（口腔临床医学专业论文）丹参酮Ⅱa对破骨细胞形成及分化的影响.pdf

中文摘要 丹参酮i i a 对破骨细胞形成及分化的影响 摘要 目的：本研究旨在利用全骨髓细胞培养系及破骨前驱细 胞培养系，探讨丹参酮i i a 对体外培养的破骨细胞形成及分 化的影响，为以破骨细胞活性增强为主的骨破坏性疾病的治 疗和预防提供一条新思路，为今后进一步深入研究破骨细胞 打下基础。 方法：选用4 周龄s d 雄性大鼠，利用全骨髓细胞培养 系及破骨前驱细胞培养系，在1 0 耀m 10 【，2 5 ( o h ) 2 d 3 和破骨 细胞分化因子s r a n k l 存在下，进行体外细胞培养，观察丹参酮i i a 对破骨细胞形成及分化的影响。 1 细胞培养及药物添加： 1 1 全骨髓细胞培养系：取4 周龄s d 雄性大鼠一只，用异 氟烷麻醉后，无菌条件下取其胫骨和股骨，剪掉骨垢端暴露 骨髓腔，然后用1 0 m l 注射器抽取不含血清的伐mem 培养 液冲洗骨髓腔，提取全骨髓细胞，2 0 0 0 转分离心5 分钟后， 加入含有1 5 胎牛血清的仪mem 培养液2 0 m l ，吹打混匀 后形成细胞悬液，计算细胞数，算出细胞原液浓度，然后配 制2 1 0 6 c e l l s m l 的细胞悬液1 3 m l ，添加活化型双羟维生素 d 3 ( 1 a ，2 5 ( o h ) 2 d 3 ) 和破骨细胞分化因子( s r a n k l ) ， 使其终浓度分别为1 0 培m m l 和2 0 n g m l ，然后用2 4 孔培养板 播种细胞，每孔加入2 1 0 6 c e l l s m l 的细胞悬液o 5 m l ( 1 1 0 6 c e l l s ) 。细胞播种后，将培养板放入c 0 2 培养箱内， 在3 7 、5 c 0 2 及饱和湿度条件下培养，培养至第4 天时 中文摘要 换培养液次，共培养7 天。 1 2 破骨前驱细胞培养系：全骨髓细胞提取后，离心浓缩成 1 5 m l ，然后注入葡聚糖凝胶g 1 0 ( s e p h a d e xg 1 0 ) 中过滤， 除去骨髓间质细胞，搜集非附着性骨髓细胞1 2 1 5 m l ，然后 计算细胞数，算出细胞原液浓度，配制细胞浓度为 2 1 0 6 c e l l s m l 的细胞悬液1 3 m l ，添加活化型双羟维生素d 1 ( 1 0 t ，2 5 ( o h ) 2 d 3 ) 和破骨细胞分化因子( s r a n k l ) ，使 其终浓度分别为1 0 m m l 和2 0 n g m l ，然后用2 4 孔培养板播 种细胞，每孔加入2 1 0 6 c e l l s m l 的细胞悬液o 5 m l ( 1 1 0 6 c e l l s ) 。细胞播种后，将培养板放入c o ，培养箱内， 在3 7 、5 c 0 2 及饱和湿度条件下培养，培养至第4 天时 换培养液一次，共培养7 天。 1 3 药物添加：在播种有两种细胞培养系细胞的2 4 孔培养板 中添加丹参酮i i a ，使终浓度分别为0 ，0 5 ，l ，2 ，5 ，1 0 u g m l ， 共加4 行6 列，每行6 个浓度，每个浓度每列4 孔( n - - 4 ) 。 第一列0 为对照组。 2 抗酒石酸酸性磷酸酶( t r a p ) 染色：两种细胞培养系细胞在 培养至7 天后分别行t r a p 染色，光镜下观察，计算t r a p 染色阳性细胞数。全骨髓细胞培养系计算3 核以上t r a p 染 色阳性细胞数。 3 统计学分析：使用s p s s1 6 0 统计学软件进行分析。数据 处理采用m e a n + s d 表示，采用方差分析对不同药物浓度相 同处理时间，各组与对照组之间相比较丹参酮i i a 对破骨细 胞形成及分化的影响，进行统计学分析。 结果： 1 破骨细胞的形态学特征 中文摘要 1 1 全骨髓细胞培养系：在全骨髓细胞培养系中，经tr a p 染色后，可见到大量成熟破骨细胞，其形态学特征为：细 胞体积大，呈椭圆形、条索形、漏斗形、油煎蛋形或不规则 形。胞浆丰满呈紫红色，并伸出许多伪足样突起。细胞内可 见到几个至几十个不等的细胞核，胞核不着色。细胞浆内可 见到空泡。见图( 1 5 ) 。 ， 1 2 破骨前驱细胞培养系：在此培养系中，经trap 染色 后，可见到大量破骨前驱细胞，其形态学特征和成熟破骨细 胞相似，只是细胞体积小，细胞核大多为单核，也可见到2 核者。见图( 6 ，7 ) 。此类细胞为不成熟的破骨前驱细胞， 如在破骨细胞分化因子刺激下，可相互融合，形成大的成熟 破骨细胞。 2 丹参酮i i a 对破骨细胞形成的抑制 在全骨髓细胞培养系中，o 5 、1 、2 u g m l 组与对照组比 较，t r a p 染色阳性细胞( 3 核以上) 数仅为对照组的5 5 0 4 、 2 5 1 8 、9 7 1 ，经统计学分析，加药组对破骨细胞的形成 有抑制作用，当药物浓度为1 u m l 时与对照组相比对破骨细 胞形成有显著抑制( p o 0 1 ) 。 在破骨前驱细胞培养系中，o 5 、1 、2 、5 u g m l 组与对照 组相比，t r a p 染色阳性细胞( 单核或2 核) 数仅为对照组 的9 5 0 1 、7 0 9 3 、4 0 7 8 、2 3 9 ，经统计学分析，加药 组对破骨细胞的形成有抑制作用，当药物浓度为2 u g m l 时与 对照组相比对破骨细胞形成有显著抑制( p o 0 1 ) 。 