（动物遗传育种与繁殖专业论文）中国猕猴属进化分析及物种特异性遗传标记的研究.pdf

独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成采，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做必贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 论文储亲笔徘绷川吼卅芗7 _ 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学鸯关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，帮学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 ， 不保密，本论文属于不保密。 v 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名： 微删 隰洲参力。 嘏刻株镒毪专奇 嗍匕。z 绀 镬建袁髂土季壤士学霞论文 中文摘要 对野外调查和保护执法工作中获德的猕猴属动物疑似样品进行物种鉴定时， 往往是恧对污染、腐败、残缺不全( 如毛发、骨骼、蹄甲、脏器、肌肉纤维等) 或极微量的检材，难以检查辨认。建立对我国猕猴属物种( 特别是微量组织) 进行 分子检测的灵敏、精确、可靠的方法，解决我国猕猴属5 个物种的分子生物学鉴 定技术问题是十分有意义的。 试验一：参照人类和猕猴c y t b 基因两端序列设计合成引物对c a 、c s ，对猕 猴属2 个物种熊猴和豚尾猴的c y t b 基因进行扩增，并将扩增片断测序，测得c y t b 基因全长1 1 4 0 b p 的片断序列( 其中豚尾猴的基因登陆号是：剐2 0 4 9 7 5 ) 。利用 d n a s t a r 软件进行比对，构建猕猴属系统进化树，进行遗传进化分析，并为其物 种的分子鉴定奠定基础。 试验- - ：从g e n b a n k 下载的7 种常见的物种、猕猴属5 个物种及同科相近属、 同目相近科l o 个物种的c y t b 基因序列，利用d n a s t a r 软件进行种间序列比对，寻 找猕猴属5 个物种的保守突变位点，然后再根据引物设计有关原则，设计合成对 该属物秭的一对特异性引物：溉、箍s 。用该对弓| 物对从l 簖 l 近源物种和7 种常见 物种的肌肉、毛发或粪便中提取的总d n a 或m t d n a 的细胞色素b 段进行p c r 扩增，并 对其特异性、敏感性和重复性进行了验证。结果表明，引物姚、m s 对我国猕猴属 物种d n a 特异，即在p c r 反应时，该引物只能特异地扩增猕猴属物种d n a ，而对一 些常见物种及近源物种的d n a 不能扩增，经验证检测正确率1 0 0 9 6 ，表明了本方法 稳定、灵敏、可靠。从而达到对猕猴属微量组织鉴定的目的，建立了猕猴属5 个 物种的分子生物学查验和实验室确证方法。为野外调查中获得的猕猴属动物的残 余物及其部分微量样品的查验提供了便捷、可靠的检测手段。 比对猕猴属5 个物种c y t b 基西痔列，寻找各物种的保守突变点，并根据这些 突变，利用p r i m e r5 o 和o l i g o6 o 软件设计各物种的特异引物，然后对其特异 性、敏感性和重复性进行了验证，并对p c r 条件进行了优化。验证结果表明：各 猕猴属物种的特异引物对相应物种的d n a 能特异p c r 扩增，即在p c r 反应时，引物 只能分别特异地扩增相应物种的d n a n 的片断，而对猕猴属其他物种的d n a 不能扩 增，经验证检测正确率1 0 。，表明本方法稳定、灵敏、可靠。从而达到对猕猴属 5 福建农林大学磺毋学位论文 5 个物种微量组织鉴定的因的，建立了猕猴瘸5 个物种分子生物学查验和实验室检 验的方法。为野外调查中获得的猕猴属动物的残余物及其部分微量样品的查验提 供了方便、可靠的检测手段。 关键词：猕猴属；物种鉴定：c y t b 基因；特异性p c r 6 褥建豢橡走学霞尝学叠论文 a b s t r a c t w h e ni d e n t i f y i n gt h ed o u b t f u ls a m p l e so fm a c a q u e so b t a i n e di nw i l d s u r v e ya n dp r o t e c t i n gw o r k ，i tw a sd i f f i c u l tt oi d e n t i f yt h e s ew h i c hw e r e u s u a li yp o ll u t e d ，p u t r e s c e n t ，p a r ta n dd e n i e r ( f o re x a m p l e ：h a i r ，b o n e s ， n a i l ，v i s c e r a , m u s c l ef i b r ea n ds oo n ) i tw a sv e r ys i g n i f i c a t i v et of o u n d as e n s i t i v e ，a c c u r a