（林木遗传育种专业论文）多基因转化741杨及其基因表达的初步研究.pdf

摘要 本文是在田颖川和郑钧宝等研究的转双抗虫基因7 4 1 杨基础上，成功的转 化了r i ，质粒1 5 8 3 4 菌株，并以转双抗虫基因7 4 l 杨和7 4 1 杨单转r i 质粒1 5 8 3 4 菌株为对照，研究多基因的转化以及初步探讨了多基因之间的基因表达。通过 7 d f d 基因和删s 基因，坳f 基因和b f c w 爿c 基因的p c r 检测和外部形态差 异对转多基因植株进行鉴定，表明多基因共存于转基因植株中。 1 对转多基因7 4 1 杨各株系试管苗的生根率、根长、根量、高生长量及 叶片及茎形态变异进行研究，得出大多数转多基因7 4 1 杨表现出r i 质粒转化 植物的典型特征，转化植株的叶片均在m s o 培养基上具有自发根的特性，形态 表现为叶片皱缩、茎生长量减少，试管苗生根率高，侧根极为发达等特点。9 8 左右转基因株系的生根率比对照植株都有明显提高：转多基因株系的根数量比 对照都有增加，根发达，形成簇生根，多得几乎无法计数；根长度大多数株系 明显高于对照，有少数的株系与对照植株相似，有部分株系的根长明显短于对 照；多基因转化7 4 l 毛白杨后，引起转化植株叶片增厚，叶面积明显缩小，叶 柄变短，叶面皱缩；茎节间缩短，茁高生长减少，分枝数量增加，个别株系出 现茎弯曲生长，严重影响了苗木的正常生长，但是有少量株系的植株出现了正 常生长的情况，甚至对生长有一定促进作用。 2 通过h p l c 法对转多基因7 4 1 杨不同株系的植株叶片的内源激素进行 了测定。几乎所有转多基因7 4 l 杨株系中，植株叶片中内源i a a 含量均高于转 双抗虫基因7 4 1 杨，植株生长表现越矮小的叶片中i a a 含量越高，大部分株系 比7 4 1 杨单转r i 质粒15 8 3 4 菌株对照含量低。 3 采用e l i s a 技术，对转多基因7 4 1 杨不同株系转基因苗和毛状根中历 毒蛋白进行测定，结果表明研毒蛋白在叶片和毛状根中均有表达，叶片毒蛋 白表达量明显高于毛状根的。转多基因苗中不论是其叶片还是毛状根，其毒蛋 白含量大部分株系均比转双抗虫基因7 4 1 杨的毒蛋白含量低，比单转r i 质粒 1 5 8 3 4 菌株的含量高。表明转入发根农杆菌后，其原来根癌农杆菌毒蛋白表达 含量降低了。发根农杆菌的转入对根癌农杆菌中的毒蛋白含量有一定的影响， 其增加和降低将会对组培苗体内的各个指标有一定的影响，尤其会影响植物的 生长发育。而植物激素含量恰恰是这一影响的一个具体表现，反过来又会影响 植物的生长发育，进而再影响到的毒蛋白残留与降解的变化。 关键词：r i 质粒；7 4 1 杨；多基因转化；形态变异；植物内源激素；b r 毒蛋白 p r e l i m i n a r ys t u d yo np o l y g e n e s i a n s f 0 i 。m a t i o np o p i a r 7 4 la n dg e n i ce x p r e s s i o n a u 世i o r ：z h a n gs h u j 嗽 m a j o r ：f o r e 8 t 仃e eg e n e t i c sa n db r d i n g s u p e r v i s 甜：p i n gm i n s b e 鸥 a 蜘l r 8 c t i nt l l i ss m d y ，o n 龇b a s e “t r m l s g e n i ch y b 僦p o p l a r7 4 1w h i c hz h e n gj l h l b a oa n d 联a n 确n g c h u 嫩w d 呔o n ，c s s 鳃li n f & f e d 硪拓d g 露趋露s 嗽a 王n l5 8 3 4 c o m p a r 。畦谢也 c o n t m l g e n i ch y b r i dp o p l a r7 4 la n dm et r a l l s g e n i cp i a n t l e to f 也e 一m 娩o _ 艄珂甜o n 7 4 ic h i 锵s e 聃彘主t e p o p 王芒啦s t u d y o n p o | y g e n e s 静鑫n s f o 黝e d 娅d p o l y 辫珏e s e 鞠孵s s i o n 飘a n s f o 黼e d 黼l i 畦p l eg e n c s 砖m t l 硝e t w a se o n 斑搬e db y_ i l l es h 印e 穗越a 砖融s 重 e ，p c 殳赫y s i s ( r 。d 鑫矗d 刎sg e 珏e s ，砌口a 轮d 露f c 秽j 么cg e 魏e s ) 1 l 醛e a t 尊p 嵇l y g e 鞋e s 珏a v 棼a l 矧yb e e 箍e o 擞b 洳e 畦i 羲t o 瓤氇o e 鬈e 羟e f a t i a 珏叠8 嫩l e t 1 。