（分析化学专业论文）zno等新型纳米材料用于酶及免疫传感器研究.pdf

硕士学位论文 摘要 近年来，生物传感器的研究和应用发展迅猛，它利用生物活性物质的亲和性， 如酶底物、酶辅基、抗原抗体、激素一受体等的分子识别功能，可以有选择地检 测待测物。由于生物活性物质具有专一识别功能，使得生物传感器具有较高的选 择性，能直接应用于复杂样品的检测。生物传感器以灵敏度高、选择性好、分离 过程和检测技术合为一体、不需要样品预处理等特点而受到广泛重视，目前发展 很快，已应用于临床医学检测、工业过程控制、环境检测、化学物质安全性评价 以及食品、制药等许多领域。 在生物传感器构建中，其关键技术之一就是如何将生物分子稳定、高活性地 固定到换能器表面。纳米材料，因其具有大的比表面积、高的表面活性、强吸附 力及高催化效率等优异特性，可在增加生物分子( 酶、抗原或抗体等) 的吸附量和 稳定性的同时提高生物分子( 酶) 的催化活性，使传感器的响应灵敏度得到提高。 自准一维功能材料诞生以来，因其具有独特的物理化学特性而引起了人们的广泛 关注。作为纳米材料的重要组成部分，一维纳米材料对构筑纳米器件、发展新型 功能材料具有重要的意义。本研究论文主要是通过发展新型的生物纳米材料及其 固定方法，以达到改进固定生物组分活性、提高传感器灵敏度等目的，以此为出 发点分别用水( 第2 章) 和乙醇( 第3 、4 章) 做溶剂，利用溶剂热法合成了片状 和棒状的纳米z n 0 ，这两种方法均具有实验操作简单、环境污染少、成本低、产 率高等优点；这两种方法所得到的材料均成功应用于生物传感器的构建( 酚类、 过氧化氢、葡萄糖传感器) 。另外，利用纳米金的吸附性和生物兼容性以及辣根酶 标记脂质体的信号增强放大作用制备了电流型免疫传感器用于人i g g 的测定( 第5 章) 。具体内容如下： 1 纳米材料有很好的生物兼容性，由于周围有利的微环境，所以它们能很好 地保持酶的活性，并且能增强酶的活性位点和电极之间的电子转移能力。在第2 章中，发展了基于新型纳米材料z n 0 为固定基质的无电子媒介的酚类传感。低等 电点的酪氨酸酶通过静电作用吸附在纳米z n o 粒子的表面，然后通过壳聚糖在表 面成膜而固定在电极上，该传感器对三种酚类化合物的测定显示出高的灵敏度和 快速响应的特点，其中对苯酚的测定的线性范围为1 5 1 0 7 5 l o m o ll ，检 测限为0 0 5 肛m o ll ，灵敏度为1 8 2 肛am m o j jl 。另外，对其表观米氏常数也进 行了测定。 2 第3 章中，利用溶剂热方法合成棒状的纳米氧化锌，之后将合成的棒状 的纳米氧化锌按照一定的浓度分散在六偏磷酸钠溶液中形成稳定的纳米粒子分散 i i ：2 茎塑型垫耋茎塑璺三璧墨堡丝堡璧量矍塞 液，以此作为辣根过氧化酶的固定基质。将z n o h r p 固定在玻碳电极上，接着 滴加n a 矗o n 在z n 0 ，h r p 修饰的电极上，作为稳定和防止h r p 溶解的保护层。 对影响酶电极电化学性质的参数如p h 值、工作电压及传感器的操作和储存的稳 定性都做了研究。结果表明，该传感器在电子媒介对苯二酚存在时。对h 2 0 2 有 快速响应，响应时间小于5s ，测定的线性范围为1 o 10 5 2 2 1 0 。m o ll 一，检 测限为o 2 m o ll 。该传感器表现出了良好的重现性和稳定性。 3 在前面的研究中，我们发现纳米氧化锌是固定辣根过氧化酶的理想材料。 在第4 章中，发展了基于z n o n a f i o n 复合膜的葡萄糖传感器。这种复合材料结 合了无机纳米材料z n o 和有机聚合物n a f j o n 的优点，既增大了酶的固定量同时 也能保持酶的活性和防止酶的泄漏。用复合膜将葡萄糖氧化酶( g o d ) 和辣根过氧 化酶( h r p ) 同时固定在玻碳电极上，由于在固定g o d 的同时也固定了h r p ， 所以传感器实现了在较低电位下检测葡萄糖，消除了电活性物质的干扰。该传感 器用于葡萄糖检测显示出高的灵敏度和快速的响应，线性范围为2 5 1 0 一3 1 0 4 m o ll 一，检测限为5 0 m o ll ，灵敏度为1 6 6 “am m o l 1l 。 4 在第5 章中，发展了一种基于辣根过氧化酶及抗体修饰的脂质体信号放大 的电流型免疫传感器，通过夹心式免疫分析测定人免疫球蛋白( h i g g ) 。分析步骤 包括：将纳米金共价固定于巯基化金电极表面，用以吸附固定羊抗人i g g 抗体 ( g - a n t i h i g g ，a b ) ，并采用高碘酸氧化法将此抗体与h r p 共同修饰于脂质体表面 ( a b h r p l i p o s o m e ) ，以夹心方式免疫识别人l g g ，由此根据酶催化产物引起的电 化学信号强度，实现对人i g g 目标物的高灵敏分析，传感检测的线性范围为o 0 0 8 1 0p gm l 一，检澳4 限为o 0 0 5 “gm l 。 美键词：生物传感器；z o 纳米材料；生物材料固定；脂质体；电流型免疫传感 器 i i i 硕士学位论文 ! 