（药理学专业论文）大鼠局灶性脑缺血再灌注损的生物标志物的实验研究.pdf

、 徐州医学院硕士学位论文 缩略词 c c a c p m g c s f d 2 0 e c a i r f d i c a m c a m c a o n m r p c a 缩略词表 a b b r e v i a t i o n 英文全称 c o m m o nc a r o t i da r t e r y 中文全称 颈总动脉 c a r r - p u r c e l l - m e i b o o m g i l l 自旋回波序列 c e r e b r o s p i n a lf l u i d d e u t e r i u mo x i d e e x t e r n a lc a r o t i da r t e r y i s c h e m i a r e p e r f u s i o n f r e ei n d u c t i o nd e c a y i n t e m a lc a r o t i da r t e r y m i d d l ec e r e b r a la r t e r y m i d d l ec e r e b r a la r t e r yo c c l u s i o n n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e p r i n c i p a lc o m p o n e n t sa n a l y s i s 脑脊液 重水( 氘水) 颈外动脉 缺血再灌注 自由感应衰减 颈内动脉 大脑中动脉 大脑中动脉闭塞 核磁共振波谱 主成分分析 。、p l s d a p a r t i a ll e a s ts q u a r e s d i s c r i m i n a n ta n a l y s i s 偏最小二乘法一判别分析 t s p 3 - t r i m e t h y l s i l y l 一2 h 4 - p r o p i o n i ca c i d3 三甲基甲硅烷基 ( 2 ，2 ，3 ，3 四氘氢) 丙酸 t r i p h e n y lt e t r a z o l i u mc h l o r i d e2 , 3 ，5 - 三苯基四氮唑 0 徐州医学院硕士学位论文 大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤生物标志物的 实验研究 中文摘要 目的从系统生物学层面寻找大鼠局灶性脑缺血( m c a o ) 再灌注损伤时体 内的“生物标志物 ，为缺血性脑损伤发病机制研究和治疗药物的筛选提供靶点。 方法本研究采用基于核磁共振氢谱( 1 h 】蝴r ) 的代谢组学分析手段，结合 多变量数据统计分析( p l s d a ) 和t 检验，观察大鼠在m c a o 再灌注0h 、0 5h 、 1h 、3h 、6h 、1 2h 、2 4 h 各时间点脑脊液和血清中代谢成分的变化及变化规律， 进而筛选出能够评价大鼠m c a o 再灌注损伤的生物标志物。 结果 1 大鼠m c a o 再灌注不同时间点的脑脊液和血清样本，其1 h n m r 图谱均未出现 明显化学位移漂移，能够满足代谢组学分析的要求。 2 脑脊液样本偏最d - - 乘法一判别分析( p l s d a ) 得分图显示，大鼠m c a o 再 灌注2 4 h 内各组均能与假手术组( s h a m ) 很好分开，利用p l s d a 载荷图和相 关数据库我们得到了2 4 种含量变化明显的代谢物质。其中又以缬氨酸、酮异 戊酸、丙氨酸、乙酸、谷氨酸、丙酮、乙酰乙酸、丫氨基丁酸、草酰乙酸、丙 酮酸、柠檬酸、肌氨酸酐、肌醇和葡萄糖的变化最为明显( 与s h a m 组比较载 荷值大于1 o ) 。 缬氨酸、乙酰乙酸和丙酮酸的相对含量在再灌注6 h 明显升高( p 0 0 1 ) ， 随后开始降低，到再灌注2 4 h 明显低于s h a m 组( p 0 0 5 ) ；酮异戊酸、丙氨酸、 乙酸、谷氨酸和肌氨酸酐的相对含量也在再灌注6 h 升高显著( p 0 0 5 ) ；丙酮、y 氨基丁酸、草酰乙酸和 柠檬酸的相对含量在再灌注1 2 h 达到高峰( 氏0 0 1 ) ，随后开始回落；肌醇和葡 萄糖的相对含量均出现了两次降低，第一次分别出现在再灌注o 5 h 和1 h 2 。-一。il一t 。 、 徐州医学院硕士学位论文 ( p o 0 5 ) ，第二次均出现在再灌注6 h ( 尸 o 0 5 ) 。 3同样的方法，我们在大鼠m c a o 再灌注2 4 h 内血清样本中得到了1 2 种含量变 化明显的代谢物质。其中又以丙二酸和甘氨酸的变化最为明显( 与s h a m 组比 较载荷值大于1 0 ) 。与s h a m 组比较：丙二酸的相对浓度从再灌注3 h 开始一直 处于升高状态( p o 0 5 ) ，再灌注1 2 h 达到峰值( 尸 o 0 1 ) ；甘氨酸的相对含量 在再灌注6 h 升高并达到峰值( p o 0 5 ) 。 