（预防兽医学专业论文）郑州地区猪球虫病流行病学调查及致病性研究.pdf

分类号 河南农业大学硕士学位论文 i i i ii ii ii i i iii i i ii i i i y 1819 4 3 0 密级 论文题目：郑州丝匡猹堕虫痘逋堑痘堂迥查亟型迓丝匦盟 学位申请人： 毯查圜i 一 导 师：一 宝益虫塾援 一陵湛型盟叠厘l 一 专 业： 预随兽医堂二一 研究方向：查生虫生物堂一 论文提交 学位授予 日期：2 007 年11 月 日期： j 1 i j 南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位沦 郑州地l 又：猪球虫病流行病学凋夯及 学位 硕十 文题目 致病性研究 级别 学生 张志刚 学科 导师铲艮中教授 姓名 专业 预防兽医 姓名陈洪科研究员 学伉论文 是如需保密，解密时问2 0 0 9 年11 月3 0 门 是否保密 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中 特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料，指导教师对此进行了审定。与我同工作的同志对本研究所做的仟何贡献 均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：刍乒压列砷导师签名：二了饧、7 _ f 期：万夕年：月哆同闩期：7 矿毋，j - jz 7 | - l 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规寅 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保彳 刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、 复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用刁 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关力 开河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论j 位为河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产 业大学所有，否则，承担相应的法律责任。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 印事哥f研究生签名雾吞锄导师签名：需獗中学院领导签名： 。 j 同期夕年j ，月刁同r 期：缈寿7 j 月卵f 1同期：岬年，哼r 而 致谢 本论文是在导师宁长申教授、陈洪科研究员的悉心指导下完成的。导师们不仅 学识渊博，而且治学严谨；不仅忠于职守，而且勇于创新；不仅敬业奉献，而且胸 襟宽广；不仅谦虚真诚，而且与人为善，所有这些都使我终生难忘。他们不仅培养 了自己对科学研究的浓厚兴趣和创新意识，而且提高了自己分析问题和解决l 口j 题的 能力；他们不仅在选题上进行了周密细致的策划，而且在论文完成过程中给予了精 心的指导和悉心的帮助。在此谨向两位导师表示最诚挚的感谢并致以崇高的敬意! 感谢河南农业大学牧医工程学院的王j l i 庆教授、张龙现教授、许兰菊教授、刘 忠虎博士、杨国宇博士、夏平安博士、菅复春老师等，他们在论文选题、技术路线、 论文撰写过程中给了我许多宝贵的建议。 感谢河南省动物疫病预防控制中心的吴志明主任、张志凌副主任、张健副主任， 感谢河南省动物疫病防控技术研究室的刘光辉硕士、河南省动物疫病预防控制中心 防疫科刘智明硕士、河南省兽医院陶顺启院长，感谢他们在完成研究课题中的支持 和帮助。 感谢郑州市畜牧局蔡仲友局长、宋庆华研究员，新郑市、中牟县、新密市、惠 济区等6 个县( 市、区) 畜牧兽医站的有关领导和部分养猪场均在病料采集和临床 应用中给我的无私帮助，在此一并表示真诚感谢! 同时，感谢河南省畜牧局办公室朱立良主任、王全周调研员，他们给我提供了 一个很好的平台，让我有充足的时间进行学习、研究，并如期完成论文的撰写。 再次表示最诚挚的谢意! i v 目录 中文摘要1 文献综述 3 1 概述3 2 猪球虫的种类及形态特征0 e m r n 3 3 猪球虫生活史9 4 致病性1 1 5 流行病学1 2 6 临床症状及病变1 3 7 诊断1 4 8 免疫1 4 9 治疗与控制1 5 1 0 结语与展望1 5 猪球虫病流行病学调查1 6 1 材料与方法1 6 2 结果与分析1 8 3 结论与讨论2 3 猪等孢球虫纯种卵囊扩增及生物学特性研究2 4 l 材料与方法：2 4 2 结果与分析2 6 3 结论与讨论2 8 猪等孢球虫致病性试验研究3 0 1 材料与方法3 0 2 结果与分析3 4 3 结论与讨论： h 参考文献4 2 附图4 7 英文摘要5 0 v 中文摘要 国内外研究资料表明仔猪球虫病目前已成为仔猪腹泻的重要病原之一，但长期以来该病没 有引起养猪业足够的重视。