t e ，d e p e n d a b l em e t h o dw h i c hc a ni d e n t i f y5m a c a q u e s t e s t1 ：a c c o r d i n gt ob o t hs i d es e q u e n c e so fc y t bg e n eo fh u m a na n d m a c a c am u l a t t a ，w ed e s i g n e da n dc o m p o s eap a i ro fp r i m e r s ：c a 、c s ，a n d a m p li f i e dc y t bg e n eo ft w om a c a q u e s ( m a c a c an e m e s t r i n aa n dm a c a c a a s s a m e n s i s ) 。11 4 0b po fc y t bg e n e sw a so b t a i n e db yn u c l e o t i d es e q u e n c i n g ( g e n b a n ks u b m is sio nn u m b e ro fm a c a c an e m e s t r in a ：e u 2 0 4 9 7 5 ) u s e dd n a s t a r s o f t w a r et oc o m p a r et h e s es e q u e n c e s ，s e t e du pp h y l o g e n e t i ct r e ea n d c a r r i e do u t p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s t h i sc o n t r i b u t e st om o l e c u l e i d e n c i f i c a t i o no ft h e s em a c a q u e s t e s t2 ：f i r s t ，t h eg e n es e q u e n c e so fc y t bd o w n l o a d e df r o mt h eg e n b a n k ， w h i c hc a m ef r o ms e v e nc o m m o ns p e c i e s ，f i v em a c a q u e sa n dt e ns i bs p e c i e s ， w e r ea li n e db yt h ed n a s t a r s o f t w a r e ，a n dl o o k e df o rc o n s e r v a t i v e m u t a t i o n a ls i t eo ff i v em a c a q u e s t h e na c c o r d i n gt ot h eb a s i cp r i n c i p l e o fp r i m e rd e s i g n i n g ，d e s i g n e da n ds y n t h e s i z e dap a i ro fs p e c i f i cm a c a q u e p r i m e r s ：m sa n dm a t h et o t a ld n aw e r ee x t r a c t e df r o mm u s c l e s ，h a i r sa n d f e c e so ft e nn e a ro r i g i n a ls p e c i e sa n ds e v e nc o l l m l o ns p e c i e s ，t h e nc y t b w e r ea m p l i f i e dt oe x a m i n et h es p e c i f i c i t y ，s e n s i t i v i t ya n dr e p e a t a b i i i t y o f m sa n d 瓢t h er e s u l ts h o w e dt h a tm aa n dm sp a r t i c u l a r l ya m p l i f i e dt h e d n ao ff i v em a c a q u e s ，w h il ed i d n ta m p lif yt h ec o m m o ns p e c i e sa n dn e a r o r i g i n a ls p e c i e s ，a n dt h er a t ei s1 0 0 i ts h o w e dt h i sm e t h o di ss t a b l e ， s e n s i t i v e ，a n dr e l i a b l e s ot h a to b t a i n e dam e t h o dw i t hw h i c ht h em a c a q u e s c a nb ei d e n t i f i e d ，a n de s t a b li s h e dam o l