（病原生物学专业论文）a组轮状病毒nsp1基因的克隆表达及免疫学性质研究.pdf

目录 舢m 删 y 1 7 7 5 7 d 摘j i j 1 前言3 实验材料及方法7 一、实验材料。7 二、实验方法9 结果与分析1 8 讨论2 5 小结2 7 参考文献2 8 论文综述3 1 附录4 0 ( 一) 缩略词4 0 ( 二) 主要溶液配方4 1 ( 三) 实验方法5 2 ( 四) 轮状病毒t b c h e n 株n s p l 基因核苷酸序列及氨基酸序列5 9 j c 谢6 1 研究生简历6 2 独创性声明。6 3 学位论文版权使用授权书。6 3 中围医学科学院& 北京协和医学院侦f j 研究生毕业论文 摘要 轮状病毒( r o t a v i r u s ，r v ) 属于呼肠病毒科( 胎d v f 以出p ) 轮状病毒属( 肋胁v f ，琊) ， 是一个直径约为7 0 n m ，无包膜，具有三层衣壳蛋白组成的正二十面体双链r n a 病毒。 r v 是引起哺乳类和鸟类及人类腹泻的主要病原体，每年全球因r v 感染所导致的重 症腹泻而死亡的儿童约6 0 0o o o 。l w 基因组包含1 1 个分节段的双链r n a ，编码6 个结 构蛋白( v p l v p 4 ，v p 6 ，v p 7 ) 和6 个非结构蛋白( n s p l n s p 6 ) 。根据结构蛋白 v p 6 的抗原性差异，可将已发现的轮状病毒分为a g 7 个组，其中，a 组为引起婴幼 儿腹泻的主要病原。 r vn s p l 在病毒与宿主的相互作用中发挥着重要的功能。本研究运用基因克隆 和重组表达技术在大肠杆菌中表达了r vt b c h e n 株n s p l 蛋白，进行了n s p l 的 免疫学性质和r v 感染细胞中n s p l 蛋白的合成与分布以及n s p l 的系统进化和基 因分型研究。结果表明，大肠杆菌b l 2 l ( d e 3 ) 能高效表达重组n s p l 蛋白( r n s p l ) ， r n s p l 表达量约占菌体总蛋白的3 4 4 。r n s p l 能诱导免疫豚鼠产生特异性血清抗 体。w e s t e mb l o t 及免疫荧光检测结果表明，抗r n s p l 血清抗体能特异性识别自身 蛋白，对s a l l ，w a 株的n s p l 蛋白有交叉反应性：免疫荧光结果还表明，s a l l 感染的m a l 0 4 细胞中合成的n s p l 蛋白在细胞质中区域化聚集形成辐射状排列的 颗粒状结构，而w a 株的n s p l 不能形成此样结构。分子系统进化研究结果表明， 至今发现的a 组r v 至少可以分为1 6 个不同的n s p l 基因型，t b c h e n 株n s p l 为 a 2 型。不同n s p l 基因型病毒具有独特的敏感宿主范围，同一n s p l 基因型可能感 染不同种动物，同一种动物也可能感染不同基因型。本研究结果为进一步研究n s p l 蛋白质的结构功能及其应用开发奠定了很好的基础。 【关键词】轮状病毒：n s p l ；重组表达；免疫学性质；亚细胞分布；基因分型 中圈医学科学院& 北京协和医学院顺i j 研究生毕业论义 a b s t r a c t r o t a v i m s e s ( r v s ) b e l o n gt ot h e 锄n i l yo f 尺e d v f ，f 幽p ，g e n u s 尺d 缸，咖般t h ep 矾i c l e o fl i sad o u b l e s t r a i n e dr n a ( d s r n a ) v i r u so fi c o s a h e d r a ls ) ，m m e t r y m e a s u r e s7 5 1 1 1 1 1 i nd i 锄e t e r ，a n dc o n s i s t so ft h r e el a y e r sw i t h o u te n v e l o p e r vi n f e c t i o ni st h ec h i e f e t i o l o 舀ca g e n to fv i r a lg a s t r o e n t 甜t i so fh u m a n s ，m a m m a l sa i l db i r d s t h e r ea r ea b o u t 6 0 00 0 0c h i l d 锄d i e d 舶mr vc a u s e da c u t eg a s t r o e n t 甜l i s 哲o b a l l ye a c hy e 札r v g e n o m eh a s1 1s e 舯e n t so fd s r n a ，w h i c h 肌c o d e6s t m c t u r a lp r o t e i n s ( v pl - v p 4 ，v p 6 ， v p 7 ) a 1 1 d6n o n s t n l