（水生生物学专业论文）丝状蓝藻产氢藻种的筛选及其产氢调控.pdf

摘要 化石能源的枯竭与人类对能源需求之问的矛盾以及燃烧后造成的环境问题 已成为2 1 世纪人类面临的最严峻的问题之一。氢气以其热值高、密度小、清洁、 可再生等特性被认为是最理想的替代能源。 目前氢气的制备主要有化学方法和生物方法两大类，生物制氢主要以细菌、 蓝藻和绿藻三个类群为主。厌氧细菌的暗发酵、光合细菌的光发酵都是分解有机 物，成本相对较高，绿藻光解水产氢又对氧气极端敏感，反应条件相当苛刻，而 蓝藻中的丝状蓝藻中有一部分藻种含有异形胞，该结构可形成天然的无氧环境， 其中的同氮酶可催化固氮反应产生氢气，因此本文对1 0 种丝状蓝藻进行产氢筛 选，并对筛选出的藻种进行调控，总结出产氢的最佳培养参数，为蓝藻生物制氢 的工业化提供一定的理论依据。 本文选取l o 种丝状蓝藻，分别为多变鱼腥藻彳门口6 a p 一口v 甜f 曲f 凰a t c c 2 9 4 1 3 ，鱼腥藻彳甩口6 口p 刀口s p p c c7 1 2 0 ，普通念珠藻 协幻cc d ，l ，l “玎p ，发状念珠 藻 ，d s f d c 船，扣，所p ，海绵状念珠藻 ，d s 幻c 妒d 馏砌甓加，肌e ，沼泽念珠藻 机幻c j p 口，“如s m ，林氏念珠藻 d s ，d c ，f 门c 七加，颤藻g 嘶胁o ，妇，钝顶螺旋藻印f ，”z f 舰 p 肠纪刀s 括，极大螺旋藻印f ，“，f ，z 口朋甜砌口。我们对其进行产氢培养后发现，念珠 藻科的藻种均有产氧能力，其中念珠藻属的发状念珠藻和鱼腥藻属的多变鱼腥藻 具有较高的产氢能力：颤藻科的3 个藻种在空气和光照环境下不具有产氢能力。 本文对筛选出的多变鱼腥藻彳门口6 口p 行口，f 动f 凰a t c c 2 9 4 1 3 进行了生长及 产氢培养的调控后发现，光照强度3 5 m o l m 一s ，温度2 8 3 0 ，使用b g i i ( - n ) 作为培养基，p h 值在7 1 左右，对多变鱼腥藻a t c c 2 9 4 1 3 进行振荡培养1 5 天， 这些条件是多变鱼腥藻光合营养生长阶段的最优化培养参数：氩气密闭环境，光 照强度8 0 m 0 1 m s ，温度3 0 ，静置培养，这种外界条件对其产氢是最有利 的，氢气产量比未调控前提高了5 倍多，达到气体总体积的8 4 。 关键词：丝状蓝藻：多变鱼腥藻a t c c 2 9 4 1 3 ；生物制氢；藻种筛选；产氢培养 调控：固氮酶 a b s t r a c t t h ec o n f l i c t sb e t w e e nd e p l e t i o no ff o s s i l 甜l dh u m a nd e m 锄df o re n e r g y ，嬲w e n 勰t h ei m p a c to fp o s t c o m b u s t i o no nt h ee n v i r o 肌e n th a sb e c o m eo n eo ft l l em o s t s e r i o u sp r o b l e m si nt h e21s tc e n t u r y h y d r o g e ni sc o n s i d e r e dt l l eb c s ta l t e m a t i v e e n e r g ys o u r c eb e c a u s eo fi t sh i g hh e a tv a l u e ，l e s sd e n s i t y 1 na d d i t i o n ，i ti sa l s oc l e a i l a n dr e n e w a b l e c u r r e n t l y ，t h e r ea r et w ow a y so fh y d r o g e np r e p a r a t i o ni n c i u d i n gc h e m i c a la n d b i o l o g i c a lm e t h o d s b i o l o g i c a lh y d r o g e np