为掌握目前河南省郑州地区仔猪球虫病的流行动态及种类分布，并为 制订切实可行的预防措施提供依据，2 0 0 6 年7 , - - 一1 1 月，应用饱和糖一盐水溶液漂浮法对河南省郑 州地区的1 6 个不同规模猪场仔猪球虫感染情况进行了初步的调查，其球虫总的感染率分别为7 9 7 、2 6 4 8 、5 8 9 、1 5 1 4 、3 1 2 、6 6 7 、o 7 6 、1 1 1 1 、3 3 5 7 、2 2 3 5 、3 8 8 7 、4 5 5 、i i 4 7 、1 7 9 6 、5 1 3 和2 2 8 7 ，平均感染率为1 3 3 3 ；其等孢球虫感染率 分别为5 3 6 、2 6 4 8 、3 9 6 、1 1 3 6 、2 1 3 、2 2 2 、0 、4 6 7 、2 2 5 4 、1 6 3 2 、 3 0 1 2 、1 9 6 、7 9 8 、1 0 1 5 、4 0 6 和1 8 4 8 ，平均感染率为1 0 1 4 。在上述调查猪 场中，仔猪球虫感染率均为阳性，最高感染率为3 8 8 7 ，最低感染率为0 7 6 ：而等孢球虫的最 高感染率为3 0 1 2 ，最低感染率为o 。感染日龄主要集中在1 1 2 0 日龄，感染率为2 2 9 7 ，其 次在2 1 3 0 日龄，感染率为1 5 8 1 ，再次在i - i 0 日龄，感染率为1 3 9 2 ；而等孢球虫感染日 龄也主要集中在i i 2 0 日龄，感染率为2 1 0 8 ，其次在l 1 0 日龄，感染率为1 2 8 7 ，最低感 染率为o ，在4 1 - - 6 0 日龄段。 用m i a s p r o 图象分析处理系统测量卵囊、孢子囊大小及卵囊周长、面积、形状因子( 卵囊长 度：卵囊宽度) 等，结合显微镜下观察卵囊、孢子囊、子孢子的形态、大小和数量，共分离、鉴 定出郑州地区各猪场猪感染的球虫有2 属、8 种，球虫种类及其感染率分别是猪等孢球虫( i s o s p o r a s u i s 感染率为6 7 7 ；杨陵艾美耳球虫新种( e i m e r i ay a n g l i n g e n s i ss p ) 为5 2 6 ；种猪艾美 耳球虫( e p o r e d 为5 1 8 ；蒂氏艾美耳球虫( ed e b l i e c k i ) 为4 2 8 ；猪艾美耳球虫( es u i s ) 为4 1 3 ；极细艾美耳球虫( 叵p e r m i n u t a ) 为3 9 8 ；粗糙艾美耳球虫汜s c a b r a ) 为3 2 4 ；新 蒂氏艾美耳球虫( en e o d e b l i e c k d 为2 6 4 。 应用单卵囊分离技术获得猪等孢球虫纯种卵囊，经3 日龄仔猪扩增，收集纯种后代，并进行 了继代扩增，同时对扩增、继代扩增的排卵囊规律、卵囊孢子化过程及孢子化率和卵囊的形态结 构等进行了研究，结果：扩增和继代扩增所获球虫卵囊，与其亲本和文献报道的猪等孢球虫的生 物学特性相一致；但猪等孢球虫扩增研究表明，仔猪排卵囊规律与文献报道稍有差异，潸隐期和 显露期比有关报道稍长。新收集猪等孢球虫卵囊，置2 5 重铬酸钾溶液中2 8 c 恒温培养，最早 2 6 h 卵囊完全孢子化，较文献报道的最早孢子化时间短；9 6 h 时孢子化率达8 0 。 将3 0 头1 日龄长大二元仔猪随机分为五组，每组6 头，除一组为空白对照外，其他5 组每组 每头仔猪分别一次经口感染l 1 0 4 个、5 1 0 1 个、2 i 0 5 个、5 1 0 5 个、1 1 0 6 个孢子化猪等孢 球虫卵囊，对猪等孢球虫致病性进行了研究。观察了人工感染后仔猪的排卵囊规律和临床症状、 剖检病变及组织学病变，结果：猪等孢球虫排卵囊滞隐期为4 5 d ，显露期为1 8 2 3 d ，有2 个排 一】一 卵囊高峰期，分别在人工感染后7 8 d ( d a yp o s ti n o c u l a t i o n ，p i d ) 和p i d l 2 1 7 。感染猪等 孢球虫的仔猪食欲下降，精神较差，眼窝下陷，喜卧，被毛粗乱无光泽，皮肤灰白，缺乏弹性， 生长发育缓慢，行走不稳；粪便初始呈糊状、灰褐色、恶臭，随着病情加重，粪便呈灰色、黑色 液状，逐渐变成黄色、土黄色水样腹泻；有的粪中带有白色至灰白色凝乳块状物。剖检病变主要 集中在空肠中、后段，可见卡他性或局灶性、伪膜性炎症，空肠和回肠粘膜表面有出血斑和纤维 素性坏死状斑块；肠系膜及全身淋巴结红肿；空肠和回肠增粗、肠壁变薄；盲肠肿大，肠壁变薄。 显微镜下可见空肠中、后段和回肠绒毛萎缩、融合、断裂，肠隐窝增生，部分肠粘膜上皮细胞已 脱落；在其固有层和粘膜下层中有单核巨噬细胞和淋巴细胞浸润现象，偶尔可见嗜酸性细胞浸润； 回肠粘膜上皮内可见大量杯状细胞增生。