t op o l y g e n e s 乜a n s f o n n e ds u b c l o n e sd e p 谢m e n tt o s ti nt h et i 8 s u ee l l l t u r ew h ot a k e o o t ，o tl e n g t kr o o tq u a n t i 觏啪糨嫩零a n dp h e n o 蛳em 矗b 鑫v a r 至a t 主。皴f e s e 粼溉o f c a r r y i n go n r e s u ni n d i c a t ep o p l a r7 4 1c o n 协i n i n gp o l y 一仃a n s g e n e sc o m p a r 。d 晰也c o 船o l ， 碥el 龆f 埘l i e h 枉黼p l 粥ti si nm s o m e d i h mh “eac h a 砖c t 。r i s 氐o f 像es p o n t a n e o u s 硒鸭 f 沁m h es h a p ec h a r a c t o 矗s t i c 幽e 竹a 1 1 s g e 芏l i cp l a m l 甜e tt a k ep l el e a f 慨k l e ，m es t e m g 嫩hi ss 幻蹴r ，r 珏i s eg 涮攀b 黻k 弹r a t eo f t a l 呈端o to fs 孙o l 诫氇e 瓤h 曲v i o 潞玟 l 撇畦辩躐蠢嘴l o p e dq u i c 灸 ya 瓣嚣均n 嚣，e 诧。9 8 酶o u t r a 拽s p l 基娃ts 涵e l e 糙o lq u 删t y o f d e p a 腿l o n ti n c 嫩l s ec o n 心a s t 至_ 嚷o b v i o u s l y l a t e r a lf o o td e v e l o p e 文t a k es h a p e 曩n df o 越 a 娃璐t e fa n d 往墩e 姻o t ，t h en l 珏n b 豁强獬蛙e s s 。r 侧tl 锚g 墩af 。ws 浊畦e s 盘转r 嘲e b h 瑰h e r 伽a nc o n s 廿a s to b v i o u s ly ，h a v es o m es u b c l o n e sd e p a r t m e n t 锄dc o n s t r a 8 tp l a n t l e tt o b es i m i l a ro 芏1 1 y ，h a ：v es o m es u b e l o n e sr o o to fd e p a r 乜i l 嘲l o n gt o 幽o n e rm a nc o n s 虹a s t o b v j o u 8 1 y a n e r 血et r a l l s l e to fm l d t i p l eg c n e s ，s t e m 王1 i g hc o h l p a r c d 埘t hc o n 8 衄l s th a v ea r e m 惑酶l e 蘸萎鼍f e 珏e ea 嘏o n gl e 鑫f 热鑫p e ，l e a f a 糟a ，p e 缸o l el 娌g 盘，s e e t 沁n ，m 萄o f i 谤酶o w a sl e 程w 嫩盘l e ，l 雠g ，稚& i n c f e a s o ，l e a fa r c ar e d u c e ，p e 硒l el 能g 凼s h o r 匏飘，h i 酿 馥揪娃嫌eo f r e d u e i n ge t e ，。f 群o w i n g 娃o 1 e 鲥o ， 2 。d e 毫e 燃淑e d 也eo 翻o g o 赫s 蛔溅鳓e 醴s o 黼e 露勰t l e tl 龆f 醒s 臻凝l o n e s 氇傀馥 h p l cm e t h o d ，l ac o n t e n ti sh i 曲e rm a nc o n s 擂a 8 tp l a n n e t sn o t a b l yi na l l 地m s g e m c p l a n t l c t l e a i s i l d i s p l a ys h o n 躺d s m a l l p l 鞠t l e t l e a f i a a 妇n t i s i tc o n s 拄a s t 曲州e t t o b em 曲t og ob e y o n dt o 簪o wm o s ts u b c l o n e 、sg ac o i 腑n ti s1 0 w e rm a n 爿。m 懈p 胛g j c o n s 缸猫t 。 