药物定量分析与分析方法验证.ppt

第四章药物定量分析与分析方法验证,第一节定量分析样品的前处理方法,一、概述含金属或卤素、硫、磷、硒等有机药物的分析方法1、不经有机破坏的分析方法2、经有机破坏的分析方法,三氯叔丁醇,六氯对二甲苯,碘他拉酸,二、不经有机破坏的分析方法适用于含金属有机药物或结合不牢固的卤素等药物的分析直接测定法经水解后测定法经还原分解后测定法,（一）直接测定法金属原子不直接与碳原子相连的含金属药物直接相连但结合不牢固的有机金属药物1.配位滴定法葡萄糖酸钙2.氧化还原滴定法富马酸亚铁,富马酸亚铁的含量测定Ch.P(2019),取本品约0.3g，精密称定，加稀硫酸15ml，加热溶解后，放冷，加新沸过的冷水50ml与邻二氮菲指示液2滴，立即用硫酸铈滴定液(0.1mol/L)滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml硫酸铈滴定液(0.1mol/L)相当于16.99mg。,原理,Fe2+Ce4+Ce3+Fe3+,（二）经水解后测定法1、碱水解后测定法适于含卤素有机药物中卤素原子结合不牢固的药物，如卤素与脂肪碳链相连者。,三氯叔丁醇的测定Ch.P（2019）,过量定量,（淡棕红色）,Fe3+SCNFe(SCN)2+,三氯叔丁醇的测定Ch.P（2019）,指示剂,硫氰酸氨,滴定,2、酸水解后测定法将含金属的有机药物与适当的矿酸（如盐酸）共热，将不溶性金属盐类水解置换为可溶性盐，然后用配位滴定法或剩余的酸碱滴定法测定。例：十一烯酸锌,（三）经还原分解后测定法,将含碘有机药物在碱性下，加还原剂（如锌粉）加热回流，药物产生还原裂解反应，使其转变为无机的碘，然后采用银量法测定。,泛影酸,例泛影酸的测定ChP(2019),取本品约0.4g，精密称定，加氢氧化钠溶液30ml与锌粉1.0g，加热回流30min，放冷，冷凝管用少量水洗涤，滤过，烧瓶与滤器用水洗涤3次，每次15ml，洗液与滤液合并，加冰醋酸5ml与曙红钠指示液5滴，用硝酸银滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硝酸银滴定液(0.1mol/L)相当于20.46mg的C11H9I3N2O4。,NaI+AgNO3AgI+NaNO3,三、经有机破坏的分析方法目的：将药物分析中有机结构部分完全破坏，使有机结合形式的待测原子转变为可测定的无机离子。方法湿法破坏干法破坏,（一）湿法破坏适用于含氮有机合成药物分析的前处理在生物制品分析中用于氮（包括蛋白质）、磷、硫柳汞及氯化钠测定法的前处理用于生物样品中金属元素测定时生物基质的去除,方法以硫酸为分解剂，加入氧化剂（硝酸、高氯酸、过氧化氢等）作辅助分解剂硫酸-硝酸法硫酸-高氯酸法硫酸-硫酸盐法硝酸-高锰酸钾法,凯氏定氮法(kjeldahlnitrogendetermination),用于含氮有机药物的定量分析。以H2SO4-SO42-为有机破坏试剂（消解剂），通过消解-蒸馏-滴定三步操作完成含氮药物的定量测定。,将含氮药物与硫酸在凯氏烧瓶中共热，药物分子中有机结构被氧化分解成二氧化碳和水，有机结合的氮则转变为无机氨，并与过量的硫酸结合为硫酸氢铵及硫酸铵，经氢氧化钠碱化后释放出氨气，并随水蒸气馏出，用硼酸溶液或定量的酸滴定液吸收后，再用酸或碱滴定液滴定。,1.仪器装置凯氏烧瓶为30-50ml(半微量法）或500ml（常量法）硅玻璃或硼玻璃制成的硬质茄形烧瓶。常量法（含氮量25-30mg)第一法半微量法（含氮量1.0-2.0mg)第二法,2.消解剂硫酸中加入硫酸钾（或无水硫酸钠）提高硫酸沸点，以提高消解温度加入催化剂加快消解速度，以缩短消解时间。常用催化剂：汞或汞盐、硒粉、铜盐、二氧化锰等硫酸铜最常用（价廉、无挥发性、毒性低）,难以分解的药物辅助氧化剂30%过氧化氢和高氯酸不能在高温时加入，应待消解液放冷后加入，并再次加热继续消解,3.应用范围：含有氨基或酰胺结构的药物含量偶氮或肼结构的含氮药物，在消解过程易生成氮气而损失，在消解前加入锌粉还原杂环中的氮不易断键而难以消解，可用氢碘酸或红磷还原为氢化杂环后在消解含氮量超过10%的样品，在消解液中加入少量多碳化合物，如蔗糖、淀粉等还原剂，以利于氮转变为氨。