结论： 1 丹参酮i i a 直接作用于破骨细胞系列细胞，抑制其形成与爿 化。 中文摘要 2 丹参酮i i a 对成熟破骨细胞及破骨前驱细胞的抑制作用在一 定浓度范围内随药物浓度的增加，抑制作用增强。 关键词：丹参酮i i a ；破骨细胞；细胞 英文摘要 t h e i n h i b i t o r ye f f e c to f t a n s h i o n e l i ao nf o r m a i o na n d d i f f e r e n t i a t i o no fo s t e o c l a s t s a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t h ea i mo ft h ep r e s e n ts t u d yi s t oi n v e s t i g a t e t h ee f f e c t so ft a n s h i o n e i i ao nf o r m a i o na n dd i f f e r e n t i a t i o no f o s t e o c l a s t si nw h o l eb o n em a r r o wc u l t u r es y s t e ma n ds t r o m a l c e l l d e p l e t e db o n em a r r o wc u l t u r es y s t e m ，t op r o v i d ean e ww a y t h a tt r e a t sa n dp r e v e n t sb o n ed e s t r u c t i v e n e s sd i s e a s e sw h i c ha r e c a u s e db yo s t e o c l a s ta c t i v i t y ，a n dt oo f f e rb a s i ce v i d e n c ef o r f u r t h e rr e s e a r c ho no s t e o c l a s t m e t h o d ：a4w e e k a g es dm a l er a tw a su s e di nt h e e x p e r i m e n t 0 s t e o c l a s ti nt h ew h o l em a r r o wc u l t u r es y s t e ma n d s t r o m a lc e l l d e p l e t e db o n em a r r o wc u l t u r es y s t e mw e r ec u l t u r e d a t1o 一8 mla ，2 5 ( o h ) 2d 3a n do s t e o c l a s td i f f e r e n t i a t i o nf a c t o r s r a n k li f lv i t r o t h ee f f e c t so ft a n s h i o n e l i ao nf o r m a i o na n d d i f f e r e n t i m i o no fo s t e o c l a s t sw e r eo b s e r v e d 1c e l lc u l t u r ea n da d d i n gd r u g s ： 1 1t h ew h o l em a r r o wc u l t u r es y s t e m ：a4w e e k a g es dm a l e r a tw e r eu s e d t h et i b i aa n df e m u rw e r et a k e ni ns t e r i l e c o n d i t i o nu n d e ra n a e s t h e s i ab yi s o f l u r a n e ，t h eb o n ed i r t sw e r e s h e a r e db r e a kt o e x p o s e m a r r o wc h a m b e r s t h em a r r o w c h a m b e r sw e r ef l u s h e dw i t ht h ea m e mc u l t u r ef l u i dw i t h o u t f e t a lb o v i n es e r u mb ya10m li n j e c t o r , w h o l em a r r o wc e l lw e r e c o l l e c t e da n dc e n t r i f u g a t e di n2 0 0 0r m i nf o r5m i n u t e s ，t h e nt h e 5 英文摘要 a m e mo fs e r u mc e l