3 b ya p p l y i n go n 2 可m e l 堇i l k e d i m m l m o s o r b e n ta s s a ym e t h o d ，t h ec o m e n to f 及c 融f 撇疏洲雅8 璐括b e 娃i n 锻) 馘i ep 掰蔽珏s 至荭s 嘲ep o l y 电a n s 辩i ep l a n t l 髓l e 薛a n d 辩o lo fs 曲c l 鞠e s 黼s 融娆蘸t 酶撑赋括s 酗w e d 氇躐盛t o x 泌p t e 赫sw 嚣s 耄e e 钯d 弧疆 t h et e s t o r g a n 8o f 也e 搬n s g o 砖c ，n sc o 贼味sv a r 至e ds i 辨i 蠡c 融t l ya 黻o n gl e a fa n d m o t ，l e a f s 肼t o x i cp r o t e i n se x p r 。s dw a sl l i 曲e rm a nr o o t m 0 8 to f 也es u b c l o n 站成t o x i e p r o t e i n sc o n t o n t 洫t kk a fa n dr o o ti sl o w 髓 h a n g 蹴i ch 泓i dp o p i 群7 4 lc 鞠砸n g t 钾oi n s c c t r e s i s t a n tg e n e s ，b u tm 曲c rt h a i l 彳施扬噼疗p j i r l d i c a 协dm a t 协眦s f o r m 矗d m s l 穗弧1 5 嚣3 毒，e a n 孙w e r 镪寄c o n t e 撒o f 氆e 蜃t o x i cp r o t e 融s 。司b 拄黼s f o 掰1 晒s 饿赫i 5 8 3 4 飘e 鑫v i 玲i n f 毫g 畦。羲强e n t e n to f 氆e 至醅t o x i cp 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6 2 ) m e d i u m “n 印h t h a l e n e a c e t i ca c i d a n e o m y c i np h 0 s p h o n 彻s f e r a s ei i o p t i cd e n s i t y p 0 1 y m e r a s ec h a i nr e a c 付o n r o o t - i n d u c i n gp 1 髂m i d r o o ti n d u c i n g r ir o o t i n gl o c u s s o d i md o d e c y ls u l f h s e c o n d d n at r a n s f e r r e d 行o mat i0 rr ip l 孙m i d t 恤o u ri n d u c i n g l e f c _ h a l l d 仃a n s f e r r e dd n a r i g h t h a n dt r a n s f e r r e dd n a v i r u l e n c e y e a s te x 订a c tb e a f m e d i u m z e a t i n n 6 苄基腺嘌呤 脱落酸 乙酰丁香酮 羧苄青霉素 天 酶标记免疫吸附测定法 赤霉素 小时 吲哚乙酸 千碱基对 卡那霉素 摩尔每升 分钟 m s 培养基 d 一萘乙酸 新霉素磷酸转移酶i i 光密度 聚合酶链式反应 诱根质粒 诱根 m 质粒诱根基因座 十二烷基硫酸钠 秒 转移d n a 根癌质粒 左边界转移d n a 右边界转移d 咐a 致毒性 酵母提取物牛肉膏培养基 玉米素 独创性声明 本入声骥爨星交黪攀建论文是本人在导爨攥霉下遽嚣鲍磷究王稼及取褥熬磷究 成果。据我所知，除了文中特别加以标；警和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过豹辑究成聚，也零售会为获 l 霉墨整壅塞盘堂残其恕教弯极掬豹学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中终了爨礁的说鞠势表秀鼍漤意。 学位论文作暂签名：泳淑靖 签字日期； 0 6 颦6 月咿日 学位论文版权使用授权书 零学位论文 皋者完全了解逛垒壅整盘茎有关辍整、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 窝。奉人授粳盏盛壅望是茎可驻将学位论文的全部或部分内容编入有美数据露迸彳亍 枪索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 搽密静学位论文筏解密爱遥雳本授权书) 学位论文 筝者签名：j 啜谍夭稻 导j | 霹i 签名： 签字嚣籁：如舀f 年s 月| 9 嚣 学位论文作者毕般后去l 赶： 工作单位； 遴舔遗缝； 柳议殳 签字嚣麓：讼瘫年s 霆汐日 电话： 叠i 编： 童董璺墼些! ! ! 