,（二）干法破坏,适用于含卤素、硫、磷等有机药物分析的前处理，亦用于某些药物中硒和砷盐的检查。高温炽灼法氧瓶燃烧法,1.高温炽灼法将含待测元素（卤素、磷、砷盐)的有机药物经高温灼烧灰化，使有机结构分解而待测元素转化为无机元素或可溶性无机盐。常加入无水碳酸钠、硝酸镁、氢氧化钙、氧化锌等辅助灰化,2.氧瓶燃烧法oxygenflaskcombustionmethod,适用于含卤素或硫、磷等元素的有机药物的鉴别、限量检查或含量测定亦可用于药物中杂质硒的检查,原理将有机药物放入充满氧气的密闭燃烧瓶中充分燃烧，有机结构彻底分解为二氧化碳和水，待测元素转化为氧化物（或无氧酸），被吸收于适当的吸收液中，然后根据欲测物质的性质，采用适宜的方法进行分析,1.仪器装置燃烧瓶为500、1000或2000ml磨口、厚壁、硬质玻璃锥型瓶；瓶塞空心，底部熔封铂丝一根，下端呈螺旋状或网状,2.吸收液的选择,吸收液的作用将样品经燃烧分解所产生的各种价态的卤素、硫、磷、硒等，定量地吸收并转变为一定的便于测定的价态（单一价态）,吸收液的选择,氟水氯水-NaOH溶液溴水-NaOH-二氧化硫饱和溶液碘直接法水-NaOH-二氧化硫饱和溶液间接法水-NaOH溶液硫浓H2O2溶液与水磷水硒硝酸溶液（130）,3.样品制备固体样品（研细）无灰滤纸液体样品纸袋,（4）操作方法,燃烧瓶燃烧前的准备用洗液洗净后，按各药品项下的规定加入吸收液，将瓶口用水湿润，小心急速地通入氧气1min，立即用表面皿覆盖瓶口。样品的准备取样品适量，精密称定后按规定方法包裹，固定于铂丝下端的网内或螺旋处。,样品的燃烧点燃包有供试品的滤纸尾部，迅速放入燃烧瓶中，按紧瓶塞，加水少量封闭瓶口，俟燃烧完毕（应无黑色碎片），充分振摇，使生成的烟雾完全吸入吸收液中，放置15min，用水少量冲洗瓶塞及铂丝，合并洗液及吸收液，同法另做空白试验。然后按各药品项下规定的方法进行鉴别、检查或含量测定。,根据被燃烧分解的样品量选用适宜大小的燃烧瓶。,（5）注意事项,Ch.P（2019）规定的燃烧瓶体积为500、1000或2000ml三种，采用常量或半微量分析,测定含氟有机药物时，用石英制燃烧瓶,铂丝燃烧时起催化作用,应同时做空白试验,燃烧时要注意防爆,燃烧要完全,燃烧产生的烟雾完全被吸收,碘苯酯,例1.氧瓶燃烧法中的装置有A.磨口硬质玻璃锥形瓶B.磨口软质玻璃锥形瓶C.铂丝D.铁丝E.铝丝,例2选择氧瓶燃烧法所必备的实验物品A.磨口硬质玻璃锥形瓶B.铂丝C.普通滤纸D.氢气E.无灰滤纸,例3氧瓶燃烧法测定含氯有机药物时所用的吸收液多数为A.H2O2溶液B.H2O2NaOH溶液C.NaOH溶液D硫酸肼饱和液E.NaOH硫酸肼饱和液,例4.氧瓶燃烧法可用于A.含卤素有机药物的含量测定B.醚类药物的含量测定C.检查甾体激素类药物中的氟D.检查甾体激素类药物中的硒E.芳酸类药物的含量测定,本章要求,掌握凯氏定氮法及氧瓶燃烧法的原理及所加试剂、操作要点熟悉各种定量分析样品的前处理方法的适用范围,第二节定量分析方法特点,测定药物的含量是评价药品质量优劣的重要手段容量分析法光谱法色谱法,一.容量分析法（一）容量分析法的特点回收率：99.7100.3相对误差0.2操作简便、快速、所用仪器普通易得专属性较差，用于含量较高的试样化学原料药的含量测定,（二）容量分析法的有关计算1.滴定度：指每1ml规定浓度的滴定液所相当的被测药物的质量。2.滴定度（T）的计算：在容量分析中，被测药物（A）与滴定液（B）之间都按一定的摩尔比进行反应的aA+bB产物ab,aA+bB产物abT=(a/b)mM(mgmL-1)a被测药物的摩尔数b滴定液摩尔数m滴定液的摩尔浓度M被测药物的毫摩尔质量,在实际工作中，所配制的滴定液的摩尔浓度与药典中规定的摩尔浓度不一定恰好符合，即TTFF实际摩尔浓度/规定的摩尔浓度,（3）含量计算直接滴定法：含量（)=(VT/W)100%(VTF/W)100%W供试品质量；mg；V消耗的滴定液体积，ml；T药典规定的滴定度，mg/ml；F校正因数,（2）间接滴定法1）生成物滴定法含量（)=(VT/W)100%=(VTF/W)100%,例葡萄糖酸锑钠的测定Ch.P（2019）取本品约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水100ml、盐酸15ml与碘化钾试液10ml，密塞、振摇后，在暗处静置10min，用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每lml的硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)相当于6.088mg的Sb。