（药物化学专业论文）bcl2蛋白抑制剂的设计、合成与初步活性研究.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名：筮越 日期：彬 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名： 毡篮二复导师签名： 论文作者签名： 砼玉堇：芝导师签名： 山东大学硕士学位论文 目录 1 1 细胞凋亡通路1 0 1 2 细胞凋亡在生物体的重要意义1 2 1 3b c l 2 蛋白功能及结构简介1 2 1 3 1b c l 2 蛋白的分类及功能1 2 1 3 2b c l 2 蛋白的一级结构1 3 1 3 3b c l 2 蛋白的三级结构1 4 1 4b e l 2 蛋白抑制剂1 5 1 4 1 反义寡核苷酸类1 5 1 4 2b h 3 模拟肽类l6 1 4 3 小分子抑制剂1 6 1 4 3 1 苯并吡喃衍生物1 6 1 4 3 2 多酚类衍生物17 1 4 3 3 酰基磺酰胺类衍生物18 1 4 3 4b h 3 i s 衍生物19 1 4 3 5 其他类小分子抑制剂1 9 1 5 结语。2 0 第二章b e l 2 蛋白抑制剂的设计2 1 2 1 分子设计思想2 1 2 2 目标化合物设计依据。2 2 2 3 合成路线设计2 4 2 3 1 逆合成分析2 4 2 3 2 所设计的合成路线2 4 第三章目标化合物的合成2 6 5 7 9 0 l 山东大学硕士学位论文 3 1 关键中间体环合产物的制备2 6 3 2 取代联苯甲醛( 9 ) 等的制备。2 6 3 3 羟醛缩合中间体的合成2 8 3 4 目标物的合成3 0 3 4 1b 系列化合物的合成3 0 3 4 2a 系列化合物的合成3 2 第四章目标化合物的初步活性测试、评价3 7 4 1 目标化合物对肿瘤细胞生长的抑制试验3 7 4 1 1 原理。3 7 4 1 2 实验材料与方法。3 7 4 1 2 1 待测物与主要试剂。3 7 4 1 2 2 主要仪器3 7 4 1 2 3 方法3 7 4 2 实验结果分析3 9 第五章总结与展望4 0 5 1 总结4 0 5 2 展望。4 1 参考文献4 2 致 射。5 1 附录i ：硕士学习期间发表的论文5 2 附录i i ：化合物的e s i m s ，i r ，1 h n m r 图谱5 3 2 1 4i n h i b i t o r so fb d - 2p r o t e i n s 15 1 4 1a n t i s e n s eo l i g o n u c l e o t i d e s 15 1 4 2b h 3 p e p t i d e 16 1 4 3s m a l lm o l e c u l a r a n t a g o n i s to f b c l 一2 1 6 1 4 3 1c h r o m e n ed e d v a t i v e s 1 6 1 4 3 2p o l y p h e n o ld e r i v a ：t i v e s 1 7 1 4 3 3a c y l s u l f o n a m i d ed e r i v a t i v e s 18 1 4 ：；4b h 3 i sd e r i v a t i v e s 1 9 1 4 3 5o t h e rs m a l lm o l e c u l ei n h i b i t o r s 19 1 5c o n c l u s i o n ：! ( ) c h a p t e r2d e s i g no f b c l 一2p r o t e i ni n h i b i t o r s 2 1 2 1d e s i g ni d e ao f i n h i b i t o r s 2 1 2 2d e s i g nt h et a r g e tc o m p o u n d s 2 2 2 3a n a l y s i so f s y n t h e t i cr o u t e s ：! z l 2 3 1r e t r o s y n t h e t i ca n a l y s i s 2 4 2 3 2s y n t h e t i cr o u t e s 2 4 c h a p t e r3s y n t h e s i so f t a r g e tc o m p o u n d s ：1 6 3 1p r e p a r a t i o no f c y c l i z a t i o ni n t e r m e d i a t e 。