c n j r a lp r o t e i n s ( n s p1 n s p 6 ) r v sc a n f a ni n t os e v e ng r o u p s ( at og ) a c c o f d i n gt ot h ea n t i g e n i cs p e c i f i c i t yo ft h ev p 6p r o t e i n g r o u pa r v sa r et h em a j o r c a u s co fa c u t eg a s t r o e n t 鲥t i si ni n f i 觚t sa 1 1 dy o u n gc h i l d r e n t h en o ns 仃u c 山同p r o t e i n1 ( n s p 1 ) p l a y sav e 叫i m p o r t a n tr o l ei ni n t e r a c t i o n b e 附e e l lv i r u sa 1 1 dh o s t i i lt h i sa n i c l e ，t l l e 如l l l e l l g t hg e l l eo fm en s p 1o fs t r a i n t b c h e nw a se x p r e s s e di nec d 以b l 2l ( d e 3 ) c e l l su s i n gg e n ec l o n i n ga n de x p r e s s i o n t e c i l f l 0 1 0 舀e s ，a n di m m u l l o g e n i c i t y ，s y n t h e s i sa 1 1 ds u b c e l l u l a rd i s t r i b u t i o no ft h en s p l p r o t e i ni nr vi n f e c t e dc e l l s ，a n dp h y l o g e i l e s i sa n dg e n o t y p e so ft h en s p lw e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h er e c o m b i n a n tn s pl p r o t e i n ( i n s p1 ) c o u l db eh i g h l y e x p r e s s e di ne c d ，fb l 2 1 ( d e 3 ) c e l l s ，w h i c hp o s s e s s e s3 4 4 o ft o t a lc e l lp r o t e i n s t h e r - n s p1c o u l de l i c i ts p e c i f i ca n t i b o d i e si ng u i n e ap i g s ，a n dt h ea n t i b o d i e sc o u l dr e a c tw i t h t h ef n s p li t s e l fa n dn s p lp r o t e i ne x p r e s s e di ns a l li n f e c t e do rw ai n f e c t e dm a l 0 4 c e l l sb yw e s t 锄b l o ta i l di m m u n o n u o r e s e n c ea s s a y t l l er e s u l t so fi m m u n o f l u o f e s e n c e a l s os h o w e dt h a tn s pl p r o t e i nw a sa g g r e g a t e di nt h ec 矿o p l a s ma n df o 肌e dr a d i a t e 伊a i i u l a rs t m c n l r ea r o u n dn u c l e u so fs a 1 1i n f e c t e dm a l0 4c e l l sb u tn o ti nw ai n f e c t e d m a l0 4c e l l s a tl e a s t16r e i c o 印i z e dg e l l o t y p e so fn s plw e r ec l a s s i f i e di ng r o u pa r v s ， b a s e do nd i v e r s i t yo fs e q u e i l c e so ft h en s p lo p e i lr e a d i n g 舶m e ( o r f ) ，a i l dt b c h e l l s 咖i l ln s p lw a sd e f i n e da sg e n o t y p