e c u l e b i o l o g ym e t h o do f i d e n t i f y i n gf i v em a c a q u e si nt h el a b i tw a sac o n v e n i e n t ，r e li a b l em e t h o d 7 福建袁俅大学嘎学位论文 f o ri d e n t i f i c a t 主o no fp a r t i a la n dl i t t l et h em a c a q u es a m p l e s l o o k e df o rc o n s e r v a t i v em u t a t i o ns i t eb ya l i g n i n gc y t bg e n es e q u e n c e s o ff i v em a c a q u e s a c c o r d i n gt ot h i sm u t a t i o ns i t e ，u s i n gt h ep r i m e r5 0 a n do l i g o6 0s o f t w a r e ，d e s i g n e ds p e c i f i cp r i m e r so fe a c hm a c a q u e ，a n d e x a m i n e dt h e i rs p e c i f i c i t y ，s e n s i t i v i t ya n dr e p e a t a b i l i t yb yp c r t h e o p t i m i z e dt h ec o n d i t i o n so fp c r 。t h er e s u l ts h o w e dt h a te a c hm a c a q u e s s p e c i f i cp r i m e r sc a na m p l i f i e dt h ed n ao fc o r r e s p o n d i n gm a c a q u e i no t h e r w o r d s ，t h ep r i m e ri sv e r yp a r t i c u l a r ，a n di td i d n ta m p l i f yt h eo t h e r s p e c i e se x c e p tc o r r e s p o n d i n gm a c a q u e s ，a n dt h er a t ew a s1 0 0 t h em e t h o d w a ss t a b l e ，s e n s i t i v ea n dr e l i a b l e ，a n dc a ni n d e n t i f yt h el i t t l es a m p l e o fe a c hc o r r e s p o n d i n gm a c a q u e s s oe s t a b li s h e dam o l e c u l eb i o l o g ym e t h o d o fi d e n t i f y i n ge a c hm a c a q u ei nt h el a b ，a n di tp r o v i d e dac o n v e n i e n t ， r e l i a b l em e t h o dt oi d e n t i f yt h er e m a i n sa n dp a r t i a l m a c a q u es a m p l e s o b t a i n e df r o mw i l di n v e s t i g a t e s k e yw o r d s ：m a c a c a ；s p e c i e si d e n t i f i c a t i o n ：c y t bg e n e ：s p e c i a lp c r 3 福建囊林太学嘎士学位论文 1 前言 1 1 我国猕猴属物种保护的现状及意义 1 1 1 猕猴属的分类 猕猴属物种在动物分类上属于哺乳动物纲灵长目人猿亚目狭鼻下目猴总科 猴科猕猴亚科。在全国王7 种灵长类动物中，猕猴属占6 种，分别是：猕猴( 蘩a c a c a m u l a t t a ) 、豚尾猴( m a c a c an e m e s t r i n a ) 、熊猴( m a c a c aa s s a m e n s i s ) 、短尾猴 ( m a c a c aa r c t i o d e s ) 、藏酋猴( m a c a c at h i b e t a n a ) 、台湾猴( m a c a c ac y c l o p i s ) ， 2 种国家一级保护动物，4 种因家二级保护动物，其中台湾猴在我国仅分布在我国 台湾省。 1 1 2 保护的现状 近几十年来，我国野生猕猴属动物被大量非法捕杀，种群数量急剧减少。猴 的非法捕杀的主要是受药材市场和餐饮业市场的驱使，传统中医认为猴骨能治疗 风湿病，猴肉是强壮滋补药，猴枣( 胆结石) 是珍贵药材，具清热、镇惊、化痰等 功效，猴脑、猴掌、都可为药；中国藏医学认为，将猴詈烧炭研细，可治自喉、 炭疽，亦可催产：猴胆汁可治食物中毒及药物中毒，心脏晾干研细，可治妇科“娘 查 、”病；头盖骨治肠道疾病。