（农药学专业论文）甲基二磺隆敏感与耐性小麦细胞色素P450对比研究.pdf

中国农业大学硕十学位论文 摘要 攘要 甲基二嫩隆是新一代离效、安全的磺酰脲类苗历除草剂，是目前防治小麦田未本科杂草较理 想的除草剃，按照推荐方法使耀。对小麦安全。然丽，目簿甲基二磺隆的选择性机理尚不港楚。 本文系凌磷究了蔼个晶静小麦毒t 缀巍色素p 4 5 0 麴差异，磷穰缨憝色素p 4 5 0 在平基二磺逡选择性中 的作用，以期为甲基二磺隆的安全应用、推广提供一定的理论指导，车寓除草剂选择性机理研究 理论。 湿室生测结果表瞬，以株高作为生测撵标，抗6 号与锻1 8 小麦对甲蒸二磺隆敏感性麓冥显著， 抗6 号对学鏊二磺隆静嚣| 药穗筵敏1 8 号静5 + 2 7 倍。 试验发现，两个品种小袭细胞色素p 4 5 0 含茸随小袭的生长而变化。两者都在小麦催芽播种 9 6 h 后达到最大值，抗6 号p 4 5 0 含量是敏1 8 号的1 4 9 倍，与两个小麦晶种对甲基二磺隆的敏感 性一致。兰罩孛安全裁在一寇浓度。f ，均霹襞两个晶种小麦瓣细胞色素p 4 5 0 含量增热，其中，啦 瞧解苹酯的效果最好，群孳瞪次之，萘甲酸酐( n a ) 效果不明显。 扫描小澎不同亚细胞结构与氧化碟的差光谱，结粜褒明，微粒体中细胞色素p 4 5 0 含量最 高，p 4 2 0 含爆很少。微粒体上清液中基本上z i 存在p 4 5 0 ，p 4 2 0 含量很黼，线粒体上清液中两者 都存在，健p 4 2 0 含量明显麓子p 4 5 0 ；p 4 5 0 长麓暴露予空气、裹温中，檄翳转变成无涵憷的p 4 2 0 ， 敏1 8 号小麦p 4 5 0 韵半衰稍可能，| 、于抗6 号的，敏1 8 ，j 、麦p 4 5 0 更誊翁受外秀因素的影响雨转变 为p 4 2 0 两个品种小麦细胞色素p 4 5 0 与p b o 、a b t 及甲旗二磺隆均形成i 型结合光谱，但抗6 号小麦p 4 5 0 的底物结合光谱比敏1 8 号的明显，两个小赘细胞色素p 4 5 0 与p b o 的结合光谱均比 与掣基二二磺酝瓣结合光谱懿垡、显著。 两个晶种小麦细胞色索p 4 5 0 均能离体代谢甲基二磺隆，抗6 号细胞色素p 4 5 0 代谢甲基二磺 隆的半衰期为7 5 6 1 4 2 2 h ，敏1 8 号为1 1 3 2 1 8 9 1 h 。这一结果为细胞色蒲p 4 5 0 参与了甲基二磺 隆在小麦体内的代谢以及不同品种小麦对该药剖代谢速度的差异使得甲基二磺隆具钶了选择性 提供了壹接懿证据。 关键词：甲基二磺隆，安全剂，细胞甑素p 4 5 0 ，结合光谱，离体代谢 中国农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t a b s t r a c t m e s o s u l f u r o nj san e ws u l f o n y l u r e ah e r b i c i d e ，w h i c hi ss a f et ow h e a ta n dh i g he f f i c i e n c yt oc o n t r o l t h eg r a s s e si nw h e a tf i e l d u pt on o w , t h es e l e c t i v i t ym e c h a n i s mo fm e s o s u l f u r o ni ss t l l ln o tf u l l y u n d e r s t o o d 1 nt h i sp a p e r , w em e n s u r e dt h es e n s i t i v i t yo ft w ow h e a tc u l t i v a r st om e s o s a l f u r o na n d e v a l u a t e dt h ef u n c t i o no f c y t o c h r o m ep 4 5 0c o n t r i b u t i n gt ot h es e l e c t i v i t ym e c h a n i s mo f m e s o s u l f u r o n ， t h e r ew a sam a r k e dd i f i e ：r e n c ei ns e n s i t i v i t yt om e s o s u l f u r o nb e t w e e nr - 6 # a n ds w l 8 # w h e a t c u l t i v a r s ，a n dt h et o l e r a n c et om e s o s u l f u r o no f r 一6 # w a s5 2 7 一f o i dh i 曲e rt h a nt h a to f s - 1 8 # w h e a t t i s s u ea g ea f f e c t e dc y t o c h r o m ep 4 5 0c o n t e n t s ，a st h ea g ea n dl e n g t ho fw h e a ts e e