（光学专业论文）光镊的光压力测量及光镊与膜片钳结合的研究.pdf

大连理工大学硕士学位论文 摘要 本文在对光镊进行简要介绍的基础上，重点展开对光镊使用不同放大倍率显微物镜 对细胞的捕获能力的分析和光镊与膜片钳结合用于研究细胞毫特性的初步研究。 绪论内容为光镊的发展历史、原理、特点、新技术、应用、及其与其他研究仪器的 仕厶 ；口口。 第二章内容为常规单光束梯度力激光光镊仪器的主要部件的详细介绍，以及对不同 的位置探测和捕获力的测量手段的介绍。 第三章内容秀应耀上海中珂光镊科技有限公司生产的l o t i i 型光镊，利用热力学平 衡原理对光捕获力的实际测量。比较采用数值孔径为0 6 5 的4 0 x 物镜和数值孔径为1 2 5 的1 0 0 x 物镜的捕获实验结果，发现1 0 0 x 物镜在侧向和轴向上鲍捕获能力均强于4 0 x 物镜。在其他实验条件，包括入射捕获光功率，被捕获的细胞等，不变的情况下，用1 0 0 x 物镜得到的光势阱刚性系数比4 0 x 物镜的大。1 0 0 x 物镜在捕获效率上和对捕获酵母菌 细胞在轴向的限制能力上都强于4 0 x 物镜。1 0 0 x 物镜捕获能力强还表现在实验中操作 被捕获细胞更加流畅的特性中。因此光镊仪器应尽量使用放大倍率高的、数值孔径大的 曼微物镜进行光捕获，以便得到高的捕获效率和流畅的操作。 第四章内容为基于提高对细胞的电生理特性的研究采用l o t i i 型光镊仪器与 e p c - 1 0 型膜片钳仪器结合的初步实验。实验事在捕获缨脆君，膜片钳针尖接近细胞， 推动细胞，但不推离光势阱，根据光镊的刚性系数推算针尖对细胞的作用力。这个结果 可以为压力器中施加的压力做定量的标定。 根据光镊对酵母菌细胞的捕获实验和与膜片钳结合的研究，发现光镊在生物研究领 域拥有很广阔的应用前景，它将更深一步地为人们了解生命科学提供研究手段。 关键词：光镊；光捕获；光压力；膜片钳 光镊的光压力测量及光镊与膜片钳结合的研究 t h em e a s u r e m e n to fo p t i c a lf o r c ef r o mo p t i c a lt w e e z e r sa n dt h e ooo n o r e s e a r c h0 nt h ec o mb i n a t i o no lo p t i c a lt w e e z e r sa n dp a t c hc l a m p a b s t r a c t b a s e do nt h ei n t r o d u c t i o no fo p t i c a lt w e e z e r s ，t h em a i np o i n t so ft h i sd i s s e r t a t i o na r et h e m e a s u r e m e n to fo p t i c a lf o r c ef r o mo p t i c a lt w e e z e r sw i t hd i f f e r e n tm i c r o s c o p eo b j e c t i v e s ，a n d t h ei n i t i a lr e s e a r c ho fc o m b i n a t i o no fo p t i c a lt w e e z e r sa n dp a t c hc l a m pa i m i n gt or e s e a r c h c e l l se l e c t r i c a lc h a r a c t e r i s t i c s 强建f i r s t c h a p t e r i st h ei n t r o d u c t i o no fo p t i c a lt w e e z e r s h i s t o r y m a i nt h e o r y , c h a r a c t e r i s t i c s ，n e wd e v e l o p m e n t s ，a p p l i c a t i o na n dt h ec o m b i n a t i o no fo p t i c a lt w e e z e r sa n d o t h e ra p p r o a c h e su s e di nr e s e a r c h t h es e c o n dc h a p t e ri st h ei n t r o d u c t i o no fm a j o ro p t i c a le l e m e n t so fs i n g l eb e a mg r a d i e n t f o r c el a s e ro p t i c a lt r a pa n dt h ed i f f e r e n tm e t h o d so fp o s i t i o nd e t e c t i o na n df o r c em e a s u r e m e n t t h et h i r dc h a p t e ri st h em e a s u r e m e n tr e s u l t so fo p t i c a