心脏疾病的实验诊断.ppt

心脏疾病的实验诊断,中南大学湘雅医学院检验系临床生物化学教研室彭剑雄,心肌组织损伤的标志物心脏功能的标志物心血管炎症疾病的标志物其他心脏标志物,冠心病概念的发展,50年代心绞痛心肌梗死80年代无Q波心肌梗死(心内膜下心梗)Q波心肌梗死(穿壁性心梗)90年代不稳定性心绞痛稳定性心绞痛2000年急性冠脉综合症(ACS),稳定性心绞痛：在六十天内，胸痛发作的强度，频率，持续时间等特征未发生改变，口服硝酸甘油能缓解，疼痛无放射性，持续约四分钟，休息能缓解。伴有心肌功能障碍，无心肌坏死,不稳定性心绞痛：在六十天内疼痛的频率，强度均发生改变，疼痛时间延长，频率增加，疼痛加重，具放射性，口服硝酸甘油作用减小,急性冠状动脉综合征,一般认为，急性冠状动脉综合征（acutecoronarysyndrome，ACS）是包括不稳定性心绞痛（UAP）、无Q波心肌梗死（NQMI）和Q波心肌梗死（QwMI）的一组病症。,近来，许多文献资料和随机对照实验中也将Q波心肌梗死称为ST段抬高的心肌梗死（ST-segmentelevationmyocardialinfarction，STEMI），而将无Q波心肌梗死称为ST段不抬高的心肌梗死（non-ST-segmentelevationmyocardialinfarction，NSTEMI）。,急性冠状动脉综合征（acutecoronarysyndrome，ACS）,临床病理生理动脉粥样斑块脱落、血小板聚集、血栓形成、心肌缺血、心肌坏死等等临床表现症状不明显的隐性心绞痛、不稳定心绞痛、急性心肌梗死（AMI）、甚至心律失常导致死亡,ACS的主要病因,急性血栓脱落进行性的冠脉梗塞炎症继发性不稳定心绞痛冠状动脉血管痉挛,AMI现状(美国),600万出现过心脏疾病，心绞痛或两者兼有每年70万患者因心脏病住院50万死于心肌梗死75,000被误诊20%没有得到及时治疗,AMI流行病学调查,在美国每年有150万心肌梗死病人：其中1/3在1年内死亡只有50%的患者被送到医院就诊，其中5%因为诊断的假阴性结果被不合适地送回家另一方面，大约有200万到心脏病重症治疗单位(CICU)就诊的患者疑有AMI，但其中只有3050%的患者被确认为AMI这些患者的治疗费用：$40亿/年,心血管病死亡率统计,全球：20世纪初，仅占总死亡率10以下21世纪初，发达国家占总死亡率近50发展中国家占总死亡率25中国：已成为常见疾病和主要死亡原因之一。1999，城市为236.08/10万（38.45%)农村为186.56/10万（30.77%)2003,城市:181.63/10万（34.38%)农村:135.53/10万（35.78%)每年约有300万人死于心血管病,心肌标志物发展史,上世纪50年代前，医生依据临床症状、心电图变化诊断MI实验室无何检验有助于诊断心肌梗死（MI）保守治疗,从1954年开始，实验室发现测定AST（G0T）有助于MI诊断60年开始测定总CK70年代CK-MB达到高峰,当时曾将CK-MB定为诊断AMI”GoldStandard”90年代开始,酶学时代巳结束,酶学标志物（50-80年代）,早期标志物：CK（肌酸激酶）CK-MB（isoenzyme,isozyme）CK-MB亚型（isoform,isotype）晚期标志物LD，LD1，HBDH（实际为LD1）AST测定无何实际临床价值,WH0诊断MI标准,典型的胸痛病史；ECG异常改变，出现Q波或QS波，持续1天以上；酶测定值的持续异常或先升高后降低至少应符合其中两条方可诊断为AMI,蛋白标志物（90年代-）,90年代心脏结构蛋白(肌钙蛋白,肌红蛋白等)取代酶成为灵敏度,特异性更高的心脏标志物早期标志物肌红蛋白，CK-MB亚型确认标志物心脏特异肌钙蛋白（cTn）CK-MB（mass）,肌细胞中的蛋白质,胞浆游离蛋白：肌红蛋白CKLDH6%TNT2%TNI1%肌球蛋白,细胞结合蛋白：TNTTNITNC肌球蛋白,Panteghini,M.Chest2002;122:1428-1435,TimecourseofreleaseofcardiacproteinsinbloodafterAMI,教科书VS.