r o d u c t i o nf o c u s e so n t i l r e et a x a 嬲b a c t e r i a ， b l u e a l g 解 锄d g r e e na l g a e n l ec o s to fa j l a e r o b i cd a r kf 色n n e n t a t i o n锄d p h o t o s y n l h e t i cb a c t e r i af e 咖e n t a t i o ni sr e l a t i v e l yh i g ht od e c o m p o s eo r g a i l i cm a n e r i na d d i t i o n ，t h ep r o c e s so fp h o t o l y s i so fw a t e rf o rh y d r o g e np r o d u c t i o ni ng r e e na l g a e i se x t r e m e l ys e n s i t i v et 0o x y g e n 肌dt h er e a c t i o nc o n d i t i o n sa r ef a i r l yh a r s h w h i l e s o m ek i n d so ff i l 锄e m o u sc y a n o b a c t e r i ac o n t a i nh e t e r o c y s ta i l di t ss t i - u c t u r ec a nf b r r i l an a t u r a l踟a e r o b i ce n v i r o 啪e n t ， i nw h i c hn i t r o g e n m x i n gn i 仃o g e n a s ee 1 1 2 了m e c a t a l y z e st h er e a c t i o no fh y d r o g e n 0 u rs t u d yc h o s e1ol ( i n d so ff i l 锄e n t o u sa l g f o r h y d r o g e np r o d u c t i o nf i l t e r ，锄dr e g u l a t e dt h e s p e c i e s w eg o tt h eb e s tp a 舢e t e r so f h y d r o g e np r o d u c t i o n w h i c h p r o v i d e d at h e o r e t i c a lb a s i sf b rt h e h y d r o g e n i n d u s t r i a l i z a t i o nw i t hc y a n o b a c t e r i a t h es p e c i f i cr e s u l t so ft h i ss t u d yi s 硒f o l l o w s ： t h i s s t u d ye l e c t e d lo t y p e s o ff i l 锄e n t o u sc y a n o b a c t e r i ab e l o n g i n gt 0 c y a n o p h y t a ，c y a n o p h y c e a e ，h o 珊o g o n a l e s ，n o s t o c a c e a e 锄da n a b n ao ft h eg e n u s n o s t o c ，s p i m l i n aa n d o s c i i i a t o r i ao ft h eo s i c i l l a t o r i a c e a er e s p e c t i v e l y a r e r h y d r o g e np r o d u c t i o nc u l t i v a t i o n ，s p e c i e so fn o