lt r a p p i n gf o r c eu s i n gl o c i o p t i c a lt w e e z e r s p r o d u c e db ys h a n g h a iu s t cl o tt e c h n o l o g yc o b a s e do nt h et h e o r y o ft h e r m a le q u i l i b r i u m t h r o u g ht h ec o m p a r i s o no ft h er e s u l t sf r o mu s i n g4 0 x m i c r o s c o p e o b j e c t i v e 谢饿o 6 5n u m e r i c a la p e r t u r ea n dt h e 10 0 xm i c r o s c o p eo b j e c t i v ew i t h1 2 5 n u m e r i c a la p e r t u r e ，i ts h o w st h a tio o x m i c r o s c o p eo b j e c t i v eh a v i n gb i g g e ro p t i c a lf o r c en o t o n l yi nl a t e r a ld i r e c t i o nb u ta l s oi na x i a ld i r e c t i o n i nt h es a m ee x p e r i m e n tc o n d i t i o n , l i k e i n c i d e n tl a s e rp o w e r , t r a p p e de e l e t c ，t h es t i f f n e s sc o e f f i c i e n tu s i n g10 0 xm i c r o s c o p e o b j e c t i v ei sh i g h e rt h a nt h a to f4 0 xm i c r o s c o p eo b j e c t i v e ，n l eh i g h e rt r a p p i n ga b i l i t yo f10 0 x m i c r o s c o p eo b j e c t i v es h o w si nt h ea s p e c t so f t h et r a p p i n ge f f i c i e n c yi sh i g h e ra n dt h ea b i l i 够 t or e s t r i c tt r a p p e dc e l l sm o v e m e n ti nt h ea x i a ld i r e c t i o n , a n dt h ef l u e n c yo fm a n i p u l a t i o no f t h et r a p p e dc e l l a c c o r d i n gt ot h i sr e s u l t ，m i c r o s c o p eo b j e c t i v ew i t hh i g h e ra m p l i f i c a t i o na n d n u m e r i c a la p e r t u r es h o u l db eu s e di no p t i c a lt r a p p i n gr e s e a r c hf o rt h ep u r p o s eo fh i g h e r t r a p p i n ge f f i c i e n c ya n df l u e n tm a n i p u l a t i o n t h ef o n l lc h a p t e ri st h ei n i t i a lr e s e a r c ho ft h ec o m b i n a t i o no fl o t i im o d e lo p t i c a l t w e e z e r sa n de p c 一10m o d e lp a t c hc l a m p 。弧ea i mo ft h i sc o m b i n a t i o ni st oi m p r o v et h e r e s e a r c ho ft h em e a s u r e m e n to fe l e c t r i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fn e u r o nc e l l s n l r o u 醢t h e e x p e r i m e n tp r o c e s s ，a f t e ro p t i c a lt w e e z e r st r a p p i n gac e l l ，t h em i c r o p i p e t t eo fp a t c hc l a m p a p p r o a c h e st h ec e l la n dp u s h