现实,男性65岁以上胸痛胸骨下放射性疼痛心绞痛历史,33%为女性3550%在65岁以下1125%没有胸痛症状35%胸痛症状不典型50%没有心绞痛历史,决定心肌标志物特点的因素,分子大小细胞内分布释放率清除率（或半衰期）心肌特异性等等,理想心肌标志物的条件,高度心脏专一性心肌损伤后很快增高增高后持续较长时间容易检测很快得到检测结果（1h）诊断价值已经临床证实,心肌损伤部分早期标志物,标志物名称MW半衰期(h)临界值(L)增高(h)高峰(h)回复(d)C反应蛋白（CRP）120000193mg6122423淀粉样蛋白A120003mg6122423血栓前体蛋白(TpP)3000004mg612243P-选择素(p-selectin)1400001200mg151可溶性纤维蛋白糖原磷酸化酶BB188000467mg24122412脂肪酸结合蛋白150001419mg266121肌球蛋白轻链(MLC)270001.251mg369610a-肌动蛋白(a-actin)4300017肌红蛋白（Myo）1750000.2580mg266121碳酸酐酶III(CAIII)28000024mg2CK-MB8600012165mg610122423,心肌梗死诊断的实验室指标的特性,实验室分子量生理半衰期升高时间峰值时间恢复正常时间指标(KD)(h)(h)(h)(d)AST9320612183634LDH-113511061248144714CK8617312122434CK-MB活性8613312122423CK-MB质量86132612243Myoglobin17.80.250.526121cTnI22.524381224710cTnT3724381296714GP-BB1884614102012H-FABP150.3256121,心肌损伤早期标志物,肌红蛋白在MI发生后最早升高,和CK-MB亚型(isoform,isotype)同列为早期标记物.缺点为特异性差,虽灵敏度很高.与横纹肌Mb有交叉，要排除：剧烈运动、骨骼肌病或损伤；由于从肾脏代谢清除，要排除休克和肾衰。,心肌损伤早期标志物,肌红蛋白（Myo）MW17.8kDa153个氨基酸的多肽和血红素辅基组成占横纹肌蛋白2%，主要位于胞浆结构与Hb相似，为携氧载体1975年首先报道AMI时增高,心肌损伤早期标志物,肌红蛋白（Myo）MI后能迅速从坏死心肌中释放，具有高度的敏感性，但心肌特异性不高阴性特别有助于排除AMI的诊断有助于观察AMI病程中有无再梗死发生以及梗死有无扩展AMI后的溶栓治疗中评价有否再灌注时较敏感而准确的指标,心肌损伤早期标志物,迄今为止受到公认的早期生化标志物主要限于肌红蛋白；CRP的应用近年来也不断受到关注；其余各标志物由于不同报道或不同方法的测定值变异较大，其临床使用价值目前尚有限,心肌损伤确定标志物,肌酸激酶MB同工酶（CK-MB）分析测定有多种方法测定其活性（U/L）的常用方法CK-MB质量(CK-MBmass)测定避免了可能的干扰，具有高度的灵敏性(最低检测限1mg/L)和准确性，测定时间短(最快仅需7min)，适合于自动化分析,CreatineKinase（CK,EC2.7.3.2，ATP:肌酸磷酸转移酶）pH9.0ATP+肌酸磷酸肌酸+ADPpH7.0CK:MM,MB,BB,MtMW86000,肌酸激酶同工酶,组织CKU/克湿重CK-MM%CK-MB%CK-BB%骨胳肌32809910(腓肠肌)骨胳肌1894991=124h轻症:总LDH正常,同工酶有变化同时有心衰、心源性休克,LDH5%总LDH:敏感性95.8%,特异性89.3%LDH1:敏感性86%,特异性91.3%LDH1/LDH2:敏感性91.6%,特异性92.7%,LDH同工酶临床评价,肌钙蛋白（troponin）,1965年Ebashi和Kodama首先发现，随后被命名1968年Hartshorne和Mueller认为是一复合物，并研究了功能1971年Ebashi等纯化后用SDS电泳分析，得到三