在空肠中、后段和回肠粘膜上皮细胞内和肠隐窝内可见 寄生虫体的带虫空泡，在其内可见成熟的双核形并以内出芽生殖的i 型裂殖体、多核的i i 型裂殖 体、裂殖子和圆形配子体。 猪等孢球虫致病性研究及纯种卵囊扩增和继代扩增表明，感染仔猪的排卵囊规律因感染剂量 不同而存在差异。 本研究结果表明，仔猪球虫病在郑州地区普遍存在，感染种类多达8 种，优势虫种和主要致 病种为猪等孢球虫，其对仔猪的致病力较强，可引起仔猪典型的球虫病症状和病理变化；其内生 发育阶段寄生于仔猪空肠中、后段和回肠上皮细胞内。 关键词：等孢球虫；猪；流行病学；致病性； 一2 一 文献综述 1 概述 球虫病是一种由寄生性原虫引起的疾病，病原在分类上属于顶复门( a p i c o m p l e x al e v i n e ， 1 9 7 0 ) 、孢子虫纲( s p o r o z o e al e u c k a r t ，1 8 7 9 ) 、球虫亚纲( c o c c i d i al e u c k a r t ，1 8 7 9 ) 、真球虫 目( e u c o c c i d i o r i d al e g e r & d u b o s c q ，1 9 1 0 ) 、艾美耳亚目( e i m e r i o r i n al e g e r ，1 9 1 1 ) 、艾美 耳科( e i m e r i i d a em i n c h i n ，1 9 0 3 ) 、艾美耳属( e m e r i as c h n e i d e r ，1 8 7 5 ) 和等孢属( i s o s p o r a s c h n e i d e r ，1 8 8 1 ) 的球虫，呈世界性分布。病原具有很强的宿主专一性和寄生部位专一性，其中 某些种类具有很强的致病性 6 1 。 猪球虫病是由猪等孢球虫( i s o s p a r as u i s ) 和某些艾美尔属球虫寄生于哺乳期及新近断奶仔 猪小肠上皮细胞引起的、以腹泻为主要临床症状的原虫病；在成年猪群，虽有球虫寄生，但一般 不引起临床表现，多呈带虫现象，而成为本病的传染源，尤其是母猪带虫，常引起一窝仔猪同时 或先后发病，或引起死亡，造成较大的经济损失 1 1 3 o 猪球虫最早报道于1 8 7 8 年，# t z u r n 和r i v a l t a ( 1 8 7 8 ) 首先发现，但朱作具体的描述和分类命名。早在1 9 3 4 年b i e s t e r 和m u r r a y 对本病主要病原 猪等孢球虫( 上s u i s ) 就作了报道，但是，直至t j 2 0 世纪7 0 年代中期，s a n y s t o r ( 1 9 7 6 ) 才从 临床上将猪等孢球虫确诊为哺乳仔猪球虫病的重要病原，1 9 7 8 年，s a n y s t o r 在自然感染的病例中 证实猪等孢球虫是引起新生仔猪球虫病的病原，且猪等孢球虫对仔猪的致病性最强n 5 1 3 2 0 。新 生仔猪的球虫病呈世界性分布嘲，在任何猪场中均可能发生，受害仔猪的生长速度远远落后于健 康仔猪。近年来，该病在欧、美、澳、东南亚国家和地区流行严重，引起兽医寄生虫学者的充分 关注，在病原学、流行病学、免疫学等方面取得了不少进展n 9 2 1 2 5 1 。 2 猪球虫的种类及形态特征 2 1 猪球虫的种类 猪球虫最早报道于1 8 7 8 年，由z u m 和r i v a l t a 首先发现，但未作具体的描述和分类命名例。 d o u w e s ( 1 9 2 1 ) 也曾描述过从猪粪便中分离的肠球虫，但未予命名；次年d o u w e s 描述并命名了猪的 蒂氏艾美耳球虫陋砌e r i ad e b l i e c k d 。自此之后，寄生虫工作者先后报道并命名了1 5 种艾美耳球 虫和2 种等孢球虫( p e l l e r d y ，1 9 7 4 ) ，但其中至少有5 种艾美耳球虫和1 种等孢球虫的有效性值得怀 疑，仍有待研究疆 1 0 1 ，目前根据不同国家和地区猪球虫病的流行病学调查结果、大多数学者比较 认可猪球虫的有效种计有艾美耳属1 0 种和等孢属1 种n0 2 6 _ ，即粗糙艾美耳球虫( s e a b r a ) 、光 滑艾美耳球虫( ep o l i t a ) 、极细艾美耳球虫( 叵p e r m i n u t a ) 、有刺艾美耳球虫( 叵s p i n o s s ) 、猪艾 美耳球虫( es u i s ) 、种猪艾美耳球虫( ep o r e d 、蒂氏艾美耳球虫( 最d e b l l e c k d 、新蒂氏艾美耳 球虫( en e o d e b l i e c k d 、赛多尼斯艾美耳球虫( ec e r d o n i s ) 、杨陵艾美耳球虫新种 ( ey a n g l i n g e n s i ss p ) 和猪等孢球虫( 上s u i s ) 。