在我阑部分地区自古就有吃猴肉、猴脑的传统陋 习，目前这种陋习在西藏、云南、广东、广西仍然存在。并且在中越边界，仍然 有大量的猴类被j 法的出入境进行贸易h 1 。 猴的捕猎自史以来就存在，但大量的捕杀及对野生种群的破坏则自1 9 1 9 年后 较为突出的。据中国太平洋环境组织2 0 0 4 年的孛国灵长类贸易报告中统计指 出：猴类的贸易种类主要有6 种：短尾猴、熊猴、猕猴、豚尾猴、黑叶猴、懒猴， 前罂种戈猕猴属物种，猕猴属动物是猴类非法走私贸易的主要对象。早在1 9 5 9 年，广西有关部门便捕捉了1 6 2 6 3 只活猴运到前苏联：1 9 6 4 1 9 7 8 年，河池地区外 贸共收魏活猕猴1 0 2 3 3 只，全区年捕杀猕猴不少于4 0 0 0 只：1 9 7 4 - 1 9 8 0 年，广西每 年平均收购活猴达2 0 0 0 0 多只；天等县大量收购生产所谓“加味桂龙膏 ，每年单 销往东j 艺地区便达唾万多包。据报道珏1 ，仅在西藏昌都地区就曾收购过2 0 9 公斤的 猕猴骨胳作为药用。近年来，猴骨的收购数量仍较大，致使野生猕猴属数量锐减， 9 福建囊拣太季硕学位论文 中国大部分猴嚣药材由非法药材公司收购。 目前，我国6 种猕猴属物种的种群数量都已经十分稀少。据中国太平洋环境 组织统计。1 9 9 8 年猕猴在中国约翥2 5 4 0 0 0 h ，到2 0 0 2 年估计数只有约? 7 9 1 3 灵， 短短四年数量减少了2 3 ：1 9 9 8 年藏酋猴约有1 0 万只，至u 2 0 0 2 年只有1 7 0 0 0 只左右， 减少了9 溉，几乎所有灵长类动物都未遂脱被捕杀以食用或药用的悲惨命运，造 成包括我国猕猴属物种在内的灵长类动物数量急剧下降，截至2 0 0 2 年中国猕猴属 物种数量估算见表1 王2 疆】。 表1 。1 22 0 0 2 年中国猕猴属猴类数量估算统计表 t a b l e l 1 2t h eq u a n t i t ys t a t i s t i c so fc h i n am a c a q u e 注：c i t e s 指濒危野生动植物种圜际贸易公约 1 1 3 保护的意义 物种是人类赖以生存和发展的资源，某些物荦中在今天不能被利用或者危害人 类的生活，但在未来很可能成为人类最重要的物质基础。因此，世界各国对野生 动物的管理不断提出越来越高的要求。例如濒危野生动植物_ 季中国际贸易公约 等多边协议的签定，加大了野生动物国际走私案件的查处力度。中国野生动物 保护法的颁布实施和相应的地方法规为打击非法撼猎和贩卖、运输等提供法律 依据。但是，野生动物产品走私的利润极高，仅次于毒品和武器走私。高强度的 猎捕使很多物种濒临灭绝，而越是濒危的物种，其价格也越高，反过来又促进了 非法猎捕和国际间非法贸易。因此，中国和世界各国都面临着野生动物及其产品 走私和非法捕猎的强大压力，执法过程中，从这些生物检材来识别物种是十分重 要的环节h 1 。 莉漏鉴定是法庭生物学鉴定重要课题之一，睫羞自然保护力度的加强，越来 i 0 福建农称太学曩士学位论文 越多的刑事案件和民事案件涉及了猕猴属类物种的鉴别。由于猴类的捕杀、贸易 都集中在少数人和地区，这些案件因为没有得到科学的物证鉴定结论，给社会造 成的损失难以计算。由于受检猴类物种的样品多种多样、质量备有不同，对种属 鉴定的要求也不断提高，因此，对于技术的要求就越来越高。靠某些传统方法检 测难以完成鹿类的种属鉴定，尤其是骨骼、皮张、被琵、肌肉、内脏等组织。 在野生动物生态学研究中，经常要进行野外生态调查。野外工作常常发现进 食遗迹，粪便或者获得胃容物。在这些材料中骨骼、肌肉、毛发等最常见的受检 样品。鉴定这些样品的来源物种只有依靠科学、有效的技术。但目前国际上流行 的方法除了毛发形态学检验以外，还没有十分有效的方法，野外生态调查工作一 直受着这方面一定程度的制约。 因此，设计和建立一套针对猕猴属动物各种材料的物种鉴定方法，对打击猕 猴属物种的非法捕杀和贸易、广泛开展猕猴属物种的野外生态调查、有效保护我 国猕猴属物种的种群具有重大的实践意义，同时也具有广阔的应用前景。 薹。2 物种或种群鉴定方法的研究进震 在野生动物物种或种群鉴定中，传统的鉴定方法是形态鉴定法。它主要是通 过感官根据检材的外部形态特征来鉴定物种或种群。此法要求检材完整，并要求 鉴定人员具备丰富的经验，尤其是面对污染、腐败、残缺不全( 如毛发、骨骼、 蹄甲、脏器、肌肉纤维等) 或极微量的检材，传统的形态鉴定就更显得无能为力 了。此外，在鉴定中还有以蛋白质为研究对象的分析，但是由于蛋白质在某些理 化因素，如高温、紫外线照射、强酸强碱作用，以及细菌等生物因素的破坏下易 失去活性。因此，该方法对送检材料的要求也较高，从而在一定程度上限制它们 的应用翻。 d n a 分子标记技术，也称d n a 分子诊断技术，是指通过直接分析遗传物质的 多态性来诊断生物内在基因排布规律及其外在性状表现规律的技术。d n a 分子的 信息量大，且不受外界因素和动物体发育阶段及器官组织差异的影响，即每一个 体的任一细胞都含有相同的遗传信息，这就使其在物种或种群鉴定方面具备了准 确性高、重现性好、敏感性强等特点。 