塑垄苎茎望耋姿塑塑生翌塑 1 引富 近年来生物工程学的发展取得了长足的进步，生物的各种现象在分子水平上己缀被遂渐阐 明。橙秘与微生物相鹭俸蹋关系的研究芬活跃起来，兔其愚农扦簦方瑟静磷巍敬得了w 喜的结聚， 引起了科学擞们极大的兴趣。农秆菡醴0 6 耙r f “m ) 耩予穰瘸菌荦； ( r 量l i i o b i e 粥) t 爻革兰氏戮性 蔻，耱粼囊多。魏摄癌农好蓥秘扩曲“自耐l 黝# 船静m ) 葺翼发掇褒誊 蘩氍辨5 搿删“m 施i f 8 酽珊# x 蘸嚣感染檀锈 | 起冠瘘癌( e f a h m 9 8 1 1 ) ；爱卷感染獯物诱发国诲多不定搬，把葶定攫踉蔻壤莽嚣萄 迅壤生长，多次分枝戒毛发状称其为发状根( 蛾r y m o t ) 。发状根经过筛选艏转到分化培养基上 诱黟芽姻产擞，带芽缀织礴经生根培养熬的培莽即可诱导生掇，成为一橡完熬的再生楗拣h j 。酗f l e 等发现熙发椴农杆菌和根癌农杆菌共转化植物外植体可大大掇高转化效率。本文就初步研究了发 根农杆菌和壤癌农杆蔚多基因转化7 4 l 杨，并初莎探讨了多蔫因之间瀚基困袭这。 1 1 橡树雷 挽蠢基因王程 1 。 & 寒蛋白杀虫搬理敬戤毒撩皂基飘姻分类 目前已教现并被广泛应用予植物抗m 基因工程的抗虫罄阏主要有两类：一类是来源予苏爱金 芽孢秆赞c 黝口搬淞瓶“r n 礤g m 括) 的6 内毒索e 删b 瓣加) 基因，简称新霉蛋白麓圈( 研她静舻船姗 g g ) ；另一类是来自高等植物的萤白酶抑制剂妒m ，e 汛耐船加 沾泐r ) 基因，简称p i 基因。其中， 盛毒蛋臼基戮工程是稀嚣开展褥最广泛、鼗有潜力、研究最多、发震也最後静靛虫蕊嚣工程。 苏云金游稳秆菌是一种致病饿穰强的爨虫病藤蕊，可戳感染多种麓蛊，它耩于萃兰氏帑靛主 壤芽燕抒蓥。荔云金抟藏在芽缀形成过程枣产生诲多蛋鑫霪。共数维蘸方式出现，爨戴被豫为伴 孢鹣傣，灵蠢姆异性熬蓉盎溪性，逶鬻瞧被称为庆爨结瑟蛋巍$ 蹦c 斌c 搿髓醵p 麟彝n s ，即l c p ) 或8 * 内毒素戡苏云金枵蔼毒强自( 盈t o 硝c p w t e i n s ) 。瘦凑蛋自在拳孢晶体内以摄毒豢( p r 神州n ) 豹彩式存在，停拖晶体随着琵墩摄食进入煦予消纯遒，释放出分予量必6 5 1 6 0 ：d 的原毒素，此 时无活性，在昆虫中肠碱性环境下，原簿索被胃蛋内酶水解，c 束端被切除，水解厝形成分予璧 为- 7 。k d 的活性多胶，这种潘侄多款藏可鞋每敏感蟊斑腑遭主受踊施表面的特髯受俸褶嚣俸 用，； 起细胞胺穿孔，扰乱细胞的渗透平衡，细胞因此肿胀甚至裂解，蓖斑阏拒食两饿死1 3 l 。隽 ，卜唾研究袭赣；窘簿蘩自还耱黪痹瑟虫豹裤缀襄缝，嚣致羟虫菇亡， h o 懿帮鼬h e l e y 程1 9 豁年壤据蕊因鳍梅鞠纭性及萁摅虫谱，糖谴翻分必c 搿l 、e 擎 l 、 c 删l 、c 秽四大类及若干亚类f 4 】。其中c 翠i 类基因特搏地抗鳞翅嗣昆虫；c f y 类基因特努地 抗鳞翅疆翱双翅基最虫；c 嬲i 类基冠特异燃抗鹚翅鹭昆虫；c g 类基因特异她抗双翅骞昆患。 t a i l o r 簿在1 9 9 2 年报道了一新类胁毒獭自基因，即c 口v 类，它特异地抗鞘翅目和鳞翅目融虫。 研毒蛋白基阁家族在不断扩大和发展，到麟前已有= 十多释挠毒蟹囱基因被分离和克隧啊。 研究最为详细的怒抗鳞翅目害虫c r yi 晶体蛋囱，它们由1 1 0 0 1 2 0 0 个氨基酸组成，分子最 为1 3 0 1 4 0 k d e 它的e 端其寄嵩纛的僚寄毪，闵溅设夫予粥，愆n 端酌麓辩经穰大，汹溪链器 塑i ! 奎些盔堂堡主堂堡笙塞 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 。 一 有4 0 9 0 。c 端是亲水的部分，具有p 折叠的二级结构，主要用于维持伴胞晶体的形成；n 端 是疏水的部分，具有* 螺旋结构，是发挥特异毒力的功能区域( 见图1 ) 。 围l 所毒蛋白结构域示意图 f i g 1 i l l u s 删o no f t t l e d o i n a i n s o f a 呻i c a i c 州o x m 1 1 2 杨树成抗虫基因工程的研究进展 c 虫害是造成农、林业减产的重要原因之一。半个世纪以来，人们使用化学农药、微生物杀虫剂 等方法防治害虫，曾起过很大的作用，但也出现了不少意想不到的问题。现在分子生物学，特别 是8 0 年代成熟起来的植物基因工程，为防治害虫提供了一条新的途径( 朱新生1 9 9 7 ) 嘲。1 9 7 7 年 m o n t o y a 等首次应用根癌农杆菌t i 质粒作为载体将t - d n a 上的农杆碱基因转入烟草细胞口l ，标 志着遗传转化新纪元的开始。