据s m it h 称，在欧洲，上述猪球虫中比较常见的 是上s u i s 、ed e b l i e c k i 、es c a b r a b 。而据d a u g s c h i e s 等对大多数文献报道的分析，上述各种球 一3 一 虫除en e o d e b l i e c k i p b ，在欧洲都很普遍，尤其是上s u i s ，常在种猪场的仔猪群中引起疾病流行 ；但k o u d e l a 等在捷克的调查认为，n e o d e b l i e c k i 这_ - - 虫种广泛存在，且有较强致病力，可引 起临床型腹泻幢引。由于猪艾美耳球虫生活史的满隐期和孢子化时间较长，种内形态变异较大：等 孢属和艾美耳属的非孢子化卵囊形态种间差异不大等特点，出现这些差异并不奇怪。 2 2 猪球虫的形态特征胆4 6 一仉1 4 2 6 2 7 0 删 2 2 1 粗糙艾美耳球虫( es c a b r ah e n r y ，1 9 3 1 ，图1 1 ) 卵囊呈卵圆形，偶有不对称者，椭圆形者少见。壁粗糙，有辐射状条纹，呈黄色或黄褐色， 厚约2i im ：有显著的卵膜孔，但无极帽。孢予化卵囊大小3 1 2 - - 一3 4 3 ( 3 2 6 1 3 ) 2 2 i 2 4 7 ( 2 3 4 o 7 ) um ；形状指数1 3 2 1 4 7 ( 1 3 9 4 - 0 0 6 ) 。孢子化卵囊内有4 个孢子囊；具极粒， 缺外残体；孢子囊长卵圆形，有时不对称，斯氏体显著。内残体由粗大的颗粒构成条状或形状不 规则的团块。孢子囊大小为1 3 0 1 8 2 ( 1 6 2 1 9 ) x 6 8 - - 1 0 4 ( 8 2 1 2 ) um ；形状指数i 6 7 - - 2 3 6 ( 1 9 7 + _ 0 2 5 ) ，呈香蕉形，尖端和钝端均有一折光球。两个子孢子头尾并列于孢子囊内。孢 子化时间为9 d ( 2 1 6 h ) 。本种卵囊的识别特征是：在猪球虫卵囊中，本种卵囊最大，多数卵囊不 对称；卵囊壁较厚，粗糙，有辐射状条纹，卵膜孔端明显变薄。 2 2 2 光滑艾美耳球虫( p o i r ap ei i e r d y ，1 9 4 9 ，图1 2 ) 卵囊呈椭圆形或卵圆形。壁粗糙，壁二层，均厚，呈黄色或淡黄色；无卵膜孔。孢子化卵囊 大4 , 2 9 8 - - - 3 3 3 ( 3 1 6 1 3 ) 2 1 1 2 3 7 ( 2 2 4 o 。7 ) um ；形状指数1 2 8 - - 1 4 9 ( 1 3 6 0 0 8 ) 。 孢子化卵囊内有4 个孢子囊。具极粒，缺外残体。孢子囊卵圆形，斯氏体显著。内残体呈颗粒状团 块，数量多。孢子囊大小为1 5 0 1 9 2 ( 1 7 1 1 9 ) x 5 9 - - 8 0 ( 6 5 1 6 ) ui n ；两个子孢子头尾 并列于孢子囊内。孢子化时间为7 9 d 。本种卵囊的识别特征是：易与粗糙艾美耳球虫相混，但 本种卵囊壁均厚，无卵膜孔，卵囊壁无辐射状条纹，壁粗糙程度不及粗糙艾美耳球虫，颜色也较 淡。孢子囊较狭长，对称；本种区别于蒂氏艾美耳球虫的主要特征是：卵囊壁粗糙，孢子囊对 称，卵囊较大。 2 2 3 极细艾美耳球虫( ep e r m i n u t ah e n r y ，19 3 1 ，图1 - 3 ) 卵囊呈圆球形或亚球形。壁粗糙由两层构成，淡黄色；无卵膜孔。大小为1 3 0 1 6 9 ( 1 5 3 1 7 ) 1 0 4 - 1 5 6 ( 1 3 4 1 8 ) um ；形状指数1 0 3 - - 1 2 5 ( i 1 4 o 1 0 ) 。孢子化卵囊有4 个孢 子囊，具极粒，但缺乏外残体。孢子囊近似椭圆形，具斯氏体；内残体颗粒粗大且较少。大小为 6 5 - - 7 8 ( 7 5 1 8 ) 4 2 5 2 ( 4 9 0 4 ) um ；形状指数1 5 0 一- 1 8 8 ( 1 5 6 + 0 1 7 ) 。子孢子呈 蚓状，钝端有一折光球。两个子孢子头尾并列于孢子囊内。孢子化需7 9 d 。本种卵囊的识别特征 是：在猪球虫卵囊中，本种卵囊最小；卵囊壁粗糙。 2 2 4 有刺艾美耳球虫( es p i n o s ah e n r y ，1 9 3 1 ，图1 4 ) 卵囊呈卵圆形，偶见椭圆形。蹙粗糙由两层构成，褐色，有明显的针刺；无卵膜孔，无极帽 和卯囊残体。孢子化卵囊大小为1 9 2 - - 2 4 3 ( 2 2 3 1 7 ) 1 6 2 2 0 4 ( 1 8 3 1 8 ) pm ：形状指 - - 4 数1 0 9 , 、一i 3 4 ( 1 2 4 0 1 0 ) 。孢子化卵囊有4 个孢子囊，具极粒。孢子囊长卵圆形，具有斯氏体和 内残体。大小为8 4 1 3 4 ( 1 1 2 2 6 ) 5 1 6 8 ( 6 o 0 8 ) 。