2 6 3 山东大学硕士学位论文 3 2s u z u k ic o u p l i n gr e a c t i o n 2 6 3 3a l d o lc o n d e n s a t i o n 2 8 3 4c h e m i s t r y 3 0 3 4 1s y n t h e s i so f bs e r i e s 3 0 3 4 2s y n t h e s i so f as e r i e s 3 2 c h a p t e r4p r e l a n i n a r ya c t i v i t ya s s a y 3 7 4 1i nv i t r oc e l l sa s s a y 3 7 4 1 ip r i n c i p l e 3 7 4 1 2m a t e r i a la n dm e t h o d 3 7 4 1 2 1c o m p o u n d sa n dr e a g e n t s 3 7 4 1 2 2i n s t r u m e n t 3 7 4 1 2 3m c 。d a o d 3 7 4 2r e s u l t s 3 9 c h a p t e r5c o n c l u s i o na n dp e r s p e c t i v e s 4 0 5 ic o n c l u s i o n 4 0 5 2p e r s p e c t i v e s 4 1 r e f e r e n c e 4 2 a c k n o w l e d g e m e n t s 5 1 a p p e n d i xhp u b l i c a t i o n s 5 2 a p p e n d i xi f ：1 hn m r , m s a n di rs p e c t r ao f t a g e tc o m p o u n d s 5 3 4 山东大学硕士学位论文 b c l 2 蛋白抑制剂的设计、合成与初步活性研究 专业：药物化学 研究生：肖桂芝 导师：方浩教授 合作导师：邢成国教授 中文摘要 恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病之一，该类疾病不仅死亡率高，而且临。 床上缺乏非常有效的治疗手段。近年来研究发现，肿瘤的发生是细胞增殖与凋亡 失衡所致，调控细胞凋亡成为了当今抗肿瘤药物研究的一个热点。细胞凋亡是指 细胞在发育的一定阶段出现的正常选择性死亡，由于其启动和进程均受一定程序 的控制，故也称程序性死亡。正常的凋亡对于多细胞有机体的发育和稳态有着重 要的作用，过度或者不足的凋亡会导致严重的病理后果。例如，研究发现过度的 凋亡与神经退行性疾病等有关；而凋亡受到抑制则与肿瘤等疾病的产生有关。因 此深入了解凋亡过程的调控机制，将为许多肿瘤等重大疾病的治疗提供新的方案 或有效药物。 细胞凋亡有两条通路，即线粒体调控途径和死亡受体通路。调控细胞凋亡通 路的因素很多，通常认为主要与线粒体、c a s p a s e 家族和b 细胞淋巴瘤2 ( b e l 2 ) 蛋 白家族有关。b c l 一2 蛋白是重要的细胞凋亡调节因子，主要在线粒体凋亡通路中发 挥作用。b c l 2 蛋白家族按功能可分为两种，一种是促凋亡蛋白，另一种是抗凋亡 蛋白。这两种蛋白在功能上相互影响，共同决定着细胞凋亡的进程，很大程度上， 二者之间相对平衡决定了细胞的命运。研究发现，b e l 2 蛋白家族中的很多抗凋亡 蛋白成员( 如b c l 2 和b c l x l 等) 在许多恶性肿瘤( 例如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、急 慢性白血病等) 中过度表达、甚至还影响到肿瘤细胞对化疗和放疗的敏感性。如果 5 山东大学硕士学位论文 抑制肿瘤细胞中这些过度表达的抗凋亡蛋白，将对肿瘤的治疗具有重大意义。因 此b c l 2 蛋白抑制剂已成为当前抗肿瘤药物的研究热点。 目前已报道的b c l 2 蛋白抑制剂有h a l 4 - 1 ，a b t 7 3 7 ，b h 3 i s 和w l - 2 7 6 等，有 些已经进入l 临床研究。其中w l - 2 7 6 是近年来新近发现的绕丹宁类似物。我们基于 b c l 2 蛋白靶点结构( 通过对现有文献报道的b c l - 2 蛋白结构研究发现，b c l 2 蛋白表 面的活性位点是一个狭长的疏水空腔) 和w i 广2 7 6 为骨架，设计、合成了一系列新的 绕丹宁衍生物。共合成3 3 个新化合物，其中新中间体11 个，目标化合物2 2 个。本 论文对合成路线和制备方法均进行了详述，所有目标化合物经1 hn m r ，i r ， e s i - m s 确证。 目标化合物应用m i n i 法进行了初步抑制肿瘤细胞活性实验。结果表明，多数 目标化合物对于b c l 2 蛋白高表达的m d a - m b 2 3 1 和k 5 6 2 两种肿瘤细胞株有明显 的抑制作用。其中目标化合物4 a ，4 c ，4 i ，6 d 和6 f 抑制肿瘤细胞k - 5 6 2 的增殖作用与 阳性对照药w l - 2 7 6 相当。 