（微生物学专业论文）嗜热厌氧梭菌降解纤维素及产氢特性研究.pdf

山东人学博i j 学位论文 摘要 木质纤维素是最丰富的可再生资源和能够转化成燃料的底物，将纤维质的生 物量转化为可再生能源具有重大的意义。由于纤维素具有高度有序、紧密结合的 晶体结构，又与半纤维素相联结，外周还由木质素包围，要把它直接水解成可利 用的葡萄糖相当困难。目前对木质纤维素酶解多使用来源于丝状真菌的纤维素 酶，但由于酶降解效率低下，酶解过程受产物抑制，酶蛋白不耐高温等，制约了 其大规模应用。某些纤维素降解菌，如热纤梭菌具有高效的纤维素降解复合体一 一纤维小体，能有效降解纤维素，具有直接把生物质转化为乙醇和h 2 的能力， 为利用一种微生物直接转化生物质的设想提供了可能。但在利用热纤梭菌进行乙 醇发酵过程中往往伴有乙酸和丁酸等副产物的产生，而且最终产物的最高积累浓 度仅为3 左右，只及酿酒酵母与发酵单胞菌属的2 5 3 0 。利用d n a 重组技术 重新设计糖酵解途径，阻断副产物的形成路线，解除乙醇生物合成的代谢阻遏作 用，同时提高细胞对高浓度乙醇的耐受性，是高产乙醇的梭菌属工程菌构建的主 要内容。 高温厌氧菌还具有产h 2 的能力。氢气具有热值高，无污染的特点。生物产 氢包括光合产氢和发酵产氢。发酵产氢需要设备简单，不需光照，但h 2 的摩尔 产量低和原材料价格高仍是未解决的问题。发酵产氢只能利用有机物降解的1 5 能量。因此提高h 2 的产量将是今后研究的重点。另外，也可利用两步法，将发 酵产氢与光合产氢或与产甲烷结合，提高对生物质的利用效率。使用纤维素或废 水产氢，可降低原料的成本。 本论文通过研究嗜热厌氧纤维素降解菌的降解特性，对其纤维素酶系和调控 机制有更深入的了解，同时可利用其能够转化纤维素生成氢气的特性，研究纤维 素发酵产氢的可行性。 本论文的主要研究内容如下： 1 嗜热厌氧纤维素降解菌的筛选与鉴定 以纤维素为唯一碳源，对嗜热厌氧纤维素降解菌进行富集。采用纤维素粉和 纤维二糖滚管法对富集后的菌群进一步纯化，得到纤维素降解菌j n 4 和其伴生 v i i 山东人学博i ：学位论义 菌g d l 7 。j n 4 能有效降解微晶纤维素和滤纸，也可利用玉米芯粉、玉米秸粉、 木糖渣等天然底物作为碳源生长，g d l 7 在富集液中数量较多，能利用纤维二糖、 葡萄糖和木糖生长。通过形态观察，生理生化特性和1 6 sr d n a 分析进行鉴定， 确定j n 4 为热纤梭菌( c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m ) ，g d l7 为热解糖高温厌氧杆菌 ( t h e r m o a n a e r o b a c t e r i u mt h e r m o s a c c h a r o l y t i c u m ) 。 2 ct h e r m o c e l l u mj n 4 和伴生菌zt h e r m o s a c c h a r o l y t i c u mg d l 7 的生长和产氢 特性 以纤维二糖为碳源，确定了ct h e r m o c e l l u m 心4 和ft h e r m o s a c c h a r o l y t i c u m g d l 7 的最适生长温度为5 5 6 0 ，并进行了生长曲线的测定。利用g c 和h p l c 对 发酵产物的分析表明，ct h e r m o c e l l u mj n 4 分解纤维素生成h 2 、乙酸、乙醇和乳 酸，zt h e r m o s a c c h a r o l y t i c u mg d l 7 可利用各种还原糖生成乙酸、乙醇、乳酸和 丁酸。ct h e r m o c e l l u mj n 4 可降解微晶纤维素、滤纸，未经预处理的玉米秸粉和 玉米芯粉。对ct h e r m o c e l l u mj n 4 的胞外蛋白酶活测定表明，ct h e r m o c e l l u mj n 4 以微晶纤维素为碳源生长时，发酵液具有c m c 酶活、磷酸膨胀纤维素酶活和微 晶纤维素酶活。以纤维二糖为碳源时，ct h e r m o c e l l u m 心4 的h 2 产率( y h ：) 约为 0 7 m o l h 2 m o l 二糖；以纤维二糖、葡萄糖和木糖为碳源时，z t h e r m o s a c c h a r o l y t i c u mg d 17 的h 2 产率 ( y h 2 ) 分别为4 m o lh 2 m o l 纤维二 糖，2 2 m o lh 2 m o l 葡萄糖和1 7 m o lh 2 m o l 木糖。 3 ct h e r m o c e l l u mj n 4 单独培养和与zt h e r m o s a c c h a r o l y t i c u mg d l 7 混合培养 利用纤维素生长和产氢的动力学研究 以微晶纤维素为碳源，研究了厌氧管内ct h e r m o c e l l u mj n 4 单独培养和与 zt h e r m o s a c c h a r o i y t i c u mg d l 7 混合培养的生长和产氢动力学。结果表明单独培 养ct h e r m o c e l l u mj n 4 可有效降解o 5 微晶纤维素，生长后期有纤维二糖、葡 萄糖的积累，乳酸、乙酸和乙醇的量逐渐增加，到6 0h 达到稳定，产h 2 能力为 o 8m o lh 2 m o l 葡萄糖。加入伴生菌zt h e r m o s a c c h a r o l y t i c u mg d l 7 ，与c t h e r m o c e l l u mj n 4 共同培养，可将ct h e r m o c e l l u mj n 4 产生的纤维二糖和葡萄糖 完全利用，乙酸和乙醇产量与ct h e r m o c e l l u m 心4 单独接种相比变化不大，有丁 v i i i 山东人学博f j 学位论文 酸产生，并在6 0h 后仍有增长，乳酸产生在6 0h 之后开始下降，最终完全检测 不到，而混合菌的产h ：能力提高到1 8m o lh 2 m o l 葡萄糖。 