孢子化需9 - - 一2 2 d 。本种卵囊的识 别特征是：卵囊壁粗糙，有明显的针刺。 图1 猪的11 种孢子化球虫卵囊 f i g 1t h e1 is p o r u i a rs w i n ec o c c i d i ao o c y s t s 1 粗糙艾美耳球虫( es c a b r a ) 2 光滑艾美耳球虫( e p o l i t 亩 3 极细艾美耳球虫( ep e r m i n u t a ) 4 有刺艾美耳球虫( es p i n o s a ) 5 猪艾美耳球虫( es “脚6 种猪艾美耳球虫( ep o r c ，) 7 蒂氏艾美耳球虫( ed e b l i e c k ，) 8 新蒂氏艾美耳球虫( en e o d e b i i e c k l 3 9 赛多尼斯艾美耳球虫( c e r d o n i s ) 1 0 杨陵艾美耳球虫新种( ey a n g l i n g e n s i ss p ) 1 1 猪等孢球虫( ，s ， 一5 一 2 2 5 猪艾美耳球虫( = s u i sn o i i e l ，1 9 2 1 ，图1 5 ) 卵囊为椭圆形或皿球形。壁光滑，由两层构成，厚约0 1 5um ，淡黄色或无色；无卵膜孔。 ， 孢子化卵囊大小为1 5 6 2 0 8 ( 1 8 4 2 2 ) x 1 1 7 1 6 2 ( 1 4 2 1 8 ) um ；形状指数1 2 6 - - 1 3 3 ( 1 3 o 0 3 ) 。孢子化卵囊有4 个孢子囊，无极帽和外残体，有极粒。孢子囊长卵圆形，大小 为8 3 1 3 0 ( 1 0 6 2 2 ) 4 7 , - - , 7 8 ( 5 9 1 3 ) l lm ，形状指数1 6 0 2 0 5 ( 1 7 8 0 1 7 ) 。斯氏 体明显，内残体由较细小的颗粒组成，数量少。子孢子蚓状，内有两个折光球。孢子化时间 l o d ( 2 4 0 h ) 。本种卵囊的识别特征是：卵囊及孢子囊都是光滑型卵囊中最小的；孢子囊残体颗 粒数量少。 2 2 6 种猪艾美尔球虫( ep o r c iv e t t e r | n g ，19 6 5 ，图1 6 ) 卵囊卵圆形。壁光滑，淡黄色或无色，由两层构成，厚约11 1m ；缺卵膜孔。孢子化卵囊大小 为1 9 5 2 3 4 ( 2 1 8 1 8 ) 1 4 3 1 7 7 ( 1 6 0 1 3 ) u1 2 1 ；形状指数1 2 6 一- , 1 5 0 ( 1 3 6 0 0 9 ) 。 孢子化卵囊有4 个孢子囊，缺外残体，有一个极粒，孢子囊宽卵圆形，斯氏体不明显，内残休由细 颗粒构成位于两子孢子之间，成条状或三角形排列。予孢子肥胖，在孢子囊内呈两极排列。孢子 囊大小为9 1 1 0 4 ( 9 8 0 7 ) 6 0 6 5 ( 6 4 0 2 ) i im ；形状指数1 4 - - - 1 6 ( 1 5 4 o 0 9 ) 。孢 子化时间为1 9 2 - - 一2 1 6 h 。本种卵囊的识别特征是：孢子囊短宽，斯氏体不明显；子孢子位于孢 子囊两极，而不是纵长向排列；孢子囊残体颗粒少，多呈条状排列。 2 2 7 蒂氏艾美耳球虫( ed e b i i e c k id o u w e s ，1 9 2 1 ，图1 7 ) 卵囊常呈椭圆形，圆柱状或卵圆形者也间或见到。壁光滑，由两层构成，厚1 4 - 4 - 0 2 “i t l ； 无卵膜孔和外余体，但有明显的极粒。孢子化卵囊大小为2 3 4 3 1 2 ( 2 7 7 2 4 ) 1 8 2 2 2 9 ( 2 0 2 1 6 ) ui t i 。形状指数为1 2 5 一- - i 6 4 ( 1 3 7 土o 1 1 ) 。孢子囊为不对称的长卵圆形，一边 较为平直，另一边呈弧形；这是这个种与卵囊光滑的其它种相区别的最火特点；大小1 5 2 2 0 8 ( 1 6 8 1 8 ) x 5 5 - - - 7 3 ( 6 3 0 5 ) um ，形状指数为2 2 9 ，- - - 3 0 4 ( 2 6 8 0 2 7 ) 。斯氏体明显 偏向一侧，团块状的内残体由较粗的颗粒构成。子孢子呈香蕉状，一头尖，一头钝，头尾并列于 孢子囊内。在2 7 的恒温箱中培养最早孢子化时间为9 6 h ，8 0 以上卵囊孢子化时间为9 6 h 。8 0 以上卵囊孢子化时间为1 4 4 h 。本种卵囊的识别特征是：在光滑型艾美耳球虫中，其卵囊较大； 孢子囊为不对称的长卵圆形，一边较为平直，另一边呈弧形，斯氏体明显偏向一侧；孢子囊 残体颗粒粗而多。 2 2 8 新蒂氏艾美耳球虫( n e o d e b l i e c k iv e t t e ri n g ，1 9 6 5 ，图1 - - 8 ) 卵囊的形状与蒂氏艾美耳球虫相似，但量度数据较小。孢子化卵囊大小为1 8 2 2 4 7 ( 2 1 2 2 4 ) 1 3 8 一- 1 8 2 ( 1 4 9 1 8 ) pi t l 。