关键词：肿瘤；b c l 2 蛋白；抑制剂；抗肿瘤药物 6 山东大学硕士学位论文 d e s i g n ，s y n t h e s i s a n dp r i m a r ye v a l u a t i o no f b c l 2p r o t e i ni n h i b i t o r s m a j o r ：m e d i c i n a lc h e m i s t r y p o s t g r a d u a t e ：g u i - z h i x i a o s u p e r v i s o r ：p r o f h a of a n g a n dp r o f c h e n g g u ox i n g a b s t r a c t i ti sw d lk n o w nt h a tc a n o e fi so n eo ft h em a j o rd i s e a s e st h a tt h r e a t e nh u m a nh e a l t h h o w e v e r , p e o p l ea g es t i l ll a c ko fe f f e c t i v em e t h o d si nc a u c 君rt h e r a p y r e c e n ts t u d i e s f o u n dt h a ti m b a l a n c eb e t w e e nc e l lp r o l i f e r a t i o na n da p o p t o s i si so n eo ft h ei m p o r t a n t l e a s o nf o rt u m o r i g e n e s i s t h e r e f o r e , r e g u l a t i o no fa p o p t o s i sb e c a m ea ni m p o r t a n t r e s e a r c hf i e l d si nc a n c e rt h e r a p y a p o p t o s i s ，a l s ok n o w na sp r o g r a m m e dc e l ld e a t h , i sa k e yp h y s i o l o g i c a lp r o c e s st h a tf l a y s a ne s s e n t i a lr o l ei nn o r m a ld e v e l o p m e n ta n d h o m e o s t a s i so fo r g a n i s m t h ed e r e g u l a t i o no fa p o p t o s i sh a sb e e na s s o c i a t e dw i t ha n u m b e ro fd i s e a s e s f o re x a m p l e , e x c e s s i v ea p o p t o s i sc a ng e n e r a t en e u r o d e g e n e r a t i v e d i s e a s e , w h i l ei n h i b i t i o no fa p o p t o s i sc o u l dl e a dt om a l i g n a n td i s e a s ea n da u t o i m m u n i t y t h e r e f o r e ，s t u d i e s0 1 1t h em e c h a n i s mo fa p o p t o s i sr e g u l a t i o nw i l l1 1 0d o u b tb eh e l p f u li n t h et r e a t m e n to fc a n c e ra n do t h e rm a j o rd i s e a s e s g e n e r a l l y , t h e r ea g et w om a j o rp a t h w a y si na p o p t o s i s o n ei s t h em i t o c h o n d r i a l p a t h w a ya n dt h eo t h e ri s t h e d e a t hr e c e p t o r p a t h w a y t h ef a c t o r st h a tc a na f f e c t a p o p t o s i si n c u l d em i t o c h o n d r i a c a s p a s ef a m i l ya n d b c e l ll y m p h o m