ea 2 r v sw i t hd i f 】融崩l tn s p1 g e n o t y p eh a v e s p e c i 6 ch o s tr a i l g e s ，r v sp o s s e s s i n gm es a m en s p 1 g e n o t y p ec 锄i n f l c c td i 保孙e n t s p 撕e s ，s 锄es p e c i e sc a l lb ei n f e c t e dw i t hr v sp o s s e s s i n gd i 腩r e i l tn s p 1 g e i l o t y p e s t h er e s u l t so b t a i n e di nt h ep r e s e n ts t u d ya r ei m p o r t a i l tf o rm n h e rs t u d y i n go ns t m c t u r e ， 矗m c t i o na n di m m u n o l o 舀c a lp r o p e n i e so ft h en s p 1 i k e yw o r d s lr o t a v i m s ； n s p l ； r e c o m b i n a n t e x p r e s s i o n ；i m m u n o l o 西c a lp r o p e r t i e s ； s u b c e l l u l a rd i s t 曲u t i o n ；g e n o t y p i n g 2 中国医学科学院& 北京协和医学院颂i j 研究生毕业论文 1 l 刖看 轮状病毒( r o t a v i r u s ，r v ) 是世界范围内致婴幼儿重症腹泻最重要的病原， 掘统计每年约有6 0 00 0 0 名儿蕈死于r v 感染导致的重症腹泻【啦】。在发展中国家由 于缺乏健全的医疗保证体系，最易导致轮状病毒的流行与病死【3 】。 1 9 7 3 年，澳大利亚科学家露丝毕夏普( r u t hb i s h o p ) 在儿童肠胃炎的研究报 告上描述了一种导致儿童重症腹泻的病毒【4 1 。1 9 7 4 年，汤玛斯亨利费留特( n o m 嬲 h e n r yf l e w 甜) 在通过电子显微镜观察过这类病毒之后，建议将其命名为“轮状病 毒”【5 6 】。电镜下的病毒颗粒结构如图l 所示。 图1 分离自大便样品中的h l w 电镜照片 f i g 1e l e c n o nm i c r o 黟a p ho 仆u m a nr o t a v i n l s e si s o l a t e df r ( 粕s t o o ls p e c i m e f l s ( f b mc b n c h e n o s m o n dp f 口，) g e n o m e e n c o d e d v i r i o ns c h e m a t i c s e g f 哐n t s p r o t e 噜s f p r o t e j nl o c 删o n l ”、 蓦蠹三越 = ； 茹= 二鬻二嚣 。 _ 。，2 一燃 n s p 3 一蝴 一1 。了篙二一 户n s 一- - h s p 6 i m 、 嫱i 图2 r v 基因组编码蛋白质模式图及其病毒粒子的构成模式 f i g 2g e n ec c i d i n g 弱s i 护1 i n 即t sa n dl l ep a t t 锄t 1 1 a tp m t e i i l sm a k e du p 吐l ev j n 玛p a n i c l eo f r v ( f 如m ：h t t p ：肌哪、m b c m e d u m o l v i 川a b s r a m i g - l a b 瓜a m i g o d i n g a s s i 髓m 饥t s h t m ) 中国医学科学院& 北京协和医学院颂f f p f 究生毕业论文 r v 属于呼肠病毒科( 尺v f ，f c 扔p ) 轮状病毒属( 尺d 胁v 护淞) 。电镜下r v 形态呈二 十面体，完整的病毒是一个直径约为7 0 n m ，无包膜，具有三层衣壳的双链r n a 病毒。 r v 基因组包含1 1 个分节段r n a 分子，共编码6 个结构蛋白v p l - v p 4 ，v p 6 ，v p 7 和6 个非结构蛋白n s p l n s p 6 【7 】ov p l 、v p 2 、v p 3 构成病毒的核心衣壳，包裹病毒全部 的基因组。v p 4 和v p 7 是病毒最外层结构的单元。中层衣壳由病毒含量最多的组抗 原v p 6 组成，根据v p 6 的抗原的特异性，目前已发现的r v 可分为7 个组( g r o u p a g ) ， 其中，a 组为引起婴幼儿腹泻的主要病原。图2 显示的是轮状病毒的基因及其编码的 蛋白以及轮状病毒的构成结构。 