形状指数为1 3 - - 1 5 ( 1 4 o 0 9 ) 。壁光滑，由两层构成， 无色。没有卵膜孔和外残体。孢子化后可见有极粒，有4 个孢子囊。孢子囊长卵圆形，有2 个子孢 子。斯氏体明显，内残体呈颗粒状，数量较多，成堆。孢子囊大小为1 0 9 1 5 6 ( 1 2 5 1 8 ) 5 2 7 8 ( 5 8 o 9 ) um ；形状指数为2 1 2 5 ( 2 1 9 0 1 7 ) 。子孢子呈豆英状；一头尖，一头钝，头 一6 尾并列于孢子囊内。孢子化时间为1 9 2 h 。本种卵囊的识别特征是：这个种与蒂氏艾美耳球虫最 火的区别在于孢子囊形状的不同，其特点是：该种孢子囊对称，形状指数为2 1 9 ，蒂氏则为2 6 8 ； 与猪艾美耳球虫相比，本种卵囊较大，孢子囊较长，孢子囊残体颗粒较多。 2 2 9 赛多尼斯艾美耳球虫( ec o r d o n i sv e t t e r li n g ，1 9 6 5 ，图1 9 ) 卵囊近似椭圆形，一端稍窄。壁粗糙不平，由两层构成，呈淡黄色，纵断面无横纹，厚约1 5 | im ；缺卵膜孔和外残体。孢子化卵囊大小为2 6 0 3 3 8 ( 2 9 9 2 2 ) 1 9 8 2 3 4 ( 2 2 1 1 4 ) um ；形状指数为1 2 8 1 5 2 ( 1 3 6 _ + 0 0 8 ) 。孢予化卵囊有4 个孢子囊和1 个极粒。孢子囊呈长卵 圆形，具明显的斯氏体和由粗颗粒组成的内残体。大小为1 5 6 - 2 0 8 ( 1 8 4 1 8 ) x 6 8 9 1 ( 7 8 4 - o 6 ) um ；形状指数为2 0 - - - 2 6 7 ( 2 3 8 _ + 0 2 3 ) 。子孢子香蕉形，钝端有一大型折光体，常呈椭 圆形。两个子孢子钝端和尖端相对排列于孢子囊之中。孢子化时间为7 d 。本种卵囊的识别特征是： 子孢子香蕉形，钝端有一大型折光体。 2 2 1o 杨陵艾美球虫新种( ey a n g l i n e e n s i ss p n o v ，图1 - - 10 ) 卵囊窄长，似长圆柱状，有的两端大小略有差异，但卵囊对称。卵囊壁而层，较厚，粗糙， 黄褐色；无卵膜孔。孢子化卵囊的大小为2 3 2 3 2 4 ( 3 0 4 1 7 ) 1 2 0 1 6 8 ( 1 4 8 4 - 1 0 ) 1 11 t i ， 形状指数为1 9 2 - - - , 2 2 0 ( 1 9 8 4 - 0 0 9 ) 。无卵囊残体，有极粒。孢子囊对称，长卵圆形，在小的 一端有一明显的斯氏体。孢子囊大小为9 6 0 - - 一2 0 4 ( 1 5 5 2 1 0 ) x 4 8 0 - 7 2 0 ( 5 6 0 _ + 0 7 0 ) u m ， 形状指数为1 6 - - - , 4 0 ( 2 7 6 + 0 5 1 ) 。孢子囊残体由一些分散的颗粒组成，子孢子呈香蕉形，2 个子孢子头尾并列于孢子囊内，每个子孢子钝端有1 个团球形的折光球。在( 2 7 1 ) 恒温箱内孢 子化时间为9 6 - - 一1 4 4 h 。本种卵囊的识别特征是：卵囊呈窄长的对称长圆柱状。 2 2 1 1 猪等孢球虫( ，s u i sb i e s t e r ，1 9 3 4 ，图1 1 1 ) 卵囊呈球形或亚球形，卵囊壁光滑且较薄，无色，孢子形成后的卵囊壁常皱裂，无卵膜孔。 卵囊的大小为1 8 7 2 7 0pm 1 5 4 2 4 4 i im ，平均2 1 2u1 t ix1 9 1ui t l ，形状指数为1 0 0 - - - 1 2 4 ，平均为1 1 1 。壁厚1 2 1 6 um ，平均1 4um 。无极粒，无卵囊余体，孢子化的卵囊内有 2 个孢子囊，孢子囊呈圆形或椭圆形，大小为1 0 8 - - - 1 6 1ui n 8 o 1 1 8um ，平均1 4 0 1 1 4 l ii t i ，形状指数为1 0 0 - 1 3 5 ，平均为1 1 4 。孢子囊余体呈颗粒状，位于孢子囊一端，无斯氏体。 每个孢子囊内有4 个子孢子，子孢子呈腊肠形或香蕉形，钝端有一折光球。孢子化时间为9 6 1 2 0 h 。 本种卵囊的识别特征是：孢子化卵囊内含有2 个圆形或椭圆形的孢子囊。 2 3 猪球虫分类的一些进展 猪球虫分类主要是依据卵囊的形态大小及结构、滞隐期和孢子化时间、寄生部位等特性来进 行。但这种分类方法对研究者的个人经验及技能有很大的依赖，且猪艾美耳球虫和猪等孢球虫及 各种艾美耳球虫间的未孢子化卵囊差异很小，需要进行较长时间的孢子化后才能进行分类，使猪 艾美耳球虫的分类比较困难。近年来，借助于计算机辅助的数值分类法和以p c r 法为基础的分子 生物学法已开始用于猪球虫的流行病学调查，取得一定进展凹4 4 、4 6 。 