福建农棕文学曩士学位论文 1 2 1 对各种微量样品的鉴定 野生动物特别是濒危珍稀野生动物，数量稀少，在野外生态调查和执法鉴定 中检材常常面临着毛发、骨骼、粪便等微量样品。 目前从粪便中提取d n a 的方法做了大量研究，并成功用于样品的d n a 检测。魏 辅文等口1 报道：通过对粪便d n a 的提取可以检测到线粒体d n a ( m t d n a ) 、微卫星位 点、小卫星位点、性别标记序列。f p a l o m a r e s 等h 1 从猞猁的8 7 个粪便样品提取 物中，成功扩增出c y t b 基因和d - - l o o p 区1 3 0 1 6 1 b p 的片断。对于珍稀的濒危动 物而言，传统的损伤性取样会对该物种造成极大的伤害。野生动物大多栖息于高 山密林中，非常警觉，普通的非损伤性取样，如采集血液、少量活体组织等也十 分困难。与其他材料相比，粪便样品更易收集旧。通过粪便中d n a 的成功提取与 分析，避免了取样对珍稀野生动物造成的伤害，也使野外生态调查的样品的范围 大大拓宽。 毛发是较易获得的检测材料，但毛发d n a 的提取较其它组织材料相对困难。 从毛干中能提取到足够用于p c r 检测的m t d n a ，但是不能有效提取到核d n a 。而如果 毛发根部带有毛囊，从毛囊中就能够提取到足够的核d n a ，并能够用于微卫星检 测等。华育平等1 从毛干中成功提取出m t d n a ，并扩增出部分c y t b 基因，对虎物 种进行了鉴定研究，并报道说：若选材、用量及提取方法不当，均可导致d n a 提 取或p c r 扩增的失败，因毛发中含有大量色素、重金属等杂质，可对p c i 魄抑制作 用，并通过实验证明g 选用白色或灰白色的毛作为实验材料效果较好；用针毛还 是绒毛对结果没有显著影响；一次提取所需毛的用量控制在0 5 - 一0 7m g 之间， 提取效果最佳。另外，不同动物由于毛的皮质和髓质相对比例不同，所需毛量应 视具体情况而定。徐艳春等口3 就利用毛囊提取的基因组d n a ，成功扩增出哺乳动 物y 染色体上的s r y 基因，用于性别鉴定研究。张于光等聃1 从毛囊中提取d n a ，并 用于微卫星的检测。 另外，尿液、血迹等d n a 的成功提取，均有见报道。 1 2 2m t d n a 线粒体d n a ( m t d n a ) 是存在于细胞质线粒体中的核外遗传物质，是一个长度为 1 5 - 2 0k b 的共价闭合环状双链d n a ，脊椎动物的m t d n a 编码2 2 种t r n a ，2 种r r n a 和编 1 2 福建农俅太謦嘎士学位论文 码包括用于电子传递及氧化磷酸化酶蛋白的1 3 种m r n a ( 如图1 2 2 ) 潮。 图1 2 2 灵长类动物m t d n a 基因结构示意图 f ig 。1 2 2t h es t r u c t u r em a po fm t d n ao fp r i m a t e s 近年来，m t d n a 被广泛的作为遗传标记的霸的片段应用于物种或种群鉴定的 研究，这主要是因为m t d n a 有很多适合于物种或种群鉴定研究的特性0 “】： ( 1 ) m t d n a 的进化速度较快，平均比核d n a 快1 0 - 2 0 倍潮，所以积累的突变较核 d n a 多，有利于寻找合适的标记： ( 2 ) m t d n a 存在于细胞器线粒体内，受着细胞膜和线粒体外膜的双重保护，即 使组织发生角化、死亡、甚至降解，m t d n a 仍然可以保存下来； ( 3 ) m t d n a 基因组小而呈共价闭合的环状结构，比链状的核d n a 更加稳定、不 易降解。 ( 4 ) 线粒体是细胞的动力工厂，在活细胞中数量众多，所以每个细胞中m t d n a 的拷贝数也十分可观( 每个活细胞中可含有2 0 0 - 1 7 0 0 个拷贝) 。在长期受自然界各 种因素影响的情况下，即使核d n a 被降解殆尽，m t d n a 仍然保留大量的拷贝，这使 很多微量生物材料( 如毛发、粪便、屎液、唾液、皮屑、嚣骼、斑瘦、刮痕等) 皆可利用，且重复性好。这对濒危物种或种群的识别以及无法辨认检材的检测极 为便利，是其他任何标记都无法比拟的。 1 3 福建表林土学磺学位论文 ( 5 ) m t d n a 是单倍体，其基因排列紧密，没有或很少含有间隔序列，所有基因 无内含子，易于测序与分析，使工作量相对减少。 ( 6 ) m t d n a 基因组比核基因组小而简单，且无重复序列，无重组，因两在分子 系统进化的研究中特别有用，甚至有些学者认为几乎没有一种其它的分子途径能 与m t d n a 分析途径媲美。 ( 7 ) m t d n a 无组织特异性，同一个体的任何部位的细胞中的m t d n a 是一致的， 包括肌肉、皮肤、骨骼、鼍发、粪便等。 ( 8 ) m t d n a 由于存在于细胞质中，遵守严格的母性遗传。这便于进行物种或群 体的分析，一个个体的基因信息就能代表个物种或群体，而珍惜野生动物的数 量十分稀少，往往在采样上有困难，更加体现出m t d n a 在野生动物遗传研究中的 应用价值。 ( 9 ) 目前很多物釉或种群m t d n a 中的部分基因的部分序列或全序列都已经在 g e n b a n k 等数据库或期刊上公布，十分有利子利用这些背景数据设计一些物种或 瓣群的遗传标记。 