a - 2 ( b c l - 2 ) a m o n g o ft h e m ，b c l 2f a m i l yp r o t e i n sa r ek e yr e g u l a t o r so fa p o t o s i si nm i t o c h o n d r i a lp a t h w a y t h e s ep r o t e i n sc a nb ed i v i d e di n t ot w os u b f a m i l i e sa c c o r d i n gt ot h e i rf u n c t i o n s o n e s u b f a m i l y , n a m e da n t i a p o p t o t i cb c l - 2f a m i l yp r o t e i n s ，i sr e q u i r e df o rc e l l s u r v i v a l w h i c hi n c l u d eb c l 2 ，b c l x l ，m c l - 1 ，a i ，b c l w ；b c l - r a m b oa n db o o t h eo t h e r 7 山东大学硕士学位论文 s u b f a m i l y , n a m e dp r o a p o p t o t i eb c l 一2f a m i l yp r o t e i n s ，i sr e q u i r e df o ra p o p t o t i cc e l l d e a t h i tw a sr e g a r d e dt h a tt h eb a l a n c eb e t w e e na n t i a p o p t o t i ca n dp r o - a p o p t o t i cb c l - 2 f a m i l ym e m b e r sc o u l dd e t e r m i n et h e f a t eo fc e l l a n da l s os o m em e m b e r so f a n t i - a p o p t o t i cb e l - 2p r o t o i n sw o r ef o u n dt ob eo v e r - e x p r e s s e di ns o m em a l i g n a n t t u m o l 甚，w h i c hc a ne f f e c tt l m l o rc e l ls e n s i t i v i t yt oc h e m o t h e r a p ya n dr a d i o t h e r a p y t od a t e , s o m es m a l lm o l e c u l ei n h i b i t o r so fb c l - 2h a v eb e e nd i s c o v e r e d , s u c h 嬲 h a - 1 4 1 ，a b t - 7 3 7 ，b h 3 1 sa n dw l - 2 7 6 w l - 2 7 6i s an e wb c l - 2i n h i b i t o rw i t h r h o d a n i n es c a f f o l d b a s e d0 1 1t h et a r g e ts t r u c t u r ea n dt h es c a f f o l do fw l - 2 7 6 ，as e r i e so f r h o d a n i n ed e r i v a t i v e sw c i ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e ds oa st oe v a l u a t em e i rb i o l o g i c a l a c t i v i t i e s a l lt h et a r g e tc o m p o u n d sh a v eb e e ni d e n t i f i e dw i t h1 hn 艮i ra n de s i m s m t rm e t h o d sw f f r eu s e dt os c r e e n i n gt h et a r g e tc o m p o u n d sw i 廿lm d a - m b 2 31 a n d1 ( 5 6 2c e l ll i n e sw h i c hw e r ei d e n t i f i e dt ob eo v e r - e x p e r e s s e db c l - 2p r o t e i n s t h e p r e l i m i n a r yr e