e st h ec e l l ，b u tm a i n t a i n st h ec e l ls t i l li nt h eo p t i c a lt r a p p i n gw e l l u s et h es t i f f n e s st o e m c i e n tt oc a l c u l a t et h ef o r c ec a r r i e do u tb yt h em i c r o p i p e t t e t h er e s u l ti s u s e f u li n t h ea s p e c to fc a l i b r a t i o no f n e g a t i v ep r e s s u r ef r o mt h en e g a t i v ep r e s s u r ed e v i c e 。 一i i _ 大连理工大学硕士学位论文 k e yw o r d s ：o p t i c a lt w e e z e r s ；o p t i c a lt r a p ；o p t i c a lf o r c e ；p a t c hc l a m p 大连理工大学学位论文独创性声明 作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究 工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外， 本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请 学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献 均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文题目：羞镊鲍迸廷左测量区左堡生腿压敛结佥鲍珏窒 作者签名：习矽弘一 日期：盟卜年上月兰日 ， 大连理工大学硕士研究生学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关学位论文知识产权的规定，在校攻读学位期间 论文工作的知识产权属于大连理工大学，允许论文被查阅和借阅。学校有 权保留论文并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，可以将 本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印、或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 作者签名： 导瘴签名： 日期：丝年上月羔日 霹期：呷一年冀望毯 大连理工大学硕士学位论文 1绪论 光镊诞生至今只有短短的三十多年时间，但是发展却很迅速。常规激光光镊技术已 经很成熟，实现了商业化，并且应用在很多研究领域中，特别是在生物领域。随着其他 技术的进步和对光镊应用的要求，新型的光镊技术，如光纤光镊、飞秒光镊、纳米光镊、 全息光镊、分时扫描光镊等也不断涌现，不仅拓宽了光镊技术，也使其应用更加广泛。 下面就光镊的发展历史，基本原理、特点、分类，与其他研究手段的结合和其应用来介 绍光镊。 1 1 光镊的发展历史 1 1 1光压力的发展历史 能够实现光学捕获的基础就是光压力。早在1 6 1 6 年开普勒就提出光压力的概念。 1 8 7 3 年，麦克斯韦在他的电磁场理论中，证明了光压力的存在。从光的粒子性出发，具 有一定动量的光子入射到物体上无论是被吸收还是被反射，光子的动量都会发生变化， 因而必然会对物体产生作用力，这种作用力就是光压力。但是由于普通光源的光子流密 度很低，方向性很差，产生的光压力微乎其微。单个光子动量为p = h 九一1 0 _ 27 k g m j s ， 太阳的光压力大约为l d y n m 2 ，只有标准大气压的一万分之一，所以人们感觉不到来自太 阳的光压力。直n 1 9 6 0 年激光器的问世，为研究者提供方向好，光子流密度大的光束， 例如输出光功率为l o m w 的h e - n e 激光器，输出光束的亮度是太阳的一万倍，在会聚焦点 处的l l j m d , 球受到的光压力可达到1 0 6 n ，光的力学效应的研究从此进入了一个全新的时 代。 1 1 2 光捕获的发展历史 激光捕获就是利用激光的动力学效应实现对粒子的稳定捕获，在这一领域中，美国 贝尔实验室的a a s h k i n 做出了开创性的研究工作。在1 9 7 0 年a a s h k i n 报道采用单束激 光可对微米大小的粒子进行加速，用两束相对传播的激光可实现对粒子的捕获。那时他 就已经提出用这种新手段进行粒子分离和其他的应用，并且讨论了其用于捕获分子和原 子的可能n 】。在1 9 8 6 年，a a s h k i n 首次采用单光束强会聚激光实现了对粒子的三维光学 捕获，并且提出由于梯度力的作用可以产生光负压，即光压力可以逆着光传播的方向瞳1 。 从此单光束梯度力光阱被形象地称为“光镊 。随后光镊技术进入了迅速发展阶段，发 展出了光纤光镊、全息光镊、分时扫描光镊、飞秒光镊等，光镊也于其他的技术结合进 行研究，如光镊结合拉曼光谱仪、光镊光刀结合等。 