自e = 目目目口= = = = = = e = t = ；_ e j i _ g = = 目自= = 口= e = = = a b s t r a c t r e c e n t l y ，t h e r eh a sb e c nr a p i dd e v e l o p m e n ti nt h er e s e a r c h 柚da p p l i c a t i o no f b i o s e n s o r w h i c hc a nd e t e c t 觚a i y l e ss e l e c t i v e l yu s i n gt h es p e c i f i cr e a c t i o no fb i o a c t i v e m a t e r i a l ss u c ha s t h e e n z y m e - s u b s t r a t e ，e n z y m e - c o e n z y m e ， a n t i g e n - a n t i b o d y ， i n c r e t j o n a c c e p t o ra n ds oo n b i o s e n s o r sc o u i d b ea p p l i e dd i r e c t i yi nt h ed e t e r m i n a t i o n o fc o m p l e xs 啪p l e s u s i n gt h es p e c i f i cb i o r e c o g n i t i o n o fb i o a c t i v em a t e r i a l s m e a r l w h i l e ，b i o s e n s o r sc a nb ea p p l i e dt oaw i d er a g eo fa n a l y t i c a lt a s k s ，i n c i u d i g c l i n i c a ld i a g n o s i s ，c o n t r o lo fi n d u s t r i a lp r o c e s s ，e n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n g ，e v a l u a t i o n o ft h es a f e t yo fc h e m i c a l s ，锄a l y s e si nf o o da i l dp h a 珊a c yi n d u s t r i e sb e c a u s eo fi t s h i g hs e n s i t i v i t y g d o ds e l e c t i v i t y ，n os a m p l ep r e t r e a t m e n ta n di n t e g r a t i n gt h ep r o c e s s e s o ft h es a m p l cs e p a r a t i n g 肌dd e t e c t i n g i nt b ed e s i g n 姐df a b f i c a t i o no fb i o s e n s o r ，t h ed e v e l o p m e n to fas i m p l ea n d e f 绝c t i v es t r a t e z yf o rt h ec o n s t m c t i o no fs e n s i t i v em e m b r a n eo nt h ee l e c t r o d ei sa c r u c i a ls t e p n a n o - c r y s t a u i n ep a n i c l e s ，e x h i b i t i n gal a r g es u r f a c ea r e aw i t hd i a m e t e r l e s st h a n1o on m ，h i g hs u r f a c e - a c t i v i t y ，g o o db i o c o m p a t i b i l i t y s t r o n ga d s o r p t i o na n d g r e a te 饿c i e n c y o f c a t a l y s i s ，m i g h t b ef a v o r a b l ef o r c o n s t r u c t i n g b i o s e n s o r - o n e d i m e n s i o n a lm a t e r i a l ss u c ha sn a i l o r o d sa n dn a n o w i r e sh a v ea t t r a c t e dm u c h a t t e n t i o nd u et ot h e i r s p e c i f i cp h y s i c a lp r o p e n i e sa n di n t e r e s t i n ga p p l i c a t i o ni n n a n o d e v i c e s t