一7 一 根据已报道的猪的9 种艾美耳球虫( 不包括叵n e o d e b l y e c k i ) 卵囊形态特征，d a u g s c h i e s 等将卵囊色泽和卵囊形态数值化，在色泽因子( c f ) 中，设定卵囊蹙无色者数值为一l ，黄色者为1 ， 褐色者为5 ，黑褐色者为8 ；在形状因子( s f ) 中将弧球形，球形，椭圆形或圆形设为一1 ，卵圆形或 不对称形设为1 ，以德国莱卡公司的计算机辅助图像分析系统用莱卡显微镜1 0 0 0 倍下测定卵囊和 孢子囊的长、宽值，首先根据卵囊壁外层的光滑度及有无微孔存在将混合种卵囊分为3 组后，再 根据卵囊长度( 1 0 ) 、形态因子( s f ) 、色泽因子( c f ) 、孢子囊长度( 1 s ) 、孢子囊宽度( w s ) 、孢子囊 形状指数( s p = l s w s ) ，用e x c e l7 0 和w i n d o w s s p s s 软件进行分析和数值分类，以u 检验法进行 统计处理( 种间差异显著的p 值应小于0 0 5 ) 并与传统方法的分类进行比较。结果表明，用该法 n e n g l 对该次调查中粪便中存在的所有9 种艾美耳球虫卵囊进行准确分类。根据数据库中卵囊壁 外层的光滑度将猪粪便中的混合卵囊分成的3 组中，第1 组卵囊壁粗糙，包括叵s c a b r a 、p o l i t a 、 ep e r m i n u t a 、c e r d o n i s , ey a n g l i n g e n s i ss p 5 种，再根据l o ，s f 和c f 等参数进行数值分 类，可将这5 种球虫准确分类至种。层p e r m y n u t a ，ey a n g l i n g e n s i ss p 总能准确分类( 1 0 0 ) ， 而对es c a b r a 、e p o l i t a 和ec e r d o n i s 则有1 3 的错误分类率。第2 组卵囊具有褐色或黄 色粗糙卵囊壁并带有明显针刺样构造，此时不需其他参数，可直接分类至单一种es p i n o s a ， 第3 组卵囊的壁光滑，包括es u i s 、点p o r c i 、ed e b l i e c k i ，需先行孢子化后再根据s f 、c f 、1 0 和孢子囊形状指数进行数值分类，结果1 0 0 的最d e b l i e c k i 可准确分类，es u y s 和p o r c y 的 准确率也达9 3 ，在这一分类方法的实际应用中，对这9 种球虫的准确率总体达到9 8 9 。稍后 p 1 i t e 等又在此基础上进行了改进，使整个分类过程实现半自动化，达到了方便、快速、准确， 用少量卵囊即可进行球虫种类流行病学调查的目的。 这种以形态为基础借助于计算机技术进行的数值分类方法，虽然可避免传统分类方法的一些 缺陷，但仍较为费时，需拍摄许多幅单个卵囊的照片，且对光滑型卵囊的球虫种需先进行孢子化， 其实用性受到一定限制。近来，r u t t k o w s k i 等根据球虫1 8 s r d n a 序列中高度保守区序列设计了两 个引物( a p i 和1 9 ) 进行p c r 扩增，结果在所研究的3 种球虫( e p o l i t a ，e p o r c i 和es c a b r a ) 扩 增出长度分别为1 3 1 8 b p ( 前两种) 和1 3 1 6 b p ( 后者) 的d n a 片段，三者间的相互差异仅为2 ， 与上s u i s 的相应扩增产物分别有8 7 ( ep o l i t a ) 和8 6 ( s c a b r a 和ep o r c h 相吻合。经对扩增 相关产物测序，发现其种间序列变异主要在6 8 0 7 7 0 b p 和1 0 7 0 - - 一i l o o b p 之间，以此间序列为基 础分别构建了ep o l i t a 、ep o r c i 、es c a b r a 和上s u i s 的特异性正向引物( 2 0 3 0 b p ) ，p c r 扩 增后，在点p o r c i 形成3 3 0 b p 的扩增产物，而在其他3 种则产生5 6 0 b p 的产物。在针对这4 种球 虫特异性引物中除es c a b r a 的s c a b l 与ep o r c i 有交叉反应外，其余引物都是种特异性的，能 根据从猪粪便中的新鲜卵囊( 无需孢子化) 所提取的d n a 将球虫方便的鉴定至种。理论上计算， 仅需2 5 0 个艾美耳球虫卵囊利2 5 个等孢球虫卵囊即可进行准确分类；且该法可用于对卵囊或孢子 囊结构已有损伤缄长时间保存的陈旧性卵囊进行精确分类。 