个片段1973年Greaser和Gergely根据其功能，将三个亚基命名为TnC，TnI，TnT,心肌细丝结构蛋白,肌动蛋白（acting）MW42000聚合成长链（F-acting）两条盘绕，双股螺旋结构原肌球蛋白（tropomyosin）MW70000调节蛋白位于F-acting双股螺旋沟中肌钙蛋白（troponin）,肌肉细丝中的肌钙蛋白位置（示意图）,肌钙蛋白的作用机制,A:示一肌节，以肌球蛋白为主的粗丝和肌动蛋白为主的细丝的相对位置，在肌肉收缩时，在ATP提供能量和细胞内钙离子作用下，肌丝间沿纵轴滑动，肌节缩短。B:在无钙离子时，肌纤维松弛状态时，肌钙蛋白原肌球蛋白肌动蛋白互相作用模式。C:钙离子进入并和肌钙蛋白结合，导致肌钙蛋白复合物构象改变。,肌钙蛋白（troponin）,肌钙蛋白基因位于染色体的位置,cTnI或cTnT的部分特性,cTn亚基主要作用分子量(kDa)等电点TnCCa2+结合亚基184.1cTnI抑制亚基239.87cTnT结合亚基345.1cTnI相对于两种sTnI有40%不同源性人cTnI氨基末端比sTnI多31个氨基酸,cTnI或cTnT的部分特性,外周血中的cTn,心肌损伤后68h后即可在外周血测得增高持续710天（cTnI）或1014天（cTnT）cTn的释放以TnC-cTnI-cTnT复合物形式，随后降解；外周血中的cTnI以cTnI-TnC复合物形式居多数（90%以上），游离的cTnI较少；cTnT游离形式较多,cTn的检测,cTn可以用高度敏感的标记免疫法作定量检测，也可用固相免疫层析法作快速定量或定性检测外周血中出现任何一种可检测到的cTn必然是心肌细胞受损伤的结果,cTn的检测,cTn的临床应用正在不断增加90%的实验室已开展cTn的检测，3年中增加2倍美国的2002年心肌标志物室间质评中，开展cTn检测的实验室数3500，比1999年增加123%,cTnT的检测,1992年推出cTnT1临床应用中存在和TnT骨骼肌亚型的交叉现象，在部分晚期肾功能衰竭病人中的“假阳性”现象1997年推出cTnT2诊断敏感性与cTnT1相同而心肌特异性更高，并基本上排除了交叉现象，部分晚期肾功能衰竭病人中的“假阳性”问题研究也有了新的进展,cTnT的检测,1999年的cTnT3运用重组人基因技术代替cTnT2的牛血清，在增加特异性和灵敏度的同时，线性范围更大，分析时间缩短到20min，诊断MI的临界值从0.50mg/L减低到0.20mg/L以下快速定量检测cTnT的分析仪测定结果与cTnT2之间相关性良好,cTnI的检测,1987年报道检测方法（放免法）目前检测cTnI的试剂、方法很多，并得到广泛应用各种cTnI分析方法测定结果之间差异很大，最大可相差36倍,几种自动免疫分析仪测定cTn的性能,cTnI的检测(抗体),各种检测方法采用不同的抗体；各种抗体针对不同的抗原决定簇cTnI分子内的不同片段和不同抗原决定簇受氧化-还原反应、磷酸化反应或蛋白水解酶作用等而降解的影响各不相同不同形式（游离或复合物形式）的cTnI对不同抗体的免疫反应性也各不相同,cTnI的检测(校准品),各生产厂商的cTnI校准品各不相同（包括cTnI标定值和cTnI复合物形式的不同）使用同一份标定cTnI值的人血清进行校准也未能完全消除不同测定系统之间测定值的差异,cTnI的检测(抗凝剂),采用血浆或全血标本加快检测速度抗凝剂的选用EDTA肝素,cTnI的检测(标本保存和操作步骤),血中cTnI分子的氧化或还原形式的互变可较大程度地影响测定结果的稳定性溶血或纤维蛋白原甚至类风湿因子有时也可对cTnI测定产生一些影响应考虑标本中cTnI的稳定性，注意标本保存时间和保存温度，并对操作步骤加以规定,cTnI的检测,用于检测cTnI的快速诊断试剂盒也有多种，同样存在缺乏标准化的问题,cTn检测在ACS中的临床意义,确定诊断危险性分类估计病情治疗指导,cTn在临床诊断中的用途,诊断主要用于心肌缺血损伤如ACS（包括隐性心绞痛和不稳定心绞痛以及急性心肌梗死）等的临床诊断预后估计急性冠状动脉综合征危险性估计cTn是早期危险性分类的较好指标急性冠状动脉综合征预后判断cTn增高程度与预后有关,cTn在临床诊断中的用途,心肌缺血损伤面积的估计临床诊断心肌炎临床诊断心肌创伤（心脏手术）围手术期心脏并发症严重脓毒血症或脓毒血症导致的左心衰竭,cTn在临床诊断中的用途,充血性心功能不全某些治疗药物的临床疗效观察等等,cTn在临床诊断中的用途,MI后的溶栓治疗（thrombolysisinmyocardialinfarction，TIMI）效果判定TIMI的疗效分级血样本采集时间（60min；90min；120min）至少两次：治疗开始时（T0）治疗开始后90min（T90）,cTn在临床诊断中的用途,不稳定心绞痛患者cTnT水平与预后危险性,危险分层是cTn的重要应用,医师对急诊疑似ACS病人,首先要进行危险分层,必须根据入院时病史,症状,物理检查,ECG和心脏标志物检查结果判断病人有无危险有无猝死,或其它非致死性心脏事件的可能性,危险分层用于,下述患者:不稳定心绞痛无ST升高的ACS病人预测下述问题:死亡危险性续发AMI需要血管成形术的可能性,危险分层的基本原则,确定危险分层以:选择治疗场所心脏监护病房,急诊或者门诊选择最合适的治疗干预措施积极的手术治疗到消极的保守治疗判断预后,根据TnI和ECG危险分层,TnI比ECG更能说明病人危险性,IFCC和NACB的专家建议：,（X）指选择性检测,1临床应用应考虑各自的诊断“窗口期”；注意选择合适的标本采集时间疑为急性心肌损伤时标本采集建议,IFCC和NACB的专家建议：,2各实验室应用cTn应根据ROC曲线选定合适的临界值3不同的cTnI检测系统有不同的临界值；对不同检测系统应根据检测条件建立适当的各实验室的参考范围；参考范围上限应选取第97.5百分位点（单向）,IFCC和NACB的专家建议：,4低临界值的测定不精密性应10%5应设法使检测周转时间（TAT）控制在1h之内等等TAT:Turnaroundtime,心肌标志物的检测TAT,AMI后6小时,胸痛6小时,肌钙蛋白,阴性,阳性,AMI,15min,15min,15min,15min,不稳定心绞痛/AMI,危险性较低其它疾病?,+4hr,危险性较低其它疾病?,不稳定心绞痛/AMI,心肌组织损伤的标志物心脏功能的标志物心血管炎症疾病的标志物其他心脏标志物,利钠肽（natriureticpeptide）,1956年，Kisch和Henry分别证实心脏具有内分泌功能1981年，deBold发现atrialnatriureticpeptide（A-typenatriureticpeptide，ANP）1988年，Sudoh报道了brainnatriureticpeptide（B-typenatriureticpeptide，BNP）1990年，Sudoh又发现了C-typenatriureticpeptide（CNP）,心脏利钠肽的释放,刺激ANP和BNP释放的主要因素是心肌张力的增加ANP的分泌释放调节主要在心房储存水平，新合成的较少BNP的合成、分泌释放调节主要在基因表达水平,利钠肽,心脏利钠肽受体,心脏利钠肽体内清除,NPR-C介导的细胞吞饮和溶酶体降解中性内肽酶（neutralendopeptidase，NEP）降解:裂解环状结构肾脏清除,deLemos,etal.BNPinCardiovascularDisease.Lancet2003;362:316-322.,心脏利钠肽的生物半衰期,心脏利钠肽的主要生理作用,肾脏增加肾小球滤过，抑制钠重吸收排钠利尿血管血管平滑肌松弛，舒血管作用降低血压，减轻心脏前负荷抗血管组织增生和纤维化,心脏利钠肽的主要生理作用,内分泌系统抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统活性抑制某些其他激素（内皮素；血管加压素；等）活性神经系统抑制中枢和外周交感神经系统活性,心脏利钠肽的主要生理作用,对心脏的直接作用抗心肌细胞脂肪分解作用抑制心肌细胞成纤维细胞DNA合成和细胞增殖抑制心肌细胞肥大其他可能作用参与凝血系统和纤溶系统