h es t u d yo fo n e - d i m e n s i o n a l ( 1 d ) m a t e r i a l sh a sb e c o m eap o t e n t i a l f r o n t i e ri nn a n o s c i e n c ea i i dn a n o t e c h n o l o g yi nt h ei a s tf b wy e a r s t h i st h e s i sf o c u s e s o n d e v e l o p i n g n e wn a n o - b i o m a t e r i a l sa n dt h e i ri m m o b i i i z a t i o n s t r a t e g i e s i n b i o s e n s o r - f 曲r i c “n gf o rt h ep u r p o s eo fi m p r o v i n gt h ep e r f b 姗a n c ea n dl o n g - t e r m s t a b i l i t yo fb i o s e n s o r s ，t h e r e f b r e ，n a n o s i z e dn o w e r 1 i k ez o ( c h a p t e r2 ) a n dz n o n a n o r o d s ( c h a p t e r3 ，4 ) w e r es y n t h e s i z e db yas i m p l el l y d r o t h e f m a lm e t h o da n da s o l v o t h e r m a lr o u t e ， r e s p e c t i v e l y t h e t w om e t h o d sa r ec o n v e n i e n t ，e n v i r o n m e n t f l i e n d l y ，i n e x p e n s i v ea n de f f i c i e n tp r o c e s s t h ep h e n o l ，h 2 0 2a n dg l u c o s eb i o s e n s o r s b a s e do nt h ez n oo b t a i n e db yt h e s et w om e t h o d ss h o w e de x c e l l e n tp e r f o r m a n c e i n a d d i t i o n ， a ni m m u n o s e n s o rb a s e do nt h eh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s ea n da n t i b o d i e s f u n c t i o n a l i z e dl i p o s o m ew a sc o n s t m c t e d t h ed e t a i l sa r es u m m a “z e da sf o l l o w s ： ( 1 ) n a n o - m a t e r i a l sh a v eg o o db i o c o m p a t i b i l i t yt h e yc a nk e e pt h ea c t i v i t yo f b i o m o l e c u l e sd u et ot h ed e s i r a b l em i c r o e n v i r o n m e n t a n de n h a n c et h ed i r e c te l e c t r o n t r a n s f 色rb e t w e e nt h ee n z y m e sa c t i v es i t e sa n dt h ee l e c t r o d e i nc h a p t e r2 ，an o v e l p h e n o lb i o s e n s o rw a sp r o p o s e db yi m m o b i l i z i n gt y r o s i n a s et on a n o z n op a r t i c l e s t h e 2 2 兰翌兰苎考翌竺璺王苎墨墨耋釜璧耋2 銮 l o wi s o e l e c 虹i cp o i n t 堪r o s i n a s ew a s 丘r s ta d s o r b e do nt h es u r f a c eo fh i g hi s o e l e c t r i c p o i n tn a n o z n op a r t i c l e si nt h ep r e s e n c eo fe i e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n s ，a n dt h e n i m m o b i l i z