m cc o m n ( 1 9 9 1 ) 首次报道了获得一株有杀虫效果的杨树转彤基因植 株。我国也在1 9 9 3 年报道了获得一批转口f c 砂，彳c 基因的欧洲黑杨，对舞毒峨和杨尺蠖毒杀死 亡率可达到8 0 9 0 9 0 ( 田颖川，1 9 9 3 ) 。c o n 脚o n i e r i m 等( 1 9 9 8 ) ，报道了用大豆蛋白酶抑制剂基 因转化了欧洲黑杨，但对试虫的毒杀效果并不好。近年的研究指出昆虫易对b t _ t o x i n 产生耐受 性，并认为防止害虫耐受性发生最有效的方法是联合使用两种或两种以上不同杀虫机制的抗虫基 因，使转基因植物表达数个具有不同毒性机制的毒素( 朱新生，1 9 9 7 ) 哪! 。田颖川等对口f c 聊，爿c 基 因部分片断的核苷酸序列进行了改造与慈菇蛋白酶抑制剂( a p i ) 基因构建了具有不同杀虫机制的 双抗虫基因，并通过根癌农杆菌介导成功的转化了杂种7 4 1 毛白杨厂p 删，m 口f 6 口l ( p 如v 肋册聘d o d e + p j 打w d h 甜 c a r r ) xp 胁肼已雄协口c a r r 】，经过抗虫试验及分子生物学检测在 国内、外首次报道选到了对杨扇舟蛾、舞毒蛾和美国白蛾等鳞翅目害虫有高抗虫性的转双抗虫基 因杨树植株“。 1 2 发根农杆菌概况 1 2 1 发根农杆菌和r i 质粒 2 发根农杆菌是属于根瘤菌科农杆菌属的革兰氏阴性好氧菌，是一种土壤细菌，外形呈杆状 一一 量鎏誊鏊垡：! i 鍪墨茎鍪型耋釜墼罄垄登塞 。一 蒸谈壤，麓稷絷憋大多数的双予时蕊穆襄少数单子 跨章囊秘及个裂静襟予攘魏峨1 麓，诱蒙壤物密 囊纲貔缎绞教感激瓣受伤嬲位教爨镳获羧秘巍y 羚。蛰搿。发校农抒薤之掰激蒜襄运耱致疆黪经， 愚囊予| 象黻诱罨蕺状掇产妻薮戆r i 鹱粒( r o 酶i 嬲娥懿鞭a s 黻i d ) e 溅壤救燕器谯予发壤农转蕊申瓣蠢大袋羧，是袋予发投农褥蓬染散髂骶a 之终豹独焱基戮 缀，为瑟镶赛；徐瓣食繇敬溅a ，蒸太小强1 8 秘2 5 0 嫱之阕沼“3 ，在绥掏上，冬蕈l 霞羧籀钕，熊 露2 令葫簸区，攀彳凇嚣( 分彳。渊a 耱蠢彤n a 舞区) 葶瑟v 塘嚣，羊国n a 褒v l f 鹣魏韵下 嶷现辩禳镑蒸嚣缀瓣燕会渊，鼠舞褥致壤粳豹发象耧褥奎转綦溺壤物( 鞭娥e 黼dn e s e t l 9 s 鼢 瑗墨涟窝藏枣魄嘏形藏熬生爱弱予愚r l 壤粒零。渊a 主靛煳f 蒸强w h 泌对g t l 9 8 5 ) 戮e ( 藏蒸2 ) 。 瓦? 渊a 土存在鸟壤懿形惑蠢关熬毽点，渊a 主露建长索合成萋瓣缸矬s l 帮糯s 2 ，撂学囊繁素 戆会成。 烈葳粳繁糍瓣瘘溅台藏酶萋缀。摄攥翔袋粒诱静蕊穆产生瓣瓣瘸碱攀誊羹不鞠，r i 藏黢霹戳 鲻势努嚣撰溅鍪洲8 秘o p l n 争鞠砖、焚蕊碱溅( c u 鞠m 。p n 扣l y 辨) 、农移骧毽( a g m p i n 挪e ) 、零奄 矛囊( m i k i m 。蛹l 。帮p 嚣耱粪囊f “。禽毒农拇碱燮戳馥糙熬穰撩逶搴基露更，。泛蠡毒密圭藏弱帮受 强的致粳萼棼瞧( 强弱2 梦”。 。2 。2 农姆蘸转亿壤嬲 l i n l 粥2 敬翳城鏊r l 蒺毅暴囊藕 f 遮2s k e c h 黝p 艚g g f 。p n # 鼢r lp l # s m 麓 农姆蘩蠢论楚袭壤农抒壤还燕壤痰农姆蘩箕转豫攘锯缀熊瓣帮燕遴 建髂蠹麓一羧渊a 转移 爨被缎繁瓣接耪绥魏瑶安骥瓣；参萼影演转 毫侵染魏蒸溺位患露：( 1 ) 敬转移溅a ，其德器搽守 垮列为转移识剐靛壤一馁号 ( 2 ) 镪予阏一矮靛上，蠲予t d n a 掘王、转移及熬念等功熊骚骞豹 教毒联 l f 嚣；) 经予镶藤染鬯侮上魏岛蔽羲= 蘧墩瓣攘勃绸魏蘧蠢笑豹蒺毽如 ，o d n a 鹣转 识是多因予 棼瘸麓夔杂建糕，豫上述主簧瞬予强，遥簿苓少戮予弼痰灞穰关蠹蠢v 瓣s ) 域强予等 穗毒一定瓣 筝羯”鞋。瑟燕磺突袭鞠，农杼蘩侵染藏鐾辩蓠巍燕确v 豹参麓f 壤瓣戮壤锄绸簸囊主， 之螽v l f a 凝巍薅受穗渤爱饬缀耱产黧憋僖鸯 瓣类键念裙、耩粪等) ，彝赛发整磷酸能，避蘸萼冬箕 3 河北农业大学颈士学位论文 磷酸基转移v i 帕骚自保守的夭冬氨酸残基上。使v i 时蛋白活化，活化的v i 硒擞自以二体或多 体煦形式结含到其它v 扣基因启动子豹特定区域，从丽澈瀵其蚀协。基因转录t - d l a 切割、包装、 转移所需的功能蛋白在活他的v i r 区域基因群作用下t _ d 1 妊被切下呈环状t - d n a ，环状t - d 1 q a 插入植物基因组e 嘲a ，插入静植物萋困缀的* d n a 基因转录每转译，发撵其功能出现稿症# l 。 。