调节减少内皮功能损伤,心脏利钠肽的主要临床用途,临床心衰的诊断评价心脏功能心衰诊断和判定心衰程度的生化标志物快速、方便、客观,NYHA的心功能不全分级,GutheryandSchumann.JAmAcadNursePract1988;10:31-41.,BNP和NYHA分级的关系（BiositeTriage研究资料）,NYHA分级,ng/L,BNP和NYHA分级的关系（Biosite和Bayer研究资料）,NYHA分级,ng/L,NT-proBNP和NYHA分级的关系（RocheElecsys研究资料）,NYHA分级,ng/L,心脏利钠肽的主要临床用途,呼吸困难的鉴别诊断心源性还是肺源性？,呼吸困难患者的BNP,deLemos,etal.BNPinCardiovascularDisease.Lancet2003;362:316-322.,呼吸困难患者的BNP,deLemos,etal.BNPinCardiovascularDisease.Lancet2003;362:316-322.,心脏利钠肽的主要临床用途,心血管疾病预后估计和危险性分类心衰的预后评价预测再次患病率和死亡率急性心肌损伤后的预后评价预测再次患病率和死亡率估计心肌缺血损伤范围ACS危险性分级,ACS后NT-proBNP的预示作用,Galvani,etal.NatriureticPeptideinAcuteCoronarySyndromes.Circulation.2004;110:128-134.,不稳定心绞痛后NT-proBNP的预示作用,James,etal.NT-proBNPandPredictionofMortalityandMIinUnstableCAD.Circulation2003;108:275-281.,不稳定心绞痛后NT-proBNP的预示作用,James,etal.NT-proBNPandPredictionofMortalityandMIinUnstableCAD.Circulation2003;108:275-281.,BNP和左心射血分数的预示作用,Richards,etal.BNPandLVEFforPrognosisAfterMI.Circulation.2003;107:2786-2792.,BNP和左心射血分数的预示作用,Richards,etal.BNPandLVEFforPrognosisAfterMI.Circulation.2003;107:2786-2792.,心脏利钠肽的主要临床用途,治疗效果的监测浓度变化与疗效相关根据变化调整药物剂量；估计疗效其他心脏移植术高危人群筛查心脏手术预后,BNP在冠脉搭桥术后的应用,Hutfless,etal.BNPLevelsandBypassSurgery.JAmCollCardiol2004;43:18731879.,BNP和NT-proBNP的检测分析,*数据引自:Yeo,etal.MulticenterEvaluationoftheRocheNT-proBNPAssayandComparisontotheBiositeTriageBNPAssay.ClinChemActa2003;338:107-115.,EDTA血浆标本中的稳定性实验比较*,中性内肽酶（NEP）在BNP体外降解过程中作用不大NEP是Zn2+依赖性糖蛋白酶NEP作用于BNP的Met4-Val5；Phe11-Gly12蛋白水解酶抑制剂可抑制BNP降解，但并不抑制NEP活性,BNP和NT-proBNP的检测分析,分析前患者应取相同的体位，以便比较为避免昼夜节律影响，采样时间也应一致采集前应休息10min（活动可使利钠肽增高，ANP受运动的影响最大）与ANP或BNP相比，NT-proANP或NT-proBNP较少受体位、运动等血液动力学改变的影响,BNP和NT-proBNP的检测分析,分析前某些药物（糖皮质激素、甲状腺素、b-阻滞剂、利尿药、血管紧张素转换酶抑制剂、肾上腺素激动剂等）会影响利钠肽的量饮食习惯（钠的摄入）会影响利钠肽的量妊娠后期、临产前以及肾脏功能不全时，利钠肽的量可增高