e do nt h eg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d ev i at h e6 l m - f o r m i n go fc h i t o s 卸t h e r e s u l t i n gb i o s e n s o rs h o w e df 缸tr e s p o n s e 蛆dh i g hs e n s i t i v i t yt o w a r d st h r e ep h e n o l i c c o m p o u n d s f o rp h e n o l ，t h es e n s i t i v i t yw a s 18 2p am m 0 1 1l ，a i l dt h el i n e a rr a n g ew a s 1 5 1 0 7 5 1 0 。5m o ll 1w i t had e t e c t i o no f o 0 5u m o ll i na d d i t i o n ，t h ek i n c t i c p a r 锄e t e rs u c ha sa p p a r e n tm i c h a e l i s m e n t e nc o n s t a n t ( k m 8 9 9 ) h a sb e e nc a l c u l a t e d t h el o wd e t e c t i o n ，l o wc o s t ，s i m p l ea n df a s tf a b f i c a t i o no ft h es e n s o rm a k e si ts u p e r i o r t oo t h e rt e c h n i q u e s ( 2 ) i nc h a p t e r3 ，z n on a n o r o d ss y n t h e s i z e db ys o l v o t h e r m a lr o u t ew a sd i s p e r s e d i ns o d i 啪h e x a m e t a p h o s p h a t e ( ( n a p o ，) 6 ) t of o r mas t a b l ea q u e o u sd i s p e r s i o nf o rt h e f a b r i c a t i o no fh 2 0 2b i o s e n s o r t h e p a r a m e t e r sa f f e c t i n g t h ef a b r i c a t i o na n d e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n so fb i o s e n s o r sw e r eo p t i m i z e d t h eb i o s e n s o rs h o w e daf a s t r e s p o n s eo fl e s st h 锄5sa n dad e t e c t i o nl i m i to f2 o 1 0 。7m o ll 叫h 2 0 2b yu s i n g h y d r o q u i n o n ea st h em e d i a t o r l i n e a rc a i i b r a t i o nf o rh y d r o g e np e r o x i d ew a so b t a i n e d i nt h er a g e1 0 1o 5t o2 2 1o 。3m o ll 1u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s t h eb i o s e n s o r e x h i b i t e ds a t i s f h c t o r yr e p r o d u c i b i l i t ya n ds t a b i l i t ya n dr e t a i n e da b o u t9 2 o fi t s o r i g i n a lr e s p o n s ea f t e rt w ow e e k ss t o r a g ei nap h o s p h a t eb u f f b ra t4 。