结论在本实验条件下可得出以下结论： 1 缬氨酸、酮异戊酸、丙氨酸、乙酸、谷氨酸、丙酮、乙酰乙酸、y 氨基丁酸、 草酰乙酸、丙酮酸、柠檬酸、肌氨酸酐、肌醇和葡萄糖等物质是大鼠m c a o 再灌注时脑脊液中潜在的生物标志物，有可能做为今后缺血性脑损伤机制研究 的靶标。 2 丙二酸和甘氨酸是大鼠m c a o 再灌注损伤时血清中潜在的生物标志物，具有 辅助临床脑卒中评估预后的潜力。 关键词大鼠；脑缺血再灌注；脑脊液；血清；生物标志物：核磁共振波谱； 代谢组学 i 徐州医学院硕士学位论文 一- 一 e x p l o r i n gt h eb i o m a k e r sf o ri s c h e m i a r e p e r f u s i o nb r a i n i n j u r yi nr a t s a b s t r a c t o b j e c t i v eu s i n gm e t a b o l o m i c sm e t h o dt o f i n dt h e b i o m a k e r s f o rr a tw i t h m i d d l ec e r e b r a la r t e r yo c c l u s i o n ( m c a o ) r e p e r f u s i o n ，a n dt op r o v i d ean e wt a r g e tf o r p a t h o g e n e s i sr e s e a r c ha n dd r u gs c r e e n i n go ft h ei s c h e m i cb r a i ni n j u r y m e t h o d s1 hn u c l e a r m a g n e t i cr e s o n a n c e ( h n m r ) s p e c t r o s c o p y - b a s e d m e t a b o n o m i c sa p p r o a c ha n dm u l t i v a r i a t ed a t aa n a l y s e sm e t h o dw e r eu s e dt oi n v e s t i g a t e b i o c h e m i c a lc h a n g e si n t h e e a r l ys t a g e s o ff o c a lc e r e b r a l i s c h e m i a r e p e r f u s i o n ( i r ) i n j u r y at i m e c o u r s e d ( 0 ，0 5 ，1 ，3 ，6 ，1 2 ，2 4 ho f m c a o ) c e r e b r o s p i n a lf l u i d ( c s f ) a n ds e r u ms a m p l e sw e r et e s t e dt oa n a l y z et h ec h a n g e so fm e t a b o l i t e sd u r i n gt h ee a r l y d i s e a s ep r o c e s si nam c a o r e p e r f u s i o nr a tm o d e l r e s u l t s 1t h e 1h n m r s p e c t r o s c o p y so fc e r e b r o s p i n a lf l u i d ( c s f ) a n ds e r u ms a m p l e f r o mr a t sw e r er e p r o d u c i b i l i t y , a n dt h i sm e t h o dc a nb eu s e dt om e t a b o l o m i c sa n a l y s i s 2p a r t i a ll e a s ts q u a r e s d i s c r i m i n a n ta n a l y s i s ( p l s d a ) s c o r e sp l o t so ft h e 1h n m r d a t ar e v e a l e dc l e a r l yd i f f e r e n c e sa m o n gt h ee x p e r i m e n tg r o u p s c o m b i n a t i o n t h er e s u l t so fp l s d al o a d i n gp l o ta n dd a t a b a s eo fm e t a b o n o m i c s ，w ef o u n dt h a t t w e n t y f o u rm e t a b o l i t e sw e r ec h a n g e ds i g n i f i c a n t l yi nt h ec s fs a m p l e sa m