,T=ma/bM=0.11/2121.76=6.088(mg/ml),2）剩余量滴定法（回滴定法）此法是在被测药物中加入定量过量的滴定液A，反应完全后，再用另一滴定液B回滴反应中剩余的滴定液。本法常需空白试验校正,含量（%）=（V0B-VSB）FBTA/W100%TA滴定液对被测物的滴定度，mg/ml；V0B空白消耗回滴定液体积，mL；VSB回滴定液体积，mL；FB回滴定液的浓度校正因数；W供试品质量；mg；,司可巴比妥钠ChP（2000）：取本品约0.1g，精密称定，置250ml碘瓶中，加水10m1，振摇使溶解，精密加溴滴定液（0.05mol/L）25ml，再加盐酸5m1，立即密塞并振摇1min，在暗处静置15min后，注意微开瓶塞，加碘化钾试液10m1，立即密塞，摇匀后，用硫代硫酸钠滴定液（0.1mol/L）滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定结果用空白试验校正。每1ml溴滴定液（0.05mo1/L）相当于13.01mg的C12H17N2NaO3。,已知：司可巴比妥钠的摩尔质量M=260.23，司可巴比妥钠与溴反应的摩尔比为1：1；供试品的量W=0.1022g，硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)浓度校正因数F=1.038；供试品滴定消耗硫代硫酸钠滴定液15.73ml，空白试验消耗硫代硫酸钠滴定液23.21ml。,T=ma/bM=0.051/1260.23=13.01(mg/ml)含量（）（V0-VS）FBTA/W100%=(23.21-15.73)1.03813.011000/0.1022100%=98.8%,二、光谱分析法（一）紫外-可见分光光度法200nm760nm1.朗伯-比耳定律A=ECL,2.特点灵敏度高，可达10-4gml-110-7gml-1准确度高，相对误差为25；仪器价廉，操作简单；应用广泛,RSD一般不大于1回收率一般应在98102线性A一般在0.30.7浓度点n5r应大于0.999截距应近于零,3.对溶剂的要求溶剂置1cm石英比色池中，以空气为空白测定吸光度，溶剂和吸收池的吸光度220240nm不得超过0.40；241250nm不得超过0.20；251300nm不得超过0.10；在300nm以上不得超过0.05,4.测定法测定时，应以配制供试品溶液的同批溶剂为空白对照供试品溶液的吸光度，应减去空白读数吸收度读数在0.30.7之间的误差较小。,（1）对照品比较法供试品溶液A供对照品溶液10010A对,C供（A供/A对）C对原料药含量（）（C供D/W）100%A供E1%1cmlC供A对E1%1cmlC对D稀释倍数；W供试品取样量,称取苯巴比妥0.1585克，加pH9.6缓冲溶液稀释至100ml，精密量取5ml,同法稀释至200ml，摇匀，滤过，再取续滤液25.0ml稀释至100.0ml作为供试品溶液；另精密量取苯巴比妥对照品适量，同法稀释制成10.1g/ml的溶液作为对照品溶液。取上述两种溶液，照分光光度法，在240nm的波长处分别测得供试品溶液和对照品溶液的吸收度分别为0.427和0.438，试计算苯巴比妥的含量。,固体制剂标示量(%)=(C供DW平/WB)100%W平为单位制剂的平均重量（或装量）B为制剂的标示量,液体制剂标示量(%)=(C供DV平/VB)100%V平为单位制剂的标示装量V为供试品的量取体积B为制剂的标示量,（2）吸收系数法供试品溶液：A已知E1%1cm计算含量C供A供/（100（E1%1cm）供）,维生素B2含量测定取本品约75mg，精密称定，置烧杯中，加冰醋酸1ml与水75ml，加热溶解后，加水稀释，放冷，移置500ml量瓶中，再加水稀释至刻度，摇匀；精密量取10ml，置100ml量瓶中，加1.4%醋酸钠溶液7ml，并用水稀释至刻度，摇匀，照分光光度法在444nm的波长处测定吸收度，按维生素B2的吸收系数E1%1cm为323计算，求含量？