c ( 3 ) i no u rp r e v i o u sw o r k ，w ef o u n dn a n o - z n ow a sag o o dm a t r i xt oi m m o b m z e h r p i nc h a p t e r4 ，an o m o p o r o u sz n o n a 矗0 nc o m p o s i t em a t r i xw a sd e v e l o p e dt o f a b r i c a t et h eg l u c o s eb i o s e n s or t h i sm a t e r i a lc o m b i n e dt h ea d v a n t a g e so fi n o r g a n i c n a n o p a r t i c l e s ，z n 0 ，a n do r g a n i cp 0 1 y m e r ，n a f i o n g l u c o s eo x i d a s ea n dh r pw e r e i m m o b i l i z e di nt h em a t e r i a lm a i n t a i n e dt h e i ra c t i v i t i e sw e l l b e c a u s eo ft h e i m m o b i l i z e dd o u b i ee n z y m e s ，t h eb i o s e n s o rc o u l dd e t e c tg l u c o s ea tal o w e rp o t e n t i a l ( 一2 0 0m v ) 龃ds o m ei n t e r f e r e n c e sw e r ea v o i d e d t h ep a r a m e t e r sa f 艳c t i n gm e f a b r i c a t i o na n de x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n so fb i o s e n s o r sw e r eo p t i m i z e d t h eb i o s e n s o r h a daf a s tr e s p o n s eo fl e s st h a n1 0s t h ei i n e a fr a n g ew a s2 5 l o 一3 1 0 - 3 m o ll 1 w i t had e t e c t i o nl i m i to f5 0p m o ll 1a tas i g n a l n o i s er a t i oo f3a n da s e n s i t i v i t yo f 1 6 6u am m 0 1 il t h eb i o s e n s o lr e t a i n e da b o u t6 9 o fi t so t i g i n a lr e s p o n s ea f t o 了 0 n e m o n t hs t o r 8 9 ei na p h o s p h a t eb u f 托r ( 4 ) i nc h a p t e r5 ，w er e p o f t e da ni m m u n o a s s a yi nw h i c ht h et h i o lg r o u po nt h e s u r f a c eo ft h ea ud i s ke l e c t r o d em o d i f i e dw i t hl ，6 h e x a n e d i t h i o lc o u l db eu s e df o r c o v a l e n t l ya t t a c h i n gn a n o - a u t h eg o a t a n t i - h u m a n( g a n t i h 1a n t i b o d i e sw e r e a b s o r b e db yt h en a n o 。a ua n dt h eh u m a ni m m u n o g l o b u l i ng ( h i g g ) w a sa p p l i e da sa 协r g e ta n a l y t e as a n d w i c hi m m u n o a s s a yf o r m a tw a sa d o 口t e dw i t hh o r s e r a d i s h v p e r o x i d a s e 锄dl i p o s o m em o d i ：f i e dg o a t a n t i - h u m a n ( g a n t i h ) a n t i b o d i e sa sat r a c e r t h ei m m u n o l o g i c a lr e a c t i o nw a sd e t e c t e du s i n ga n e n z y m a t i c l a b e l i n gp r o c e d u r e t o g e t h e r w i t ht h e a m p e r o m e t r i cd e t e c t i o n 也r o u g hs u i t a b l es u b s t r a t e s ( h 2 0 2a n d h y d r o q u i n o n e ) f o rt h ee r 屹y m e ( h r p ) t h el i n e a rr a n g ew a s0 。