而在猪等孢球虫，同样以的p c r 产物进行多态性分析和聚类分析后发现，有斯氏体或无斯氏 一8 一 体的不同种等孢球虫差异较大，在无斯氏体的等孢球虫1 8 s r d n a 与肉孢子虫科成员间同源性更人 一些，而有斯氏体者则与艾美耳科同源性较大，因此有人建议在系统分类上，上s u i s ( 无斯氏体) 应归于肉孢子虫科( s a r c o c y s t i d a e ) 5 一町 3 猪球虫生活史 迄今为止，在猪球虫中，仅只有点s c a b r a 、es p i n o s a 、d e b l i e c k i 、n e o d e b l i e c k i 、和 上s u i g s 中的生活史得到实验研究。对其它6 种艾美耳球虫的生活史过程还不详细了解。一般而言， 猪艾美耳球虫的潜隐期多在1 0 - - - 1 4 日间，排卵囊持续期( 明显期) 也长达6 - 1 0 日。在2 5 重铬酸 钾溶液中于2 5 。c 孢子化时一般也需l o d 以上阳9 1 。据调查，从新鲜猪粪便中分离的9 种艾美耳球虫卵 囊( 未发现n e o d e b l i e c k d 在1 2 5 的重铬酸钾溶液中于3 0 。c 通氧孵化，1 2 d 时有9 7 的卵囊完成 孢子化。但猪等孢球虫的潜隐期较短，为4 6 d 。明显期为3 , - u 1 3 d ，卵囊的体外孢子化时间为3 5 d 。 3 1 猪艾美耳球虫生活史 现以en e o d e b l i e c k i 为例说明猪艾美耳球虫的生活史心钔 en e o d e b l i e e k i 的卵囊为椭圆形或卵圆形，卵囊壁双层，无色，外层光滑，无微孔。孢子化 卵囊大小为1 9 8 1 5 2 ( 1 7 2 4 x 1 4 - - - 1 8 ) ui l l ，无卵囊残体，有极粒。孢子囊长卵圆形，有明显 的斯氏体利孢子囊残体，孢子囊大小为1 3 1 6 1 ( 1 2 1 4 5 - - 7 ) um 。在2 5 重铬酸钾中于2 5 孢子化需时l o 1 2 d ，而在2 0 。c 时则需1 6 d 才能完成孢子化。其内生性发育是在距回盲口5 0 3 0 0 c m 处的中后段空肠肠绒毛上皮细胞内进行的。口服感染en e o d e b l i e c k2 5 x1 0 4 孢子化卵囊后5 d 时， 首先在后段空肠的组织切片中，于肠隐窝处的肠细胞内出现末成熟的单核裂殖体，星球形，位于 宿主细胞核上方的顶端胞质中，大小为1 5 3l am ，每个细胞内可达5 个裂殖体，至第7 d 时，可见 到球形的成熟裂殖体，沿周边分布有1 0 - - - 1 8 个核，至第8 d 裂殖体增殖至最大，含1 2 - - 2 0 个新月形 的裂殖子，此时刮取肠粘膜涂片进行显微镜检查，可见到大小为8 i 1 0 - 一i 5um 的裂殖子。至 第9 d ，开始山现未成熟的大配子体( 3 - - 5 um ) ，第l o d 时，裂殖生殖仍在进行，但已有合子形成， 此时的组织切片上可见剑8 的末成熟的裂殖体，1 3 的未成熟的大配子体，5 9 的成熟大配子体， 1 6 的正在发育的小配子体和4 卵囊。在胍染色切片上，成熟大配子的特征是胞质中含多量嗜伊 红颗粒。在成熟的小配子体中小配子星周边分布，中央有8 - 1 01 1m 大小的残体。l l 1 2 d 时仍有 少量有性期虫体，至1 4 d h 寸在肠切片上再也术见内生性各阶段虫体。感染后l o d 时，粪便中可查到 卵囊，排卵囊持续期6 - 8 d ，排卵囊高峰期为感染后第l o d ( 4 8 0 6 54 - 2 1 7 8 9 0 p g ) 和l l d ( 3 4 4 4 5 3 2 0 2 6 0 p g ) 。临床症状显示期为第8 l l d 。尽管在这研究中只发现一代裂殖体，但所见到的裂殖 体很可能是第二代裂殖体，因为感染后第5 - - 一6 d 时球形单核的裂殖体大量出现，表明在此之前应存 在第一代裂殖生殖，只不过由于数量较少，而在组织切片或粘膜涂片上未能发现而已。 3 2 猪等孢球虫的生活史 等孢球虫的生活史可分为三个阶段：孢子生殖( 孢子化) 阶段、裂殖生殖( 裂体增殖) 阶段、 一9 一 配子生殖( 有性生殖) 阶段。裂殖生殖阶段和配子生殖阶段是在机体内完成的，合称为内生发 育阶段。 孢子化阶段是指粪便中的卵囊从未孢子化的、不具有感染力的阶段发育为有感染力的阶段。 整个孢子化过程是在机体外完成的，进行孢子化时必须有合适的温度和湿度，在2 0 c 3 7 c 时猪 等孢球虫的卵囊能迅速孢子化( l i n d s a y ，1 9 8 2 ) ，一般在2 8 c 左右人工进行孢子化。据赵德明等 报道猪等孢球虫在1 2 h 以内即可迅速孢子化， 左仰贤报道乜1 猪等孢球虫孢子化需3 5 d ；孔繁 瑶报道猪等孢球虫形成子孢子需要的的时间为9 6 h “1 、6 3h 畸1 ；完全孢子化后，其卵囊含2 个孢子 囊，每个孢子囊均有4 个子孢子。 感染性孢子化卵囊被机体摄入后，经过胃，卵囊壁发生变化，使胆盐和消化酶进入并激活子 孢子，被激活的子孢子从孢子囊和卵囊中脱离出来并进入肠腔，然后子孢子穿透肠上皮细胞，开 始进入增殖的内生发育阶段。 内生发育阶段在整个小肠肠上皮细胞