4 2 l 反应器中ct h e r m o c e l l u mj n 4 单独培养和与zt h e r m o s a c c h a r o l y t i c u m g d l 7 混合培养利用纤维素的生长和产氢情况 用自制的2 l 厌氧反应器在不控制p h 的情况下，以滤纸为碳源单独培养c t h e r m o c e l l u mj n 4 ，产氢量约为1 8 m m o l l 培养基，其它发酵产物有乙酸、乳酸和 乙醇，其中乙醇的含量较高，达到2 4m m o l 1 培养基以上，显示该菌有改造成为 纤维素乙醇生产菌的可能。与用厌氧管培养不同，发酵液中没检测到纤维二糖和 葡萄糖，表明扩大培养较有利于j n 4 的生长和代谢。ct h e r m o c e l l u mj n 4 与r t h e r m o s a c c h a r o l y t i c u mg d l 7 混合培养，在不控制p h 的情况下，产氢量约为 3 5 m m o l 1 培养基，其它发酵产物有乙酸、乳酸、丁酸和乙醇。乳酸含量在5 0 h 到达最高，然后逐渐减少，同时丁酸含量逐渐增加，与厌氧管培养结果相似。控 制p h 在p h 6 0 6 5 ，产氢量约为2 5 m m o l 1 培养基，比不控制p h 要少。其它发 酵产物中，乳酸含量最高，这表明p h 在6 0 6 5 的情况下，更有利于乳酸的生成， 造成产氢量的减少。如果延长培养时间，zt h e r m o s a c c h a r o l y t i c u mg d l 7 可利用 乳酸，会有更多的h 2 产生。 5 ct h e r m o c e i l u mj n 4 外切葡聚糖酶基因c e l s 的原核表达 以ct h e r m o c e l l u mj n 4 的基因组为模板，以ct h e r m o c e l l u ma t c c2 7 4 0 5 的 c e l s 基因为参考设计引物，p c r 扩增得到的序列与g e n b a n k 的己知序列进行比 对，结果表明扩增获得的片段为c e l s 基因，且与c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u ma t c c 2 7 4 0 5 的c e l s 基因仅有3 个碱基的差异。将ct h e r m o c e l l u my n 4 的c e l s 基因和 质粒p e t - 2 2 b 连接，构建表达载体，并利用大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 进行c e l s 的异 源表达，得到的重组蛋白r c e l s 具有水解磷酸膨胀纤维素的能力。 6 ct h e r m o c e l l u mj n 4 外切葡聚糖酶基因c e l s 的定点突变 结合蛋白质结构生物学信息，对ct h e r m o c e l l u mj n 4 的r c e l s 蛋白催化中心 i x 山东人学博：j ：学位论交 的相关位点进行d 2 5 5 n 和y 3 5 1 f 定点突变和原核表达，结果表明定点突变后的 两种r c e l s 蛋白均没有水解磷酸膨胀纤维素的能力。表明a s p 2 5 5 有可能作为广 义碱基团在外切葡聚糖酶c e l s 的催化反应中n 广- y 酸基团g l u 8 7 进行翻转型催 化反应。t y r 3 5 1 是c e l s 的保守位点，将其变成p h e 可z 日* 匕l - , 对c e l s 的结构与催化功 能造成影响。 关键词：嗜热，纤维素，厌氧，发酵产氢，c e l s ，定点突变 x 山东人学博j j 学位论文 a b s t r a c t c e l l u l o s ei st h em o s ta b u n d a n tr e n e w a b l er e s o u r c et h a tc a nb et u r n e di n t of u e l e f f e c t i v eu t i l i z a t i o no fc e l l u l o s ee f f e c t i v e l yi so fg r e a ts i g n i f i c a n c e h o w e v e r ? c e l l u l o s ei s v e r yd i f f i c u l tt oh y d r o l y z eb e c a u s eo fl a c ko fc e l l u l a s e sw i t hh i g h a c t i v i t i e s w h i c hh a sl i m i t e di t su s e s a tp r e s e n t ? c e l l u l a s e sa r em a i n l yf r o mf u n g i s o m ea n a e r o b i cb a c t e r i as u c ha sc l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u mp r o d u c ec e l l u l a s e sw h i c h c a nh y d r o l y z ec e l l u l o s ee f f e c t i v e l y ct h e r m o c e l l u mc a np r o d u c ee t h a n o la n dh 2 h o w e v e r , t h eu s eo fc t h e r m o c e l l u mf o re t h a n o lf e r m e n t a t i o no f t e