0 0 8 1 0 拉gm l l lw i t ha d e t e c t i o nl i m i to fo 0 0 5 “gm l 1a tas i g n a l n o i s er a t i oo f3 k e yw o r d s ：b i o s e n s o r ；n a n o - z n om a t e r j a l ；b i o m a t e r i a l si m m o b j l j z e d ： l i p o s o m e ；a m p e r o m e t r i ci m m u n o s e n s o r v i 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其 它个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果 由本人承担。 作者签名：座良峰 日期：年月日 i l 学位论文版权傅用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密囵。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：虐鲁艮峰日期： 导师签名：_ f 饩少翮饥日期： 年月日 年月日 硕士学位论文 1 1 概述 第l 章绪论 生物传感器是个非常活跃的研究领域，它与生物信息学、生物芯片、生物 控制论、仿生学、生物计算机等学科一起，处在生命科学和信息科学的交叉区域。 生物传感器是在化学传感器的基础上发展起来的，它是将生物活性物质与各种固 态物理传感器相结合而形成的一种检测仪器，具有灵敏度高、选择性好、准确度 高、稳定性好和进行快速在线连续监测等特点，能广泛应用于基础研究、生物、 临床化学和诊断、环境监测、食品分析、过程控制与检测等领域【1 4 j 。 生物传感器研究起源于2 0 世纪的6 0 年代，1 9 6 7 年u p d i k e 和h i c k s 把葡萄糖 氧化酶( g o d ) 固定化膜和氧电极组装在一起，首先制成了第一种生物传感器，即葡 萄糖酶电极【l o 】。此后，随着生物、化学、物理学、医学、电子技术等相关学科的 迅速发展，各种类型的生物传感器相继出现；到8 0 年代生物传感器研究领域已基 本形成，成为电化学分析和生物技术研究最为活跃的领域之一。 1 1 1 生物传感器的组成和工作原理 生物传感器一般由生物敏感膜、换能器和信号处理器三部分组成。生物敏感 膜是生物传感器的关键部件，由膜基质和敏感材料组成。可做敏感材料的生物材 料有：酶、微生物、生物组织、抗体、细胞和核酸等；与生物活性材料，即敏感 膜组合的传感器可以是多种类型的物理或化学传感器，如电化学( 电位测定、电 导测定、阻抗测定) 、光学( 光致发光、共振表面等离子体) 、机械( 杠杆、压电 反应) 、热( 热敏电阻) 或者电( 离子或者酶场效应晶体管) 等等。所有这些具有 生物识别功能的组合体通称为生物传感器。其工作原理是：待测物与采用特殊技 术固定在换能器内或表面的具有分子识别作用的生物活性因子作用时，产生电化 学、光学、热学、压电学等响应信号，其大小与分析物含量或浓度存在定量关系， 从而实现对待测物质的定量检测。 1 1 2 酶传感器 酶是生物体内产生的、具有催化活性的一类蛋白质，对相应底物具有催化转 化能力。酶不仅具有一般催化加快反应速度的作用，而且具有高度的专一性( 特 异的选择性) ，即一种酶只能作用于一种或一类物质，产生定的产物。酶的这种 专一性及其催化低浓度底物反应的能力在化学分析上非常有用，可用于构建基于 催化作用的生物酶传感器。 酶传感器研究经历了三个发展阶段，第一代传感器以酶的天然介体一氧来作为 酶与电极之间的电子通道，直接检测酶反应底物的减少或产物的生成的第一代传 z i l o 等新型纳米材料用于酶及免疫传感器研究 感器：第二代生物传感器基于人工合成的媒介体来代替氧沟通酶的活性中心与电 极之间的电子通道，通过检测媒介体的电流变化来反映底物浓度的变化：第三代 生物传感器无媒介体存在下，利用酶自身与电极间的直接电子转移来完成信号的 转换的【i “。 1 1 3 酶传感器的类型 酶传感器是应用固定化酶作为敏感元件的生物传感器。依据信号转换器的类 型，酶传感器大致可以分为酶电极、酶场效应管传感器、酶热敏电阻传感器等。 酶电极按换能方式可分为电化学酶传感器和光化学酶传感器。按测量信号不同， 电化学生物传感器又可分为电流型、电位型和电导型。电流型酶传感器的原理是 利用酶催化反应产生的物质在电极上发生氧化或者还原反应产生的电流信号，在 一定条件下，测得的电流信号与被测物质浓度呈线性关系【1 2 】；电位型传感器是基 于离子选择性电极原理而发展起来的，固定到电极表面酶对底物催化，产生离子 型物质，能引起指示电极电位改变，电位变化关系遵循n e r n s t 方程【】；电导型传 感器利用酶催化底物反应，导致反应体系中离子种类及浓度的变化，从而引起溶 液导电性的改变，以溶液电导率为响应信号。 光化学酶传感器利用酶的高选择性，待测物质( 相应的酶的底物) 从样品溶液 中扩散到生物催化层，在固定化酶的催化下生成一种待测物质，当底物扩散速度 与催化产物生成速度达成平衡时，即可得到一个稳定的光信号，信号大小与底物 浓度成正比。