s u l t ss h o w e dt h a tm o s to ft h ec o m p o u n d sh a v et h ea b i l i t yt oi n h i b i tt u m o l c e l l sg r o w t h c o m p o u n d4 a ，4 e ，4 i ，6 da n d6 fh a v es i m i l a rp o t e n c yc o m p a r e dw i t ht h e w l 2 7 6f o ri n h i b i t i n gk 5 6 2c e l ll i n e k e y w o r d s ：t u m o r ；, b d 2p r o t e i n ；i n h i b i t o r , a n t i - t u l n o rd r u g 8 d m f n , n - d i m e t h y l f o r m a m i d e n ，n - - i 甲基甲酰胺 e d c h c l d i e a 1 - 3 - ( d i m e t h y l a m i n o ) p r o p y l 卜乙基一( 3 一二甲基氨基丙 3 e l l l y l c a 而o d i i l i l i d e 基) 碳二亚胺盐酸盐 二异丙基乙胺 d m a p 4 - d i m e t h y l a m i n o p y r i d i n e 4 一二甲氨基吡啶 d m s o d i n l e t l l y ls u l f o x i d e二甲基亚砜 d c m e s i - m s d i c h l o m m e t h a n e二氯甲烷 电喷雾电离质谱 红外光谱 n m rn u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e核磁共振 t h f t e t r a h y d r o f u r a n 四氢呋喃 c a d d c o m p u t e r a i d e dd r u gd e s i g n 计算机辅助药物设计 p r o s t a t i cc a n c e r - 3前列腺癌 9 山东大学硕士学位论文 第一章前言 1 9 7 2 年l 沁一i 】等发表的一篇文章中最早提出凋亡一词，文中指出细胞发生凋 亡时形态学上会发生以下的改变：细胞起泡、染色质皱缩、细胞核片段化等。它 的发生与发展对于肿瘤有一定的生理学与病理学意义，遗憾的是机制不太清楚。 随着进一步的研究发现细胞凋亡是细胞由基因控制的有序的死亡【2 】，是一项很重 要的生理过程，生物体通过此过程可以在适当的时间有选择性的去除一些不需要 的、已经损坏的、或者有危险性的细胞，因此凋亡对于控制细胞数量，维持生物 体的发育生长具有重要意义，然而往往事情都有两面性，不正常的凋亡与各种疾 病也有一定的关系【3 一。目前研究发现，过度的凋亡与神经退行性疾病等有关；而 凋亡受到抑制则与肿瘤等疾病的产生有关【5 1 。所以若是能够了解凋亡的机制以及影 响因素，那么将会给医药学带来无线光明。大量文献资料表明线粒体、c a s p a s e 家 族、b d 2 蛋白家族是主要的调节因素【6 】，它们调节细胞凋亡的机制主要在于：( 1 ) 抑制促凋亡蛋白b a x ，b a k 的活性；( 2 ) 抑制c a s p a s e 家族成员的活性；( 3 ) 抑制线 粒体促凋亡物质的释放。 起初，科学家们在人类b 一细胞淋巴瘤中发现t b c l 2 基因，并且认为它是简单 的原癌基因【7 引。随后人们又发现，与其他的原癌基因相比，b c l 2 不会促进细胞增 殖而会增强细胞的存洲9 ，1 0 1 ，这一点引起了研究者的广泛关注。b d 2 蛋白家族成 员庞大，有二十多个成员，科学家发现这一家族中的很多成员在许多恶性肿瘤中 过度表达、甚至还影响到肿瘤细胞对化疗和放疗的敏感性【l l 】。因此b c l 2 抑制剂已 成为当前抗肿瘤药物的研究热点【1 2 】。 1 1 细胞凋亡通路 细胞凋亡是细胞由基因控制的有序的死亡又称为程序性的细胞死亡 ( p r o g r a m m e dc e l ld e a t h ，p c d ) ，它是生物体有选择性的去除一些不需要的、已经 损坏的、或者有危险性的细胞的一种生理学过程【1 3 】，细胞凋亡的最终结果是细胞 死亡，还有与其导致相似细胞命运的过程，那就是细胞坏死，虽然二者导致相同 的细胞命运，但二者还有本质的区别。 细胞凋亡有两条途径，即线粒体调控途径和死亡受体通路( f i g u r e1 ) 。在线粒 体调控途径 1 4 l ( 又称为内部凋亡途径) 中，b d 2 蛋白家族具有非常重要的作用。