由予以上优点，使得m t d n a 十分适合于作为物种或种群的识别标记“。在 m d n a 中各个基因的进化速率也是不同的，因而用予动物不网分类级别的研究。 细胞色素b ( c y t b ) 基因、1 2 s r r n a 基因和d - l o o p 区是m t d n a 中最常用的几个遗 传标记基因。其中c y t b 、1 2 s r r n a 基因和1 6 s r r n a 基因因为是功能基因，需要承受 选择压力，序列进化速率适中，积累的遗传变异较d - l o o p 区少，又远多于核d n a ， 有种蠹变异小，种间差异大的特点，在荤中及种以上的系统进化研究中应用的十分 广泛，是研究物种间差异的首选标记基因。而d - l o o p 区序列国于进化速度更快， 是m t d n a 其健序列的王o 倍，其3 端含串连重复序列，特别适予种内亚种水平、种 群水平甚至个体水平的系统进化及异质性鉴定研究，而不能作为种以上阶元分类 的标记秘羽。 1 2 。3p c r - r f l p r f l p 是通过对核酸的限制性酶切来考察d n a 碱基序列的差别，其操作的复杂 秘耗时耗力，让研究者望两生畏。p c r 技术产生后，p c r - - r f l p 应运露生，以方便 快捷，多态性良好受野生动物鉴定研究者的青睐。方法是选取所研究若干物种或 种群特定基困中掰端高度保守而中闻为高度突变区翡同源片断，根据蹲端保守区 1 4 锾建袁髂文学硬考学燕论文 设计引物并扩增( 大多利用m t d n a 基因，特别是c y t b 基因) ，然后根据对各个序列 的酶切分析来确定内切酶进行消化，以产物的多态性作为鉴定的依据。 怼r r f 渖也曾被广泛用予物种或种群的鉴定研究。m e y e rr 等n 3 1 在不知道 c y t b 基因序列的情况下，利用p c r - r f l p 方法建立了对番肠等爽制最中的猪、牛、 鸡等九种可能成分进行鉴定的方案。吴平等n 帕分别用r f l p 和p c r - r f l p 方法对东 北虎和华南虎的m t d n a 中的控制区进行了多态性研究，建立了对他们的后代进行 鉴定的技术方案。j a g r i c n 鳓经过p c r 扩增，然后用三个内切酶成功对六种金枪 鱼进行了鉴定。孙红荚秘翻眈对合漓绒螯蟹和中华绒螯两亚种的1 6 s r d n a 序列，发 现两个碱基的固定突变，著据此利用p c r - r f l p 技术成功对他们遴行了鉴定。周 建峰等n 刀用4 种限制性内切酶酶切鲤鱼3 个亚神的m t d n a 的n d 5 6 区段，得到多 态性，找到诊断性限制性酶切位点。可利用其作为鉴定3 个弧秘的遗传标记和遗 传育种的辅助手段。田焱等n 阳利用两种限制性内切酶消化六个鲫鱼品系的c y t b 基因得到多态性。冯强等n 钉采用一对通用引物扩增人及1 5 种常见动物的m t d n a 的c y t b 基因，产物经内切酶a 1 ui 酶切，成功把入和它们区分，建立一种较好 的法医学种属鉴定方法。 p c r - r f l p 方法具有快速、可靠性嵩的特点，但r f l p 方法中需要有一个对内 切酶和酶切位点的大i 量试验选择过程，并且p c r - r f l p 方法因结果的判定是建立 在对d n a 酶切图谱的差异性进行比较分析的基础上，需要有对每个物种的所有 种群都进行大样本的抽样调查、建立标准图谱的大量的前期工作。且对于进化较 晚的，亲缘关系很近的物种，由于物种碱基序列差异很小，所以很难找到合适的 酶切位点用于区分物种n 玎。 1 2 4s s r s s r 是利用广泛存在于真核生物基因组中的高度重复序列的多态性为依据的 分子标记。高度重复序列两侧的特异序列是相当保守的，以此设计专一引物，通 过p c r 技术来扩增微卫星片断，不同物种、亚种、类群甚至个体之间因核心序列 重复次数不同，而表现出多态性。 匿翁，微卫星主要应用予个体闻亲缘关系的鉴定。p am o r i n 等潮用从毛囊中 提取的d n a ，对4 3 个非洲黑猩猩群体中的2 5 个个体用徽卫星标记徽了亲子鉴定。 张志和等口甜利用1 8 对微卫星引物对大熊猫做了亲缘关系的研究。 1 5 福建农林大学硬士学位论文 微卫星标记是基于基因组中特定座位的p c r 扩增分析，其在野生动物鉴定领 域，较少用于物种水平的鉴定研究。v a l s e c c h i e 等3 报道：某些微卫星d n a 核心序列大小在近缘物种间存在差异，可用于物种的相互区分，这使得部分物种 的d n a 分子鉴定更为简便。湫香香等乜钔从2 7 6 对s s r 弓i 物中筛选出5 对在种间具有多 态性，而在种内具有保守性的引物，对松科7 个树种进行了鉴定研究。 1 2 5s c a r s c a r 标记是在r a p d 技术的基础上发展起来的，它有r a p d 的优点，即模板数量 和纯度要求低，操作简便、快速、成本低，对于大多数基因组序列未知的野生动 物十分适用啪1 。另外，s c a r 标记还屏弃了r a p d 标记重复性差的缺点，十分适用于 物种及种以下的分类单元的鉴定。