李瑛等【1 4 】首次以碳糊为固定化载体，将g o d 固定在碳糊电极上， 制成了光导纤维电化学发光葡萄糖生物传感器。葡萄糖的酶催化反应、鲁米诺的 电化学氧化和化学发光反应可以在电极表面同时发生。该传感器制作简单，响应 时问仅为l os ，线性范围宽，葡萄糖浓度在1 ox 1 0 一2 0 1 0 也m o l l 1 范围内 与发光强度呈线性关系，检出限为6 4 1 0 “m o ll ，可应用于市售饮料中葡萄 糖的测定。 1 2 酶生物传感技术中生物分子固定化新方法 在生物传感器的构建中，如何将生物分子稳定、高活性地固定到换能器表面 是成功构建传感器的关键。经典的固定酶的方法主要有物理或化学吸附法【1 5 d 引、 包埋法【1 9 。2 1 、化学交联法阢2 4 1 和共价键固定法f 2 5 。2 7 喀。虽然常用于固定生物材料 的方法很多，但它们都有自身的优势与不足，大多数成膜时膜较厚，均匀度较差， 附着力低，因此影响了生物传感器的检测灵敏度，重现性和再生性等。所以，人 们一直在努力探索生物分子新的固定方法，以达到高的稳定性，保持高的生物活 性，简单实用和良好的固定重复性能等目的。 硕士学位论文 1 2 1 分子自组装技术 自组装技术是目前倍受瞩目的一种新技术，该技术可根据需要制备带有不网 活性功能团的单层膜，并已被广泛用作生物材料的载体膜。目前已经有多种类型 的自组装膜：醇和胺在铂表面；硫醇、二硫化物和硫化物在金银和铜表面；脂肪 酸在金属氧化物表面；磷酸在金属磷酸盐表面等。其中长链巯基化合物进行自组 装形成的单层修饰膜应用最广泛。自组装单层膜技术作为一种制备超薄有机膜的 方法较之其他方法简化了操作步骤，其稳定性高、取向性良好及制备步骤简易， 已成为一种电分析化学方法1 2 8 3 0 1 。g o o d i n g 等【3 1 1 通过自组装将3 巯基丙酸固定在 金电极上，然后用e d c 和n h s 活化偶联葡萄糖氧化酶制得葡萄糖传感器。 f e r a 口o n t o v & 等【3 2 】将亚硫酸盐氧化酶固定在混和自组装膜修饰的金电极上制得了无 电子媒介的第三代亚硫酸盐生物传感器。 1 2 ，2 溶胶凝胶技术 溶胶凝胶( s o l - g e l ) 技术是指有机或无机化合物经过溶液、凝胶而固化，再 经过热处理而制得氧化物或其他化合物固体的方法。在多孔的凝胶网状结构中， 不仅适合固化小分子也适合固定生物大分子。由于生物分子的识别部位往往暴露 在表面，而在水溶液中，它的侧链只通过氢键和偶极力与溶剂分子相互作用，因而 可呈现出最大的活性。使用溶胶凝胶圃化法就可以为网络中生物分子提供一个水 溶液的微环境，因为网络结构中含有大量的孔隙水。与其它固化方法相比，溶胶 凝胶包埋法的优势还表现在它可适用于任何种类生物组份，可以较好的保持蛋白 质表面微观结构的整体性和方向均一性，从而对组份的活性和稳定性的损伤较小。 到目前为止利用溶胶由于其识别部位往往暴露在表面凝胶过程捕获的生物大分子 有金属c u z n 蛋白、超氧化物酶、肌红蛋白、细胞色素c 、b s a 、等。选用的无 机基底材料有绝缘性材料硅、t i 纤维素复合材料、半导体材料v 2 0 “导体材料 s i 2 c 等【3 3 1 。 溶胶凝胶技术在电分析化学中的应用主要体现在修饰电极的制各和生物传感 器的构建。s a n c h e z 等p 刖在t m o s 的溶胶凝胶中加入了g o d 及二茂铁媒介体 并在玻碳电极上研究了其伏安行。b r i g h t 和n a r a n g 对比研究了g o d 的3 种固化 方式即物理吸附、掺入到t e o s 的溶胶凝胶液中及将g o d 夹心于两层溶胶凝胶 膜中，结果表明酶在夹心式固化结构中的活性比物理吸附高5 6 倍，稳定性比包埋 法高3 倍。夹心式的g o d 电极响应时间为3 0s ，检出限可低至o 2m m o ll 。1 【3 ”。 同时，溶胶凝胶技术在生物传感器中的应用前途也体现在光学型生物传感器的开 发上。因为溶胶凝胶溶液的一个显著特点就是光学透过性强，且本身的荧光度低。 由于酶、抗体及蛋白等一些生物分子在溶胶凝胶中的成功捕获，为光学型生物传 感器的发展奠定了基础。b 1 y t h 等用分光光度测定法研究了溶胶凝胶法固化的肌红 蛋白、细胞色素c 、血红蛋白等对c 0 、n o 的分析测定1 3 矾。 三= 2 兰登銎垫耋翌銎璺三氅圣釜耋釜曼苎翌耋 1 2 3 自组装聚电解质复合膜 自组装复合膜是一类具有特殊结构与性能的新兴材料，不但合成聚离子，天 然多糖、蛋白质、d n a 可用于构筑多层膜，而且带静电有机小分子、聚离子前驱 物、粘土粒子、胶体粒子等也可用于多层膜的合成。某些情况下，还可采耀非水 体系。随着更多聚电解质和功能物质的引入，这种基于静电相互吸引、逐层吸附、 自组装合成的多组分超薄膜，将在许多领域获得研究和应用。聚电解质作为一种 水溶液高分子化合物，在水溶液中以稳定的线性聚粒子形式存在并带有大量的同 种电荷。相对于l - b 膜和自组装单层膜来说，聚电鳃质多层复合膜在结构上也可 以实现分子尺寸范围内的一维控制，而且对设备和原材料没有特殊的要求，合成 方法简单，并且可根据需求引入活性物质1 3 7 1 ，如抗生蛋白链菌素( s t r e p t a v i d i n ) 的 介入，吸附的蛋白质或d n a 不会失去生物活性，可在生物传感器【8 ，3 9 l 领域获得 应用。