月经周期中利钠肽的量出现变化激素替代治疗（HRT）影响利钠肽的量,BNP和NT-proBNP的检测分析,第一代检测方法主要是竞争法（放射免疫分析法，RIA）样品需要量较多（1ml血浆）通常需要先萃取，增加了操作步骤萃取的回收率通常只有80%90%CV相对较大，降低了检测的精密度其他因素影响,BNP和NT-proBNP的检测分析,第二代检测方法非竞争分析法（如ELISA或IRMA）采用双抗体夹心的免疫分析，无需萃取抗体特异性高，其灵敏性、精密性和特异性比竞争法要好所需时间仍较长（一般536h），难以适用于自动化,BNP和NT-proBNP的检测分析,第三代检测方法酶免疫分析法和化学发光分析法直接采用血浆或血清能在自动化分析仪上使用检测BNP/NTproBNP仅需数分钟更适用于临床检验部门的常规检测分析，得以在临床广泛应用,BayerADVIACentaur的BNP检测,1,10,21,30,39,50,60,76,70,抗原决定簇1:捕捉抗体,抗原决定簇2:检测抗体,NT-proBNP,ElecsysNT-proBNP检测位点,BNP和NT-proBNP的检测分析,商业竞争使各种检测方法不断问世分析方法的不同，使检测特异性有所不同，有可能出现如同cTnI一样的不同实验室之间的测定结果不一致性问题AbbottAxSYM和BayerADVIACentaur检测BNP都参照BiositeTriage的检测值，相关较好,BNP和NT-proBNP的检测分析,NT-proBNP半衰期相对较长，浓度相对较稳定，含量相对较高（比BNP约高1620倍），检测相对较容易，是较理想的预测标志物BNP半衰期相对较短，在了解病人即刻情况时较有价值BNP或NT-proBNP的临床应用价值相同,BNP和NT-proBNP的检测分析,检测心衰时的临界值（建议）,Cowie,etal.ClinicalApplicationsofBNPTesting.EuroHeartJ2003;24:17101718.,BNP和NT-proBNP的检测分析,检测方法中需进一步解决的问题增加分析敏感性和精密度参考范围上限的检测不精密度（CV）10%增加分析特异性（准确性）和检测标准化不同检测方法之间的可比性增加临床检测可操作性利于常规检测，TAT短，费用合理,心肌组织损伤的标志物心脏功能的标志物心血管炎症疾病的标志物其他心脏标志物,心血管炎症疾病的标志物,C反应蛋白（CRP）ACS炎症、损伤的早期标志物。在心肌损伤发病后几小时即出现异常增高且“窗口期”较短，在心绞痛等心肌损伤的早期诊断和预后估计中有较好的临床价值超敏C反应蛋白（hs-CRP）,hs-CRP的临床应用,大量研究资料表明，动脉粥样化的血栓形成除了是脂肪堆积过程外，也是一个慢性炎症过程，而CRP是动脉粥样化血栓形成疾病的介导和标志物CRP对心绞痛、急性冠脉综合征和行经皮血管成形术患者，具有预测心肌缺血复发危险和死亡危险的作用,hs-CRP的临床应用,CRP在动脉粥样硬化中的可能作用激活补体系统增加分子间黏附作用增强吞噬细胞对LDL的吞噬作用刺激NO的生成增强纤溶酶原激活抑制物的表达和活性等,hs-CRP的临床应用,根据欧美的许多研究，个体的CRP基础水平和未来心血管病的关系密切CRP水平与用于心血管疾病危险性评估的一些传统指标（如年龄、吸烟、血胆固醇水平、血压、糖尿病等）没有直接关系,hs-CRP的临床应用,前瞻性研究资料显示，CRP是比LDL-ch更有效的心血管疾病预测指标CRP在代谢综合征的几乎所有过程中都起着重要的作用，这是CRP与LDL-ch明显不同的另一个显著特点血脂评价加CRP评价可增加预测价值,RidkerPM.C-reactiveprotein:Asimpletesttohelppredictriskofheartattackandstroke.Circulation.2003;108:e81-e85.,hs-CRP的临床应用,对门诊病人，进行血脂检查的同时应进行CRP检测在初级预防中CRP是未来心血管疾病发病的独立预测项目，可以增加血脂检查、代谢综合征和Framingh