s t o c a c e h a v eah y d r o g e np r o d u c t i o n c a p a c i t y 肌de s p e c i a l l y t h e s ，d c 月哪f ，咖删p 锄d 彳m 6 口p ms h o w e dh i g h e r h y d r o g e np r o d u c t i o nc a p a b i l i t i e s ；t h r e es p e c i e so fo s c i l l a t o r i ad i dn o ts h o wa n y h y d r o g e np r o d u c t i o nc 印a c i t ) ，i nm e a i r 肌dl i 曲te n v i r o 姗e n t i n t h i ss t u d y ；a r e rr e g u l a t i o no fg r o 、机ha n dh y d r o g e np r o d u c t i o nc u l t i v a t i o no f t h ea l g a e 彳疗口6 口p 胛口v 口r 胁6 f ，西a t c c 2 9 413 、v e6 l t e r e do u t ，w ef 0 u n dt h a tl i g h t i n t e n s i t yo f3 5 “m o l m 。2 s ，t e m p e i ? a t u r eo f2 8 3 0 ，t h eu s eo fb g i i ( n ) a sa m e d i u m ，p hv a l u eo fa b o u t7 1 ，s h a k i n gc u l t u r f o rl5d a y so nt h e 彳门口6 口p 刀口 v 口，f 口6 f ，括a t c c 2 9 4l3 ，t h e s ec o n d i t i o n sa r et h eo p t i m i z ep a r 锄e t e r si np h o t o s y n t h e t i c g r o 、机hp h a s eo ft h i sa l g a e i na d d i t i o n ，e x t e m a lc o n d i t i o n sa sa r g o ng a su n d e rs e a l e d e n v i r o n m e n t ，l i g h ti n t e n s i t ya t8 0 “m o l m - z s ，t e m p e r a t u r co f3 0 锄ds t a t i c c u l t u r ew e r em o s tf a v o r a b l eo nt h eh y d r o g e np r o d u c t i o n i t sh y d r o g e np r o d u c t i o n i n c r e a s e db ym o r et h a j l5t i m e s ，w h i c hr e a c h e da b o u t8 4 o ft h et o t a lv o l 啪eo fg a s k e yw o r d s ： f i l 锄e n t o u s c y a n o b a c t e r i a ； 爿玎口6 口p ，z 口v 口，口6 f ，西a t c c2 9 4 1 3 ； b i o - h y d r o g e n ；s c r e e n i n go fa l g a e ；h y d r o g e np i 。o d u c t i o nr e g u l a t i o n ；n i n i o g e n a s e s i ：海师范人学硕i ：学位论文 声明 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 作者签名：后交岳苛日期：j 形4 工 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名：后戈荔青导师签名： 嘴矗慨矿j7 7 i i ：海师范人学硕f j 学位论文文献综述 1 文献综述 1 1 生物制氢的研究背景 能源是人类生存与发展的物质基础，当前，人类所使用的主要为煤炭、石油 和天然气等化石燃料。