nh a so r g a n i ca c i d s a s b y - p r o d u c t s t h eh i g h e s t c o n c e n t r a t i o no fe t h a n o li s o n l y a b o u t3 r e c o m b i n a n td n a t e c h n o l 0 9 3 7w a su s e dt or e d e s i g nt h eg l y c o l y s i sp a t h w a yt ob l o c k t h es y n t h e t i cp a t h w a yo fb y - p r o d u c t sa n dt oi m p r o v et h ec e l lt o l e r a n c et oe t h a n 0 1 h y d r o g e n i sac l e a na n ds u s t a i n a b l ee n e r g yc a r r i e rf o rt h ef u t u r eb e c a u s eo fi t sh i g h c o n v e r s i o ne f f i c i e n c ya n dn o n p o l l u t i n gn a t u r ew h e nu s e di nf u e lc e l l s a n a e r o b i c f e r m e n t a t i o nh a sb e e nd e m o n s t r a t e da sat e c h n i c a l l yf e a s i b l ew a yt op r o d u c e h y d r o g e n s o m ea n a e r o b i cb a c t e r i ac a nu s ef o rh ep r o d u c t i o n h o w e v e r , t h ec o s to f h y d r o g e np r o d u c t i o na n d l o wh y d r o g e ny i e l dc o u l dl i m i ti t sw i d e s p r e a da p p l i c a t i o na s a ne n e r g ys o u r c ei nt h ef u t u r e c e l l u l o s ei st h ep r o m i s i n ge c o n o m i c a ls o u r c ef o r h y d r o g e np r o d u c t i o n h y d r o g e np r o d u c t i o nb yf e r m e n t a t i o n c a nu s eo n l y15 e n e r g yo ft h eo r g a n i cm a t t e r t h e r e f o r e ，t oi m p r o v et h eh 2p r o d u c t i o ni sb e c o m i n g t h ef o c u so fe n e r g yr e s e a r c h c o m b i n a t i o no fh y d r o g e np r o d u c t i o nb yf e r m e n t a t i o n w i t hp h o t o s y n t h e t i ch y d r o g e np r o d u c t i o no rm e t h a n ep r o d u c t i o nc a ni m p r o v et h e e f f i c i e n c yo ft h eu s e o fb i o m a s s t h e r m o p h i l i ca n a e r o b i cb a c t e r i ac a ne f f e c t i v e l yu t i l i z e c e l l u l o s ea n dh a v eg r e a t p o t e n t i a lf o rh ep r o d u c t i o n t h es t u d yo fc e l l u l o s ed e g r a d a t i o nc h a r a c t e r i s t i c so f t h e r m o p h i l i ca n a e r o b i cb a c t e r i ac a nh e l pu sh a v eab e t t e ru n d e r s t a n d i n go ft h e i r c e l l u l a s e sa n dr e g u l a t i o nm e c h a n i s m s f u r t h e r m o r e ，w ec a nm a k eu s eo fc e l l u l o s e f e r m e n t a t i o nt op r o d u c th y d r o g e n t h em a i nr e s u l t so ft h et h e s i sa r ea sf o l l o w s ： x i 山东人学博i ：学位论文 1 s c r e e n i n ga n di d e n t i f i c a t i o no ft h e r m o p h i l i ca n a e r o b i cb a c t e r i a u s i n gc e l l u l o s ea st h es o l ec a r b o ns o u r c e ，t h et h e r m o p h i l i ca n a e r o b i