r v 感染的靶细胞是小肠局部的微绒毛上皮细胞，虽然有些人类i w 株能感染成 人，但r v 的主要感染对象是婴幼儿。往往，i w 在初次感染时都伴有较严重的症状， 然而随着感染次数的增加，症状有明显的改善【8 】。这与获得性免疫的记忆性相符， 肠道有关的特异免疫器官主要为肠道淋巴样组织( g u t - a s s o c i a t e dl 舯p h a t i ct i s s u e ， g a l t ) ，肠黏膜2 5 是由g a l t 构成。研究表明分泌型的抗体s i g a 在保护反应中起 到重要的作用，分泌型的抗体s i g a 则是黏膜局部抗感染的主要免疫分子。s i g a 在急 性期和重症r v 肠炎的患儿体内的水平明显减少，可能原因是r v 感染肠黏膜后导致 分泌i 酚的浆细胞大量减少。另外，对于婴幼儿来说，肠道的免疫功能在出生时尚 未健全，这也可能是婴幼儿对其极其易感的一方面原因。 组成r v 最外层壳体的蛋白v p 4 、v p 7 ，是中和抗体产生的靶标蛋白，这两种蛋 白都能很好的诱导产生i w 特异性的中和抗体【9 1 ，v p 4 能被蛋白酶切割成2 条多肽 ( v p 5 宰和v p 8 宰) ，v p 7 是一种糖蛋白。根据基因编码框( o r f ) 核苷酸序列同源性 差异，可将v p 4 ( p 型) 和v p 7 ( g 型) 分为不同的基因型。在a 组感染人类的病毒 株中，以g 1 g 4 与p 4 和p 8 的组合体以及g 9 p 6 ，g 9 p 8 基因型r v 最多【l o 】。最近，很 多来自动物实验的研究结果发现，由结构蛋白6 ( v p 6 ) 激起的体液免疫和细胞免疫 对r v 感染都能起到保护作用】。 r v 感染的部位在小肠上皮处，然而近些年来，不断有报道指出血清型抗体i g g 对中和病毒是可以起到作用，但是仍然存在争议。虽然通过对老鼠、猴等动物模型 的研究，了解了一些细胞因子、淋巴细胞是如何保护机体免受r v 感染引起的严重腹 泻。然而，i 在不同的动物中感染及机体产生的免疫应答相差较大【1 2 1 。根据以往 对r v 感染小鼠的研究，小鼠感染r v 后所引起的免疫反应及后续过程大体可以用以 下几步来描述( 见图3 ) 。病毒入侵后，机体能产生针对外壳蛋白v p 4 、v p 7 的特异 性抗体，这些抗体结合r v 表面的v p 4 、v p 7 后能阻止病毒与宿主细胞的结合以及进 入靶细胞。若病毒成功逃避这步，那么病毒就可以进入细胞并在细胞内复制，病毒 复制产生的病毒蛋白会导致细胞内膜的稳定状态发生改变而引起吸收不良或腹泻。 r v 的感染还会导致细胞内c a 2 + 的浓度升高，使得细胞骨架结构、细胞间的连接都会 遭到破坏，从而改变了细胞的通透性。在细胞内复制的r v 可能会与跨细胞转运的分 4 中固医学科学院北京协和医学院顺l ：研究生毕业论文 泌型v p 6 抗体( a n t i - v p 6s i g a ) 作用从而阻止病毒在细胞内的复制，由r v 激活的分 泌细胞因子的特异性t 细胞也能阻止r v 的复制。若这机体的这些免疫反应仍然不能 有效阻止病毒的复制，n s p 4 蛋白将会诱导c f t r ( n o n c y s t i c 仙r o s i st r a n s m e m b 砌e c o n d u c t a n c er e g u l a t o r ) 介导的腹泻。然而对婴幼儿感染r v 的早期的免疫应答却知之 甚少【1 2 1 。 图3 1 w 感染和免疫的可能机制 f 嘻3p o t e i l t i a lm e c h a n i s m so f r o t a 、，i n l sp a t h o g e n e s i sa n di i i l m u n 时( f r o mj u 锄aa n g e l ) a 组r v 非结构蛋白l ( n o n s t r u c t l j r a lp r o t e i nl ，n s p l ) 是由病毒基因组第5 基 因片段编码，其序列差异性很大，是r v 蛋白中最不保守的蛋白，一般的基因片段 长约15 0 0 b p ，约编码4 8 6 个a a ，分子量约5 4 k d 【1 3 - 1 4 j 。在病毒感染细胞中起抗干 扰素( i n t e m 釉na n t a g o n i s t ) 作用，因而将n s p l 的基因型以“a ”表利2 8 1 。 以往的研究表明n s p l 蛋白是r v 蛋白质中保守性相对较低的一种蛋白【2 引，氨 基末端存在一个由8 l 氨基酸组成的具有相对保守结构，在这一结构里半胱氨酸含 量丰富，在a 组和c 组r vn s p l 中这一富含半胱氨酸的序列具有 c - x 2 一c x 8 c x 2 c x 3 h x c x 2 c x 5 c 保守基序的结构特征f 1 5 ，1 6 j 。在体外实验中， 其可以和锌离子结合，估计可以形成特定的锌指结构旧，与r v 病毒r n a 特异结 合f 1 3 1 8 1 9 1 。