o n gt h e g r o u p sw i t h i n2 4 ho fr e p e r f u s i o n a n dt h ec h a n g e so fv a l i n e ，k e t o i s o v a l e r i e a c i d ， a l a n i n e ，a c e t i ca c i d ，g l u t a m i ca c i d ，a c e t o n e ，a c e t o a c e t i ca c i d ，g a m m a - a m i n o b u t y r i c a c i d ，o x a l a c e t i ca c i d ，p y r u v i ca c i d ，c i t r i ca c i d ，c r e a t i n i n e ，m y o i n o s i t o la n dg l u c o s e w a sm o r es i g n i f i c a n t l yt h a no t h e r s ( v ss h a m ，t h ev a l u eo fl o a t i n gp l o tw a sm o r et h a n 1 0 ) c o m p a r e i n gt h er e l a t i v ec o n c e n t r a t i o no ft h o s e1 4m e t a b o l i t e si ne a c ho ft h e m c a og r o u pt ot h es h a mg r o u p ，w ef o u n dt h a t ：t h er e l a t i v ec o n c e n t r a t i o no fv a l i n e ， a c e t o a c e t i ca c i da n dp y r u v i ca c i dw e r ei n c r e a s e de v i d e n t l ya tt h et i m eo f6 ha f t e r r e p e r f u s i o n ( v ss h a m ，p o 0 1 ) ，a n dt h e nd e c r e a s e d ，a tt h et i m eo f2 4 ha f t e rr e p e r f u s i o n i t sc o n c e n t r a t i o nw a sl o w e rt h a nt h a ti nt h es h a mg r o u p 畔0 0 5 ) ；t h er e l a t i v e c o n c e n t r a t i o no fk e t o i s o v a l e r i ca c i d ，a l a n i n e ，a c e t i ca c i d ，g l u t a m i ca c i da n d c r e a t i n i n ew e r ea l s oe v i d e n t l yi n c r e a s e da tt h et i m eo f6 ha f t e rr e p e r f u s i o n ( v ss h a m ，p 4 - t ，- b 徐州医学院硕士学位论文 。二一一 0 0 5 ) ；t h em a x i m a l l yr e l a t i v e c o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e dt i m eo fa c e t o n eg a m m a - a m i n o b u t y r i ca c i d ，o x a l a c e t i ca c i d a n dc i t r i ca c i dw e r e1 2 h ( p o 0 1 ) ；a n dt h er e l a t i v ec o n c e n t r a t i o no f m y o i n o s i t o ia n d g l u c o s ew e r ea l ld e c r e a s e dt w i c e ，o n ew a sa tt h ee a r l yt i m eo f r e p e r f u s i o n ( v ss h 锄 p 0 0 5 ) ，a n dt h eo t h e rw a sa t6 ha f t e rr e p e r f u s i o n ( 坩s h a m ，p 0 0 5 ) 3w i t ht h ep l s - d al o a d i n gp l o ta n dd a t a b a s eo f m e t a b o n o m i c s ，w ea l s of o u n d t h a tt w e l v em e t a b o l i t e sw e r ec h a n g e ds i g n i