cb a c t e r i at h a t c a nu t i l i z ec e l l u l o s ew e r ee n r i c h e df r o mr o t t e nw h e a ts t r a w s i n g l ec o l o n i e sw e r e i s o l a t e d b yu s i n ga g a r r o l lt u b e sc o n t a i n i n gc e l l o b i o s e ac e l l u l o s e - d e g r a d i n g b a c t e r i u mj n 4w a so b t a i n e da n di d e n t i f i e da sct h e r m o c e l l u mb y16 sr d n a a n a l y s i s a n dm o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o n a n o t h e rb a c t e r i u mt h a tw a st h em o s ta b u n d a n ti n t h e s a m p l e w a si s o l a t e da n di d e n t i f i e da st h e r m o a n a e r o b a c t e r i u m t h e r m o s a c c h a r o l y t i c u m 2 g r o w t ha n d h 2p r o d u c t i o np r o p e r t i e so fct h e r m o c e l l u ma n dz t h e r m o s a c c h a r o l y t i c u m t h e o p t i m a l g r o w t ht e m p e r a t u r e o fct h e r m o c e l l u mj n 4a n dz t h e r m o s a c c h a r o l y t i c u mg d 17w a s6 0 b y u s i n gc e l l o b i o s ea sc a r b o ns o u r c e t h e g r o w t hc u r v e so ft h et w os t r a i n sw e r ed e t e r m i n e d g ca n dh p l ca n a l y s i ss h o w e d t h a tt h ef e r m e n t a t i o np r o d u c t so fct h e r m o c e l l u mj n 4w e r eh 2 ，a c e t a t e ，l a c t a t ea n d e t h a n o lu s i n gc e l l u l o s ea sc a r b o ns o u r c e ct h e r m o c e l l u mj n 4c o u l du t i l i z e m i c r o c r y s t a l l i n ec e l l u l o s e ，f i l t e rp a p e ra n ds e v e r a lk i n d so fn a t u r a ls u b s t r a t e ss u c ha s c o r nc o bp o w d e ra n dc o r ns t a l k p o w d e r t h ee x t r a c e l l u l a rp r o t e i n so fc t h e r m o c e l l u mj n 4s h o w e dc m c a s e ，p a s c a s ea n dc e l l o b i o h y d r o l a s ea c t i v i t yw h e n g r o w n o n m i c r o c r y s t a l l i n e c e l l u l o s e t h ef e r m e n t a t i o n p r o d u c t s o fz t h e r m o s a c c h a r o l y t i c u mg d 17w e r eh e ，a c e t a t e ，b u t y r a t ea n de t h a n o lu s i n gr e d u c i n g s u g a ra sc a r b o ns o u r c e t h ep r o d u c t i o no fh y d r o g e nb yb o t hs t r a i n sw a si n v e s t i g a t e d t h eh y d r o g e ny i e l do fct h e r m o c e l l u mw a s0 7 m o lh 2 ( m o lc e l l o b i o s e ) t h e h y d r o g e ny i e l do fzt h e r m o s a c c h a r o l y t i c u mg d 17w a s 4 m o lh 2 ( t o o lc e u o b i o s e ) ， 2 2m o lh e ( m o lg l u c o s e ) a n d1 7 m o lh 2 ( m o lx y l o s e ) 3 t h eg r o w t hk i n e t i c sa n dh y d r o g e np r o d u c t i o no fct h e r m o c e l l u mj n 4a n d c o c u l t u