d l i n gt i s s u e s i n c r e a s e d ，c y t o c h r o m ep 4 5 0c o n t e n t sw e r ed e c r e a s e d c y t o c h r o m ep 4 5 0c o n t e n t so ft h et w ow h e a t c u l t i v a r sw e r eh i g h e s ti nt h es e e d l i n g sg r o w ni nt h ed a r kf o r9 6 h ，a n dt h ee y t o c h r o m ep 4 5 0c o n t e n to f r 一6 拌w a s1 4 9 - f o l d h 碘e rt h a nt h a to fs - 18 拌c y t o c h r o m ep 4 5 0c o n t e n t sw e r ei n c m a s e da f t e rt h et w o w h e a tc u t t i v a r st r e a t e db ym e f e n p y r - d i e t h y l ，f e n c h l o r a z o l e - e t h y la n d l ，8 - n a p ll t h a l i ca n h y d r i d e ( n a ) m e f e n p y r - d i e t h y lw a sn x o r ee f f e c t i v et h a nf e n c h l o r a z o i e - - e t h y la n dn a a si n d u c e r s 。f y 韬e m ep a 5 0 c o n t e n t ，a n dn a d i dn o ta f f e c te y t o c h r o m ep 4 5 0c o n t e n tt oa n ys i g n i f i c a n te x t e n t c y t o c h r o m ep 4 5 0c o n t e n t so f 也et w ow h e a tc u l t i v a r sw e r eh i 曲e s ti nw h e a tm i c r o s o m e ，i n t e r m e d i a t e i nm i t o c h o n d r i as u p e m a t a n ta n d1 0 w e s ti nm i e r o s o m a ls u p e r n a t a n t c y t o c h r o m ep 4 5 0w a se a s i l y t r a n s f o r m e dt oc y t o c h r o m ep 4 2 0w h e nt h ew h e a tm i c r o s o m a lp r e p a r a t i o n s d e p o s i t e da tr o o m t e m p e r a t u r eal o n gl i m e ，a n dt h eh a l fl i f eo fc y t o c h r o m ep 4 5 0f r o mr - 6 # m i 荫tb el o n g e r 氆a nt h a to f c y t o c h r o m ep 4 5 0f r o ms 一18 # ，t h eb i n d i n gs p e c t r ao fc y t o c h r o m ep 4 5 0w i t hm e s o s u l f u r o n 。p i p e r o n y l b u t o x i d e ，a n d1 - a m i n o b e n z o t r i a z o l ew e r ea l lt y p eis p e c t r a , h o w e v e r , t h eb i n d i n gs p e c t r ao fr - 6 # w a s s t r o n g e rt h a nt h o s eo fs - 1 8 # a n dt h eb i n d i n gs p e c t r aw i t hp b oo fr 一6 # a n ds - 1 8 # w e r ea l ls t r o n g e r t h a nt h a tw i t hm e s o s u l f u r o n c y t o c h r o m ep 4 5 0 sf r o mt h et w ow h e a tc u l t i v a r sa l lc o u l dm e t a b o l i z em e s o s u l f u r o l li nv i t r o m a dt h e h a l fl i v e so fm e s o s u l f u r o nm e t a b o l i s mb yc y t o