f i c a n t l yi nt h es e r u ms a m p l e s 锄o n gt h e g r o u p sw i t h i n2 4 ho fr e p e r f u s i o n a m o n gt h e m ，t h ec h a n g e so fm a l o n i ca c i da n d g l y c i n ew e r em o r es i g n i f i c a n t l yt h a no t h e r s ( ws h a mg r o u p ，l o a f i n gp l o tv a l u ew 弱 m o r et h a n l 0 ) t h er e l a t i v ec o n c e n t r a t i o no fm a l o n i ca c i dw e r ea l w a y sh i g h e r t h a i l s h a mg r o u pd u r i n gt h er e p e r f u s i o nt i m e3 - 2 4 h ( j f 0 0 5 ) ，a n dt h em a x i m a l l yi n c r e a s e d t i m ew a s12 h ( p 9 0 ，且仅需几滴血液， 就可以诊断出心脏病的严重程度。并具有快速、安全、专一性强的优点。 代谢组学技术在肿瘤标志物和诊断方面的应用相对广泛，2 0 0 9 年发表在n a t u r e 上的一篇报道称：s r e e k u m a r 等| 9 j 在长期研究前列腺癌的基础上，利用代谢组学分 析方法，对临床上2 6 2 例前列腺癌病例标本进行了研究，筛选出了变化最明显的生 物标志物一肌氨酸。在小鼠动物实验中发现，抑制生成肌氨酸的酶，能大大降低前 列腺癌的恶性程度，这说明肌氨酸在前列腺癌中可能扮演了重要角色，因此生成 肌氨酸的通路可能成为前列腺癌的新治疗靶位。目前代谢组学技术已应用于检测 脑瘤、乳腺癌、卵巢癌、白血病【1 0 3 1 等引发的体内代谢产物的变化。 f e n g 等【1 4 1 对爆发性肝衰竭大鼠血清进行了代谢产物分析，结果显示血清中5 吲哚乙酸、葡萄糖、p 羟丁酸盐和磷酸盐含量增高，提示这些物质的改变可能成为 肝衰竭的潜在生物标志物。b o g d a n o v 等【l5 j 通过多年研究，在血液中找出了能够早 期诊断和评价帕金森病的生物标志物。 v i a n t 等6 l 在外伤性脑损伤大鼠的实验研究中，用核磁共振波谱对大鼠脑组织 提取物进行测定，用主成分分析法对代谢标志物进行筛选，并用a n o v a 和t 检验法 对所筛选出的代谢物做了进一步筛选，最终从损伤部位中找到抗坏血酸、谷氨酸、 磷酸胆碱和肌醇磷酸胆碱、n 一乙酰天冬氨酸等变化较明显的代谢标志物群，但该 研究用的样品是脑组织匀浆液，所得结果包括神经元内外混合代谢成分( 包括神 经递质) ，不足以真正说明脑外伤脑内代谢产物的变化，而且临床上不可能用类似 标本进行检测，因此临床意义受到质疑。相对于局部组织匀浆液，用脑脊液观察 脑内代谢物质的变化则显得更为客观。 7 徐州医学院硕士学位论文 目前国内外采用代谢组学技术，进行重大疾病的诊断及发病机制的探讨，主 要集中在心脏病、肿瘤等方面。但利用代谢组学技术，从系统生物学角度全面地 探讨缺血性脑损伤的发病机制，寻找其生物标志物，并根据生物标志物分析发病 机制，寻找药物治疗新靶点，鲜有报道。 本文采用基于核磁共振氢谱( 1 h n m r ) 的代谢组学分析手段，结合偏最小二 乘法判别分析( p l s d a ) 的模式识别方法和t 检验，研究大鼠局灶性脑缺血( m i d d l e c e r e b r a la r t e r yo c c l u s i o n ，m c a o ) 再灌注0h 、0 5h 、lh 、3h 、6h 、1 2h 、2 4 h 脑 脊液和血液中代谢成分的变化及变化规律，筛选出能够评价缺血性脑损伤病理生 理过程的“生物标志物 ，为代谢组学技术进一步应用于缺血性脑损伤发病机制的 探讨提供理论依据。 徐州医学院硕士学位论文 材料和方法 1 材料 1 1 动物 健康s d 雄性大鼠8 0 只，体重2 3 0 2 8 0 9 ，徐州医学院实验动物中心提供，动 物生产许可证号：s y x k ( 苏) 2 0 0 7 0 0 3 7 。 1 2 主要试剂 试剂生产厂家 2 ，3 ，5 三苯基四氮唑( t t c )国药集团化学试剂有限公司 水合氯醛国药集团化学试剂有限公司 硅油i i国药集团化学试剂有限公司 3 一三甲基甲硅烷基( 2 ，2 ，3 ，3 一四氘s i g m a 公司 氢) 丙酸( t s p ) d 2 0 s i g m a 公司 1 3 主要仪器及设备 仪器名称生产厂家 低温高速离心机 美国o p p e n d o r f 公司 7 2 5 超低温冰箱美国t h e r m of o r m a 公司 梅特勒托利多a e 2 4 0 电子天平瑞士m e t t l e rt o l e d o b r u k e ra v a n c e6 0 0 m h z 核磁共振波谱仪 德i 雪b m k e rb i o s p i n 2 方法 2 1 实验分组 火鼠随机分为假手术组( s h a m ) 、缺血再灌注o h 、o 5h 、1h 、3h 、6h 、1 2h 、 2 4 h 组( m c a o o 、m c a o o 5 、m c a o i 、m c a 0 3 、m c a 0 6 、m c a 0 1 2 、m c a 0 2 4 ) ， 9 徐州医学院硕士学位论文 每组1 0 只。