羧基端可以与干扰素调节因子家族( i n t e 疵r o nr e g u l a t o wf a c t o r i l m i r f f ) 成员的共同区域相互作用，通过蛋白酶体依赖途径将i r f f 家族成员降解从 而阻断干扰素表达的信号通路，降低i 型干扰素( i f ni ) 的表达，从而抑制宿主天 然抗病毒免疫机制的建立，使r v 可以在宿主细胞间传播【2 0 】。免疫荧光实验表明 n s p l 蛋白可以与细胞骨架蛋白作用，相互作用的区域定位于n s p l 蛋白锌结合结 构相邻的约1 0 0 个氨基酸残基组成的序列中，见图4 。 中围医学科学院北京协和医学院硕i ：研究生毕业论文 叭n s p l l 弘1 l 搿 图4 野生型s a l l - 4 f 株r vn s p l 蛋白的功能结构域 f i g 4t 1 l em n c t i o ns t m c m r eo fw i l dt y p es al l - 4 fn s p lp m t e i n 尽管对n s p l 蛋白的生物学功能已有一些研究，但对n s p l 蛋白的结构以及免 疫学性质的了解还很少。对n s p l 基因和蛋白的进一步研究，有利于深入认识其结 构与功能以及研制控制r v 感染的预防疫苗和治疗药物。 t b c h e n 是一株分离自胃肠炎患儿的r v ，是国内全基因序列被克隆和研究的 第一株a 组r v 【2 1 ，2 2 1 。对t b c h e n 株病毒的v p 4 ，v p 6 ，n s p 2 ，n s p 3 ，n s p 6 ，v p 5 木 和v p 8 宰等蛋白的重组表达以及免疫学性质已有了较好的研究【2 3 2 7 ，3 2 1 。本研究对 t b c h 饥株n s p l 蛋白进行了基因克隆和重组表达，对表达n s p l 蛋白的免疫学性 质、在病毒感染细胞中n s p l 蛋白的合成和亚细胞分布，以及对现有的a 组r v 的 n s p l 蛋白的基因型进行了进一步研究。 6 中困医学科学院& 北京协和医学院坝i j 研究生毕业论义 一、实验材料 1 主要器材 ( 1 ) ( 2 ) ( 3 ) ( 4 ) 材料及方法 冷冻离心机：m i c r o m g el i t e ，德国b e c k m 锄公司；b i o 如g e1 5 r ，德国h e r a e u s 公司；a v a n t ij 一1 0 ，德国b e c k m a i l 公司；h i m a cc p 5 6 g ，日本h i t a c h i 公司 p c r 仪：p t c 2 0 0 ，美国m jr e s e a r c h 公司 核酸电泳仪：d y 弘i i i ，北京六一仪器厂 蛋白电泳仪：s e 6 0 0 ，美国p h 撇a c i ab i o t e c h 公司；s e 2 6 0 ，美国p h a 姗a c i a b i o t e c h 公司 蛋白质电泳转膜仪：m 酣o l2 2 1 r b ，美国b i o r a d 公司 凝胶图像分析系统：i m a g e m a s t e rv d s ，美国p h 姗a c i ab i o t e c h 公司 分光光度计：d u 7 5 0 0 ，德国b e c k m a n 公司 四用紫外分析仪：z f 一2 ，江苏海门市其林医用仪器厂 p h 计：p h i3 2 0 ，德国b e c k m a l l 公司 超声波细胞破碎机：j y 9 2 i i ，宁波新芝科器研究所 空气浴振荡器：t h z c ，江苏太仓市实验设备厂 恒温水浴箱：s 6 4 8 ，上海医疗器械七厂 恒温槽：w c 0 9 0 5 ，中国重庆银河试验仪器有限公司 c 0 2 培养箱：l n a 1 2 2 d ，日本t a b a i 公司；t h e n n os c i 铋t m c3 1 1 0 ，美国 t h e n i l of i s h e rs c i e l l t i f i c 公司 ( 1 5 )荧光显微镜：e c l i p s ee 6 0 0 ，日本n i k o n 公司 ( 1 6 ) 酶标仪：b i o r a dm o d e l5 5 0 ，美国b i o r a d 公司 ( 1 7 )洁净工作台：s w 二c j 2 f ，苏州安泰空气技术有限公司 ( 1 8 ) 微波炉：w p 7 0 0 p 2 0 ，广东格兰仕集团有限公司 ( 1 9 )架盘药物天平：h c t p l l b 5 ，北京医用天平厂 ( 2 0 )定时恒温磁力搅拌器：m l 广9 0 2 ，上海浦江分析仪器厂 ( 2 1 ) 微量加样器：g i l s o n ，法国g i l s o n 公司；t h e 册o ，美国t h e n i l of i s h e r s c i e l l t i f i c 公司 ( 2 2 )8 0 冰箱：t h e 肌of