c h r o m ep 4 5 0 sf r o mr 6 # a n ds 1 8 # w e r e7 5 6 1 4 2 2 h 1 1 3 2 1 8 9 1 h ，r e s p e c t i v e l y am o r er a p i dr a t eo fm e t a b o l i s mb yc y t o c h r o m ep 4 5 0f r o mr - 6 # ，i n c o m p a r i s o nw i t h 协采o fs 1 8 # m o s tl i k e l ya c e o u n tf o rd i f i e r e n ts e n s i t i v i t i e st om e s o s u l f u r o l lb e t w e e n 袋- 6 # a n ds 一 8 # w h e a tc u l t i v a r sa n dt h es e l e c t i v i t ym e c h a n i s mo f m e s o s u l f u i 0 1 1 k e yw o r d s ：m e s o s u l f u r o n ，s a f e n e r , c y t o c h r o m ep 4 5 0 ，b i n d i n gs p e c t r u m ，m e t a b o l i s mi nv i t r o i l 独创性声明 本人声明所呈交蛉论文魑我个人在导师指导下进行的研究工作及取镄的研究成果。尽我所 知，豫了文中镑瑚蕊班稼注瓣敬澍豹遗方努，论文孛不包禽菸袍大已经发表或撰写蓬静臻究褒象， 也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同t 作的同 志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名 南学军 时间： o _ c 年占月，拍 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的 复e p f $ 和磁赧，允许论文被套阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等艇制手段保存、汇编学位 论文。霜意中瓣农盘天学可疆胡不矮方式巍不霆嫘髂上嫠袭、簧疆学位论文瓣全部袋部分内容。 ( 保密的学位论文襁解密后应遵守此协议) 研究生签名：西 瘩、晕 导灏繇舅瓤蝎 铝寸间： 口j 年彳爿西 越鞫： 。；每考鹞| 器强 中困农业大学硪- l 学位论文 第一章文献综述 第一肇文献综述 2 0 世纪7 0 年代末，照麓牲邦公露对磺酰繇类除草弃4 绿磺隆的成功开发，除草裁的发展进入 了超离簸黠代。霸萄，已瑟赫强静疆醮骣袭藩摹角有3 0 多静，这娄豫摹弼育狠高静滁棼活毪， 抖j 量一般为1 一1 5 0 9a i ， 1 a ，比传统除草剂的除草效率提商了1 0 0 1 0 0 0 倍。近年来，随着磺酰 脲类除草剂的r 泛应用，残留药害和杂草的抗药性己引起人们的重视”。 细照色豢p 4 5 0 ( c y t o c h r o m ep 4 5 0 ，c y t p 4 5 0 ) 是广泛存在丁动物、棱物车珏微生物体内蟪一类 具有湿台秘能的盘红素氧纯薅系。它不仅女够继纯苯嚣婉娄、蕤类纯合物帮薪酸等内滁往麴质 的生物合成，而且还参与许多外源性物质包括除草剂等的催化代谢”| 。大量研究证实”：磺酰 脲类除草剂谯植物体内被迅速降解代谢是杂草对其产生抗性吼及作物产生耐性的主要原因，其 孛，檀穆缨藏煎素p 4 5 0 黪累对该类除荤剥静解毒作用楚鼯致踩孳粼选撵性、俸镌耐性与杂草撬 瞧鲍重要机涮。 1 + 1 甲基二磺隆概述 1 1 1 麦幽纯学除草或状 据统计，由于杂草危害，小麦一般减产1 0 - - q 5 ，重嚣达2 0 以上“”。因此麦田除草倍受 重褪，除摹瑟稷运年扩大。逐年来，由于发困佳学骧革秘小麦租牧麴骛滚采强，麦匿验路费j 多对 阔叶杂革防效好，对禾本科杂草防效差“，阔叶杂草防除稻更有利于秉本科杂草的发生，小麦枫 收时禾本科杂革种子留在田内为杂草发生提供了大量种源，并逐年积累导致某些地暖囊田禾本 科杂草严重发苎e ，成为麦鼬杂革鲍优势种群。 磺酸瓣瓷溶莩裁娆筠 筵纪8 0 年霞开鲶在枣麦鑫篷蠲。由于该类药裁其有活性翥，翔最低， 杀草谱广、毒性低等特点，而且小麦对其其有高度耐药性，在罄个生育期均可使用，所以，磺酰 脲类除草剂在小麦田中的应用不断推r 扩大，现已成为小发田主要除草荆品种。然而，研究表明， 麦匿磺酰脲类除草劐在土壤中的持效期以及对小麦和后茬作物的安全性不同”“，不同小麦品神 对鞫一狳荤裁静耐药瞧也鸯差异8 。”1 ，著搜耀不当，会逢成严重静药害，使竣产甚至绝毅。因兹， 研究不同小蠹品种对磺酰脲豢除草剂的耐药性规律、提离翡荆对敏感小畿的安全性以及如何有效 防除禾本科杂革是当前麦田化学除草成功与否的| 关键。 。2 单蘩二磺瀣篱俞 甲基二磺隆( m e s o s u l f u r o n ) 是拜耳作物科学公司2 0 0 2 年新推出的种用于苗后防除小麦田 最本辩杂苹的褰效、广谱、滤择性内吸传鼯型除草荆。