各组大鼠均于手术前1 2 h 禁食，自由饮水。 2 2 动物模型的制备 我们参照z e a - l o n g a 1 7 1 和曹勇军【1 8 】的方法，并进行了改进：1 0 水合氯醛 ( 3 5 m g k g ) 腹腔注射麻醉大鼠，颈部正中切口约1 5 c m ，分离右侧颈总动脉( c c a ) 至分叉处，无需分离颈外动脉( e c a ) 和颈内动脉( i c a ) 。结扎c c a 近心端，两 个微动脉夹分别夹闭e c a 近心端和c c a 远心端，在c c a 上用缝合线打一活结， 眼科剪在距分叉l c m 处剪一缺口，将栓线经缺口插入。松开c c a 上动脉夹，调整 进线角度( 向左侧倾斜约2 0 度角) ，使栓线进入i c a 。再次调整进线角度( 向右 侧倾斜约1 5 度角) ，并轻轻牵拉c c a ，使栓线进入大脑，进约1 8 0 5i l l n 稍有阻 力感时说明已阻断大脑中动脉( m c a ) 的入口，即可造成m c a 的栓塞，将c c a 上 活结扎紧，并松开e c a 上的动脉夹，缝合皮肤。缺血3 h ，再灌注时大鼠再次轻微 麻醉( 2 0m g k g ) ，轻轻将线栓头端拉退至c c a ，剪掉多余线栓即可。假手术( s h a m ) 组进行同样的手术操作，但栓线只插入i c a 即可。 在再灌注前和各实验点参照z e a - l o n g a l l 7 l 的行为学评分标准对各组动物进行行 为学评分：0 分，无神经缺损体征；r 分，不能充分伸展左侧前爪；2 分，向左侧转圈； 3 分，向左侧倾倒；4 分，不能自发行走，意识丧失。选取再灌注前行为学得分为2 3 的动物( s h a m 组除外) 进行进一步实验。 采血后，大鼠断头取脑，置于冰上，用刀片将脑切成厚2i t l l n 的冠状切片，浸 于质量分数为2 的t t c 磷酸盐缓冲液中( p h = 7 4 ) ，恒温水浴槽中3 7 c 避光孵育 3 0 m i n ，正常脑组织染为深红色，脑梗塞区不染色( 苍白色) 1 1 7 1 。 如若模型失败，则随机补充动物。 2 3 脑脊液样本的采集和处理 2 3 1 脑脊液采集【1 9 】 各组动物在相应时间1 0 水合氯醛3 5 m g k g 腹腔注射麻醉，头颈部剪毛、消毒， 沿后正中线切纵行切口( 约2 c m ) ，用镊子钝性分离颈部背侧肌肉。最深层附着在 l o 徐州医学院硕士学位论文 骨上的肌肉用手术刀背刮开，以避免出血，暴露寰枕筋膜后，直视下可看到枕骨 大孔及脑组织。鼠头尽量向胸部弯曲，用l o o g l 尖头微量注射器，针尖位于枕骨大 孔后外侧朝向小脑延髓池侧向进针，针尖完全进入后直接抽取脑脊液1 0 0 p 1 。 2 3 2 脑脊液预处理 采集的大鼠脑脊液样本置于o 5 m l e p 管中，4 c3 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ，上清液 置一8 0 冰箱保存，2 个月内完成核磁共振波谱测试。 检测时取出脑脊液样本，常温解冻，1 4 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ：取上清液1 0 0 肛1 ， 添加0 1 t s p 重水溶液1 0 p l 和4 0 0 “1d 2 0 于5 m m 核磁共振样品管中，混匀后置 4 c 冰箱保存，待测。 2 4 血液样本的采集和处理【2 0 】 各组动物取脑脊液后于腹主静脉取静脉血1 0 m l ，放置1 5 m le p 管中，4 c 3 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n 。取上层血清置8 0 。c 冰箱保存待测。实验时，取出血清，常 温解冻，4 c1 4 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i r a 取上清液3 0 0 1 x l ，添加o i t s p 重水溶液1 0 0 1 x l 和2 0 0 “1d 2 0 于5 m m 核磁共振样品管中，混匀后置4 c 冰箱保存，待测。 2 51 h n m r 检测1 2 1 】 检测时取出制备好的样品，室温放置1 0 m i n ，按照以下技术参数进行一维 6 0 0 m h z 核磁共振氢谱( h n m r ) 扫描即可。 