尽 管此通路有放大死亡受体通路信号的作用，但主要还是由一些死亡受体非依赖性 a p o p t o s i s 亡 f i g u r e1 a p o p t o s i ss i g n a l l i n gp a t h w a y i nm a m m a l s 在正常情况下，促凋亡蛋白b a x 主要是以单体形式存在于胞液或者松弛地嵌在 细胞膜上。细胞受到凋亡信号刺激后，b a x 转移到线粒体上并且牢固地嵌入到线粒 体外膜上。此时b a x 的构象发生改变，可以诱导同源低聚物形成更大的复合物，从 而促进线粒体释放细胞色素d 1 5 】。与此同时c a s p a s e 8 通过酶切b i d 将它变为无促凋 亡活性的t b i d ( t r u n c a t e db i d ，t b i d ) 触发内部凋亡途径【1 6 】。t b i d 可以引发b a x 和b a k 依 赖性的线粒体外膜通透作用( m i t o c h o n d r i a lo u t e rm e m b r a n ep e r m e a b i l i z a t i o n ，m o m p ) 并且t b i d 与移位的b a x 一样，也会促进线粒体将位于膜间隙中的细胞色素c 、凋亡 诱导因子( a p o p t o s i s - i n d u c i n gf a c t o r ，触f ) 、核酸内切酶g ( e n d o n u c l e a s eg ，e n d o g ) 以 及其他的促凋亡分子释放到胞液中1 刀。由于线粒体释放大量的促凋亡分子到胞液 中，促进了凋亡小体的形成。凋亡小体是一种由凋亡蛋白酶活化因子- l ( a p o p t o t i c p r o t e a s ea c t i v a t i n gf a c t o r l ，a p a f - 1 ) ，c a s p a s e 一9 酶原，细胞色素c 构成的多蛋白复合 物【1 7 1 ，它能够活化c a s p 嬲e 9 酶原进而激活c a s p a s e 7 、c a s p a s e 3 等产生级联放大效 应发挥细胞凋亡效应【1 5 】。 另一条称为细胞凋亡的死亡受体通路【1 引，也称为“外部死亡通路 。由死亡 配体( 如肿瘤坏死因子，t u m o rn e c r o s i sf a c t o r ，t n f ) 与肿瘤坏死因子受体( t u m o r n e c r o s i sf a c t o rr e c e p t o r ，t n f r ) 结合后启动。此结合导致死亡受体的三聚化，随后 山东大学硕士学位论文 在胞内募集一些衔接蛋白如f a s s 相关的死亡结构域( f a s s - a s s o e i a t e dd e a t hd o m a i n ， f a d d ) 与e a s p a s e - 8 酶原形成一种信号复合物。复合物中的e a s p a s e - 8 酶原( 在正常 细胞内e a s p a s e 是以无活性的酶原形式存在，只有在对细胞凋亡做出应答时才被激 活 5 1 ) 经过蛋白酶水解后变为有活性的形式，然后它将启动c a s p a s e 的级联反应，使效 应c a s p a s e - 3 、- 6 、7 激活，这几种激活的c x u s p a s e s 可降解胞内结构蛋白和功能蛋白， 最终导致细胞凋亡。此通路虽受一些蛋白的调节，但基本上不受b e l 2 蛋白家族的影 响【1 9 1 。 1 2 细胞凋亡在生物体的重要意义 细胞凋亡是维持人体正常生理过程和功能活动所必须的，具有重要的生理学 意义，主要表现在：( 1 ) 细胞凋亡在生物界普遍存在；( 2 ) 细胞凋亡是生物在进化 过程中形成的死亡方式；( 3 ) 细胞凋亡是多细胞生物生命活动中不可缺少的内容， 贯穿于全部寿命周期中。细胞凋亡的生物学作用主要有清除无用的、有害的、已 完成任务的、发育不正常的细胞。正常的细胞凋亡能够确保胚胎发生；器官发育； 调节细胞群体的比例；维持内环境稳定；发挥积极的防御功能【1 3 l 。非正常的细胞 凋亡能够导致器官功能障碍；恶性肿瘤发生；免疫系统疾病比如自身免疫紊乱。 1 3b c i - 2 蛋白功能及结构简介 鉴于细胞凋亡在生物体内的普遍存在和重要生物学作用，科学家们深入研究 细胞凋亡发现调控细胞凋亡通路的因素很多，一般认为主要与线粒体、e a s p a s o 家 族和b 细胞淋巴瘤2 ( b e l 2 1 蛋白家族有关。b c l 2 蛋白是重要的凋亡调节因子，主 要在线粒体凋亡通路中发挥作用。b e l 2 蛋白家族按功能分为两类，一类为促凋亡 蛋白，另一类为抗凋亡蛋白。很大程度上，二者之间相对平衡决定了细胞的命运。 一些科学家发现这一家族中的很多抗凋亡成员( 比如b c l 2 ，b e l x l 等) 在许多恶性肿 瘤( 乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、急慢性白血病等) 中过度表达、甚至还影响到肿瘤 细胞对化疗和放疗的敏感性。