光镊的光压力测量及光镊与膜片钳结合的研究 1 2 光镊的基本原理 通常情况下将粒子受到的光压力分为两部分：散射力和梯度力。在散射力、梯度力 和其他作用力( 如重力、液体粘滞力) 平衡时，粒子能被稳定捕获。散射力方向沿着光 束传播方向，表现为欲将粒子推出光势阱。梯度力方向指向光强较强方向，在单光束梯 度力势阱中表现为指向聚焦焦点，梯度力是能实现捕获的关键因素。粒子受到的光压力 可以表示为3 ： f ：= q n , p c q 是等于小于1 的无量纲参数，表示的是激光光功率转化为光作用力的效率。对于一 个平面波入射完全被粒子吸收的情况下，q - 1 。q 是由显微物镜的数值孔径，激光波长， 光的偏振态，激光的模式，粒子与介质的相对折射率和粒子的几何形状有关。n - 为介质 折射率，c 是真空中的光速，腥入射光功率。 在讨论光与粒子相互作用时，通常根据粒子与光源波长的大小关系，分为三种情况 分析讨论，以下分别介绍。 1 2 1mie 粒子 半径r 远远大于光在介质中波长k 的粒子称为m i e 粒子，此时采用几何光学模型对微 粒的受力情况进行分析。此时散射力和梯度力计算公式分别为口3 ： k = n , p c t l + r c o s 2 8 一穹筹老美笋) 2 ， = n = p c r sin20一t=百sin(2矿0-砑2占)丽+rsin20d，- ( 1 3 ) 其中，和7 、是与入射光线传播方向平行和垂直的单位矢量，研扮别为光线的入 射角和折射角，r 、t 分别是菲涅耳反射率和透射率，与偏振态有关，所以光压力也是 与偏振态有关的。图1 1 描述的是几何光学力的计算原理图。在图中，倒置显微镜的焦 点在光线主轴z 上，变量有：入射角舅折射角白入射立体角的一半，疗是法线单位矢 大连理工大学硕士学位论文 量，k 是孔径半径。一束功率为釉单束激光与粒子作用产生的反射，折射功率有胪 尸、抑，脬等。散射力和梯度力的箭头方向表示了作用方向。 幽l1 单光束梯度力势阱捕获的几何光学原理图 f i g1 】s c h e m m i c d i a g r a mo f f o r c ea p p l y i n g o na m i c r o - p a n i c l e i ng e o m e t r i c a lo p t i c s 单光束梯度力光势阱正是根据这个原理发明的。粒子对光线的透明度决定了梯度力 的情况。大多数生物体如细胞，细胞器以及寄生虫等，对某一段或全部可见光谱都是透 明的，因而能够被光捕获，所以光镊的应用在生物方面是相当广泛的。 122r a y l e i g h 粒子 半径r 远远小于光介质中波长k 的粒子称为r a y l e i g h 粒子，此时采用电磁场模型对 粒子受到的光压力进行分析“。在这种限制下，认为电解质周围的电磁场是均匀的，将 电解质粒子看作电偶极子。散射力的表达方式如f ， 一 口 ，f2n m 4 光镊的光压力测量及光镊与膜片钳结合的研究 = 詈舳舟2 惠) 2j搬十z ( 1 5 ) 其中，硝半径为r 的r a y l e i g h 粒子的散射截面，碱时间平均的波恩挺矢量，m 为粒子折射率，l l l = n 。m 为粒子与介质的折射率相对值，k = 2 u n j 九是激光的波数，九为入 射激光在真空中的波长。散射力与能量流成正比，方向沿着入射光传播方向。 梯度力为光场作用在偶极子上的洛仑兹力，表达式为： = 詈v l 情况 。 由以上分析可知，粒子被稳定捕获的必要条件是梯度力大于散射力。但由于捕获细 胞通常在溶液中进行，所以需要考虑布朗运动的影响，梯度力的势能还须远远大于粒子 布朗运动，即： 唧移矧唧币1 ( 1 。8 ) 其中，u 梯度力势能，k 。为玻耳兹曼常数，t 粒子周围介质的绝对温度。 1 2 。3 介于m ；e 粒子与r a y l e i g h 粒子之间的粒子 当粒子的半径r 与光波长九可比时，并没有十分有效的模拟方法对光压力进行分析。 若在电磁场模型中采用更加严格的边界条件可得到比几何光学模型要好的结果。但是两 种模型的模拟结果都不能很好地与实验结果相吻合。在实验上却发现对这种粒子的捕获 效率却是最高的，并且实际上需研究的粒子尺寸大多数与捕获光波长可比，介于o 1 九 至0 笼之阆。 t l u s t y “1 等人介绍了一种可以应用予任意大小粒子的模拟计算方法。假设粒子的折 射率与周围介质的折射率是相近的。他们认为在离斯光束焦点处的能量密度是 一4 一 大连理工大学硕士学位论文 帅 z ) = e x p ( - 刍一番) ( 1 9 ) 蔗距离光轴的半径，提沿光轴的距离，焦点的位置是原点，砜= i e o e 2 是光束 能量密度的最大值( 在z = o 处) 。对于使用大数值孔径的光镊实验，s 3 ，人为的限制 占可。虽然在实际中不能实现，但是这样使得分析公式很简单。t l u s t y 发现在c = 7 时，在 被捕获粒子受到的回复力遵从 k ：帅等以 ( 1 1 0 ) 给出的小扰动，= = r m 为粒子半径与激光束腰半径之比。对于d 零的更实际的情况， 他们发现 巧毗号t 层c c 争啪孚坝参哆毛 亿 驷乩缈等c 唇孚坝渺c 妒， 亿 ：再j 。 