脉冲程序：自旋回波序列( c a n - p u r c e l l m e i b o o m g i l l ，c p m g ) ； 采样温度：3 0 0 k ； 预饱和时间：2 s ( 预饱和方式抑制水峰) ，采样8 次； 自旋回波时间：1 m s ； 样本累加次数：1 2 8 次； 采样点数：3 2 k ； 谱宽：1 5 p p m 。 自由感应衰减( f r e ei n d u c t i o nd e c a y , f i d ) 信号经过3 2 k 傅立叶变换转化为 徐州医学院硕士学位论文 1 h n m r 谱图。 2 61 h n m r 图谱预处理 所有样本的1 h n m r 图谱先进行手工调相和基线校正，化学位移采用内标法定 标( 设置内标试剂t s p 的化学位移为o ) 。为了消除化学位移漂移的影响，同时达 到数据降维的目的，对谱图1 0 0 0 - 0 1 6 p p m 区间进行分段积分，积分间隔为 0 0 4 p p m ，4 6 8 - 5 0 0 区间的谱峰设置为零，以消除残留的水峰对分析结果的影响。 将所有样本的分段积分数据导入e x c e l 数据软件，可以得到一个m 行n 列的图 谱原始数据矩阵，每一行代表单个样本的所有变量，每列代表所有样本的同一变 量。 2 71 h n m r 数据预处理【2 2 】 通常即使是同一类样品得到的n m r 谱图也不可能完全一致，因为：1 ) 仪器 的稳定性和灵敏度会产生差异；2 ) 随机噪声：采集噪声和人工噪声引起的差异等。 为了尽可能的消除这些因素的影响，归一化是必要的。 本实验选用面归一化法对所有数据进行归一化处理，即把每个样本的所有变 量相加，归一化为一个常量。 3 数据统计及解析 偏最小二乘法判别分析( p l s d a ) 选用s i m c a p1 1 5 数据分析软件；计量 数据以又s 形式表示，两组问t 检验采用s p s s1 3 0 统计软件，p 0 0 5 表示差异 有统计学意义。根据多元统计结果，结合核磁共振谱学理论及相关数据库 ( h t t p ：w w w h m d b c a ) 对数据进行解析。 1 2 徐州医学院硕士学位论文 结果 1 大鼠m c a o 再灌注损伤时脑脊液和血液1 h n m r 图谱 大鼠脑缺血再灌注损伤时不同灌注时间的脑脊液和血清代表性1 h n m r 图谱 分别见f i g u r e l 和f i g u r e2 ( 由于体内绝大多数代谢物质的核磁化学位移均处于 0 2 4 5 p p m 之间，故此处只给出了0 0 0 - 4 5 p p m 的核磁谱图) 。从图中可以看出， 同一样本( 脑脊液或血清) 的1 h n m r 图谱在不同组之间各代谢物峰对应性良好， 且均未出现明显的化学位移漂移，这说明本方法能够满足代谢组学分析的要求。 同样，从f i g u r e1 和f i g u r e2 中也可以看到，各缺血组与假手术组间的谱图也 同样存在着差异，例如在f i g u r e1 中：化学位移3 0 5 p p m 处1 - b ( m c a o o ) 和1 一e ( m c a 0 3 ) 明显低于1 a ( s h a m ) 。为了阐明引起这些差异的原因，我们进一步采 用有监督的模式识别方法p l s d a 对图谱数据进行了多元统计分析。 2 大鼠m c a o 再灌注损伤时脑脊液和血液1 h n m r 图谱的p l s d a 分析 2 1 脑脊液样本 从大鼠m c a o 再灌注各组脑脊液的p l s d a 分析得分图( s c o r ep l o t ) 中可以 看出，各实验组与假手术组均能明显区分开，说明它们之间确实存在着某些代谢 物质的差异( f i g u r e 3 ) 。 为了得到引起这些差异的化学位移，我们在获得p l s d a 得分图的同时，也 得到了各组p l s - d a 分析的载荷图( l o a d i n gp l o t ) ( f i g u r e4 ) 。从载荷图中都可看 出，大多数点均集中在原点附近，有统计学意义的点相对远离原点，其代表的化 合物是产生代谢图谱差异的主要原因，可能是潜在的缺血再灌注损伤的生物标记 物。载荷或回归系数为正值，表示对应于1 h n m r 图谱积分区段的物质：s h a m 组 比m c a o 组的浓度高；负值则相反。 在多元统计分析中，一般选择载荷值大于0 0 7 ( 小于0 0 7 ) 为判断差异有意 义的依据2 3 ，2 4 1 。在本实验中我们选择主成分一( p c i ) 和主成分二( p c 2 ) 均大于 徐州医学院硕士学位论文 0 0 7 做为入选标准。 2 2 血清标本 采用同样的方法，我们同时得到了假手术组( s h a m ) 和各实验组( m c a o 组) 之间血清p l s - d a 分析的得分图( f i g u r e5 ) 和载荷图( f i g u r e6 ) 。从f i g u r e5 我 们可以看出，随着再灌注时间的延长，实验组与假手术组之间的分开趋势越来越 明显，到再灌注2 4 h 时，在前两个主成分方向均已能分开，说明大鼠在m c a o 时， 随着再灌注时间的延长血清中代谢物质的变化也越来越明显。 