化石燃料是远古时期动植物遗体沉积在底层中经过亿万年 的演变而来的，是不可再生能源，其储量有限。大量化石燃料被开采利用，开采 量正逐年递减，并趋于枯竭，带来了严峻的能源危机【l l 。化石燃料的燃烧产物一 般为二氧化碳、氮氧化物、硫化物、粉尘颗粒等【2 j ，造成严重的环境污染，诸如 温室效应、酸雨、土壤盐碱化和沙漠化，著名的厄尔尼诺现象就是环境污染的产 物。随着全球现代化的进一步发展，工业、农业、汽车、同常生活中对能源的需 求j 下急速增长，而环境的污染更是直接威胁到人类的生存，因此，寻求清洁的可 再生能源来替代传统的化石能源j 下成为全世界各国科学家们研究的热点【3 l 。目前 人们j 下在利用的可再生能源一般有太阳能、地热能、潮汐能、风能等等，这些天 然的可再生能源虽然取之不尽，但受环境的牵制，不便于广泛应用。生物能源即 可再生物质生产的能源，包括燃料乙醇、生物柴油、沼气、氢气等，其较化石能 源具有两大明显优势：首先是环境友好，有利于改善己遭破坏的生态环境；其次 是可再生，因为植物固定的太阳能形成的生物能源是取之不尽的。因此，生物能 源将成为今后解决能源问题的主要途径之一1 4 1 。近年来，氢作为热值高、密度小、 清洁的可再生能源，已被越来越多的人关注。氢气独特的化学性质，使其具有最 小的密度，最高的热值，且燃烧产物只有水，没有任何其他的污染物，是非常理 想的替代能源【5 1 。美国、欧盟、同本及加拿大等国将氢能技术置于社会和经济发 展的优先地位，制定了相关的国家氢能发展计划，相继制定了有关的“国家氢能 路线图”，并由此提出了氢能经济”、“氢能社会的概制6 d 3 1 。为应对能源 短缺和改善中国能源消费结构，中国政府也将氢能发展提到了战略高度，提出摆 脱依赖石油的r 子，创可持续发展的氢能未来【i 4 1 。 传统的氢气制取方法一般为化学方法，即电解水、光解水、热解水、热化学 分解水和热催化重整、热解、气化、汽化富氢有机化合物等。目前，商业用氢中 9 6 来自于化石燃料进行催化重整，4 来自电解水i i5 1 ，这些制备工艺属于高耗 能工艺，成本高，且存在环保问题【i6 1 。利用生物体的一些代谢途径制取氢气，则 钱忠 l 【：丝状蕊藻产氧藻种的筛选及j 产氧调控 是环保节能的、低成本的制取方法，具有广泛的应用价值，已成为当前研究热点。 生物制氢也有多种途径，一般为绿藻光解水产氢、蓝藻固氮产氢、光合细菌光发 酵产氢、厌氧微生物暗发酵产氢以及光暗联合发酵产氢等途径【1 7 舶】。 1 2 生物制氢的发展与研究现状 1 2 1 生物制氢的发展 1 9 3 1 年，s t e p h e n s o n 等人首次报道了在细菌中存在着氢酶后【2 0 1 ，n a l ( a m u r a 于1 9 3 7 年观察到了细菌在黑暗条件下发酵产生氢气的现剃2 1 l ；1 9 4 2 年g a m o n 和r u b i n 报道了绿藻利用光能产生氢气【2 2 1 ；1 9 4 9 年，g e s t 和k 锄e n 发现了光合 产氢细菌深红螺菌，在光照条件下能产氢和固氮；l e 晰s 于1 9 6 6 年提出了 利用生物制氢的概念后i i5 1 ，人们开始思考氢气是否可以作为替代能源，但是直到 2 0 世纪7 0 年代出现的石油危机才使各国政府和科学家意识到寻求替代能源的急 迫需求，生物制氢才第一次被认为具有实用的可能，进行了大量的研究。然而， 2 0 世纪8 0 年代，由于全球经济出现明显的衰退，介于资会问题，各国对生物制 氢的研究力度降低，直到2 0 世纪9 0 年代初，在多个环境问题的叠加出现之后， 人们再次关注高效环保的生物制氢。德国主要在藻类制氢方面进行了广泛的研 究，而美国则开始研究低成本、环保的暗发酵和光发酵联合制氢，日本作为能源 极度匮乏的国家之一，在这两方面都进行了相当多的研究。