lc u l t u r ef l u i dw i t hl5 f e t a lb o v i n es e r u m 2 0m l sw a sa d d e da f t e rb l o w i n gi n t oe e l ls u s p e n s i o n t h e n 2x10 0 c e l l s m lc e l l s u s p e n s i o n w a sp r e p a r e d b yc a l c u l a t i n g n u m b e r so fo s t e o c l a s t s 1a ，2 5 ( o h ) 2d 3a n dp r o m o t i n gc e l l d i f f e r e n t i a t i o nf a c t o rf s r a n k l )w e r ea d d e di n t ot h ee e l l s u s p e n s i o n w h i c ht h ef i n a lc o n c e n t r a t i o n sw e r e1o 8m m la n d 2 0n g m lr e s p e c t i v l y t h ec e l ls u s p e n s i o nw a si n o c u l a t e di n t o2 4 - w e l lc u l t u r ep l a t e ( 0 5 m le a c hw e l l ) t h e2 4 一w e l lc u l t u r ep l a t e w a sc u l t u r e di nt h ec 0 2i n c u b a t o rw i t h5 c 0 2a n ds a t u r a t e d d e g r e eo fh u m i d i t ya t37 o nt h e4 t hd a y c u l t u r ef l u i dw a s r e p l a c e do n c e t h ec e l l sw e r ec u l t u r e df o r7d a y st o t a l l y 1 2s t r o m a lc e l l d e p l e t e db o n em a r r o wc u l t u r es y s t e m ：t h e w h o l em a r r o wc e l l sw e r ec e n t r i f u g a t e dt oc o n d e n s ei n t o1 5m 1 t h e nf i l t e r e db ys e p h a d e xg10 ，m a r r o wm e s e n c h y m a lc e l l sw e r e r e m o v e d m a r r o wc e l lw i t h o u ts t i c k a b i l i t yw e r ec o l l e c t e d12 15 m 1 t h e na m e mo ft h es e r u mc e l lc u l t u r ef l u i dw i t hl5 f e t a l b o v i n es e r u m2 0m l sw a sa d d e d ，a f t e rb l o w i n gt h e mt oc e l l s u s p e n s i o n t h e n2 10 6 c e l l s m lc e l ls u s p e n s i o nw a sp r e p a r e d 1 q ，2 5 ( o h ) 2d 3 ( f i n a lc o n c e n t r a t i o n ，1 0 - 8m m 1 ) a n d p r o m o t i n g c e l ld i f f e r e n t i a t i o nf a c t o r ( s r a n k l )( f i n a l c o n c e n t r a t i o n ，2 0n g m 1 ) w e r ea d d e di n t ot h ec e l ls u s p e n s i o n t h ee e l l s u s p e n s i o nw a si n o c u l a t e di n t o2 4 w e l l c u l t u r e p l a t e ( o 5 m le a c hw e l l ) t h e2 4 - w e l lc u l t u r ep l a t ew a sc u l t u r e d i nt h ec 0 2i n c u b a t o rw i t h5 c 0 2a n ds a t u r a t e dd e g r e eo f h u m i d i t ya t3 7 a f t e rb e i n gc u l t u r e d4d a y s ，c u l t u r ef l u i dw a s r e p