A=0.4923W=76.28mg,（3）计算分光光度法双波长分光光度法解线性方程组法三波长法导数光谱法,（4）比色法供试品本身在紫外-可见光区没有强吸收，或在紫外光区虽有吸收，但为了避免干扰或提高灵敏度，加入适当的显色剂后进行测定的方法。,取标示量为0.3g/片的干酵母片20片，重量为10.0120g，研细，精密称取其片粉0.5507g，经消化蒸馏，用2%硼酸溶液50ml吸收，加甲基红-溴甲酚绿指示剂，用硫酸滴定液（0.05145mol/L)滴定至终点，消耗19.02ml,空白消耗该溶液0.08ml,求干酵母片蛋白质的标示量%。1ml硫酸（0.05mol/L）相当于1.401mg的氮.蛋白质的含氮量为16%,本课要求,掌握滴定度的定义掌握容量分析法和光谱分析法的计算熟悉容量分析法和光谱分析法的特点,三、色谱分析法色谱分析法是一种分离分析方法是分析混合物的最有力手段特点高灵敏度:10-12gml-110-15gml-1高效能、高速度应用广泛,1.对仪器的一般要求以C18为固定相的反相色谱系统，流动相为甲醇-水，间或加有乙腈、缓冲液、反离子物质等,中国药典正文规定的条件除固定相种类、流动相组成、检测器类型不得任意改动外，其他条件均可适当改变，以适应色谱系统并达到系统适应性试验的要求。,2.系统适应性试验色谱柱的理论板数（n)n=5.54(tR/Wh/2)2(2)分离度:R=2(tR2-tR1)/(W1+W2)R应大于1.5,(3)重复性：同一样进5次相对偏差2.0%(4)T=W0.05h/2d1T=0.951.05,3.测定法（1）内标法加校正因子测定供试品中主成分含量计算校正因子测定含量,内标法将一个已知含量，样品中不含有的纯物质，加至待测样品溶液中，以此纯物质的量为标竿，对比测定待测组分的含量的方法谓内标法。优点：定量结果与进样量无关（不超载条件下）。,对内标物的要求：内标物是原样品中不含有的组分内标物的保留时间应与待测成分相近，分离度R1.5。内标物必须是纯度合乎要求的纯物质。,校正因子的计算精密称（量）取药物对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子（f）测定用的含内标的对照品溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积（或峰高）计算校正因子：校正因子（f）（As/Cs）内标/（Ai/Ci）对照,含量测定含量（C供）fA供/（As/Cs）内标配供试品溶液和上述内标溶液，同法配成含内标的供试品溶液，取一定量注入仪器，记录色谱图，测量供试品中待测成分和内标物质的峰面积或峰高（A或h）,地塞米松的HPLC法测定：取本品精密称定，质量为0.0697g，置50ml量瓶中，加30ml乙醇溶解，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置25ml量瓶中，加0.2mg/ml甲基睾丸素液5.0ml，用流动相稀释至刻度，摇匀，取20l进样，测得地塞米松的峰面积为1313，甲基睾丸素的峰面积为1032，质量校正因子为1.05，求其含量。,地塞米松%=（fAX）/ASCsD/W100%=（1.051313）/10320.2250/69.7100%=96.8%,(2)外标法测定供试品中主成分含量外标法是以供试品的对照品或标准品作对照物质，相比较以求得供试品的含量。,方法精密称（量）取对照品和供试品，分别配制成对照品溶液（C对）和供试品溶液（C供），分别精密量取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品的峰面积（A对）和供试品待测成分的峰面积（A供）（或峰高），按下式计算含量：C供（A供/A对）C对,（二）气相色谱法标准溶液加入法精密称（量）取待测成分对照品适量，配制成适当浓度的对照品溶液，取一定量，精密加入到供试品溶液中，根据外标法