美国和同本政府支持 开展了数个长期的研究计划，预计将在2 1 世纪中期可实现生物制氢技术的实际 应用。目前，在藻类分子生物学、耐氧藻类丌发等技术领域取得了突破性的进展， 并丌发和改良了各式生物反应器，完成了藻类制氢从实验室逐步走向实用的转 化f 2 3 2 4 1 。 我国的生物制氢研究起步较晚，开始于2 0 世纪9 0 年后期，研究得最多的 是微生物发酵产氢，其中比较成功的是哈工大任南琪教授领导的团队，他们直接 以厌氧活性污泥作为天然产气微生物，将废水中的碳水化合物作为供氢体，通过 厌氧发酵成功制备出了氢气，使生物制氢的成本大大降低，并使生物制氢技术在 走向规模化生产方面有了实质性的进展【2 5 】。目前国内在厌氧细菌发酵，光合细菌 发酵同样取得了很大进步【2 6 d 3 1 ，但是我国在藻类制氢方面的研究还比较少，特别 是利用基因手段调节藻类产氢方面，还处于起步阶段。 2 i ：海师范人学硕f ? 学位论文 文献综述 1 2 2 生物制氢的方法 已知能产氢的生物主要有厌氧细菌、固氮菌、光合细菌、蓝藻和微型真核藻 类。人们目前可知的生物制氢方法主要有绿藻和单细胞蓝藻的光解水产氢、含异 形胞的丝状蓝藻的固氮产氢、光合细菌的光发酵产氢、厌氧微生物的暗发酵产氢 和光暗两步联合发酵产氢。 1 2 2 1 微藻产氢 已知的微藻产氢主要分为两类，一种是一些微型真核绿藻( 如衣藻) 和一些 单细胞蓝藻( 如高山黏球藻) ，在厌氧条件下，可以通过光合作用分解水产生氢 气，通常也被称为光解水产氢途径，其代谢过程与绿色植物的光合作用有密切联 系，但高等植物因为不含有对产氢起关键作用的产氢酶而不能产；另一种则是一 些含有异形胞的丝状蓝藻( 如念珠藻、鱼腥藻等) ，在固氮反应中，能产生副产 物氢气，该反应是一个耗能过程，将外界环境中的氮气转化为铵盐，同时释放出 氢气。 ( 1 ) 绿藻和单细胞蓝藻的光解水产氢 通常情况下，绿藻的叶绿体进行光合作用，光系统i i 将水分解为质子h + 和 0 2 ，并释放电子e 。随后电子在类囊体膜的电子传递链上按一定的顺序进行传递 ( 如图1 1 所示) ，经过质体醌、细胞色素b 6 f 复合体( c y t b 6 f c o m p l e x ) 和光 合系统i 后，传递给铁氧还蛋白( f d ) ，并进一步还原n a d p + 产生n a d p h ( 还 原力) 。在电子传递过程中会把叶绿体基质中的h + 跨膜运输到类囊体腔中，形 成一定的质子梯度，类囊体腔中的质子经过位于类囊体膜上的a t p 合成酶运回 基质中时产生a t p ；光反应产生的n a d p h 和a t p 用于c a l v i n 循环合成碳水化 合物，再提供给线粒体用于呼吸作用和细胞的生长。厌氧条件下，线粒体的氧化 磷酸化水平受到抑制，在这种情况下，有些微型绿藻( 如莱茵衣藻) 有可能通过 n a d ( p ) h p q e 转移机制，把这些碳水化合物水解产生的电子和质子传给叶绿 体中的h 2 a s e ，h 2 a s e 将h + ( 来自基质中) 和e ( 来自还原的铁氧还蛋白) 合成 h 2 ，释放到细胞外，同时通过光合磷酸化途径促进a t p 的产生，是这些微藻在 无氧胁迫下生存的一种适应机制( 图1 2 所示) 【3 4 _ 3 8 1 。代表性藻株有：衣藻 ( ( 场肠，啪如所d 门伽) ，栅藻( p 刀p 幽j 刀妒) 【4 5 1 、小球藻( 劭，d 旭砌) 【3 9 。4 1 1 。单细胞蓝 藻的反应途径与绿藻相似，只是催化产生氢气的中心蛋白为镍铁氧还蛋白 饯0 i 十：机# f 毓凛神的筛选l 【p h 埘摔 ( n 】_ f d ) 。代嵌悱藻株柏：集胞藻( 固m p c 。叫f m ) 、高山黏球藻( g f 0 p d 。印删 a i p k 、髓趣挺tm l c r 。c y n l s 、。 l 甜1 - l 绿藻，o 氢时氯耐的相戈电r 传递逢释 喇1 2 扶氧条什f 农藻产氢示意i 刳 2 ) 台异形胞的蜒状蓝藻固氦产氧 n 含 j 舛形胜的缝状监藻一 参与，“氢代谢的关键酶包括同氮酶、吸收氢化酶 和- 逆氢化酶，j 产氧代谢过料见图l - 3 。