其基本步骤是：先作r a p d 分析，然后把特异r a p d 片段进行克隆和测序，根据原r a p d 片段两末端的序列设计更长的特异引物( 通常 2 4 个碱基) ，再进行p c r 特异扩增，这样就可把与原r a p d 片段相对应的单一位点鉴 定出来。这样的位点就称为s c a r 。s c a r 与r a p d 及其它利用随机引物的方法相比使 用的引物更长，所以有更高的可重复性，能更好地在物种鉴定中应用。 s c a r 标记已经广泛应用于植物及其种子纯度鉴定和中药鉴定等，在野生动物 鉴定方面还很少见报道。童芳芳胁1 利用r a p d 和s c a r 复合分子标记成功对黄颡鱼属 的3 个种进行了鉴定研究。美国威斯康辛大学的e l i z a b e t ha s c h e e f 等乜刀利用对 翦股颖属的1 7 个种进行了鉴定研究。胡炜等汹1 开发出了4 个稳定s c a r 标记，可作 为区分斑马鱼和稀有绚鲫以及从鲫鱼、白鲢、鲤鱼、鳊鱼等其它鱼类中鉴别出来 的分子标记。 童芳芳报道说s c a r 的关键步骤是特异性r a p d 片断的克隆，原因是该片段可能 会因为琼脂糖的低分辨率而不是一种片断，导致测序的困难。另外一个关键是 s c a r 弓 物的设计，根据测序结果，引物设计最好包含全部或部分r a p d 序列，如 e l i z a b e t ha s c h e e f 伽1 在翦股颖的s c a r g 物的开发研究中就是在r a p d 弓 物的3 端加上9 一1 0 个碱基组成了s c a r 引物。出于s c a r g i 物稳定性的考虑，也可以不包 含r a p d 引物序列。 也可以用i s s r 标记代替r a p d 进行s c a r 的初级筛选， y eo i a n 等呻3 报道i s s r 用于s c a r y 物的筛选比r a p d 有更高的稳定性和可重复性，并成功将i s s r 标记转化 为了s c a r 标记，对夏腊梅进行了鉴定研究。 1 6 福建糸俅太学j 曩士学位论文 1 2 6s s c p s s c p 的原理是：在自然状态下的单链d n a 会折叠卷煞，形成一定的空间构 象，其特性是由d n a 链的特定碱基顺序决定，当即使有一个碱基发生突变时， 也会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空阅构象有差异的单链d n a 分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同，因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电 泳，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开，从而达到不同物秘或耪群鉴 定的目的。 s s c p 利用于物种或种群鉴定，其靶基因仍然以m t d n a 中的e 灿基因等为最佳 选择。p c r - - s s c p 方法除简便、快速、不需要特殊的仪器外，相对于其他标记 的主要优点是其敏感性特别强，如前所述，一个碱基的突变就熊被其灵敏的捕捉 到。因此，十分适合于同源性特别高( 例如9 5 甚至9 9 以上) 的物种之间的区别 鉴定。a 。k 。d a n i e l s d 6 t t i r 等 3 l 】分别利用p c 嚣一s s c p 和咒嚣一r f l p 对四种鲈纳及 类群进行了鉴定研究，扩增了c y t b 基因1 2 6 1 2 8 b p 的片断和d - - l o o p 区5 3 0 b p 的片 断，利用s s c p 成功的从物种以及类群等级鉴别了它们；并报道说由于四者及其类 群之间c y t b 基因的同源性高达到9 9 5 和9 8 4 ，d - - l o o p 区高达9 6 和9 9 ， p c r - - r f l p 是无能为力的。 目前，s s c p 在野生动物鉴定方面还少有报道，r g s h a r p e 等口2 1 利用p c r 一 s s c p 成功黠露静蚊子进行了种质鉴定研究，并报道说s s c p 杰用予物种或种群鉴定 有以下优点：1 除了要扩增的区域以外不需要其他的基因序列信息：2 能鉴定出 是否力杂交个体：3 能充分利用咒r 产物的信息：4 。它能容易的一次区别多个种 质，并且易扩展到其他种质：5 易于检测种质内未知的突变。因此，它比特异性 p c r 更能提供有价值的遗传信息。 当然s s c p 的高灵敏度是一把双刃剑，它造成了s s c p 的重复性较差，p c r s s c p 受d n a 的结构、胶成分、电泳条件等诸多因素的影响。要得到清晰一致的 结果，需要对各种条件进行控制嗍。具体的控制操作前人已作过很多的研究报道 隗瓢圆。为了迸一步提高s s c p 的捡出率，可将s s c p 分析与其它突变检测方法相结 合。总体说p c r s s c p 是一种良好的鉴定手段。 1 7 徭建袁俅土季氓穗学位论文 1 2 7 特异性p c r 标记 特异性p c r 标记大多是根据m t d n a 中的c y t b 等基因和d - l o o p 区中的保守区域， 设计针对特定物种( 更低或更高分类水平) 的特异性引物，通过p c r 扩增来验证引 物的特异性，然后根据扩增目的条带的有无来判定。 