o m a ，美国t h e n l l of i s h e rs c i e l l t i 6 c 公司 ( 2 3 ) 细胞培养仪：p b 1 ，国营京西机械厂 ( 2 4 ) 转移脱色摇床：t s 8 ，江苏海门市麒麟医用仪器厂 7 ) )o 1 2 3 4 5 6 7 8 9 l l l l l( 中国医学科学院& 北京协和医学院颂i ：研究生毕业论义 ( 2 5 )制冰机：z b e 2 5 0 ，德国z i e g r ae i s m a s c h i n e n 公司 ( 2 6 ) 旋涡混合器：q l 9 0 1 ，江苏海门市麒麟医用仪器厂 ( 2 7 )高压蒸汽灭菌锅：s x 5 0 0 ，同本t o m yk o g y o 有限公司 ( 2 8 )细胞培养板：六孔板9 6 孔板，德国g r e i n e rb i o o n e 公司 2 主要试剂 ( 1 ) 限制性核酸内切酶及d n a 分子量标准和t 4d n a 连接酶：宝生物( 大连) t a k a r ab i o 公司生产。 ( 2 )d t t 和琼脂糖：美国a m r e s c o 公司生产 ( 3 ) s d s 、丙稀酰胺、嘶s 碱及l 甘氨酸：美国s i 舯a 公司生产 ( 4 )蛋白低分子量标准：美国f e m e n t a s 公司生产 ( 5 ) 乙酰化胰酶：美国s i 舯a 公司生产 ( 6 ) 辣根过氧化物酶( h r p ) 标记的山羊抗豚鼠i g g ：美国s i 舯a 公司生产 ( 7 ) 荧光标记山羊抗豚鼠i g g ：美国s i 舯a 公司生产 ( 8 ) 3 ，3 ，5 ，5 四甲基联苯胺( t m b ) 底物试剂：美国s i 舯a 公司生产 ( 9 )m e m 培养基：同本同水制药株式会社生产 ( 1 0 )硝酸纤维膜：美国b i o r a d 公司生产 ( 11 ) p v d f 膜：美国m i l l i p o r e 公司生产 ( 1 2 ) 3 ，3 二氨基苯胺四氢盐酸( d a b ) 底物试剂：美国s i 舯a 公司生产 ( 1 3 )弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂：美国s i 舯a 公司生产 ( 1 4 )胎牛血清、谷氨酰胺、青霉素、链霉素和n a h c 0 3 ：本所提供。 ( 1 5 ) 其余试剂均为国内生产 3 实验动物 体重2 0 0 9 左右的豚鼠由医学生物学研究所灵长类动物中心和昆明医学院动物 科提供。 4 菌株，载体，细胞系和病毒株 ( 1 ) 大肠杆菌d h 5 n ：医学生物学研究所中心实验室保存，基因型：s u p e 4 4 l a c u l 6 9 ( p 8 0l a c z m 1 5 ) h s d r l 7r e c a le i l d a lg r y a 9 6t h i - 1r e l a l 。说明： 一种用于扩增质粒和粘粒的重组缺陷抑制型菌株。用于质粒d n a 的制备。 ( 2 ) 大肠杆菌b l 2 1 ( d e ) ：医学生物学研究所中心实验室保存，基因型：h s d s g a l ( 九c i t s 8 5 7i n d ls 锄7n i n 51 a c u v 5 t 7g e n e1 ) ，用于载体上由t 7 噬菌体启 动子( t 7p r o m o t o r ) 控制的外源基因的表达。t 7 噬菌体r n a 聚合酶基因 受控于位于九噬菌体d e 3 区的l a c u v 5 启动子，该区整合于b l 2 1 的染色体 上。该菌株作为宿主用于外源重组蛋白的表达。 中国医学科学院& 北京协和医学院硕i j 研究生毕业论义 ( 3 ) ( 4 ) ( 5 ) 恒河猴肾传代细胞( m a l 0 4 细胞) ：医学生物学研究所中心实验室保存， 是最常用的增殖轮状病毒的细胞。 恒河猴轮状病毒s a l l 株和人轮状病毒、株：医学生物学研究所中心实验 室保存，这两株病毒均属于a 组，是轮状病毒的模式株。其中s a l l 基因 型为g 3 p f 2 】；w a 株为g 1 p 8 ，g 1 p 1 a 8 】型是世界范围内最流行的轮状病 毒血清型。 r vn s p l 基因：从t b c h 朗株轮状病毒【2 l 】( 分离自一2 岁龄的急性胃肠炎 患儿大便样品) 中扩增得到。该株r v 为a 组，i i 亚组，基因型为g 2 p 【4 】， 该毒株n s p l 全长基因为1 5 6 7 b p ( 见图5 ) ，编码4 8 6 个氨基酸组成的分子 量为5 7 6 k d a 的蛋白质。该n s p l 基因全长核苷酸及编码氨基酸序列见 g e n b a n k ( a c c e s s i o nn u m b e r ：a y 7 8 7 6 4 7 ) 。n s p l 基因经基因重组，克隆到 质粒p b s ( p b l u e s 舐p t ) 保存。 