蓝藻异型胞巾的i 州氨酶在吲鲺的h 时 j “p 氧t ，这螳氧气会被异刑脾中的吸收氧酶分解为质子( 图】一3 ，a ) ，冈此同 氨细胞( 即异型细胞) 中的净产氧量是圃氨酶和吸收氯酶练台作用的结果：但在 非氯情况下( h p 营养细胞中) 的产氢则主要是山双向氢化酶催化，双向氢化酶 蛐 瑚。瑚 咖 州 * ”“ 顺竽似* t 空献综述 u r 川时吸收或释放氧c ( 图1 3 ，b ) 。蓝藻产氢所需的质子和电子柬源于水的裂 解同氯和产氧在刊一过程中，因此不需要无氧环境( 图1 3 。c ) 但固氮酶催 化产氢反应需要a t p 的参与，这就大大降低了太阳能转化为氢气的效率，而双 向氧化酶产氧不需a t p ，但蓝藻的双向氢化酶催化效率较低f 2 。2 刊。 i m 1 ， t 一。 削i 3 监菠r p 川氪酶的产氯机制_ l 嗳鲺酶的吸氡机制 刿l 一3b 监藻中可逆氢酶的作川机制 图1 3c 蓝藻瑚氟产氢总的示意捌 ； 嘶一 蛩h 甜 j j 鼍 。 、黩 n 钱忠萍：丝状虢藻产氧藻种的筛选及其产氧调控 1 2 2 2 细菌产氢 目前细菌产氢主要有3 个途径，第一是厌氧微生物利用有机化合物发酵产 氢；第二是光合细菌通过光照，在厌氧环境中将有机物分解产生氢气；由于暗发 酵产氢过程产氢效率高、发酵条件可控，可以在生物反应器中完成整个反应过程， 但在反应中有机物的分解并不充分，而光合细菌则可以通过光照将有机物彻底分 离，因此人们研究将二者结合，形成第三种途径，即光暗联合发酵产氢。 ( 1 ) 厌氧细菌利用有机化合物发酵制氢 厌氧细菌暗发酵产氢，是目f j 我国生物制氢领域研究得比较成功的一个方 法，其中哈尔滨工业大学任南琪教授的研究团队以厌氧活性污泥为菌种来源，以 废糖蜜为原料，采用两相厌氧反应器制备出氢气，开创了利用非固定化菌种进行 生物制氢的新途径。由于此技术采用的是混合菌种，在运行中方便操作和管理， 大大提高了生物制氢技术工业化的可行性，突破了生物制氢技术必须采用纯菌种 和固定技术的局限，并于2 0 0 0 年在国内外首创并实现了中等规模的非固定化菌 种连续流长期持续产氢技术，是生物制氢领域的一项重大突破【2 5 1 。 ( 2 ) 光合细菌产氢 1 9 4 9 年，美国生物学家g e s t 和k a m e n 首次证明光合细菌在光照条件下能产 氢。光合细菌产氢是利用光合细菌在厌氧条件下通过光照将有机物分解转化为氢 气。光合细菌产氢是在与光合磷酸化偶联的固氮酶的放氢作用下产生的( 如图 1 4 所示) 。由于光合细菌只含有一个光合中心，且电子供体是有机物或还原态 的硫化物，所以光合磷酸化过程中是没有氧气产生的，且只产生a t p 而不产生 n a d ( p ) h 。与绿藻和蓝细菌相比，这种只产氢不放氧的特性，可大大简化生产工 艺，不存在产物氧气和氢气分离问题，也不会造成固氮酶的失活，但其缺点是需 要依赖有机底物，增加了产氢的成本【1 8 】。 ( 3 ) 发酵细菌和光合细菌进行光暗联合产氢 黑暗厌氧发酵产氢和光合细菌产氢联合起来组成的产氢系统成为耦合法制 氢，也称光暗联合产氢。图1 4 中给出了联合产氧系统中厌氧细菌和光合细菌利 用葡萄糖产氢的生物化学途径和自由能变化【5 0 】。如图所示自由能可以看出，由于 反应只能向自由能降低的方向进行，在分解所得有机酸中，除甲酸可进一步分解 出h 2 和c 0 2 外，其它有机酸不能继续分解，这是发酵细菌产氢效率很低的原因 6 ：海师范人学硕 ：学位论文 文献综述 所在，也是发酵细菌产氢实际应用面临的主要障碍。然而，光合细菌可以利用太 阳能柬克服有机酸进一步分解所面临的j 下自由能堡垒，使有机酸得以彻底分解， 释放出有机酸中所含的全部氢，但是仍然需要依赖有机底物【1 8 】。 低 l o w 高 h 蛐 j g o 图1 4 光合细菌光合产氢过程示意图 - 6 lk c 刚 光会缎鲸 p h o i 鹏y n t h e l i cb 矗c l p r i l l m 幽1 5 发酵细菌与光合细菌耦合法产氢生化途径 7 钱：占萍：丝状蓝藻产氧藻种的筛选及其产氧调控 1 2 3 生物制氢的研究方向 1 2 3 1 各类生物制氢的比较 我们将上述几类生物制氢的优势与弊端进行了比较，结果如表1 1 所示。 