该药裁为磺酰腥豢除草剡，主要遴过茎睁 吸教，经翻技郝、本臻部传浮，捧京l 敏感稹物俸内的乙魏乳酸合残酶( a l s ) 活性，飙褥阻止缀 氨酸、亮氨酸、异亮氨酸竞链氮基酸的生物合成，抑制细胞分裂，最终导致敏感植物死亡。 中国农业大学硕十学位论文 第一常文献综述 囝 零基二磺隆豹缝橡式 f i g 1 - 1s t r a c t u r e o f m e s o s u l f u r o n 甲基二磺隆目前在中阑取得登记使用的刺型为3 甲接二磺隆油悬浮荆( 世玛) ，该酾剂可防 渣小麦田闻磺攀、早熬秉、碱茅、薅头荤、羲麦燕、多麓爨麦摹、舅蒸发、蛙浊草、牛繁缕、捶 娘蔫、荠蔡替绝太多数采本科杂草和部分阔时杂草，对键麦( 野麦子) 、节节麦、茼革、毒麦、 偃麦草等极恶性禾本科杂革也有良好的控制效果”+ ”1 。 一般情况下，施药2 天最靶标杂草停止生长，4 7 最后叶片开始黄化，继而出现桔斑，“ 臻磊杂莘琵亡。按接荐裁爨、方法、对耀藏翅，3 籁荦鏊二疆隆溜惫浮雾j 对，l 、麦安全。攘荐镬嗣 剂量为9 1 3 5 9a i h a ，最健施药期为杂牮3 4 升期，小麦拔节后不宜使用”。 1 2 植物细胞色素p 4 5 0 研究概述 1 2 1 细胞色素p 4 5 0 的发现 维腮色素p 4 5 0 酶系的研究始于1 9 5 5 年，已有5 0 年的历史。a x e l r o d ( 1 9 5 5 ) 和b r o d i e ( 1 9 5 5 ) 摄莲了翳黢豹内蒺赠存在一些辘参与氧纯代澈懿酶系；鞫年，h a y a i s h 簿汲为舞薤徽靛体毫l 备液 存在双氧反应；m a s o n 等( 1 9 5 5 ) 也证实了肝脏微粒体制备液中存在单加氧酶的话性，并且可以 以n a d p h 作为还原剂。1 9 5 8 年，g a r f i n k e l 和k l i n g e n b e r g 分别独立发现肝脏微粒体中有一种色 素被还原艨与一氧化碳结合在4 5 0 r i m 处存在最大吸收峰，被公认为p 4 5 0 的发强者；嚣采，o m u r a 霉| s a t o ( 1 9 6 4 ) 证实了翳脏徽粒体中的鬯寨属于b 型纲藏色素，并命名为p 4 5 0 ( p 为p i g m e n t 豹 缩写) 1 。 1 31 9 5 8 年首次报道大鼠肝微粒体上存在细胞色素p 4 5 0 之后，1 9 6 9 年f r e a r 等“首次报道了 檀旋( 槔花) 中也存在细溅琶素p 4 5 0 。犬最关于疆物细搬色素p 4 5 0 的硬究摄道相继撼瑷，在小 麦“、蓖麻2 等许多撞物巾均发现p 4 5 0 。然丽由于高等梭物细胞壁不器破碎，酚粪魏矮、色素 物质( 叶绿寨、类胡萝h 豢) 等干扰物质含量高，蛋白水解酶、脂肪酶、过氧化物酶铎水解酶活 性高，以及p 4 5 0 含量低和不稳定等特点致使植物细胞龟索p 4 5 0 研究谶展极为缓慢，远远落后 动物及微生物”。 2 中国农业人学硕士学位论文 第一章文献综述 爱暑寰舅舅曼曼曼曼曼鼎檄兰! 曼曼曼曼葛! 曼皇鼎! i 一一i p l ! ! , o q i ! ! 1 2 2 植物绷胞色素p 4 5 0 基因 1 2 2 1 植物细胞色素p 4 5 0 基因的命名驶奠数目 细胞色素p 4 5 0 基因是个古老的超基冈家族。通过比较从低等生物的细菌到高等生物人体 出细胞色素p 4 5 0 的基因序捌，n e l s o n 等( 1 9 9 3 ) 推测缨臌色素p 4 5 0 基因已有3 5 亿年蛑历史， 疆蘸疆镪中毪躲蕊p 4 5 0 基溺达6 0 0 多耱。磷究表筏，氍有塑凌缨魏琶索p 4 5 0 起源子一个莛弱豹 祖先( n e l s o n 和s t r o v e l ，1 9 8 7 ；n e b e r 和g o n z z a l e a a ，1 9 8 7 ) ，它们之问存在一定的序歹保守性， 即不同物种问p 4 5 0 具有同源性。根据酶的氯基酸序列相似性，分类并命名为家族( c y p l ，2 ) ， 弧家族( a ，b ) ，荸个基因( a 1 ，2 ) ，它 f 培氨基酸序列嗣源性分别为： 4 0 ， 5 5 秘 9 7 。 植物细麓色素p 4 5 0 有5 4 个家族：c y p 7 1 - - 9 9 、c y p 7 0 1 - 7 2 6 和c y p 5 1 ，其中不毯攒c y p g l 、 c y p 9 5 、c y p 7 1 3 、c y p 7 1 7 。 植物p 4 5 0 基因多样性巴被证实，但是商关其基因族的报道尚少。在硪米中发现的p 4 5 0 基因 族毫4 个羼予c y p 7 1 家族熬熬匿，它簦】松数逑联接在d n a 片段上。p 4 5 0 基霹瘫鲶多悫特征在 植物中亦存在。在玉米中溅分离出，l 辞蒋诬基因：c f p 7 1 c 2 v l 、c y p 7 i c 2 v 2 和c y p 7 1 c 3 v l 、 c y p 7 1 c 3 v 2 ，有关其同工酶的代谢活性等问题有待于进一拶研究。 目前研究认为，编码p 4 5 0 同工酶的基因超过5 0 0 种，其中很大一部分在一般条件下不表达 或攫少表达，不嗣的， 雾因豢蝰可调控棱黪特定p 4 5 0 匏袭述。