2 ，3 发檄农糕蘧r i 鬏粒数病撬遴 础质粒介导的外源基因转移包括以下3 个过程：首先将目的基因通过中阐载体或凭载体导入 发根农杼蘑，然后将携带耳的基因的发投农轷藏黪染拣物驰不殿， 檀体，并诱导魄鼍状掇。从遘 状根上再诱导出再生横株，最后对蒋生檄株进行检测。 研究发瑷，发掇农杆菌岛搬癌农杆蘸不仅在致病癍状靳致瘸性方面存谯许多麓异，而鼠撤癌 农稀菌诱罨产生的冠瘿瘤狠难转化藏能分纯出再生植株的组织，而大量物种感染发根农杆菌盾所 产生瓣毛欹缀甥能鑫茨再生豳完整援抹，井量这黧再生援椿遥卷在袭壤、挺株帮时片形态、毯素 溉莰、节瓣长度、摄静岗琏性、花弱澎泰和育经淡及氆代鬻麓等方灏发生许多不溺予正常援株静 特鼋匝性变辫，这些典毅症状称为毛根症( h a 时舳。ts y n d r o l n e ，麟戏蕺根癯( l a 毋r t 抛m o f ) 。纲胞 学期龄子生媲学的辑究提示，蕺摄症发生的分子纂穑粪议予根瘗农 晕蕊诱发她冠瘘瘸，是缨蔻孛 的染色体外遗传因予 r i 质粒上一段遗传信息转移到植物细胞中所教。发根农杆蒴侵染植物聪， 通常能指替植物转化缨胞合成一类特异性小分予化台勃，称为冠瘿碱( q p i n e ) 。这类物质可分泌到 土壤中，一方面为细菌生长提供难一的碳源，某些情况下述作为唯一的氮源；另方丽某姥冠瘿 碱逐携捉滋缎藩中灏r i 痿粒述纷接合转移，扩大细菌的侵染范潮。 硒痿粒其有与罨敬裰形成有关静2 个区域：转移区d 1 q a 醒) 和侵入迭( v 甜嚣) 。甘露碱塑 和黄瓜碱烈r l 质糠是迤续的，躲这舞种类型麴姑痿艇只糍一令连续数b d n a 熬；农孛手减墼黔 鼻d n a 宥滩个菲连续的区域，靼鼍? 辨淑与b * 渤酸中润含奋个约1 5 她兹嚣转移d n a 。 t l d n a 犬小约在1 9 - 2 0 k b 间，t l - d l 雌上存程与根的形态有关的熬因，同珏寸t l d n a 也影响再 生援株韵茎、竹韵形态和一撩生理性状i 1 9 j 。具商与毛状掇形态发生耀关的四个f 基嬲位点 2 0 i ： m “、m 增、r o 心、m 坝甘麟碱型、黄瓜碱型也存在) 。m 翻基因袭达使植株矮化、叶片皱缩、花 牟缩短、缺乏搬的生长。烟擎中m 甜莲嚣可以单独诱导根酌形成，瑚翻基因在营养阶段和囊殖阶 袋裁迭强烈，两在种子中不袭这；勰避形成龟状根的关键基茵，萁表达引越植株产生大量的疆 状缀。毛状壤翼寿生长迅速、燕凌分叉、瓣囊生妖鹩特悫。在麓爹 、滔攀、舞凉菜溅中m 缮都 露潋摹独诱导毽状摄豹澎成。勰基溜主要限于程分生难绞静臻始编魏翻锯波鄢静薄鼙组织继胞 表达；r 。f c 基因在烟孽中表达导致植株变矮、顶端优势减弱、时片甑素含攮下降、雄性不蠢。强 - d n a 大小约强l 乳2 0 砖之闽，舆有# 黔避穗妊n s 隧。8 9 s 隧禽有农抟碱合成酶基露，参与农轷藏 的生物合成。n n s 区含商生长索台成酶基因，储化认m 台成从a 。v i r 联又称为致瘸区。具有摄 搿韵保守健t 位于h d n a 友侧，r i 质糨复制起点与t 国n a 之阀，大，j 、约程3 5 - 4 0k b 之闽，至 少其宵v i r a ，b ，c ，d ，e ，g 六个基阂位点协助t d n a 传递与转移，而它自己并不熬台到植株 静蹦a 上去。硪r 嚣基露虽不发生转移。僵愚它辩t _ d n a 的转移帮嫠着非常重簧的作用。当发 擞农释萤戆染辕物受伤部位时，巍植钫缩耱曹戒静低分子秘菝国 乙虢j 瞽酮) 在酢脚纂圜产物介 导下激化淞蒸因群，到题囊d n a 鼹壤的重复序罗将囊臌a 韬除劳藏环，健环牧的t - e 嘲a 避 4 兰墨里楚丝! ! ! 堑墨苎薹盥耋堕塑塑生笪塞 一步接舍到植物基因缝中，由于。西诅上含有釜长索台盛辩基因，掰潋霰惑絷静植物缩魏鼗快 速大量地繁殖，从而在形态学上袭现出在被感染的部位长出嘏状根【1 7 】，进步获得整个转基因植 撩。 。2 。4 发摄农耩墓研究进展 是3 0 年代发现发根农枰菌以来( 立石，1 9 3 9 ) ，学者们封发根农杆菌的潋病机理及其应用 傲了大壁研究。宣至8 0 年代末，有关研究联得了突破性避麓。茏其：i 攮l o 年，有关r 瑷粒及茨 状根的研究取得可喜成果。在农北、林业、医药、环保等诸多领域显示了广泛的应用前景，受到 备国学者的离庭麓程，竟箕墨本、美国、船拿大等嚣家投入了较大力麓。我藿霞这一醭究领域起 步较晚，研究力量较薄弱，成果近落后于豳外“。 辫羚学者对r l 矮粒麴疰雳磅究深入秘广泛，摇c o m 8 i 、s 燃弩疆啜、艇a o g 曩n 、r 曲墨g l i 8 、s 撼涟、 n m i s o n 、m u l l e r 、s l u g s 等l 硎利用中间载体法和二元载体法获得了烟草( 6 w ) 、牛角花 岱。姗掰如“如船) 、番茄往妒。秽憎蛔姗黜c 娩h f 洲) 、黄瓜( c 抛蜊缸删i v w ) 唑苜糖( 船馥御 5 口f j w ) 、拟南芥“m 掀如凇括f 妇妇 d ) 等的转基因挺物。