用含功能基的聚离子吸附或功能物质掺杂，可制得化学传感器【4 们、智能开 关等。 1 2 4 l b 膜以及b l m 膜技术 l b 技术】是一种人为控制特殊吸附的方法，将具有脂肪链疏水基团的双亲 分子溶于挥发性溶剂中，通过垒控制表面压，溶质分子便在气，液界面形成二维排 列有序的单分子膜，即l a n g m u i f 膜，( l 膜) 。用膜天平将不溶物单分子膜转移到固 体基板上，组建成单分子或多分子膜，即l a n g m u i r - b l o d g e t t 膜。l b 膜与其他膜 比有以下特点：( 1 ) 膜的厚度可以从零点几纳米至几纳米；( 2 ) 高度各向异性的层 状结构：( 3 ) 理论上具有几乎没有缺陷的单分子层膜。因此l b 膜技术可以在分 子水平上进行设计，按人们预想的次序排列和取向，制成分子组合体系，这是实 现分子工程的重要手段1 4 2 】。正因为有这些其他技术无法比拟的优越性质，激发了 科学家们对l b 膜的研究热情，使l b 膜技术在材料学【4 孙、光学队4 ”、电化学 传感和生物仿生学1 4 6 4 7 】等领域显示了巨大的理论价值和应用潜力。 类脂双层构成了所有生物膜的基本结构，双层类脂膜( b l m ) 在结构上与天然 生物膜非常相似，它与l 柏g m u i r b l o d g e t t 膜和其它膜体系不同之处主要在于( 4 8 j ： ( 1 ) 具有流动性和自我封闭性：( 2 ) 使配体受体相互作用的同时又能保持其生物活 性：( 3 ) 能明显降低背景噪声，并能阻止亲水性电活性物质到达传感膜发生不希望 的反应。因而，双层类脂膜成为一种理想的传感器膜而被广泛应用于生物、免疫 传感器研究。近几年，基于b l m 膜的传感器在电化学分析中有了一定的进展， 已在b l m 中嵌入了许多不同的实体，如酶、聚肽、通道蛋白、抗体、参与配体 受体相互作用的化合物、氧化- 还原物质等，应用于临床、食品、环卫等领域【4 9 】。 目前研究较多的酶是葡萄糖氧化酶( g o d ) ，将g o d 包埋于聚吡咯卵磷脂形成的 b l m 中，再组装到金属电极上，即可检测葡萄糖【5 0 】；h i a n i k 等人 5 1 】还制各了基 硕士学位论文 于s - b l m 固定化技术的用于检测人i g e 和农药2 ，4 d 的免疫传感器。 1 2 5 纳米技术 纳米技术是在2 0 世纪8 0 年代末、9 0 年代初才逐步发展起来的前沿、交叉 的新兴学科。在纳米技术发展过程中，纳米材料的开发和应用处于核心地位。一 般来说，纳米材料的尺寸在l l o on m 范围内，而大多数重要的生物分子( 如蛋 白质、核酸等) 的尺寸都在这一尺度内，因此可以利用纳米材料进入生物组织内 部探测生物分子的生理功能，进而在分子水平上结识生命过程。纳米材料具有普 通材料所不具备的四大效应：( 1 ) 小尺寸效应，指当纳米粒子的尺寸与光波波长、 德布罗意波波长以及超导体的相干波长等物理尺寸相当或更小时，其周期性的边 界条件将被破坏，非晶态纳米微粒的颗粒表面层附近原予密度减小，导致光吸收、 电磁、化学活性、催化等物性呈现新的小尺寸效应。( 2 ) 表面效应，可用纳米微粒 表面原予与总原子数之比来量度。随著粒径减小，表面原子数迅速增加。由于表 面原子数增加，原子配位不足及高的表面能，使得这些表面原子具有高的活性， 极不稳定，使其在催化、吸附等方面具有常规材料无法比拟的优越性。( 3 ) 量子尺 寸效应：当粒子的尺寸小到某一值时，金属的费米能级附近的电子能级由准连续 变为离散，纳米半导体微粒存在不连续的最高被占据分子轨道和最低未被占据的 分子轨道能级，从而使得能隙变宽，这种现象称为量子尺寸效应。( 4 ) 宏观量子隧 道效应。研究发现，一些宏观量，如纳米粒子的磁化强度、量子相干器件中的磁 通量也具有隧道效应，称为宏观量子隧道效应【船，5 3 j 。 1 2 5 1 纳米粒子固定技术 纳米材料具有以上的四大效应，并由此产生出许多特殊性质：奇异力学、电 学、磁学、热学、光学和化学活性等l 】。正是具有以上的特性，使得纳米粒子与 生物材料有着特殊的相互作用，人们已经将金属纳米粒子、金属氧化物纳米粒子 应用到生物分析及传感器轳5 】的构制当中，如金纳米粒子有很强的等粒子吸收峰， 具有很强的显色能力【5 6 5 。】；银纳米粒子有很强的拉曼增强作用，可以大幅度提高 生物分子的拉曼响应【5 9 j ；半导体纳米晶有很强的荧光且具有良好的抗光漂白能力 胪o 】：纳米储存的氧化铁在室温下显现超顺磁性【6 l ，6 2 】等。金纳米粒子是研究较早的 一种纳米材料，在生物学研究中一般成为胶体金。1 9 7 1 年，f a u l k 和t a l o r 【6 3 1 首 先将胶体金作为标记物引入到免疫学的研究中。之后，大量研究表明纳米金能稳 定而迅速吸附蛋白质，而且蛋白质的生物活性不会发生明显的改变“】。纳米金目 前已经被广泛被用作研究蛋白质的直接电化学【6 5 正7 1 。纳米金能很好地保持生物组 分的活性，而且能加快蛋白质与电极之间的电