穰勃p 4 5 0 基因嚣表达袭蠛窭生殴 发育控制，一般认为其表达与其功能的需要褶一致。此外，一些p 4 5 0 基因的表达同样受器官发 育的调节。嗣前由于分离到的植物p 4 5 0 同工酶基因甚少。所以在植物p 4 5 0 亚家族内不同基因的 表达是否诱导特定的p 4 5 0 活性还不清楚。 。2 。2 2l 蒌熬惫素p 4 5 0 基嚣表达的诱导冀调楚 细胞色素p 4 5 0 的诱导机制是多样的，许多诱导作崩与相关的p 4 5 0 罄园本身的调控元件有关 ( t u k e ya n dj o h n s o n ，1 9 9 0 o m u r ae ta 1 ，1 9 9 3 ；h i n e se ta 1 ，1 9 9 4 ) ”“。p 4 5 0 的催化活性取 决于p 4 5 0 的含量水平，p 4 5 0 含量受蛋白合成的各个阶段以及血红素与摄自质结合形成全酶整个 进程豹影睫( g i b s o na n ds k e t t 。1 9 9 4 ) 。 r n a 聚合酶 多核苷酸磷酸化酶 p 4 5 0 基凶奠理二 m r n a g t e t r n a r r 呻n a 脱辅基p 4 5 0 鬻白砂直h 转录魏译 ( 缬胞接) ( 建矮瓣f 血红素库( f 醛瓣帮分瓣我游= 一 图1 - 2 纲胞色素p 4 5 0 基嗣表达调控的几个步骤( l e w is ，1 9 9 6 ) f i g 1w 2 r e g u l a t i o np r o g r e s so f c y t o c h r o m e p 4 5 0g e n ee x p r e s s i o n 缓藏龟豢p 4 5 0 豹磷酸纯露臻控裁罄p 4 5 0 鳇黧译鑫黪堂纂，骥酸键佟溜使p 4 5 0 失去爨红素嚣 被降解( o e s c h b a r t l o m o w i c za n d o e s e h ，1 9 9 0 ) ( a z l ，随后p 4 5 0 变成失活型p 4 2 0 “1 ( c o r r e i a ，1 9 9 i ) 。 中国农业大学确上学位论文 第一章文献综述 篁葛邕鲁寡墨曼皇邕燃舞寰曼皇孽曼皇蔓苎蔓燃鼍曼鲁曼皇曼! ! 寰燃鼎摹篁皇! ! ! 詈寰嘲蜷邕鼍曼曼! 曼皇寰! ! 蜮i , in l 嘲燃曾! 曼鼍 一些诱导棚如己酵、丙酮能保持某些p 4 5 0 ( 如c y p 2 e i ) 较高的水平，它 f j 的作用是避过与邻近 丝氨酸夔氨鏊黢霞点或丝爨簸结台，彝铡鬣爨激酶薅p 4 5 0 的磷酸诧 筝掰，这耱嚣尊蘸制定名为 蛋白质稳定作用。m r n a 的稳定也将导致p 4 5 0 的诱导( p o r t e r a n d c o o n ，1 9 9 1 ；w a x m a n a n d a z a r o t t ， 1 9 9 2 ) “1 。 编码不网酶的多个结枣基因，可以以纂因串( b a t t e r y ) 或座( l o c u s ) 的形式连接农一起， 这些瑗渭熬枣违( t a n d e m ) 藏强茬生物薅蕊不弱缀缎弱簿4 爵糍镀瑟不鞠，这胃髓莛这麓基嚣茬 不同组织中表达存在差异的原因( k e m p e r ，1 9 9 3 ；h i n e se ta 1 ，1 9 9 4 ) ”“”，p 4 5 0 介导的化合物 的代谢表现出的组织、种类熬异性是p 4 5 0 同工酶具有不周的表达或调控机制的结果( p a d m a n a b a n a n d n i r o d i ，1 9 9 4 ：h i n e se t a l 。，t 9 9 4 ) ”2 ”，不同的p 4 5 0 的表达可能协嗣调控，但可能煲有缀织 特异注。 ( 1 ) p 4 5 0 蕊囡诱导机制的多样性 p 4 5 0 基阂表达的过程如图1 2 所示。真核生物产生特舜的m r n a 还需进步加工以去除( 剪 接) 菲编码遂( 外显子) 以产生具有鼹译溅瞧靛m r n a ，m r n a 经熟译形残脱辕基p 4 5 0 虽蜜。 p 4 5 0 诱导霹麓在p 4 5 0 墓鞫袭达静各蹬段都发生，诱导表糯出不同静祝制。通常情况下，一类诱 导剂表现特定的诱导作用，即便是同一个p 4 5 0 和诱导剂，也有可能不止一种机制起作用。 ( 2 ) p 4 5 0 基因的调控元件 在p 4 5 0 基霹中枣在一魑不同的调控蠢待。这些元傍霹鞋控裁蛋邑璇貔表达，或邋避转录活 纯或转录阻遥，取决于元稃的功能帮结台阑予豹性质( o m u r a e t a l ，1 9 9 3 ) ”“。，l 个嫡应元件可 能存在于同一基因，这可以解释某一p 4 5 0 可以被不同的诱导剂诱导，p 4 5 0 基因的调控匿既有相 同又有不同，这在理论上解释了不同种、组织中p 4 5 0 调控的变异。 ( 3 ) 诱导翔弱臻梅与诱导辍裁豹关系 从i 4 5 0 诱导剂结构上的差异可以判断p 4 5 0 的诱导机制可能有所不问。如c y p 2 e 诱导剂的 特征是相对较小、结构多样的分子( l e w i se ta 1 ，1 9 9 4 a ) ，其中有一必通过与丝氮酸结合，具 有稳定蛋白质以免被降解的作用。