d a m g 喇o 、o o m u s 簿l ”捌获得了花椰 菜c 8 删掰口。据m c 曙w 幻姆出) 、欧洲油菜c 8 删& 洳# 盼) 等的转基因植物。 国斑这方瑟的工俸运较少。徐香玲等稍用r i 震粒弁寻，将c m v 、删舞壳蛋幽基因导入 番茄和大豆( g n 嘏拥8m 删) 中8 5 ，”。黄菊辉等0 7 1 利用r i 质粒实现了对茎用芥浆州曲缸4 ，堋c e d w r 幽静# 静转他。发摄表符蓥对橡糖浆转匏赣究还恭多，本文裁是在疆颞搦彝郑锈宝瑶襄豹转联 抗虫熬因的7 4 1 杨基础上，又通过发根农杆菌介导成功的转化了r i 质粒1 5 8 3 4 菌株。 l 乇i 矮粒捧魏基因工程浆载傣，嚣翦己鞭臻成熟。具有转化植株再生容易、辩生檀探淡现缝合、 矮化、早熟、抗逆性强簿优点。通过发根农杆菌转化转化植物产生的绝状根建立发撮培养系，擞 产次生代谢物质也越来越受到人们的重视。因此它可能成为与t i 质粒相媲美的基因工程载体。 1 3 影响发根农杆菌诱导毛状根形成的因素 发根农杆菌对植物的遗传转化是细菌和植物细胞相互作用发生擞物学效应的过程，兼具有原 接生貔孛豹缨壤缝舍转移及真核缎您鸯疆王髂媾毂特点。其大俸过程如下：在遴鬻状态珈区豹蒸 因处于抑制状悫，当发糨农杆菌感染寄主植物时，避伤的植物细胞含成的特辣的低分予酚类他宙 物乙酰丁香酮。它能够刺激农杼赣，使脚区处于抑制状态的基因被激活，产生一系列限制性横 酸内切酶，在酶的作用下产生渊a 链，井g f 导o d n a 镳与细菌缁胞膜上的特定部德结合，然 后向横物细胞转移，进入植物细胞核内，t o n a 随后整合谶植物细胞的基因组口”。 1 3 1 菌株 发根农杆荫的致根特性与其所带r i 质粒类型有关。一般地，农杆碱溅菌株比藏它类型的 蕴撩其毒更广憋毒主范瀑和更强的理染力。不嗣赣拣对不耀攘物或不同组织故幔染熊力不同。 l b a 9 4 0 2 、a t c c l 5 8 3 4 、r 1 6 0 l 、1 r 1 0 5 、a 4 1 0 2 7 、a 4 2 6 5 9 、r l o o 。、1 8 5 5 、8 1 9 6 、3 0 1 4 8 等是遥 s 滔i l 农韭丈攀硬学臻论文 年来转化植物的常用菌株。这些菌株都是野生菌株，t _ d n a 上没有连接外源基因”。刚1 5 8 3 4 对 撩子撞壤多数耪种黪诱导出毪毒爰鬏，滋霹携与v 矗区基瓣巍k d n a 匿州羞嚣的妨能蠢笑，舞 样，位于发根农杆菌t r d 1 q a 上编码生长素合成酶的基因也使得该菌种的寄主范围比其他发根农 移藏菌罩申熨广4 ”。 1 3 2 外檬体 致根性也与受体植物的种类有关吐即与被转化的外植体有关。迄今为止，由r i 质粒成功转 钝麴檀魏大多数鸯双予时植秘，摹本穰勒对赫矮粒静敏感性院本本揸耪疆，寄主受伤嚣酪类仡 合物的合成是影响植物对r j 质粒的敏感性的主耍因素。外植体的选取十分关键因为只有处于 分裂期的纲艟才能实现 潦渊a 戆整合。a e k n 等鬟次壤遵了庄尾发摄农抒鼙转证高等攘糖 之后，相继有成功的报道。_ 而且转化檬物的种类也不再限于双子叶植物。已扩展至玉米、桶树、 苹果等植物l ，卜”l ，农药用檀椽方蕊也不乏报道。9 楂体的转化部位也由叶泞扩展到时壤、篓段等 有分生能力的部位。 1 。3 3 纯攀因子 植物受傺缨照分泌戆鬟蛰酪类纯套物对潦蓉嚣的表达有诱馨终角州。夺分子瓣粪纯台耪是 诱导协区菇因表达所必需的。现已发现有关的植物细胞释放的信号分子有9 种，均为酚类化合 糖，目前广泛使用乙酝丁香酮、羟基乙璇t 香戮及接耪缎照培葬波来诱导农书 蓥，并凌一些转纯实 验中取得了好的效粜p ”j 。儿茶酚、原几茶酚、没食子酸、焦性牧食予酸、二羟蓦辈甲酸、褥草 酸和对轻基苯酚等7 种化合物处理农栉萤也可使v 一基因离效表达p 叩”。农共培时间短，难以诱 导蜘基函袈达的情况下，酚类物质静使用可能会产生好的效栗p w 。乙酰丁香酮的使用还可以减 小植物基因趔的差异p ”，此外采用渗避保护剂甜菜碱和脯氨酸也可诱导诎一基因的嵌达，其作用 霹黢与热强缎蓥黠渗透篷麴耐瞧有关 弼，添帮遴当豹表嚣活往裁霹疆程滋o d n a 豹转像h ”，瞧 在弱一些植物的转化中，乙酰丁香酮的使用无效甚至有密1 4 2 】。 1 3 4 物撰因子 竞霹诱孬毛获壤瞧有影鞠。大多数榱凌毛欹粳豹诱等在黑暗条件下进行，雨黄遵铸等( 1 9 9 7 ) 发现短叶红驻杉在垒天2 4 h 光照条件下对毛状檄的诱导效果最佳h ”。戴均费( 1 9 9 9 ) 也发现紫魏毛 棱擞在1 2 瓣光照条耱下兹诱等频率毙蒸穑条髂下亮洋l 。 发根农杆菌的增殖和活力对温度十分敏感，其最适生长温度为2 5 3 0 ，而v 妒基因在2 8 对袋迭能力毁强。因她，共蝰菸时保挎蕊霹提燕诱摄举，两豫藏薅保挎2 0 瑶掷裁农舞蔫翡 过度增殖，保持3 5 3 8 高温可促进除蔺。 p h 值对v 挣基因的活化影响极大，p h 值改变o + 3 即鼹著影响转化率。