t l u s t y 指出这些表达式中，对于非线性回复力的大扰动情况，计算结果与实验结果 也是相吻合，对于任意大小的粒子都适用。 1 3 光镊的特点 光镊所具备的各种特点使其广泛地应用在生命科学的研究领域。首先光镊具有穿透 特性，使得其捕获光可以透过封闭的样品池外壁，操控池内的微粒，也可以无阻挡的越 过细胞膜操控其内部微粒如细胞器，实现无菌操作。第二光镊操作具有可视性，被操作 的粒子悬浮于液体中，其四周没有遮挡，为实验操作者提供了极大的方便。第三光镊系 统还具有实时显示的特性，可以保留活体细胞和大分子的生命活力，能反映生命体系作 用过程的真实特性。第四光镊是一种微小力的探针，类似弹簧，能实时感应微小的力负 荷，是极其灵敏的力传感器。基于光镊的这些特点，光镊成为了揭示生命过程中物质输 光镊的光压力测量及光镊与膜片钳结合的研究 运，能量转换和信息传递规律的研究工具。光镊提供的这种对生命活动的基本过程的研 究具有的高度选择性是传统研究方法不可比拟的。生命科学研究者可以秽l 选所需要的特 定活细胞来观察它的个体行为，研究特定细胞间相互作用的基本过程。 4 光镊分类 随着光镊技术和其他技术的发展，光镊仪器发生了巨大的改进，从单光束梯度力激 光光镊演变出全息光镊、分时扫描光镊、飞秒光镊、近场光镊等新的光镊技术。下面对 光镊分类介绍，对于常规激光光镊的详细介绍将在第二章进行。 1 。4 1 全息光镊 全息光镊使用的是空间调制器或者是衍射光学元件来产生二维或者是三维的多光 点阵列。其基本原理如图王。2 所示强1 ，通过计算机产生全惠圈加载到空闯光调制器上，激 光束经扩束准直后照射到空间光调制器上，经衍射被调制成所需要的光强分布，在通过 一个望远镜系统将光束收集进入显微物镜，在显微物镜的焦乎瑟上得到所需要的光点阵 列。 大连理工大学硕士学位论文 图12 采用液晶反射空间光调制器的动春全息光镊原理阁：插入的相位光栅酌全息方程( p ) 的1 2 5 刻出2 0 2 0 的光阱排列，白色的区域表示的是此处的相位转变到2 ，黑色的区域表示相位转变到0 。 一个望远系统破置将光柬传递进入一个高数值孔径的物镜，物铙橹光束聚焦成势阱。艘在样品池中 的样品可咀通过普通的显微镜成像。插入的显微成像元件表示从暂时放置在聚焦平面出的反射镜反 射的光阱光强度为，( i ) = ，川d ( i 一) 9 1 。 f i g i2 s c h e m a t i c i m p l e m e m a g e no f d y n a m i ch o l o g l a p h i c o p t i c a l t w e e z e r su s i n gar e f l e c t i v e l i q u i d c r y s t a ls p a t i a l l i g h t m o d u l a t o rt h e i n s e t p h a s e g r a t i n g i s l 2 5o f t h eh o l o g r a m ( p ) e n c o d i n g a 2 0 + 2 0a r r a y o f a p s ，w i t h w h i t er e g i o n sc o r r e s p o n d i n g t o l o c a ip h a s es h i f t so f 2 nr a d i a n s a n db l a c k t o 0a t e l e s c o p e r e l a y s t h ed i f f r a c t e db e a m s t o a h i 曲一n u m e r i c a l a p e r t _ a r eo b j e c t i v e w h i c h f o c u s e s t h e m i n t o o p t i c a l t r a p s t h es a m p l e ，e n c l o s e d i n a g l a s s f l o wc e l lc a r lb e i m a g e d t h r o u g hc o n v e n t i o n a lv i d e o m i c r o s c o p yt h e i n s e t v i d e o m i c r o g r a p hs h o w s t h e i n t e n s i t y ，( i ) = j 川j 扩一) o f l i g h t f r o m t h e t r a p sr e f l e c t e do f f a m i r r o r t e m p o r a r i l yp l a c e d i n t h e o b j e c t p l a n e l 5 1 光镊的光压力测量及光镊与膜片聿甘结合的研究 每一个光点都可以作为一个光学势阱，通过编程改变全息图来改变光点阵列的结 构从而可以同时并行地捕获和操作多个粒子，如图13 所示。 图1 3 一个由2 6 个直径为0 9 9 岬的硅胶粒子组成五角图形运甩动态全息光镊转变成圆形的过程。( 砷 初始态图形，( b ) 在l6 步之后， ( c ) 在3 8 步之后的最终图形”。 