1 4 徐州医学院硕士学位论文 3 大鼠m c a o 再灌注损伤时脑脊液和血液中代谢物质的变化 将载荷图中有意义的化学位移代入代谢组学数据库( h t t p ：w w w h m d b c a ) 进行 化合物的检索和鉴定。所得各组代谢物变化情况如下： 3 1 大鼠m c a o 再灌注0h 体内代谢物的变化 与假手术组比较，大鼠在缺血再灌注0h 时，脑脊液中代谢产物主要差异为： 乳酸、丙酮酸、二甲胺、丙酮和酮异戊酸的升高，葡萄糖的降低；血清中代谢产 物主要差异为：乳酸、丙酮酸、甜菜碱、丝氨酸、乙酸和苏氨酸的降低( t a b l e1 ) 。 t a b l e1 t h ec h a n g e so fm e t a b o l i t ei nc s fa n ds e r u ms a m p l e sf o rr a tw i t ho h r e p e r f u s i o na f t e rm c a o t h es y m b o l s ( + a n d ) i n d i c a t et h ei n c r e a s ea n dd e c r e a s eo ft h em e t a b o l i t el e v e l s 1 5 徐州医学院硕士学位论文 3 2 大鼠m c a o 再灌注o 5h 体内代谢物的变化 与假手术组比较，大鼠在缺血再灌注o 5h 时，脑脊液中代谢产物主要差异为： 乳酸、二甲胺、谷氨酸、3 羟异戊酸、草酰乙酸、琥珀酸和乙酸的升高，葡萄糖、 丙酮酸、甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、甘油和肌醇降低；血清中代谢产物主要差异 为：丙二酸和柠檬酸的升高，乙酸和缬氨酸的降低( t a b l e2 ) 。 t a b l e2 t h ec h a n g e so fm e t a b o l i t ei nc s fa n ds e r 6 ms a m p l e sf o rr a tw i t ho 5 h r e p e r f u s i o na f t e rm c a o t h es y m b o l s ( + a n d 一) i n d i c a t et h ei n c r e a s ea n dd e c r e a s eo ft h em e t a b o l i t el e v e l s 1 6 徐州医学院硕士学位论文 3 3 大鼠m c a o 再灌注lh 体内代谢物的变化 与假手术组比较，大鼠在缺血再灌注l h 时，脑脊液中代谢产物主要差异为： 果糖、肌氨酸酐、丙氨酸、肌醇和谷氨酸的升高，葡萄糖、丝氨酸、甘油和二甲 胺的降低；血清中代谢产物主要差异为：反乌头酸的升高，丙酮酸和缬氨酸的降 低( t a b l e3 ) 。 t a b l e3 t h ec h a n g e so fm e t a b o l i t ei nc s fa n ds e r u ms a m p l e sf o rr a tw i t hlh r e p e r f u s i o na f t e rm c a o t h es y m b o l s ( + a n d 一) i n d i c a t et h ei n c r e a s ea n dd e c r e a s eo ft h em e t a b o l i t el e v e l s 1 7 徐州医学院硕士学位论文 3 4 大鼠m c a o 再灌注3h 体内代谢物的变化 与假手术组比较，大鼠在缺血再灌注3h 时，脑脊液中代谢产物主要差异为： 2 羟基丁酸、草酰乙酸合果糖的升高，柠檬酸、乙酰乙酸、3 羟基丁酸、甘氨酸、 葡萄糖和肌醇的降低；血清中代谢产物主要差异为：丙二酸的升高，苏氨酸、乙 酸和缬氨酸的降低( t a b l e4 ) 。 t a b l e4 t h ec h a n g e so fm e t a b o l i t ei nc s fa n ds e r u ms a m p l e sf o rr a tw i t h3 h r e p e r f u s i o na f t e rm c a o t h es y m b o l s ( + a n d 一) i n d i c a t et h ei n c r e a s ea n dd e c r e a s eo f t h em e t a b o l i t el e v e l s 徐州医学院硕士学位论文 3 5 大鼠m c a o 再灌注6h 体内代谢物的变化 与假手术组比较，大鼠在缺血再灌注6h 时，脑脊液中代谢产物主要差异为： 丙酮、酮异戊酸、缬氨酸、异亮氨酸、丙酮酸、乳酸、3 一羟异戊酸、乙酸、二甲胺、 肌氨酸酐、丙氨酸、谷氨酸、3 羟基丁酸、2 羟基丁酸和果糖的升高，丝氨酸、柠 檬酸、甘氨酸、葡萄糖和肌醇的降低；血清中代谢产物主要差异为：鸟氨酸和谷 氨酸的升高，甜菜碱的降低( t a b l e5 ) 。 