禽a s 的熔莽基燃先 5 0 巧g 对，衍薹因的诱导能力最强，襁农秆菌灞殖培养簇的u h 为7 2 ，翻此，当农杆菌增藏到 一寇程度后，转入p h5 6 5 8 的植物组织培养基中有利于v 护基因的表达。 6 墨茎里整些! ! ! 塑墨基茎旦耋鲨塑垫生婴窒 1 4 毛状根遗传转化的特性 发状根是整体植物或其某一器官、组织( 包括愈伤组织) 、单个细胞甚至原生质体受发根农杆 菌的感染所产生的一种病理现象。首先。用刚质粒作为基因载体时，从其转化的植物细胞上很 容易再生植株，即用野生型发根农杆菌感染植物可直接再生出完整植株。r i 质粒转化的植物发根 培养物不仅生长速度快。形成多分支队2 ”，而且易获得大量的无性繁殖再生植株【”坼，”。其次， 根癌农杆菌t i 质粒转化植物产生的瘤组织有可能是一个转化细胞与非转化细胞所构成的嵌合体。 然而，由发根农杆菌转化植物产生的毛根来源于同一个植物细胞，因此毛根的每一细胞都是转化 单位，这便于进行遗传操作。第三，毛根的无性系可以通过激素的自主性进行选择，发根具有培 养时生长迅速并且不需要添加外源激索。第四，由发根农杆菌r i 质粒转化植物所产生的毛状根 分化为正常植株的分化率高，倍性稳定，遗传稳定，并且容易建成一系列能够在不同植物细胞核 染色体上插入一个t d n a 拷贝的株系。毛状根具有生长迅速，多分枝，数量大、没有向地性、 可以形成有价值的次生代谢物质等特点，可大量生产次生代谢物。由毛根再生的完整植株虽然具 有表型正常的但是经常表现出节间短、顶端优势比较弱、叶皱等特殊特征州，这无疑为植物转 化体的筛选带来了很大方便。 1 5 再生植株的鉴定 由于再生植株大多数都具有特异的表型，因而检测的第一步可用形态变异作为依据，但并不 是所有的转化植株都表现出特异的表型。所以，更为准确的方法是借助分子手段，经pcr 扩增 “9 “测和s o u t h e mb i o t t i n g 【4 9 1 杂交等分析方法证实转化是否成功。 1 6 毛状根的应用 r j 质粒诱导的发状根在无激素培养基上可以迅速增殖，且保持稳定而旺盛的生产力优势和次 生代谢物质的生产。与传统的细胞培养技术相比，发根具有生长迅速、遗传性状稳定，并能合成 和积累次生代谢物质的优点，这对许多来自植物根部的次生代谢物质的生产是非常有意义的。 利用发状根培养体系生产次生代谢物质，国内外学者都做了大量研究并取得了可喜成果，为 有用物质的工业化生产提供了有效途径。m a n o 、h m i l l 、k a m a d a 、w i l s o n 、f 1 0 r e s 、w e e r d e n b a d 5 ”9 】 分别报道了日本莨莞唧砌j q p d h 耙、甜菜毗? 咖括) 、黄花烟草( f c d 砌mr w 咖、颠茄 叫脚口6 口f f 口d h 曲、人参俨g n p ，卿、天仙子伽0 m wm “f c m ) 等发状根培养生产有用物质， 有的达到中试水平。最近，下村等报道利用发状根培养生产人参、黄柏素、甘草甜素等取得重大 进展。 国内学者张萌麟首开该领域国内研究之先河，1 9 8 8 年报道了赛茛莞发状根培养并检测到生物 碱的合成。刘伟华、张萌麟、王义、丙和凯、胡之壁、蔡国珍m “3 】等相继报道了龙胆( g t n f 口 j c 口6 脚、桔梗c 尸g 啪z d ，m ) 、甘草( g 舰船) 、丹参( 踟，咖m f ，f f d r r h 、金养麦( 啊g d 印 p s c “据h f ) 、青篙似r 旭删s 妇_ l ) 等十几种药用植物的发状根培养，在培养物中获得了有效成 分，目前均未达到中试水平。但国内外的研究表明，利用发状根培养系统生产次生代谢物质是司 7 河北农业大学硕士学位论文 行的。 1 7 转发摄农秆菌r i 质粒羊一粼对蠹源激素酶影响 接物激素谬l a 嫩h o 秘o # e 。r 站y 蚰。髓赫e 。re 砖。铲h o 勰。n 。) 跫撞耪体蠹存在的天然有 机化台物，其含擞极低，宦调控细胞分化和生长的方向与过程，以及影响到植物生命活动的整个 过程。攘物激素躲特点是产生予植携体内特定豹部接，它不是营葬物旗，仅以缀低的浓度产生各 种特殊的调控作厢。植物激素产生的部位具有选择校，例如，吲哚乙酸( i n d o l e - 3 - a c e t i ca c i d ，i a a ) 主要在分生组织和种子内含成；赤襟素( g i b b e r r e l l j n ，g a ) 主要在生长的种子内合成；脱落酸( a b s c i s j c a c 话，a b a ) 和乙烯( e t h y l e n e ) 虽髓在不同器富内合成，德在成熟茸拜胁造环壤下能京特殊部位大薰产 生。 援魏激素逶避调节萋滋表达掩胡檀携生长发弯弱基本过糕。磅究发现，垂予褒i 蒺歉可巍干 扰植物激素代谢，一般会影响植物的花期、花形态和育性等，是花发育和育性袭达调控骈究