如果能发现抑制这些过度表达的蛋白的功能对于治 疗肿瘤以及解决肿瘤耐药性的问题具有重大意义。 1 3 1b c i - 2 蛋白的分类及功能 迄今，人们在哺乳动物中发现了约2 5 个b c l 2 蛋白家族成员，根据功能的不 同可以将它们分为两类：促凋亡蛋白( 包括b a d ，b i k ，b i d ，b i m ，h r k ，b m f , n o x a 等) 和抗凋亡蛋白( 比如b c l 2 ，b c l x l ，b e l w ，b o o ，b c l r a m b o 等) 【2 0 1 。两类蛋白 山东大学硕士学位论文 通过之间的作用来协调细胞凋亡。多区域的b e l 2 蛋白主要位于线粒体膜、内质网 膜( e r ) 和核膜上。通常来讲，促凋亡和抗凋亡蛋白之间相对的平衡决定了细胞的 命运【2 。例如过多的促凋亡蛋白会使细胞过分凋亡而过多的抗凋亡蛋白则会抑制 细胞凋亡。 抗凋亡蛋白能够保持线粒体膜的完整性，它们和促凋亡蛋白形成异源二聚体 或者形成同源二聚体而发挥作用【1 8 】，越来越多的资料表明内质网在诱导细胞凋亡 瞄】过程中发挥了重要作用，然而b c l 2 蛋白通过影响内质网内、细胞内钙的水平和 阻止凋亡因子的释放来调节细胞凋亡【2 3 1 。抗凋亡蛋白的细胞保护作用与它们和促 凋亡蛋白b a x b a k 形成无活性的异源二聚体有关【捌。在多种人类肿瘤细胞中( 前列 腺癌，结肠癌，肺癌，胃癌，肾癌，神经母细胞癌，非霍奇金淋巴瘤和急慢性白 血病瞵- 2 9 ) ，b c l 2 基因都过度表达，更为严重地，过度表达的b c l 2 会增强肿瘤细 胞对化疗的耐受性。 促凋亡蛋白影响线粒体膜的通透性，结果使得线粒体释放凋亡蛋白( 例如细 胞色素c 等) 3 0 , 3 1 】，除此以外，b a x 和b a k 通过调节内质网钙依赖性凋亡信号来控 制凋亡【3 2 1 。 b h 3 - o n l y ( 促凋亡蛋白的一类) 蛋白主要位于细胞浆液中，当被死亡信号刺激激 活后它们会转移到线粒体内。这类蛋白通过增强线粒体膜的通透性而传递凋亡信 号，信号刺激线粒体释放细胞色素c ，激活细胞内c a s p a s d 3 3 1 的活性，产生级联放 大效应使得细胞质和细胞核结构降解，产生的凋亡小体迅速被吞噬细胞吞噬。 1 3 2b e i - 2 蛋白的一级结构 在蛋白生物学功能部分已经提到了b c l 2 蛋白分为促和抗凋亡两类。促凋亡和 抗凋亡蛋白的共同结构特征是大部分都有保守的羧基端跨膜结构域，这个跨膜结 构域可以使它们固定在不同的细胞器上面，包括核膜、内质网、线粒体外膜等【划。 促凋亡蛋白分为两个亚型，一种亚型是含有两个到三个b h 结构域的蛋白比如 b a x ，b a k ，b o k m t d 和b c l g ：另一种亚型是仅含有b h 3 结构域( b h 3 o n l y ) 的蛋 白例如b a d ，b i k ，b i d ，b i m ，h r k ，b m f , n o x a 和p u m a t 2 0 , 3 5 , 3 6 1 ( 见, f i g u r e2 ) 。 抗凋亡蛋白通常都含有b h l b h 4 结构域，例如b d 2 ，b c l x l ，b c l w ，b o o 和 b c l r a m b o 3 5 1 ，除y a l 和m c l 1 。b c l 2 ，b c l - x l 是完整的膜蛋白，它们主要位于 线粒体膜外【15 1 ，c 一末端裂解掉后抗凋亡蛋白可以进入到细胞液中【3 7 1 。研究证明 山东大学硕士学位论文 b h l b h 3 结构域在调节促凋亡和抗凋亡蛋白的相互作用方面发挥重要的作用【3 s l ， 它们可以形成一个疏水凹槽【3 9 1 ，此处是促凋亡蛋白的b h 3 区域的结合位点 4 0 1 。n _ 末端的b h 4 区域在背面通过和一些疏水残基作用来稳固此疏水凹槽，此结构域能够 调节蛋白之间作用( 例如磷酸酶和蛋白激酶r a f - 1 ) 而不是b e l 2 蛋白问的作用【4 1 1 。有 一项研究指出，在b e l - 2 和b e l - x l 蛋白中，b h 4 区域对于阻止线粒体的改变发挥重要 作用【4 2 】。对b h 3 - o n l y 蛋白来说，b h 3 区域更是至关重要，它是b h 3 - o n l y 蛋白发挥 促凋亡作用的区域 4 3 】而且它是高度保守的。 。删h 愀b 等。蜘盼d 2d“西柚叮 州 口， d 2d “西 柚叮 一一 o e ；- 2 2 m o a - j d 血函 = = = = 面正二二卫面正= 二二= j 函汇r j 3街 b “伍豇二= 二二卫西c = = = = 五商正二= = = 】蟊夏工= 亩3 阱 c 二= = 二二