目前，该方法广泛应用于野生动物的物种或类群的鉴定研究。袁巍等n 2 1 通过 对马鹿、梅花鹿和狍的c y t b 基因的比对，根据各自的特异序列，设计了三对特异 引物，并成功进行了p c r 特异性检测验证；华育平等秘3 运用同样的方法设计了虎 特异性弓| 物；杨学干等利用1 2 s r r n a 基因设计了中国林蛙和黑龙江林蛙的特异 性引物，达到对它们的产品进行来源鉴定的目的；f p a l o m a r e s 等“1 利用c y t b 基 因和d - - l o o p 区序列设计了罂对猞猁特异性弓| 物，成功对其进行了鉴定。 在以往野生动物检材鉴定中，常常通过首先利用通用引物对c y t b 等部分基因 序列扩增并测序，然后与对照样晶序列或以往发表的序列进行验证比对来进行。 例如贺培建等啪1 利用1 2 s r r n a 基因的比对成功黑麂和黄麂的肌肉进行了鉴定。刘 辉等汹3 稍用1 2 s r r n a 基因和c y t b 基因部分序列，通过d n 矗序列眈对，对三件猴骨样 品进行了鉴定。此方法虽然充分利用了基因库的资源和m t d n a 标记的优点，十分 准确，健由于测序工作费时费力，并且成本较高，难以在普通实验室推广应用。 特异性p c r 标记将p c r 技术和m t d n a 标记的优点相结合，不仅具有p c r 技术的方便快 捷、灵敏度高、特异性好、稳定性强的优点，两且具有m t d n a 标记的检材范围广、 检材中的d n a 丰富、d n a 提取方便等优点，其应用前景十分广阔。 1 3 5 研究的目的与意义 为? 有效保护我国猕猴属野生动物资源，建立对野外调查和保护执法工作中 获得的猕猴属动物疑似样品，特别是微量组织样品，建立物种鉴定的敏感、精确、 可靠的方法，解决我国猕猴属动物的分子生物学物种鉴定技术问题，本研究利用 d n a s t a r 软件对猕猴属物种线粒体细胞色素b 基因进行了比对研究，根据保守突 交位点，设计合成猕猴属特异弓| 物鼢、溉，短尾猴特异引物d s 、醯，豚尾猴特 异引物t s 、t a ，藏酋猴特异引物z s 和z a ，熊猴特异性引物x s 、x a 分别对猕猴 属动物和相近物种及常见物种的粪便、毛发、骨骼、腿夷样品进行扩增试验。 1 8 福建袁俅史学曩士学饿论文 本研究拟通过m t d n a 分子标记技术，解决我国猕猴属分子鉴定问题，建立一 种能方便、快速、精确对其各种组织( 皮、毛、肌肉、角、甲等) 进行分子检测鉴 定的方法，并对其特异性、敏感性和重复性进行验证。为猕猴属野生动物保护工 作提供有力的鉴定乎段。 1 9 福建农林土学j i l 士学位论文 2 材料与方法 2 1 试验样品的采集及保存 从市场和福州市标本公司采集新鲜肌肉样品，立即提取核酸，多余肌肉2 0 保存。在市动物园采集当天的新鲜粪便，并立即用冰盒送到实验室进行核酸提 取，多余粪便- 8 0 保存。从本实验室工作人员拔取毛发样品( 带毛囊) ，放入 1 5 m l 离心管，加入1 0 0 乙醇1 2 m l 于- 2 0 保存。 表2 1 样品及采集地点 t a b l e 2 1s a m p l ea n dp l a c eo b t a i n e d 2 2 主要试剂 5 mn a o h - 1 0 0 9n a o h 溶于4 0 0 m l d d h 2 0 中，定容至5 0 0 m l 。 5 mn a c h1 4 6 2 5 9 n a c l ，d d h z o 定容至5 0 m l 。 0 5 me d t a ( p h8 0 ) ：称取1 8 6 1 9 的e d t a - n a 2 h 2 0 ，用5 mn a o h 调节溶 液p h 至8 0 ，d d h z o 定容至1 l 。 1 mt r i s ( p h8 0 ) ：8 0 0 m l 蒸馏水，1 2 1 1 9 t r i s - b a s e ，用浓盐酸调p h 至8 o ，定 容至l l 。 6x _ l ：样缓冲液：1 0 m me d t a ( p h 8 0 ) ，溴酚蓝0 0 2 5 9 ，二甲苯青f f 0 0 2 5 9 ， 福建农俅文学碛士学位论文 聚蔗糖4 9 ，用水定容到1 0 m l 。 5 0 x t a e 电泳缓冲液：2 4 2 9t r i s ，5 7 1 m l 冰醋酸，1 0 0 m l0 5 me d t a ( p h8 。o ) ， 加水溶解定容至l l 。 s t e ：2 5 m l0 5 me d t a ( p h 8 0 ) ，0 5 m l1 mt r i s ( p h8 o ) ，l m l5 mn a c l ，d d h 2 0 宠容至5 0 m l 。 t e ( p h8 。0 ) ：1 0 m mt r i s h c i ，lm l v le d t a ( p h8 o ) 。 酚氯仿异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ：取饱和酚：氯仿：异戊醇1 2 5 ：2 4 ：1 混合，4 c 避光保存。 氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) ：取氯仿异戊醇= 2 4 ：l 混合，4 c 避光保