r e so fct h e r m o c e l l u mj n 4a n dzt h e r m o s a c c h a r o l y t i c u mg d l7u s i n g m i c r o e r y s t a l l i n ec e l l u l o s ea sc a r b o ns o u r c e x i i 山东了i 学博l j 学位论文 u s i n gm i c r o c r 3 , s t a l l i n e c e l l u l o s ea sc a r b o ns o u r c ea n dh u n g a t et u b e s ，b a t c h f e r m e n t a t i o nw a s p e r f o r m e d t o i n v e s t i g a t e t h e g r o w t h c h a r a c t e r i s t i c sa n dh 2 p r o d u c t i o no fc t h e r m o c e l l u mj n 4c u l t u r e sa n dc o c u l t u r e so fc t h e r m o c e l l u mj n 4 a n dz t h e r m o s a c c h a r o l y t i c u mg d 17 t h er e s u l t ss h o w e dt h a tct h e r m o c e l l u mj n 4 c a nd e g r a d em i c r o c r y s t a l l i n ec e l l u l o s et o p r o d u c eh y d r o g e n e t h a n o l ，a c e t a t ea n d l a c t a t e ? b u tc a n n o tc o m p l e t e l 3 7u t i l i z ec e l l o b i o s ea n dg l u c o s ep r o d u c e db yt h ec e l l u l o s e d e g r a d a t i o n i t sh y d r o g e ny i e l dw a sa b o u t0 8m o lh 2 ( m o lg l u c o s e ) ，w i t hl a c t a t e a st h em a i np r o d u c t w h e nct h e r m o c e l l u mj n 4 w a sc o c u l t u r e dw i t hr t h e r m o s a c c h a r o l y t i c u mg d 17 ，h y d r o g e np r o d u c t i o ni n c r e a s e da b o u t2 - f o l da n dh 2 y i e l dr e a c h e dah i g hl e v e lo f1 8m o lh 2 ( m o lg l u c o s e ) b u t y r a t ew a st h em o s t a b u n d a n tb y p r o d u c ta n dl a c t a t ew a sn o td e t e c t e da tt h ee n do ft h ec o - c u l t u r ep r o c e s s 4 t h eg r o w t ha n dh 2 p r o d u c t i o no fc t h e r m o c e l l u mj n 4a n dc o c u l t u r e so fc t h e r m o c e l l u mj n 4a n dz t i t e r m o s a c c h a r o l y t i c u mg d l 7i n2 la n a e r o b i cr e a c t o r u s i n gf i l t e rp a p e ra sc a r b o ns o u r c ei n2 la n a e r o b i cr e a c t o r ct h e r m o c e l l u mj n 4 c a np r o d u c e18 m m o lh 2 ic u l t u r e o t h e rf e r m e n t a t i o np r o d u c t sa r ee t h a n o l ，a c e t i c a c e t a t ea n dl a c t a t e t h eh i g h e re t h a n o lc o n t e n to f2 4m m o l lc u l t u r ei n d i c a t e dt h a t t h es t r a i nh a dt h ep o t e n t i a lo fc e l l u l o s i ce t h a n o lp r o d u c t i o n d i f f e r e n c e sf r o m c u l t u r e si nh u n g a t et u b e s ，c e l l o b i o s ea n dg l u c o s ew e r en o td e t e c t e d t h a tm e a n s t h a tt h es c a l e u po fc u l t i v a t i o n m a yb e n e f i tt h eg r o w t ha n dm e t a b o l i s mo fc t h e r m o c e l l u mj n 4 w h e nct h e r m o c e