f i g l3 ap e n t a g o n a lp a t t e r n o f 2 6c o l l o i d a ls i l i c as p h e r e s0 9 9 p r o i n d i a m e t e r i s t r a n s f o r m e d i n t oac i r c l e u s i n gd y n a m i ch o l o g r a p h i co p t i c a l t w e e z e r s ( a ) t h eo r i g i n a lc o n f i g u r a t i o n 啦) a n h l 6s t e p s ( c ) t h e f i n a l c o n f i g u r a t i o na l t e r3 8s t e p sf 6 1 , g r i e r 的研究小组叫及丹麦r i s o 国家实验室”在全息光镊的研究处于领先地位。他 们设计的动态全息光镊系统不仅可咀产生任意形状的二维光点阵列，而且通过使用特 殊算法可以产生三维光点阵列，并通过计算机控制实时改变光点阵列的结构。图1 4 是 他们的全息光镊系统产生二维和三维光点阵列捕获粒子的照片。 大连理工大学硕士学位论文 乏? ：雾：_ ：。：。蔷一。茹一。蔷 圈14 光镊捕获和对粒子进行操作，将硅胶粒子排列成任意的形状( s i o z 直径：22 5l l 白l 聚苯乙烯 直径= 3 叫) ，图的上部分。粒子的三维相对排列图的下部分”。 f i g l4o p t i c a l i r a p 脚n ga n d m a n i p u l a t i o n i n t oa r b i t r a r yc o n s l c l l a t i o n s o fc o l l o i d a l m i c r o - s p h e r e s ( s i 0 2 ， d i a m e t e r = 2 2 5 m ，p o l y s t y r e n e ，d i a m e t e r = 3 1 a m ) ，l o p3 dr e n d e r e d v i e wo f t h es p h e r 、e s r e l a t i v e p o s i t i o n s ， b o n 1 7 ) 142 分时扫描光镊技术 全息光镊受空间光调制器透过率及衍射效率的限制，通常需要使用大功率激光器 才能产生足够强度的多光阱阵列。与之相比，分时扫描光镊由于采用单光束扫描，所以 光强损失小，可以使用较低功率的激光器。分时扫描光镊的核心部件是光束偏转器，通 常使用扫描振镜、声光偏转器、电光偏转器等器件。激光束经过偏转器在显微物镜的像 平面e 快速扫描，通过计算机控制光束的行走路径，也可以使激光束在几个固定点之 间快速切换。当光点在各个微粒上的作用时间大于最小停留时间，而离开时间小于粒子 的布朗运动时间时。粒子可以被束缚在光点扫描路径上，排布成各种图案，或者在几 个固定点上同时捕获粒子。通过控制光束的扫描速度，还可以使被捕获的粒子沿光束的 扫描轨迹运动。分时扫描光镊的缺点是可同时捕获的粒于数目不多。扫描光镊的另一个 缺点是不能产生三维光点阵列。t i m p 教授对这种方法进行了改进”，将扫描技术与空间光 调制器技术相结台，产生了3 3 3 的三维光点阵列可同时捕获2 7 个细胞，在空间排列 成方阵，用来研究细胞间信号传递。由于声光偏转器和空间光调制器都可编程控制，因 而可以产生任意结构的二维或三维光点阵列。 隘潍 。喜 0 。o o m ： 光镊的光眶力测量及光镊与膜片钳结合的研究 1 4 3 非高斯光束光阱 单光束高斯光镊的另外一个局限性是只能在光束的焦点处捕获粒子，这要求粒子 的折射率要大予周围介质折射率并对捕获光波长透明。使用高斯光束通过锥镜可以产生 空闻不衍射的贝塞尔光束。贝塞尔光束具有沿光荣传播方向保持光束直径不变的特性， 可以克服高斯光束瑞利极限的限制n 羽。贝塞尔光束的横向光场分布是同心圆结构，零阶 贝塞尔光束的中心是一个亮斑，聚集了光束的大部分麓量，可以用来捕获折射率大于周 围液体的透明粒子。高阶贝塞尔光束的中心是一个暗斑，随着阶数的增加暗斑半径也随 之增加，这个暗斑就可以看作是一个光学陷阱。对折射率小予周围液体的透明粒子或鼍彝 透明的吸收型粒子，在这个陷阱中会受到指向暗斑中心的梯度力，从而被因禁在暗斑 中心。另外，贝塞尔光束具有轨道角动量，可以与其它模式的光束，例如高斯光束，干涉 形成特殊的光场模式，用于光致微粒旋转的研究n 。贝塞尔光镊的缺点是轴商光梯度力 很小，要产生足够的光梯度力需要加大捕获光的功率。 1 4 。4 飞秒光镊 随着飞秒激光器的出现，光镊技术又有了新的发展。国内外的研究小组在对飞秒光 镊进行理论模拟的同时，在飞秒光镊的系统结构及其应用上也徽了很多的研究工作和烫 献。2 0 0 1 年天津大学精仪学院超快激光研究室提出了一种捕获生物细胞的飞秒激光光镊 装置。凰王5 力飞秒激光显微操作实验样机的结构图。以嵩重复率飞秒激光为光源对盘 红细胞，白细胞，更小病毒，聚苯乙烯小球可实现稳定捕获，并对飞秒激光与连续激光 的捕获能力进行了研究。通过对单细胞的操作和基于双光子激发光动力学对癌细胞的诊 断和治疗进行了研究，提出了光动力治疗法班彰。 