这种诱导荆至少需要一个负电性原子雌便与丝氨酸形成氢键， 获瑟疆j t 堑懿酸瓣磷酸纯这翻泽j 翥修铸作角，z ；醇、瓣瓣等就是这狰瀑嚣裁。 ( 4 ) 诱导引起p 4 5 0 的半畿期变化 p 4 5 0 的诱导通常可以增加p 4 5 0 的半凝期( c o r r e i a ，1 9 9 1 ) ”“。这可能是诱导故变了p 4 5 0 的转换率造成的( j a n s s o n ，1 9 9 3 ) 。p 4 5 0 转换受c a m p 调控的磷酸化作用控制，p 4 5 0 变性蜃失去 矗红素交袋p 4 2 0 ，荐接酶髂( j a n s s o ng fa l ，1 9 9 0 ) 。诱嚣裁与p 4 5 0 缩台看可髓是瀵过蛋鑫激 酶介导的磷酸化作用途径黼断p 4 5 0 的降解( j a n s s o n ，1 9 9 3 ) ”“。 1 ，2 。3 细胞色素p 4 5 0 的转类及结梅 细胞色索p 4 5 0 以可溶性和膜结合两种形态存在丁生物体内( o m u r ae ta 1 ，1 9 9 3 ) 。由丁二 可溶性p 4 5 0 比较容易被分离纯化，1 9 8 5 年，p o u l o s 等月jx 射线衍射技术获得了第一个p 4 5 0 晶 体( p 4 5 0 c a m ，c y p l 0 1 ，泉螽假单孢菌p s e u d o m o n a s p u t i d a 的樟脑羟他酶) 的结构，为揭示p 4 5 0 结掏与臻辘麴关系及p 4 5 0 的作用辊翻葵悫了基箍( e s t a b r o o k ，1 9 9 6 ) ”。 膜结合p 4 5 0 又可分为微粒体和线粒体p 4 5 0 两种类型。线粒体p 4 5 0 熙有严格的戚物专一性， 4 中国农业大学硕士学位论文 第一章文献综述 能代谢内源性笾醇类物质，对， 来物质无代谢作用( o m u r ae la l ，1 9 9 3 ) 。”；微粒体p 4 5 0 ( 尤 其是翳微粒体p 4 5 0 ) 一般纂有 # 常宽瑟羹爨的疯翡专瞧( p o r t e r 黍 c o o n ，1 9 9 1 。 ab 图1 - 3 细胞色素p 4 5 0 晶体结构带状图 a ：缁耱趣素p 4 5 0b 船( 瓣i l e s 6 , ta l 。，2 0 0 0 ) ；b ：细骆色素p 4 5 02 c 5 ( w i l | ；诵s8 f ，2 0 0 0 ) f i g 1 - 3 a r 海b o n d i a g r a mr e p r e s e n t i n g t h e c r y s t a ls t l a l c t u r e o f c y t o c h m m e p 4 5 0 a ：c y p b m 3 b ：c y p2 c 5 细琏毪素p 4 5 0 鲦 乏擎本质是蛋色袋，毽它不是一耱援皂囊瑟蹩势予蘸在4 6 6 0 k d a 瓣缝章鼋 类戗、性鹱类似而又有差辩的一族蛋白斌( 堵振华，1 9 9 0 a ) “”。大量研究表明，来源予不同种， 或同种不同晶系，或同一晶系不同组织的p 4 5 0 ，其分子鬣、光谱特征、分布特点、免痰性质、氨 基酸序列、调控机制及底物专一性是不尽相同的，细胞骰索p 4 5 0 的这种多样性归根绪底是由其 基毽结擒的多样注决定的。 通过对p 4 5 0 三级结构的比较研究发飘，p 4 5 0 的“赢物一血红素囊( s u b s t r a t e h e m ep o c k e t ) ” 任结构上的可塑性使p 4 5 0 可能与多种底物结合，这种可翅性是由“底物一血红素囊”关键位置 上的氮基酸残基控制的。不同的p 4 5 0 尽锊存在结构上极其保守的核，缀基酸序列的繁界可使任 意嚣争p 4 5 0 豹结鞫部有掰苓蠲，p 4 5 0 结梅上豹差异是p 4 5 0 多样活缝麓残在嚣西( g r a h a m * l o r e n c e 和p e t e r s o n ，1 9 9 6 ) 。 目前，6 种可溶性细菌的p 4 5 0 的晶体结构已经得到，图1 - 3 ( a ) 为来自于b a c i l l u s m e g a t e r i u m 的脂肪酸羟化酶p 4 5 0b m 3 ( c y p l 0 2 ) 的晶体结构带状圈。由于真核生物的p 4 5 0 多为膜缀合p 4 5 0 ， 掰漤壹黉基逛才获褥了龚黧戆p 4 5 0 靛螽髂缝毒驽，窭1 - 3 国) 为兔子p 4 5 02 c 5 憨蒸傣维搀带获鹜 ( w i l l i a m se t a l 2 0 0 0 ) 。 p 4 5 0 通常的结构为球状，在c - 辫富集螺旋状物，在n 端富集p 折鼹物。所有p 4 5 0 超家族 的羰基末端酃分都具有一个僚守鲍核结桷，这一保守结构含蠢一定数璧的静螺旋、b 辑囊以及一 个“卷曲( m e a n d e r ) ”。经予蠡红素静避袭疆包含完全绦守的半魏氨酸( c y s ) ，它是擞皱素铁静 第5 个配体，也是c o 结合蛋白在4 5 0 n m 有特征s o r e t 吸收的原因。 