l a c e do n c e t h ec e l l sw e r e c u l t u r e df o r7d a y st o t a l l y 6 英文摘要 1 3a d d i n gd r u g s ： t a n s h i o n e l i aw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n sw e r ea d d e dt o 2 4 w e l lc u l t u r ep l a t e t h ec o n c e n t r a t i o nw a s0 ，0 5 ，l ，2 ，5 ， 10 u g m lr e s p e c t i v e l y 2a n t i - t a r t a r i ca c i d a c i d i t yp h o s p h o r i c a c i dm a o ( t r a p ) s t a i n i n g ：o nt h e7 t hd a y ，t w ok i n d so fc e l lc u l t u r el i n e sw e r e s t a i n e dw i t ht r a p t h ep o s i t i v ec e l l sf o rt r a p ，w h i c hc o n t a i n n u c l e u sm o r et h a nt h r e e ，w e r eo b s e r v e da n dc a l c u l a t e dw i t h l i g h tm i c r o s c o p e 3t h es t a t i s t i ca n a l y s i s ：s p s s16 0t h es t a t i s t i c sl e a r ns o f t w a r e w a su s e dt oc a r r yo na n a l y s i s t h ed a t aw a sr e c o r d e di nm e a n + s d ，a n a l y s i s o fv a r i a n c ew a s a d o p t e d f o rd if f e r e n t c o n c e n t r a t i o n sa n dc o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p r e s u l t ： 1t h em o r p h o l o g yc h a r a c t e r i s t i c so fo s t e o c l a s t s ： 1 1t h ew h o l em a r r o wc e l lc u l t u r el i n e ： t h ep o s i t i v ec e l l sw e r em a u v e ，t h e r ea r em a n yp r o c e s s e sa n d n u c l e u s t h ec e l l s a r e r o u n d ，e l l i p s e ，a n d s oo n t h e c y t o c h y l e m ai sr i c hw i t hv a c u o l e s 1 2s t r o m a lc e l l - d e p l e t e db o n em a r r o wc u l t u r es y s t e m ： a f t e rt r a ps t a i n i n g ，an u m b e ro fs t r o m a lc e l l d e p l e t e db o n e m a r r o wc e l l sw e r eo b s e r v e d t h em o r p h o l o g yc h a r a c t e r i s t i c so f t h ec e l l sa r el i k em a t u r eo s t e o c l a s t s ，b u tt h eb o d yo ft h ec e l l si s s m a l l e r ，t h e r ei s o n en u c l e u si n m a n yc e l l s t h e c e l l sa r e i m m a t u r es t r o m a lc e l l - d e p l e t e db o n em a r r o wc e l l s ，l a t e rb e c o m e m a t u r eo s t e o c l a s t sb ys t i m u l a t i n go fd i f f e r e n t i a t i o nf a c t o r 7 英文摘要 2 i n h i b i t o r ye f f e c to f t a n s h i o n e l i ao no s t e o c l a s tf o r m a t