l l u mj n 4w a s c o c u l t u r e dw i t hz t h e r m o s a c c h a r o l y t i c u mg d 17w i t h o u tp hc o n t r o l ，t h eh ep r o d u c t i o ni n c r e a s e dt o 35 m m o l 1c u l t u r e o t h e rf e r m e n t a t i o n p r o d u c t s a r ee t h a n o l ，a c e t a t e ，l a c t a t ea n d b u t y r a t e l a c t a t ei n c r e a s e du n t i l5 0 ha n dt h e nd e c r e a s e d a tt h es a m et i m e ， b u t y r a t ei n c r e a s e d ，w h i c hw a ss i m i l a rt ot h ec u l t u r e si nh u n g a t et u b e s w h e nc t h e r m o c e l l u mj n 4w a sc o c u l t u r e dw i t hzt h e r m o s a c c h a r o l y t i c u mg d 17w i t hp h c o n t r o la tp h6 0 - 6 5 ，t h eh 2p r o d u c t i o nw a s2 5 m m o l 1c u l t u r e l a c t a t ew a st h e p r e d o m i n a n tf e r m e n t a t i o np r o d u c t b e c a u s en oh ew a sp r o d u c e di nl a c t a t e f e r m e n t a t i o n ，t h eh 2p r o d u c t i o nd e c r e a s e d x i i i 山东人学博i j 学位论义 5 c l o n i n ga n de x p r e s s i o no fc i o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u mj n 4c e l sg e n ei n e s c h e r i c hi nc o l i t h eg e n ew a sc l o n e db yu s i n gt h eg e n o m eo fc l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u mj n 4a s t e m p l a t e t h ep r i m e r sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt oct h e r m o c e l l u ma t c c2 7 4 0 5 c e l sg e n e t h en u c l e o t i d es e q u e n c ed a t aw e r es u b m i t t e dt og e n b a n k t h e r ew e r e o n l y3b a s e s d i f f e r e n c eb e t w e e nt h es u b m i t t e ds e q u e n c ea n dc t h e r m o c e l l u ma t c c 2 7 4 0 5c e l s g e n e s ot h e f r a g m e n tw ec l o n e d s h o u l d b e e e l sg e n e t h e p c r a m p l i f i e dg e n ef r a g m e n t ，f o l l o w i n gr e s t r i c t i o n e n z y m ed i g e s t i o n s ，w a sl i g a t e d w i t ht h es i m i l a r l yd i g e s t e dp l a s m i dp e t 一2 2 b t h el i g a t e dp l a s m i dw a si n t r o d u c e d i n t oec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) t h er e c o m b i n a n tp r o t e i nr c e l sh a dp a s c a s ea c t i v i t y b u tt h ea c t i v i t yw a sl o w 6 s i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i so fc l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u mj n 4c e l sg e n ea n d e x p r e s s i o ni ne s c h e r i c h i ac o i l a c c o r d i n g t o p r o t e i n s t r u c t u r a li n f o r m a t i o n ，t w os i t e sw e r es i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s t h eo n ew a sd 2 5 5 na n dt h eo t h e rw a sy 3 