fc o d i 啕r 叼i r i i l b p3 3 姊1 4 9 3 b p1 5 6 7 b p 图5 完整t 阻c h e n 株n s p l 基因的结构 f i g 5f u l l g e n es 们c t u r eo ft h en s p lo fs t r a i nt b c h e l l ( 6 ) 表达质粒p e t l ：由质粒p e t - 3 a 改造而来，去掉t 7 标签( t 7t a g ) ，并在 如i 和b 口m hi 位点之间插入含有勋ci 单一酶切位点的多克隆位点序列。 该质粒在医学生物学研究所中心实验室保存。 二、实验方法 1 r vn s p l 编码基因的p c r 扩增和检测 r vn s p l 基因克隆自从云南地区一2 岁龄急性胃肠炎患儿大便样品中分离到的 r v ( t b c h e n 株) 。该株r v 为a 组g 2 p 4 】型，其完整的n s p l 基因包含1 5 6 7 个核苷酸， 含有1 个编码框，编码区为3 3 1 4 9 3 b p ，编码1 个含有4 8 6 个氨基酸残基的蛋白，分子 量约为5 7 6 k d 。完整的n s p l 基因5 端起始处有两个相隔很近的a t g ，下游的编码序 列完全相同。普遍认为n s p l 是从第二个a t g 开始编码。t b c h e l l 株r v 完整的n s p l 基因已克隆到质粒p b l u e s 嘶p t 上( p b s n s p l ) 。根据t b c h e n 株r vn s p l 编码区序列， 9 中困医学科学院北京协和医学院影 f j 研究生毕业论文 我们设计了克隆引物( 见表1 ) 。p c r 的反应体系( 总体积1 0 0 l ) 含1 0 x p c rb u 行e r 1 0 u l ，3 0 n gp b s n s p l 的模板d n a ，2 0 p m o l 肛l 的上下游引物各3 “l ，2 5 m 的d n t p s 2 “l ，l a t a qd n a 聚合酶5 u ，用无菌d d h 2 0 补足。 表ln s p l 基因p c r 反应的引物 p c r 反应的程序为：9 4 预变性3 m i n ；9 4 变性4 5 s ，5 6 复性4 5 s ，7 2 延伸 反应l m i n ，共4 0 个循环。最后，在7 2 反应1o m i n 。取5 “lp c r 扩增产物在1 5 的 琼脂糖凝胶( 含o 5 “咖l 溴乙锭，e b ) 中电泳检测。 2 p b s n s p l 的p c r 扩增产物的纯化 取9 5 “lp c r 产物，与适当体积的d n al o a d i n gb u 舐r 混合后，加入到含 0 5 “咖le b 、浓度为1 5 的琼脂糖凝胶的上样孔中，1 4 0 v 恒压电泳至溴酚蓝跑至 凝胶底部。在紫外光下观察，用刀片切下目的条带，将胶条装入预先用d d h 2 0 浸泡、 t e 润洗过的合适截流分子量的d n a 透析袋中，加入t e 溶液。在1 4 0 v 恒压条件 下电泳分离，使d n a 从胶条贴近透析袋的一侧向另一侧电泳。当目的条带电泳跑 出胶条后倒转电极，反向电泳2 0 s ，吸出溶液。 核酸溶液在4 ，5o o o 叩m 离心5 m i n 去固体杂质，移上清至另一离心管中。 用等体积的酚和氯仿各抽提一次。回收的核酸溶液中加入醋酸钠至终浓度为o 3 m ， 再加入2 倍体积的无水乙醇，冰上放置1 5 m i n ，沉淀d n a 。4 ，1 5o o o r p m 离心 1 5 m i n ，沉淀用少量的7 5 乙醇漂洗一次，4 2 烘干箱中干燥后用适量的无菌t e 溶解，使其d n a 的含量约为l p p l 。取o 5 斗l 的回收d n a 在进行琼脂糖凝胶电 泳检测。 3 n s p lp c r 产物p m d 1 8 的克隆质粒构建 将纯化的n s p l 基因1 5 此在下列反应条件：o 5 p lp m d 1 8 克隆载体；1 2 此 1 0 t 4l i g a s eb u f | f e r ；l p l5 w e i s su p l 的t 4 d n al i g a s e ；d d h 2 0 补充到总体积1 2 扯l 。 将整个反应设定在2 2 下过夜。 将连接过夜的d n a 转化d h 5 a 感受态细胞，方法如下：取低温冻存的大肠杆 菌d h 5 q 感受念细胞，立即手捂融化后，加入连接产物，混匀后冰上静置3 0 m i n ， l o 中固医学科学院北京协和医学院颂i ：研究生毕业论文 转到4 2 水浴7 0 s ，然后冰上放置5 m i n ，接着加入5 0 0 “ll b 培养基，混匀，3 7 孵育3 0 m i n ，20 0 0 r p m 离心3 0 s 。吸出4 0 0 h l 上清，剩余的上清与沉淀混匀均匀的 涂在涂有7 “l 2 0 ( m v ) 的i p t g ，2 0 p l 4 x g a l 的l b 培养平板上( 含2 0 0 “咖l 氨苄青霉素，a m p ) ，3 7 培养箱中倒置培养1 6 1 1 r 。