i o n ： i nt h ew h o l em a r r o wc e l lc u l t u r el i n e t h en u m b e r so fp o s i t i v e c e l l sf o rt r a p s t a i n i n ga r e5 5 0 4 、2 5 1 8 、9 7 1 i no 5 ，1 ，2 u g m l t a n s h i o n e l i ag r o u pc o m p a r i n gt oc o n t r o lg r o u p t h e n u m b e r so fp o s i t i v ec e l l sf o rt r a ps t a i n i n ga r em u c hl e s si n0 5 ， 1 ，2u g m lt a n s h i o n e l i ag r o u pt h a nc o n t r o lg r o u p t a n s h i o n e l i a s h o w si n h i b i t o r ye f f e c to nm a t u r eo s t e o c l a s tf o r m a i o na n d d i f f e r e n t i a t i o ni ne x p e r i m e n t a lg r o u p i ns t r o m a l c e l l d e p l e t e d b o n em a r r o wc u l t u r el i n e ，t h e n u m b e r so fp o s i t i v ec e l l sf o rt r a ps t a i n i n ga r e8 5 7 4 、 4 1 1 4 、2 2 4 i nl ，2 ，5 u g m lt a n s h i o n e l i ag r o u pc o m p a r i n g t oc o n t r o lg r o u p t h en u m b e r so fp o s i t i v ec e l l sf o rt r a p s t a i n i n ga r em u c hl e s s i n 2u g m lt a n s h i o n e l i ag r o u pt h a n c o n t r o l g r o u p t a n s h i o n e l i a s h o w s i n h i b i t o r y e f f e c to n i m m a t u r eo s t e o c l a s tf o r m a i o na n dd i f f e r e n t i a t i o ni n e x p e r i m e n t a lg r o u p c o n c l u s i o n ： lt a n s h i o n e i i as h o w sd i r e c te f f e c t so no s t e o c l a s ts e r i e sc e l l s a n di n h i b i t st h e i rf o r m a i o na n dd i f f e r e n t i a t i o n 2w i t ht h ec o n c e n t r a t i o no ft a n s h i o n e l i aa s c e n d i n g ，i t s i n h i b i t o r ye f f e c to nm a t u r ea n di m m a t u r eo s t e o c l a s t si n c r e a s e d k e yw o r d s ：t a n s h i o n e l i a ；o s t e o c l a s t ；t h ec e l lc u l t u r e 8 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师( 或指导小组) 的指导下，由本人独 立e 成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河 北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交 流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文， 第一署名单位为河北医科大学，试验材料、原始数据、申报 的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应 的法律责任。 孵生虢榭鲕擗黪级学院领导擗誉豢霎 ， 鞋 j 魏戳：警 ? 神年4 月芗 日 河北医科大学 研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成兵，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含 其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审 定。