5 1f t h es i t e sw e r e c h o s e db e c a u s et h e yw e r ek e ys i t e so fc a t a l y t i cf u n c t i o n t h em u t a t i o n sw e r e e x p r e s s e di ne s c h e r i c h i ac o l ib u tn e i t h e ro ft h e mh a dp a s c a s ea c t i v i t y s ow e s p e c u l a t e dt h a ta s p 2 5 5m a yb et h eb a s eg r o u po ft h ec a t a l y t i cc e n t e r t y r 351i sa c o n s e r v a t i v es i t ea n dt h ec h a n g et op h em a yi m p a c tt h es t r u c t u r eo fc e l sc a t a l y t i c c e n t e r k e yw o r d s ：t h e r m o p h i l i c ；a n a e r o b i c ；c e l l u l o s e ；h y d r o g e np r o d u c t i o n ；c e l s ； s i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i s x i v 山东人学博卜学位论丈 a m p b p c b h c f l1 c a p c m c d n t p d t t e d t a e g g c h p l c i p t g k d a m c c p a g e p a s c r c e l s s d s s e m t c d t e m t r i s 符号说明及缩略词 a m p i c i l l i n b a s ep a i r ( s ) c e l l o b i o h y d r o l a s e c f11c e l l u l o s ep o w d e r c h l o r a m p h e n i c o l c a r b o x y m e t h y lc e l l u l o s e d e o x y r i b o n u c l e i o s i d et r i p h o p h a t e 1 ，4 - d i t h i o t h r e i t o l e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d e n d o g l u c a n a s e g a sc h r o m a t o g r a p h h i g hp e r f o r m a n a c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y 氨苄青霉素 碱基对 外切葡聚糖酶 c f l1 纤维素粉 氯霉素 羧甲基纤维素 脱氧三磷酸核糖核苷 二硫苏糖醇 乙二胺四乙酸 内切葡聚糖酶 气相色谱 高效液相色谱 异丙基一1 一硫代1 3 - d i s 。p r o p y l - 1 “。- 侈- d g a l a c t 。p y r a n 。s i d e 吡喃型半乳糖 k i l o d a l t o n m i c r o c r y s t a l l i n ec e l l u l o s e p o l y a c r l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p h o s p h o r i ca c i d - s w o l l e nc e l l u l o s e r e c o m b i n a n tc e l s s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y t h e r m a lc o n d u c t i v i t yd e t e c t o r t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y t r i s - h y d r o x y m t h y i - a m i n o m e t h a n e 千道尔顿 微晶纤维素 聚丙烯酰胺凝胶电泳 磷酸膨胀纤维素 重组c e l s 蛋白 十二烷基磺酸钠 扫描电镜术 热导检测器 透射电镜术 三羟基氨基甲烷 原创性声明 本人郑重声明：所呈蓟拇学擞，是本 在导f 币的指导下，独立进嗣咒蹶 得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个7 i 或集体已经发 表豉撰蒌随瞻骄沥燃。列碎玻琦镢啡出重要掺摘擀人和燃均已在文中以明 确方i 姝示明。本声明的法碍琴责科壬由本人承担。 期：兰! 堕：! 主：! ! 本 完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家 有关部门或机l 勾j 送姆瓮的复印件和电子f 瓦允许沧文：波查阅和借阅：本人授权山东 大学可以将本学囱忿瑚昭涪阿商；分内容编k 彰魈端弱割行检索，可以采用影印、 缩印或尉螨怦锻i 保存论艾嘲盛舷斟雏磁汶。 论砩翟酩：量：1 聋鱼撇 山东，：学博。j ：学位论文 第一章绪论 石油的利用会造成c 0 2 浓度的提高，导致全球变暖和气候的变化，在不久 的将来，随着石油的不断减少，还可能造成能源危机。因此，大量的研究用以寻 找可代替石油的能源。木质纤维素是最丰富的可再生资源和能够转化成燃料的底 物。它廉价、丰富和可再生。地球上的陆生植物每年产生1 3 1 0 m 吨( 干重) 的木材，这相当于7 1