t a b l e5 t h ec h a n g e so fm e t a b o l i t ei nc s fa n ds e r u ms a m p l e sf o rr a tw i t h6 h r e p e r f u s i o na f t e rm c a o t h es y m b o l s ( + a n d - ) i n d i c a t et h ei n c r e a s ea n dd e c r e a s eo f t h em e t a b o i i t el e v e l s 1 9 徐州医学院硕士学位论文 3 6 大鼠m c a o 再灌注1 2h 体内代谢物的变化 与假手术组比较，大鼠在缺血再灌注1 2h 时，脑脊液中代谢产物主要差异为： 吡咯( 型) 谷氨酸、丫- 氨基丁酸、琥珀酸、甘油、乙酰乙酸、草酰乙酸、丙酮、缬氨 酸和3 羟基丁酸的升高：血清中代谢产物主要差异为：反乌头酸和谷氨酸的升高， 丙氨酸的降低( t a b l e6 ) 。 t a b l e6 t h ec h a n g e so fm e t a b o l i t ei nc s fa n ds e r u ms a m p l e sf o rr a tw i t h12 h r e p e r f u s i o na f t e rm c a o t h es y m b o l s ( + a n d ) i n d i c a t et h ei n c r e a s ea n dd e c r e a s eo f t h em e t a b o l i t el e v e l s 2 0 徐州医学院硕士学位论文 3 7 大鼠m c a o 再灌注2 4h 体内代谢物的变化 与假手术组比较，大鼠在缺血再灌注2 4h 时，脑脊液中代谢产物主要差异为： 琥珀酸的升高，柠檬酸、甘氨酸、丙酮酸、吡咯( 型) 谷氨酸和丫一氨基丁酸的降低； 血清中代谢产物主要差异为：甘氨酸、丁二酸、丙酮酸、乙酸、丙二酸、鸟氨酸 和谷氨酸的升高，乳酸的降低( t a b l e7 ) 。 t a b l e7 t h ec h a n g e so fm e t a b o l i t ei nc s fa n ds e r u ms a m p l e sf o rr a tw i t h2 4 h r e p e r f u s i o na f t e rm c a o t h es y m b o l s ( + a n d ) i n d i c a t et h ei n c r e a s ea n dd e c r e a s eo ft h em e t a b o l i t el e v e l s 2 1 徐州医学院硕士学位论文 4 大鼠m c a o 再灌注损伤时体内生物标志物的判定 4 1 脑脊液中生物标志物的判定 由上文可知，大鼠在脑缺血再灌注2 4h 内，脑脊液中2 4 种代谢物质的含量均 发生了明显变化。为了使结果更加具有代表性，我们再次选择p l s d a 载荷图中 载荷值大于o 1 ( 或小于0 1 ) 的化学物质，作为大鼠m c a o 再灌注损伤时脑脊液 中潜在的生物标志物。 与s h a m 组比较，大鼠m c a o 再灌注2 4h 内脑脊液中载荷值变化大于1 0 的 代谢物质有：缬氨酸、酮异戊酸、丙氨酸、乙酸、谷氨酸、丙酮、乙酰乙酸、丫 氨基丁酸、草酰乙酸、丙酮酸、柠檬酸、肌氨酸酐、肌醇和葡萄糖。为了进一步 对这些物质进行定量，我们将各物质在各时间点的积分值和s h a m 组进行了比较， 发现了4 种变化规律，分别如下：缬氨酸、乙酰乙酸和丙酮酸的相对含量在再 灌注6 h 明显升高( 氏0 0 1 ) ，之后开始降低，到再灌注2 4 h 明显低于s h a m 组 ( 氏0 0 5 ) ；酮异戊酸、丙氨酸、乙酸、谷氨酸和肌氨酸酐的相对含量也在再灌 注6 h 显著升高( p o 0 5 ) ； 丙酮、y 氨基丁酸、草酰乙酸和柠檬酸的相对含量在再灌注1 2 h 达到高峰 ( p o 0 1 ) ，随后丌始回落：肌醇和葡萄糖的相对含量均出现了两次降低，第一 次分别出现在再灌注o 5 h 和l h ( 氏o 0 5 ) ，第二次均出现在再灌注6 h ( p 0 0 1 ) ， 之后又开始回升，到再灌注2 4 h 恢复到j 下常水平( 胗o 0 5 ) ( t a b l e8 ，f i g u r e7 ) 。 4 2 血清中生物标志物的判定 大鼠在脑缺血再灌注2 4 小时内，血清中1 4 种代谢物质含量也发生了明显变 化，与s h a m 组比较，载荷值变化大于1 0 的代谢物质有：丙二酸和甘氨酸。其中 丙二酸的相对浓度从再灌注3 h 开始一直处于升高状态( p o 0 5 ) ( t a b l e9 ，f i g u r e8 ) 。 此两种物质有可能作为大鼠脑缺血再灌注血清中的生物标志物。 n n dfl最iiibi肇一o0、h： 价oox量 n可ooo州口西ooo -心可ooo州”noo -。onooo刊nno