大连理工大学硕士学位论文 l n v c 靠e dm i c r o s c o p y 图1 5 飞秒激光显微操作原理结构图：p ：偏振片，l 1 ，l 2 ：透镜，m 1 ，m 2 ，m 3 ，m 4 ：反射镜，c ：转换 室，b s ：分束器，i r ：红外滤光片m 1 。 f i g 1 5 s c h e m a t i co f t h eo p f i c a lm a n i p u l a t i o ns y s t e m ：p ，p o l a r i z e r , l i ，l 2 ，l e n s e s ； m i ，m 2 ，m 3 ，m 4 ，m i r r o m ；c ，t r a n s m i s s i o nc u b e ；b s ，b e a ms p l i t t e r ；i 心i rb l o c k i n gf i l t e r t l 6 1 2 0 0 4 年kd h o t a k i a 的研究小组采用单光束梯度力光阱对1 2 8 岬的硅球进行了研究， 发现飞秒激光和连续激光光镊的捕获效率与平均功率有关，而与峰值功率没有关系；首 次开展了飞秒光镊与多光子实时荧光荆法的实验珏毂翔。这个研究小组在2 0 0 6 年提毒了飞 秒激光双光束光纤光阱，可实现对粒子的捕获和对荧光的激发，长焦距聚焦物镜可以实 现对微粒的成像和对荧光信号的搜集。通过向介质中添加荧光素，利用双光子荧光成像， 实现了光学束缚过程中光场分布可视化h 引。 l 。4 5 近场光镊 常规远场光镊技术一般是将激光荣经过大数值孔径显微物镜聚焦，在光束焦点附近 产生光学势阱，用来捕获粒子。由于聚焦光斑大小受到远场衍射极限x 2 的限制，其尺寸 在微米量级，可以稳定的捕获微粒尺寸也在微米量级，而且激光焦斑的形状在光轴方向 上被拉长，其轴向捕获距离约为横向捕获距离的3 倍，这样在有多个粒子的溶液中有时会 光镊的光压力测量及光镊与膜片钳结合的研究 同时捕获多个粒子，捕获的精度和稳定性会受到影响。近场光学由于其分辨率突破了衍 射极限九2 的限制，其操控精度和研究对象都达nt 纳米量级n 引。近场光学产生的倏逝场 仅局域在界面表面约1 0 0 n m 范围内，其光强随离开界面的距离而迅速衰减，利用倏逝波的 光强梯度产生梯度力，将有可能显著降低捕获微粒的尺寸啪一h 刎。 1j5 光镊与其他研究手段的结合 1 5 1 光镊拉曼光谱技术 当一种频率的光照射到某种分子时被散射，散射光的频率不同于入射光，这种现象 称为拉曼散射。拉曼散射产生的原因是分子转动能级和振动能级在外界光场作用下发生 跃迁。因此，拉曼光谱可以用于样品分子结构的研究。拉曼光谱技术具有无接触、非破 坏、微量检测、快速、高精度等优点，广泛应用于无机、有机、高分子、生物、环保等 领域的化学成分分析。测量样品的拉曼光谱时需要将激光束聚焦到样品上，利用探测器 接收光束焦点处样品激发的光谱信号。由于焦点以外的散射光以及荧光等背景噪声也会 进入探测器，因而降低了系统的信噪比和空间分辨率。共焦拉曼光谱技术结合了激光共 聚焦显微技术的优点，散射光经与激咣共焦的探测针孔后被光谱仪接收，只有焦点处激 发的散射光才能进入探测针孔，因而抑制了背景噪声，极大地提高了系统的信噪比和空 间分辨率。由于激光束对样品的扫描可以是三维的，所以共焦拉曼光谱技术可以探测样 品内部的光谱信号。但是如果要将共焦拉曼光谱技术应用于生物学中活体细胞的研究， 待测的活体细胞必须被固定在载波片上，这样一来就改变了细胞的周围微环境，有可能 对细胞机能产生影响。为了避免这种情况，可以使用光镊来固定细胞。如图1 6 所示口朝， 当激光功率较弱时，它的作用相当于激光光镊，可以将细胞捕获在光束焦点处，与载波片 不接触，不会影响细胞周围的微环境。当需用测量该细胞的拉曼光谱时，瞬间增大激光功 率，再对焦点处激发的细胞的拉曼光谱进行测量。共焦拉曼光谱技术与光镊技术的结合 使得测量单个活细胞的拉曼光谱成为可能。 大连理工大学硕士学位论文 目世暑二 图1 6 实验室搭建光镊与拉曼光谱仪结合豹系统，m ：反射镜，l ：透镜，d m 分光镜，p h ：小孔， h n f ：全患刻槽过滤器。 f i g 1 6e x p e r i m e n t a ls e t u po f t h ec o m b i n e dl a s e rt w e e z e r sa n d1 - r m a ns p e c t r o s c o p ys y s t e m m ：m i r r o r , l ： l e n s ，d m ：d i c h r o i cm i r r o r ，p h ：p i n h o l e ，h n f ：h o l o g r a p hn o t c hf i l t e r1 2 3 】 1 5 2 光镊与其他微操作技术结合的微操作台 在2 0 0 7 年由中国科学院西安光学精密机械研究所瞬态光学和光子技术圜家重点实 验室搭建成功了多功能光学微操作平台。这是种集微操控、微加工和微测量的新型系 统。该所设计并建立的多功能光学微操纵系统包括激光光镊、飞秒激光光刀、显微光谱 仪等多种功能。