重组的含n s p l 基因的p m d 克 隆质粒结构如图6 所示。 三 ；三 圭 兰 = 一t - c i j n g s 的 回 收 产 物 图6 重组克隆质粒p m d n s p l 结构示意图 f i g 6s t n l c m r eo fr e c o m b i n a n tc l o n i n gp l a s m i dp m d j n s p l 4 重组p m d n s p l 质粒d n a 的制备和鉴定 ( 1 ) 碱裂解法小量制备质粒d n a 挑选数个白色菌落及少数几个蓝色菌落进行d n a 扩增。菌落接种到3 m l 含 2 0 0 p m l 的a m p 的l b 培养液中，1 3 0 印m 摇床3 7 培养过夜( 1 4 h r ) ，取1 5 m l 培养液加入1 5 m le p p e i l d o r f 离心管中，4 ，3o o o 印m 离心5 m i n 收集菌体。将菌 体重悬于1 7 0 此预冷的s o l i 中，振荡混匀；加入1 7 0 此s o l ，迅速温和颠倒摇匀 离心管，确保离心管整个内表面均与s o l 接触，置于冰上5 m i n ；加入1 7 0 l s o l ， 摇匀，置于冰上1 5 m i n 。4 ，1 5o o o 印m 离心l o m i n ，将上清转至另外一个离心管 中，用等体积酚氯仿，氯仿各抽提一次。4 ，1 5o o or p m 离心1 0 m i n ，取上清， 加两倍体积预冷的乙醇置于冰上2 0 m i n 沉淀质粒d n a 。4 ，1 5o o o 印m 离心1 5 m i n ， 除去上清，用7 5 预冷的乙醇洗沉淀，3 7 干燥4 5 m i n 。用2 0 此t e ( p h 7 4 ) 溶解 沉淀。 ( 2 ) 舭i b 口删hi 酶切鉴定重组克隆质粒 将溶解的小量制备的质粒d n a ( p m d n s p l 克隆质粒) 1 5 “l 在酶切体系为： 1 2 p lk - b u 伺陆；0 3 肛l 如i o 3 p l 曰口聊hi ；0 1 “lr n a s e ；其他部分用d d h 2 0 补足 到1 2 此。混匀后，在3 7 水浴中反应1 5 h 。然后将酶切的d n a 样品加样到含 0 5 p 咖l e b 的1 5 琼脂糖凝胶中电泳检测，根据电泳结果判定阳性克隆。 中困医学科学院& 北京协和仄学院硕i j j f 究生毕业论义 ( 3 ) 大量制各质粒d n a 将5 0 h l 被鉴定为含有阳性质粒d n a 的细菌培养液转接到3 0 0 m l 含2 0 0 p m l 的a m p 的l b 培养液中以同样的条件培养1 4 h r 。菌液收集在5 0 0 m l 离心管中。在 4 ，4o o o 印m 离心8 m i n ，收集菌体。菌体用3 0 m lt e 重悬，转入3 0 m l 离心管， 4 ，50 0 0 r p m 离心6 m i n ，弃上清。菌体加3 m l 预冷的s o l i ，振荡混匀。加4 m ls o l m 温和摇匀，冰置8 m i n ，加4 m l s o l ，摇匀至碎片状，冰置2 5 m i n 。4 ，1 2o o o r p m 离心2 0 m i n ，取上清。上清中加入等体积酚氯仿，充分振荡，4 ，1 20 0 0 印m 离心 1 0 m i n ，取上清。加入等体积氯仿，振荡，4 ，1 20 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，取上清。 上清中加入2 倍体积无水乙醇，冰置3 0 m i n ，4 ，1 20 0 0 印m 离心2 0 m i n 。除去上 清，用7 5 预冷的乙醇沈沉淀，3 7 干燥后，沉淀用1 8 m lt e 溶解沉淀，加9 斗l r n a s e ( 1 0 m m l ) ，4 2 消化2 0 m i n 。重新用等体积的酚氯仿和氯仿各抽提一次， 加1 2 体积的预冷p e g 溶液，混匀后冰置2 0 m i n 。4 ，1 20 0 0 r p m 离心1 5 m i n ，7 5 的乙醇漂洗沉淀。沉淀干燥后，溶解于9 0 0 “l p h 7 4 的t e 中，加1 0 0 “l3 m 的醋酸 钠，加2 倍体积的预冷无水乙醇。置于2 0 2 0 m i n ，4 ，1 50 0 0 r p m 离心1 5 m i n 。 7 5 的乙醇漂沈沉淀。沉淀干燥后，溶于1 m lt e 。 再次用双酶切的方法鉴定大量制备的p m d n s p l 质粒d n a 后，将鉴定为正确的 质粒保存在2 0 条件下。 5 制备a ，如i b 口朋hi 酶切的n s p l 基因的编码及p e t 载体片断 ( 1 ) 将大量制备得到的p m d n s p l 质粒4 l 在反应体系为：如i ( 1 0 u p l )