本论文由本人独立撰写，文责自负。 研究生签名：枋夏弼导师签 歹 日 研究论文 丹参酮l la 对破骨细胞形成及分化的影响 - j 一 刖声 丹参为唇形科植物，药用部分为其干燥根及根茎，丹 参的化学成分包括脂溶性二萜醌类及水溶性两类。现代医学 认为，丹参具有：抗衰老作用；免疫增强作用；降低血压，改 善微循环，对缺氧心肌有保护作用；促进受损组织再生和修 复的作用；抗肿瘤；抗菌；镇静等作用。丹参酮i i a 是丹参 的脂溶性成分，主要用于治疗冠心病，肺心病等心血管疾病， 尤其是制备成丹参酮i i a 磺酸钠后。近来有研究表明丹参酮 i i a 能够抑制巨噬细胞中磷脂酶a 2 来达到其抗炎的作用。 破骨细胞是具有蚀骨功能的细胞，其形态多样，通常 呈油煎蛋状，长条形等，并可见到伪足，较一般细胞大，多 含有几个至几十个细胞核。破骨细胞与成骨细胞在骨的新陈 代谢中起着主要的作用，两者间靠未知的机理维持着动态平 衡。当破骨细胞活性增强时，则以骨吸收为主，有可能发生 以骨吸收为主要特征的疾病如牙周炎，骨质疏松症等疾病； 当破骨细胞活性受到抑制时也就是成骨细胞活性增强时，则 以骨形成为主，有可能发生以骨过量形成为主的疾病如石骨 症等疾病。 牙周炎及骨质疏松症等以骨吸收为主要特征的疾病严 重影响人类健康，虽然治疗方法多样，但总的治疗效果不佳。 牙槽骨吸收是牙周炎的主要病理变化之一，也是造成牙周炎 患者牙齿松动和脱落的主要原因。骨质疏松是以骨量减少， 骨组织显微结构退化，骨脆性增加，骨折发生率升高为特征 研究论文 的全身性骨骼疾病。随着人口老龄化的加剧，w h o 已将骨 质疏松症列为老年三大疾病之一。临床上将骨质疏松分为原 发性骨质疏松和继发性骨质疏松。原发性骨质疏松分为绝经 后骨质疏松与老年性骨质疏松。目前认为本病的发生与遗传 因素，绝经，各种激素的代谢异常，生活习惯与方式有关。 祖国医学则认为骨质疏松的发生与“肾虚有关。肾为先天之 本，肾藏精，精生髓，髓生骨，故骨者，肾之所主也；髓者， 肾精所生，精足则髓足，髓足则骨强。肾精虚少，骨髓化源 不足，不能营养骨骼，而致骨髓空虚，骨矿含量下降，故发 生骨质疏松。骨质疏松的主要临床表现为背部等处的骨疼 痛，畸形及易发生骨折。人体的骨骼处在不断的新陈代谢过 程中，在这一过程中，成骨细胞与破骨细胞靠未知的机制巧 妙的维系着骨吸收与骨形成之间的平衡。因此如何抑制破骨 细胞活性则是治疗诸如骨质疏松等疾病的关键所在。目前， 临床上治疗骨质疏松症的药物较多，西药方面主要包括抑制 骨吸收的制剂与刺激骨形成的制剂，近期疗效满意，远期效 果尚不肯定，况且药物的副作用多，价格昂贵。祖国医学根 据“肾主骨”的理论，采用补肾为主的治疗方法，从多方面， 多层次以补肾治疗骨质疏松，取得了引人注目的疗效。丹参 应用较为广泛，但其无论在中药方剂中治疗骨质疏松还是单 独应用治疗骨质疏松均有独到之处，取得了令人满意的效 果。李隆敏等【1 】选择绝经后的骨质疏松妇女6 1 例，采用中药 丹参酮治疗，对照组采用尼尔雌醇治疗，同时补充钙制剂治 疗一年，研究结果表明：丹参酮和尼尔雌醇均有抑制骨转换 率，延缓或阻断绝经后骨快速丢失的作用。这一研究结果表 明，丹参酮对绝经后的骨质疏松有治疗作用。这一研究结果 研究论文 提示我们，既然丹参酮对绝经后的骨质疏松有治疗作用，有 可能对破骨细胞也有抑制作用。故在上述研究启发下，我们 设计此课题：丹参酮i i a 对破骨细胞形成与分化的影响。有 关丹参酮i i a 用于破骨细胞的研究目前国内尚未见报道。 本研究旨在探讨丹参酮i i a 对体外培养的破骨细胞形成 与分化是否有抑制作用，并探讨其可能的机制，为治疗以破 骨细胞活性增强为主的骨破坏性疾病提供新的思路，为以后 进一步研究破骨细胞打下基础。 材料与方法 l 材料 1 1 实验动物 s d 雄性大鼠( 4 周龄) ：购自河北医科大学动物实验中心， 清洁级，体重1 5 0 9 ，合格证编号8 1 1 0 6 2 。 1 2 仪器及设备 b b 5 0 6 0 b b16 二氧化碳培养箱 上海h e r a e u s 公司 v d 6 5 0 型桌上式细胞培养超净操作台苏州净化设备有限公 司 b f x 5 3 2 0 型低速离心机中国上海泸南科学仪器联营厂 x d 1 0 1 9 8 1 0 倒置显微镜江南公司 c x 2 1 光学显微镜日本o u m p u s 微量加样器法国g i l s o n 2 5 1 0 型变频振荡仪上海新波生物技术有限公司 g f 3 0 0 型电子天平 j a p a na & dc o m p a n y , l i m i t e d 7 2 5 型超低温冰箱f o r m as c i e n t i f i c i n c 研究论文 2 4 孔细胞培养板c e l ls t a r 一次性使用三通阀日本尼普洛 株式会社 1 3 药品及试剂 丹参酮i i a中国药品生物制品检定所 l 仅，2 5 ( oh ) 2d3英国普利茅斯生物研究实验室 仪mem 培养基 美国g i b c ob r l s o l u b l er ankl 英国p e p r o t e cs c i e