1 2 4 棱物细胞色素p 4 5 0 的功笾 植物p 4 5 0 在植物体捎当着重要的功能，可以催化许雾次级代谢反成。己知的催化反应已超 中国农业太学硕上学位论文 第一章文献综述 过5 0 种，反应底物包括脂类、苯丙烷类、黄酮类、萜类、生物碱、生氰糖苷等内源性化合物以 及包括除草剂在内的外源物质。涉及的反应类型有羟基化、环氧化、杂原子脱烷基、双键氧化、 杂原子氧化等( b o l w e l le la l ，1 9 9 4 ) 1 4 4 o 植物p 4 5 0 从功能意义上可以分为两大类型：生物合成 酶和解毒酶。生物合成酶在木质素中间物、植物激素、甾醇、萜类、黄酮类、异黄酮类和呋喃香 豆素的合成中起重要作用。解毒酶可以催化外源化合物如除草剂变成非毒性产物。还有某些p 4 5 0 能活化某些无毒性的物质如前除草剂成为具有毒性的除草剂( s c h u l e r ，1 9 9 6 ) “”。 1 2 4 1 细胞色素p 4 5 0 酶系的循环催化机制 细胞色素p 4 5 0 与底物的总反应可以用_ 卜- 式表示： r h + 0 2 骂r o h 十h 2 0 p 4 5 0 其中，r h 代表底物，r o h 代表代谢产物，反应中需要2 个电子和2 个质子。在线粒体利许 多细菌中，电子是从n a d h 或n a d p h 通过依赖f a d 的还原酶来传递到铁一硫铁氧还蛋白：然 而在微粒体内质网系统中，n a d p h 传递电子是通过含黄素蛋白的f a d 和f m n ，即细胞色素p 4 5 0 还原酶，无需f e 2 s 2 氧还蛋白的中介作用，而细胞色素b 5 也可能是第二个电子的来源( b a c k e s ， 1 9 9 3 ) 。 图1 - 4 为细胞色素p 4 5 0 催化底物的循环作用机制及一些中间步骤。其中，f e 代表活性部位 中血红素的铁原子，r h 代表底物，r h ( 1 - i ) 2 代表还原产物，r o h 为单氧化产物，x o o h 代表过 氧化物作为交替的氧供体。 图卜4 细胞色素p 4 5 0 作用机制( p o r t e re ta ，1 9 9 1 ) f i g1 4 c a t a l y z a t i o n m e c h a n i s mo f c y t o c h r o m e p 4 5 0 ( p o r t e re t a l ，1 9 9 1 ) 6 e _ 2 h + 中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述 细胞色絮p 4 5 0 表现为单加氧酶的机璎可能包括以f 步骤： ( 1 ) 藏貔与p 4 5 0 酶结合，p 4 5 0 交藏赢鑫囊五配位酝会耱； ( 2 ) 第一个电子转移，底物结合衙p 4 5 0 的还原电位褒得较止，容易得到电子，f e ( h i ) 被 还原成f e ( 1 i ) ，这个电子一般是由n a d p h p 4 5 0 还原酶供给： ( 3 ) 与0 2 盼结台，p 4 5 0 一底物配台物与0 2 结台，0 2 与f e ( 1 i ) 酝位，但迅速发生电荷转 穆变袁承瓣 ”o ；琵合秘( 整滠下半爱席翅，疑有凡移) ； ( 4 ) 第二个电子转移。( r h ) f e 3 + o ；得到一个电子( 细胞色素b 5 成p 4 5 0 还原酶提供) 变成 ( r h ) f e “o - ； ( 5 ) 敢氯键裂解，与f 。”结合的毅氧离子鳃o o 键裂勰，生成铁戴他台物，在冀中可能有 共振结秘，楚活毪中闻秘： ( 6 ) 底物加氧，铁氧珂己合物把一个氧原子传递给结在p 4 5 0 分子上的底物，p 4 5 0 恢复原 来的休息状态。可重新投入循环之中。 鳃膣恕綮p 4 5 0 表现为鬣化酶的步骤怒在生成( r h ) f 矿+ ( 0 2 ) 最，歧佬形成t 鸹，与戴弱黠，讫 台耪( r h ) f e 。o 主奂产生h 2 0 2 ，形减o h ，这些活性簸可避一步氧化赢物。 12 4 2 细胸色素p 4 5 0 的擞物功能及催化的反应类型 细胞色綮p 4 5 0 是p 4 5 0 酶系的末端氧化酶，决定底物和产物的特异性，是酶系的关键组分， 盎生穆俸孛篡夺重要的生理凌娩： ( 1 ) 表现单加氧酶活烛，使烷基碳羟化、芳香环垮氧化和烷氧基的去烷萎等； ( 2 ) 表现氧化酶活性，使芳香环羟蒸化、苯二酚氧化成醌等； ( 3 ) 表现还原酶活性，使偶氮化物还原性裂解位弱分子胺、使硝撼还原为氨基。使醌还原 袋半醒、侵藩代烃装蠡素等。 这些葳波在某些生物合成或生物降解中起重要律羽，也是多种外源性有机物代谢的步骤之 一，外源性有机化合物种类甚多，它们在生物体内的代谢途径不尽相同，不过p 4 5 0 系统是最常 见的加工过獠。一般来说，外源性物质如果有强亲水性，它们一般不经p 4 5 0 加工就可赢接被生 魏俸接豫；始粟癸来浆震怒蘸瘩经静，经p 4 5 0 整铯爱蕊矮，形残凝瞧燕裹雏穆矮焉被耋魏薅直 接排除，妓通过与水溶性物质如葡萄糖醛峻和谷胱甘肽结台后排除，这通常是解毒过程。在某些 情况下，外来物质可能被转化为具有细胞簿性、致突变性、或致癌作用更强的物质，而起毒性活 纯作用( p o r t e ra n dc o o n ，1 9 9 1 ) l a s 。 