他们成功地捕获、移动了红细胞、酵母菌细胞、聚译基丙烯酸甲脂小球 等微粒。同时利用圆偏振光与双折射微粒之间角动量传递，实现了对c a c 0 s 微粒的光致旋 转，最高转动频率可达1 2 h z 。利用飞秒激光多光予浇蚀帮双光子吸收效应对一般材料秘 有机光致变色材料进行了显微加工，并且测量t l c d 彩色滤光片、s i 0 2 光子晶体、 z n s ：c u 微粒的显微吸收光谱和荧光光谱3 。 1 6 光镊的应用 在生物学和莲学领域，光镊已经成为深入研究活体细胞和生物大分子个体行为，探 索生命运动规律的重要实验手段。主要用于动植物基因工程、农产品改良宵种等领域， 光镊可以实现捕获单个活细胞甚至在细胞内操纵微小的细胞器，完成注入细胞融合、染 光镊的光压力测量及光镊与膜片钳结合的研究 色体切割与分选、细胞转基因操纵、微细手术等精细操作乜5 2 6 硎。光镊技术还可以用来 探测生物细胞以及分子马达的动力学特性，d n a 的折叠、细胞膜弹性参数的测量等瞄瑚1 。 在原子物理的研究中，光镊技术可以用来捕获、冷却原子，研究玻色一爱因斯坦凝 聚以及原子激光，原子钟啪1 。 在凝聚态物理的研究中光学势阱技术已经迅速的应用在研究胶体和悬浮体的行为 ( 包括不正常的扩散特性和空间扩展效应) m 一 在工业领域，它可用于对微小零部件和物体进行加工、调整、装配等微操作，如微 齿轮的抓取和释放等阻副。 1 7 本文的主要内容 本文的主要内容是在对光镊的发展历史和常规单光束梯度力激光光镊的主要元件 介绍的基础上，并且同时基于常规光镊的各种位置探测手段和光镊对微小力的测量的不 同方法的详细描述前提下，描述了使用l o t i i 型光镊在4 0 x 和1 0 0 x 显微物镜对酵母菌 细胞的捕获能力的比较和结果的分析，以及在4 0 x 下对乳腺癌细胞和海马神经元细胞， 这些尺寸比较大和形状不规则的细胞进行捕获的实验。在成功捕获海马神经元细胞的前 提下，将光镊仪器与膜片钳仪器结合用于研究细胞的电特性，对膜片钳针尖对细胞的作 用力做出了初步的计算和分析。 大连理工大学硕士学位论文 2 常规光镊系统 常规的单光束梯度力光镊系统，是舀前最成熟的光镊技术，已经被广泛的应用在各 个研究领域中，下面详细的对其进行介绍。 2 1常规单光束梯度力光镊系统 常规的单光束梯度力势阱光镊系统，如图2 。l 所示。擒获激光光源输出捕获激光， 光束经扩束器扩束后，由反射镜、分光镜反射，进入显微物镜，在显微物镜焦平面上形 成聚焦光斑，实现对样品池粒子的捕获。照明光通过显微物镜，透过分光镜后被反射到 滤光片上，滤撵捕获激光磊成像在成像系统上。翻成像系统进行图像采集和实现视频的 记录，同时可由显示器显示出来。实验后可以通过一定的软件系统对图像或者是视频进 行分析。 多 2 缀嚣 矿l 、 ? 图2 1 常规单光束梯度力光镊光路图。1 光镊光源，2 扩束镜，3 全反射镜，4 分光镜，5 显微透 镜，6 。样品台，7 ，样品池，8 。样品照明电源，。激光滤波片，1 0 。数码摄影头，l l 。图象显示与处理 计算机 f i g 2 1 s c h e m a t i ci m p l e m e n t a t i o no f s i n g l eb e a mo p t i c a lt r a p p i n g 1 t r a p p i n gl a s e r ，2 ：o p t i c a l e x p a n d e r , 3 ：m i r r o r , 4 ：d i o c h i cm i r r o r , 5 ：m i c r o s c o p eo b j e c t i v e ，6 ：s a m p l es t a g e ，7 s a m p l ec e l l ，8 ：i l l u m i n a t i o n l i g h ts o u r c e ，9 ：f i l e rp l a t e ，io ：c c d ，1 l ：c o m p u t e r 光镊的光压力测量及光镊与膜片钳结合的研究 2 1 。1 捕获激光 光镊光源通常采用连续波激光器，也可采用高重复频率的飞秒脉冲激光器作为捕获 光源口引，其捕获效率比连续波激光器要低。光镊系统对捕获激光光源的最基本的要求是 它能够传递一束具有良好的准直性和比较低的功率波动的单模光束，通常选择可以输出 强度具有高斯分布特征的t e m 0 0 模的激光器作为捕获光源m 1 。 在捕获生物样品时，激光器输出的激光波长是个主要的考虑因素，特别是在生物体 内捕获细胞或者是细胞内更小的细胞器时口3 ，要求光镊光源波长对生物样品透明，这样 可以避免由于生物样品对光的吸收产生损伤。生物样品在波长8 0 0 h m 处的吸收最少，而 在近红外长波区，由于水对光的严重吸收产生热效应会对生物样品造成严重损伤。如果 对生物样品损害很小则不需要考虑，那么选择光波长就变得不重要了，但是由于介质或 者是被捕获微粒对光束的吸收产生的潜在的热效应还是应该被考虑的。最合适的激光光 波长还应该由捕获所使用的物镜的透过率所决定。在没有生物样品的光捕获应用中，任 何符合在样品台上能达到所需要的功率，有比较好的准直度、稳定的振幅、高斯强度包 的激光器，都是可以采用的。我们实验中使用的激光光源的波长为7 8 0 n m ，仅从波长因 素考