n c e 抗酒石酸酸性磷酸酶( tra p ) 试剂盒美国s i g m a 公司 葡聚糖凝胶上海如吉科技发展有限公司 标准胎牛血清( 产品批号0 7 0 3 2 8 ) 山东银香伟业生物工程有 限公司 注射用青霉素钠( 产品批号y 0 8 0 7 3 1 0 ) 华北制药有限公司 注射用硫酸链霉素( 产品批号n 0 8 0 6 0 1 ) 深圳华药南方制药 有限公司 丙酮石家庄市有机化工厂 甲醛溶液石家庄市有机化工厂 异氟烷鲁南贝特制药有限公司 二甲基亚砜天津市光复精细化工研究所 2 实验方法 2 1 实验用品的消毒 2 0 0 u l 吸头，1 0 0 0 u l 吸头分别装入吸头盒内锡纸包装；5 m l 玻璃吸管，l o “玻璃吸管各5 支，锡纸分别包装；5 0 m l 注 射器除去内芯锡纸包装；组织剪两把锡纸包装，镊子两把锡 纸包装；以上用品布包包裹。 15m l 离心管2 0 个，5 0m 1 离 心管3 0 个装入储槽内； 5 0 9 葡聚糖凝胶粉剂放入2 5 0 m l 干 研究论文 净的生理盐水瓶中，加入蒸馏水1 5 0 m l ，将瓶子放入另一储 槽；连同以上用品，用前高压蒸汽l5 磅，2 0 分钟消毒灭菌。 放入生物安全柜中备用，葡聚糖凝胶消毒后放入4 恒温冰 箱备用。 2 2 药液的配制及葡聚糖凝胶柱的制备 2 2 1 仅mem 培养液的制备 ( 1 ) 仅mem 粉一袋+ 超纯净水8 0 0 m l ，完全溶解； ( 2 ) 加碳酸氢钠3 0 2 9 待完全溶解后加h c l 测p h 达7 2 ； ( 3 ) 再次加超纯净水至1 0 0 0 m l ； ( 4 ) 加抗生素( 青霉素及链霉素) ； ( 5 ) 滤过灭菌( o 2 2 微米微孔滤膜过滤，p o m p 排气) ； ( 6 ) 5 0 0m l 灭菌瓶分装4 储藏备用。 2 2 2l o t ，2 5 ( oh ) 2d3 储存液的分装 ( 1 ) 取1a ，2 5 ( oh ) 2d3 原液5 0 微升( 5 0 微升一支) ，加 入无水乙醇1 1 5 0 微升，使总量至1 2 0 0 微升( 即2 4 倍稀释) ； ( 2 ) 以1 0 0 u l 只分装于1 2 支灭菌试管内，3 0 冰箱内 储存备用； ( 3 ) 应用前再次稀释1 0 0 0 倍，使最终浓度为1 1 0 一m 。 2 2 3s o l u b l erankl 储存液分装 ( 1 ) 取rankl 冻干粉一支( 1 0 微克) ； ( 2 ) 0 1 mt r i s h c lb a f f e r 5 0 微升溶解rankl ； ( 3 ) 以5 u l 只分装于l o 支灭菌冷冻管内，3 0 冰箱内 储存备用； ( 4 ) 使用前取出一支，先用含1 0 f b s 伐mem 培养液 4 9 5 微升稀释( 即稀释1 0 0 倍) ；添加前再次稀释10 0 倍，使 最终浓度为2 0 n g m l 。 研究论文 2 2 4o 1 mt r i s h c lb a r f e r 的制备 ( 1 ) t r i s h c l1 2 1 1 9 ( o 1 m ) ； ( 2 ) d d h 2 08 0 0 m l ( 添加溶解后，调整p h 至8 2 ) ； ( 3 ) 再次加d d h 2 0 至1 0 0 0 m l 备用。 2 2 5 丹参酮i i a 储存液的制备 ( 1 ) 储存液的浓度：l m g m l 及1 0 0 u g m l 。 ( 2 ) 储存液的配制：称取丹参酮i i a 粉剂l m g 放于灭 菌冷冻管内，加入二甲基亚砜l m | 完全溶解，配成l m g m l 的储存液。从l m g m l 的储存液中取出1 0 0 微升放于另一支 灭菌冷冻管内，加入二甲基亚砜9 0 0 微升即配成1 0 0 微克 毫升的储存液，储存于4 。c 恒温冰箱，使用时间不超过两周。 l m g m l 的储存液冷冻保存。 2 2 6 tr ap ( 抗酒石酸酸性磷酸酶) 固定液的制备 在染色之前，按产品说明书配制。首先取无菌2 0 m l 试 管一支，按以下顺序依次加入试剂：a c e t o n e ( 丙酮) 6 5 m l ， c i t r a t e ( 枸橼酸) 2 5 m l ， f o r m a l d eh y d e ( 甲醛) o 8 m l ，充分混匀，计9 8 m l ，现 配现用。 2 2 7t rap 染色液的制备 同样是在染色之前配制，按产品说明制备。取无菌2 0 m l 试管一支，按顺序依次加入： ( 1 ) f a s tg a r n e tg b cs o l uo 1 m l ( 2 ) s o d i u mn i t r i t es o l u0 1 m l ( 3 ) d h 2 0 9m l ( 4 ) n a p h t h o l a s b lp h o s p h o r i ca c i d o 1m l ( 5 ) a c e t a t es o l u0 4 m l 研究论文 ( 6 ) t a r t r a t es o l uo 2 m l ( 1 ) ，( 2 ) 加入之后先充分混匀，然后依次添加蒸馏 水等各种试剂，共计9 9 m l ，现配现用。 