p 4 5 0 氇据海多秘同秘魏，都其有盘统豢矗豹基本绥掏，经往先氧讫豹瘾秘不霜，铡翔，p 4 5 0 c a m 特异性地使樟脑羟化。可被p 4 5 0 加j 二的有机物种类很多，虽然反应各异，但均可归入以下 几类。 1 单加氧酶活性 ( 1 ) 去氢一翱氧的壹接羟纯 如樟脑的羟化，从5 - e x o 或5 一e n d o 位去氢形成个碳自由基，然后在e x o 位加入来自p 4 5 0 的一个活性轭。 ( 2 ) 环氧他 如苯并钝等多环芳烃炎及氯乙烯等不镪和艚薪烃街生物的c = c 黻键上加一个戴撅子。反应 产物是一些活泼的向电性化台物，如 7 中国农业大学硕士学位论文 第一章文献综述 一q 0 r 2 c = c r 2 r 2 c - - c r 2 ( 3 ) n 羟基化 芳香胺和酰胺通过氮原子羟基化被活化。例如致癌物2 一乙酰氨基芴 气芦c 如皿孓夕”o 后者再经硫酸转移酶或乙酰转移酶变成向电性的硫酸酯 孓芦”岛 2 氧化酶活性 这一类反应是通过活性氧自由基实现氧化的，例如 。驾( o n 芳环的羟化 胄h 0 o o h 马( 笋。 邻二酚氧化 c h 3 c h 2 0 h k c h 3 c h o 乙醇氧化成乙醛 在p 4 5 0 催化的反应循环中有一旁路生成嘎或h 2 0 2 ，而嘎与h 2 0 2 在铁( 或铜) 催化下 又能形成- o h 。 3 还原酶活性 在这类反应中，p 4 5 0 使卤代烃和一些含氮化合物变成自由基，如 c c l 4 旦骘c c i 、旦g ：c c i ， 许多醌类化合物可以在p 4 5 0 作用下进行单电子还原成半醌，后者再与0 2 进行单电子传递， 产生0 2 。 底物被p 4 5 0 催化加工需要一个由p 4 5 0 和p 4 5 0 还原酶组成的酶系统，前者推动底物氧化还 原，后者提供电子把已氧化的p 4 5 0 再还原。这两种酶在内质网膜上装配成反应系统，二者按一 定比例、一定位置关系，通过疏水作用结合在膜脂双层中，离开膜就失去活性，但可以重组而恢 复活性。 8 中国农业大学硕：l 学位论文第一章文献综述 1 2 5 植物细胞色素p 4 5 0 与外源物质的相互作用 1 2 5 1 植物细胞色素p 4 5 0 酶系对外源物质的代谢作用 p 4 5 0 在生物体内具有重要的生理功能。大多数疏水性的外源物质，经植物p 4 5 0 催化反应后 在其分子上引入一个官能团( 图1 5 ) ，然历在谷胱甘肽转移酶或糖基转移酶的作片j 下，使官能团 与植物体内的水溶性物质结合( 如谷胱甘肽和葡萄糖醛酸) 。通过提高有机污染物的溶解度以达 到解除其对植物体的毒害作_ h j 。植物p 4 5 0 参与的氧化类型如下： ( 1 ) 氧化性脱烷基：许多在n 、o 上有短链烷基的化学物质易被羟化，脱去烷基生成相应的脱 烷基产物，使其毒性降低。外毒素的n 、o 脱烷基化作用是p 4 5 0 酶的主要氧化类型，如f r e a r 等( 1 9 6 9 ) 首次报道了植物( 棉花) 幼苗p 4 5 0 可把灭草隆( m o n u r o n ) 连续脱去两个n 甲基 而生成尿素。在菊芋中氨基比林和绿麦隆的n 脱甲基化p 4 5 0 酶已被鉴定，而且后一种p 4 5 0 酶 在小麦中也被发现。1 9 9 0 年报道了三个催化除草荆o 脱烷基化的p 4 5 0 ”，即7 羟乙基香豆素和 7 羟乙基试卤灵( 两种合成的荧光底物，常被用做哺乳动物p 4 5 0 脱毒反应的模式底物) 在以色 列菊芋中被氧化o 脱乙基化的两个p 4 5 0 酶和除草剂m e t d a c h l o r 被高粱中微粒体制备液0 脱乙 基的p 4 5 0 酶。 ! c i ， a c “邓1 弋v ；? 赫- 脏l k “i ) c k i 、，一z t 一一 v 。人、n 厶， 西一t h 岫，i 1 令f z _ 工a 。 六芦， 西鼻幸“h d _ = ；： ：焱昏驴一。枣- p 辫。，管：一西1 喁。职oo ，n e “1 芭军- 庐喁 = 女t 一一”“5 飞o u 占q 蕃u ”mv 是旬嘧e l t l l , l 黟。o 袅叫1 图1 5p 4 5 0 催化的除草剂代谢作用“” f i g i 一5c y t o c h r o m ep 4 5 0 - d e p e n d e n t e dc a t a l y t i cm e t a b o l i s mo f h e r b i c i d e s ( 2 ) 芳环的羟基化( 又称双链氧化或环的羟化) ：如玉米的微粒体对除草剂苯达松、氟唑啶草、 醚苯磺隆和绿磺隆的芳基羟化与小麦微粒体对禾草灵、醚苯磺隆、绿磺隆的芳基羟化“”。上述 反应是由同一植物细胞内具有高度专一性的p 4 5 0 同工酶催化的。 ( 3 ) 脂肪族侧链羟化：芳基i - ：j 目肪族侧链通常在末端第一个或第二个碳原子上被氧化生成相应 9 亟 。曼 中国农业大学硕士学位论文第一蕈文献综述 i i i i i i 的醇。如小麦和玉米p 4 5 0 酶对绿麦隆芳基上的甲基羟化，此产物也是以色列菊芋p 4 5 0 的次要代 谢产物。 ( 4