一株产物产量高，遗传性状稳定和发酵条件优良的菌 株，而菌株筛选的历史进程中主要有两个阶段【2 5 l ：传统的以诱变和筛选为中心 的技术原生质体融合，重组d n a 技术 1 9 1 以诱变和筛选为中心的技术 菌种筛选方法包括随机筛选方法和理性筛选方法 2 7 1 。随机筛选是在菌种诱 变后无选择性的测定很大数量的菌株的效价，这类方法是最原始最简单的方法， 不需要生化和遗传学方面的知识，这类方法在实际应用中已取得明显的成功，至 今也仍很有效。然而，随机筛选是一个很费事的过程，为了获得极少数的优良菌 株往往需要测定的菌株数目很大。理性筛选是人们根据氨基酸及核苷酸的生物合 成途径，采用生化和遗传学原理设计的筛子来进行筛选的一种方法，该法极大的 提高了育种的效率。理性筛选又分为直接法和间接法。直接法包括表型筛选和营 养缺陷型的筛选等，间接法包括抗有毒物、解除终产物的抑制以及渗透压的改变 等等。 诱变剂包括物理和化学诱变剂【2 9 j ： 化学诱变剂是一类能对d n a 起作用、改变其结构、并引起遗传变异的化学 物质。通常有羟胺、亚硝基胍( n t g ) 、吖啶橙、亚硝酸和5 溴尿嘧啶。n t g 有 超级诱变剂之称，n t g 诱变是一种常用的很有效的微生物育种技术，n t g 能够 引起d n a 中的胞嘧啶( c ) 和腺嘌呤( a ) 碱基烷基化，改变生物体的遗传信息， 从而很可能产生高产突变株。n t g 诱变的特征是致死率相对低但变异率高，微 生物经过n t g 处理后，可得到较多的营养缺陷型，其变异频率1 2 至1 8 。 物理诱变剂包括紫外线( u v ) 、y 射线和x 射线。后两者要用专门仪器，较 难应用，而u v 容易获得，u v 诱变容易操作，u v 能够引起嘧啶发生二聚体反 应并使d n a 产生交联，也是一种常用的物理诱变剂，一般认为7 5 至9 5 的杀 菌率比较好。 利用一些生化试剂作为“筛子”来筛选突变株的方法是近些年发展起来的一 种应用普遍的理性筛选方法1 2 3 1 ，这些生化试剂通常为代谢抑制剂，这些“筛子” 能够有效地排除掉大量的无用菌株，大大减少分析测定的工作量，采用这种代谢 抑制法能够非常有效地筛选出符合要求的正突变株。宋【】等报道自从发现维生素 l o 第1 章前言 b - 2 和卟啉的产生由尿卟啉原分叉之后， 剂，从检出的不产生卟啉的1 8 0 有科学家利用紫外线和亚硝基胍等诱变 株费氏丙酸杆菌( p r o p i o n i b a c t e r i u m f r e u d e n r e i c h i i ) 中发现有2 株维生素b 1 2 高产菌。也有从筛选5 ，6 - 二甲基苯并眯 唑或乙硫氨酸抗性突变型一步步选育，使邓氏假单胞菌( p s e u d o m o n a s 砌沂班衄n s ) 产生维生素b 1 2 的水平提高3 0 0 倍以上【蚓。 1 9 2 原生质体融合，重组d n a 技术 原生质体融合技术是将两个具有优良性状的菌株通过筛选营养缺陷型，原生 质体制备，再生和重组子筛选等操作，选育出具有两者优良性状于一身的单一菌 株【捌。 重组d n a 技术育种是通过代谢途径的分析，找出对终产物有关键影响的基 因，通过建立该基因和载体d n a 的重组子，并将该重组子导入受体细胞内，以 扩增异源d n a ，并实现其功能表达的育种技术【捌。 c h a r l e s a r 等【3 0 1 人报道在大肠杆菌中用重组d n a 技术扩增了维生素b 1 2 合 成的前十二个关键酶，虽然并不能完全合成维生素b ，2 ，但也为大肠杆菌生产维 生素b 1 2 提供了极有价值的研究方法。p i a o 等人1 3 1 1 报道通过在费氏丙酸杆菌 ( p r o p i o n i b a c t e r i u mf r e u d e n r e i c h i i ) 中用重组d n a 技术扩增出r h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e s 的h e m a 基因，使其增加了c 4 代谢途径，同时扩增了其自身维生素 b 1 2 的合成过程中的关键酶基因，使维生素b 1 2 的产量最高提高了约两倍。 1 1 0 维生素b 1 2 的发酵工艺 利用丙酸杆菌属的细菌进行厌氧发酵生产维生素b 。2 ，在发酵过程中会产生 丙酸和乙酸等的副产物，而丙酸作为一种有效的微生物抑制物，能降低发酵过程 中染菌的风险，但同时也对丙酸杆菌的生长有强烈的抑制作用，导致菌体发酵浓 度不高，发酵单位不高的不良影响。针对维生素b 1 2 的发酵工艺的研究，主要集 中在如何降低发酵液中丙酸的浓度，从而提高菌体浓度【3 2 】。丙酸的生物合成 途径见图1 _ 5 1 6 1 。 2 0 0 6 届中山大学硕士学位论文 陈兆佳 p r o p i o n a t e s u c d n a t e i f u m a r a t e i m a l a t e s u c c i n y l - c o a _ 斗m e t h y l m a l o n y l c o a p r o p i o n y l - - c o am e t h y l m a l o n y l c o a 0 1 a 1 。”t 8 t e 图1 - 5