2 2 8 葡聚糖凝胶柱的制备 ( 1 ) 消毒后5 0 m l 注射器一个，除去内芯； ( 2 ) 注射筒与注射头交接处置消毒后的脱脂棉球一个； ( 3 ) 固定架固定针筒，针头处接关闭状的三通； ( 4 ) 将灭菌的葡聚糖凝胶混匀，抽取3 0 m l 注入针筒内， 打开三通，缓慢过滤沉淀，待凝胶沉淀液面至1 5 m l 时为止； 关闭三通，放入4 。c 恒温冰箱过夜； ( 5 ) 实验前1 小时用含有1 5 胎牛血清的仪mem 培 养液5 0 m l 缓慢注入凝胶柱内，打开三通，自然过滤洗涤凝 胶柱后待用。 2 3 全骨髓细胞培养 2 3 1 全骨髓细胞提取 实验开始前3 0 分钟将标准胎牛血清放入3 7 水浴箱内 解冻；取5 0m 1 无菌离心管一个，装入4 0 m l 不含胎牛血清 的仅一mem 培养液，以备冲洗全骨髓细胞用。 ( 1 ) 选4 周龄s d 雄性大鼠1 只，7 5 乙醇消毒后，采 用异氟烷吸 入麻醉； ( 2 ) 待麻醉起效后，无菌条件下取大鼠两侧胫骨和股 骨，剪掉骨垢端暴露骨髓腔； ( 3 ) 用1 0 m l 注射器抽取不含血清的仅mem 培养液， 换用2 5 号针头后自骨髓腔内冲出骨髓细胞至5 0m l 无菌离心 管内； 研究论文 ( 4 ) 将所提取的细胞悬液充分吹打，待没有团块后， 将盛有细胞的离心管与平衡管一起放入离心机内离心，调整 转速( 2 0 0 0 转分) ，离心5 分钟；离心过程中配制含有1 5 胎牛血清的仪mem 培养液5 0 m l ( 7 5 m l 胎牛血清加入 4 2 5 m l mem 培养液中) 备用； ( 5 ) 离心结束后弃去上清液，加入含1 5 胎牛血清的 q mem 培养液2 0 m l ，充分吹打混匀，形成细胞悬液，此液 简称为细胞原液。 2 3 2 细胞数的计算( 原液浓度及稀释倍数) ( 1 ) 取以上提取的细胞悬液2 5 u l 放入试管内，然后加 入5 a c o h ( 醋酸) 4 7 5 u l ，即形成2 0 倍稀释的细胞悬液； 将试管放在振荡器上，振荡2 0 秒钟，目的是去除红细胞。 ( 2 ) 计算细胞数：取振荡后细胞悬液滴入细胞计数盘， 勿超过边缘，盖玻片覆盖，倒置显微镜下计算细胞数，计数 盘4 个大格内所有细胞均计入。本实验计算细胞数为5 3 7 个， 根据公式( 细胞数4 ) 2 0 x 1 0 4 c e l l s m l 推算细胞原液的浓度， 本实验计算如下( 5 3 7 4 ) x 2 0 x 1 0 4 = 2 6 8 5 x 1 0 6 c e l l s m l 即本实 验细胞原液浓度为2 6 8 5 x 1 0 6 c e l l s m l ，而我们需要的目的浓 度是2 1 0 6 c e l l s m l ，所以细胞原液需要稀释。 ( 3 ) 稀释倍数计算如下：稀释倍数= 原液浓度目的浓度； 本实验稀释倍数= 2 6 8 5 x 1 0 6 c e l l s m l 2 x 1 0 6 c e l l s m l = 1 3 4 2 5 ，即 原液需要稀释1 3 4 2 5 倍才能达到需要的目的浓度。本实验需 要2 1 0 6 c e l l s m l 的细胞悬液4 0 m l ，简称为目的量。 ( 4 ) 达到目的浓度所需原液的量，计算如下：达到目 的浓度所需原液的量= 目的量稀释倍数。本实验计算如下： 达到目的浓度所需原液的量= 4 0 m l 1 3 4 2 5 - - - - - - - 2 9 8m l 。即取 研究论文 2 6 8 5 x1 0 6 c e l l s m l 的细胞原液2 9 8m 1 放入灭菌的5 0 m l 离心 管内，然后加入3 7 0 2m l ( 4 0 2 9 8 ) 含1 5 胎牛血清的o f , mem 培养液即可配成2 1 0 6 c e l l s m l 的细胞悬液4 0 m l ，然 后加入10 c ，2 5 ( oh ) 2 d 3 储存液4 0 u l ，操作过程应避光，即l q ， 2 5 ( o h ) 2 d 3 终浓度为1 1 0 一m ；再加入4 u ls o l u b l e 1 ran kl 储存液，即s o l u b l e1 rank l 终浓度为2 0 n g m l ；加液 过程在超净工作台上操作，至此，所需2 1 0 6 c e l l s m l 的细胞 悬液目的量配置完成。 2 3 3 培养细胞、加药 ( 1 ) 细胞接种：取4 行6 列2 4 孔培养板一块，每孔加 入2 1 0 6 c e l l s m l 的细胞悬液0 5 m l ( 1 1 0 6 c e l l s ) 。 ( 2 ) 加入丹参酮i i a ：取1 0 0 u g m l 丹参酮i i a 分装液一 支于培养板的第2 列分别加入2 5 u l ，每加一孔均需换一个吸 头；第3 列每孔加入5 u l ；第4 列每孔加入1 0 u l 。加完第4 孔后，将此液放入4 恒温冰箱保存，取l m g m l 丹参酮i i a 储存液一支。第5 列每t l d h 入l m g m l 丹参酮i i a 储存液2 5 u l ； 第6 列每孔加入5 u l 。加完后剩余药液放入4 c 恒温冰箱保存。 第