表1 1 各种生物制氢方法的利弊 1 2 3 2 生物制氢的研究方向 ( 1 ) 产氢菌( 藻) 种 菌种是生物制氢的主角。菌种性能的优劣直接关系到生物制氢技术各种经济 指标的水平，不同菌株的产氢能力差别很大，筛选优良菌种是提高生物制氢产量 的最基本和直接的方法。由于菌种筛选工作量大，任务繁重，所以目前菌种系统 筛选方面所做工作较少，只有少量的局部分离f 5 i - 5 3 1 ，通过基因工程改良目标菌株 是目前国外的主要研究方向1 5 4 1 。 厌氧发酵产氢：原料转化效率偏低、产氢速率偏低以及气相产物成分复杂是 厌氧发酵产氢的主要矛盾，筛选培育高效产氢菌株是该领域研究的一个基本方 向。 光合细菌产氢：光转化效率偏低、原料成本太高是所有种类的光合细菌产氢 ：海师范人学硕l j 学位论文文献综述 所面临的共同问题。此外，光合细菌产氢机理还没有彻底探明，这从很大程度上 制约了光合细菌产氢的研究进程。光合细菌产氢可利用的原料范围广泛，针对不 同的原料筛选高效产氢菌株是提高光合细菌产氢效率的重要途径。此外利用物 理、化学或基因工程手段培育高效产氢菌株也是光合细菌产氢研究的重要方向。 藻类光解水产氢：除了存在与光合细菌产氢相同的问题之外，藻类光解水产 氢还存在氧气对产氢酶的抑制作用以及光转化效率低两个方面的主要障碍。应主 要集中在以下几个方面丌展研究：利用基因工程改造、培育耐氧菌株，克服绿藻 光合产氢的同时产生氧气的瓶颈问题；通过基因工程改进产氢菌株提高其光转化 效率。 ( 2 ) 产氢工艺条件 产氢工艺条件的研究是生物制氢研究中研究最多的方面，工艺条件的研究主 要集中为确定特定的菌种产氢的最佳环境参数，属于生物制氢的基础性研究。由 于不同的菌种要求的生长条件各不相同，不同的研究者采用的菌种不同、使用的 产氢基质不同，所以需要首先确定各自研究对象产氢的最佳工艺条件。工艺条件 的研究是所有生物制氢研究者都要经历的阶级，因此这方面的资料最多，工艺条 键的研究主要包括温度、光照度( 光合生物制氢) 、气液相成分及含量、氮源种 类和添加量、培养基( 产氢基质) 成分和含量、p h 值、接种量、菌龄等各方面的 内容1 5 5 5 7 1 。 ( 3 ) 光转化效率 生物制氢研究中对于光转化效率和原料转化效率的研究不多，目前光转化效 率和原料转化效率仍处于较低的水平，太阳能的分散性和由此形成的地球表面太 阳能的低密度性，使得光驱动的生物制氢过程成本很高。目前光合生物制氢研究 中对光转化效率的研究不多，少量报道的数据一般小于1 ，所以要使光合生物 制氢用于工业化生产，必须提高光合生物的光转化效率。研究开发新型光合生物 反应器是提高反应器的光传导效率、提高光转化效率的最佳方法。 1 3 蓝藻生物制氢的研究进展 虽然发酵法制氢和光合细菌制氢的产氢量比藻类光解水产氢高，但是它们依 赖有机物，生产成本很高，不能完全实现可持续生产。而微藻光解水产氢底物来 9 饯忠萍：丝状蓝凛产氧藻种的筛选及j e 产氡调挖 源于水，大大降低了生产成本，是利用太阳能生产氢能的最理想途径。 微藻生物制氢的两大群体分别为蓝藻和绿藻。虽然绿藻的产氢酶系统单一， 且绿藻中的氢酶( 【f e 】型氢化酶) 活性高，但其生长周期短、氢化酶因氧气的存 在而失活，是制约其成为最佳产氢藻种的关键因素。而蓝藻作为具有光合能力的 原核生物，虽然其产氢与三个酶有关( 固氮酶，吸氢酶和双向氢酶) ，反应条件 比较复杂，氢气产量与这三个酶均有关系，但其特有的异形胞结构可以形成自然 的无氧环境，保护固氮酶不受氧气的影响而失活，使固氮产氢反应得以顺利进行。 而作为常用的蓝藻分子生物学材料，其清晰的遗传学背景、成熟的外源基因表达 体系都将成为利用基因工程改造高产氢藻株的有力保障。s v e s h n i k o v 等人利用基 因工程手段，得到敲除吸氢酶的多变鱼腥瓤胛口6 口p 刀口唧蛔6 f 胁突变株p k8 4 ， 在特定的培养环境下，氢气产量高达1 6 7 6um o l m gc h la h ，是同等培养条件下 野生多变鱼腥藻氢气产量( 4 5 1 6um o l m gc h l 讹) 的3 7 倍【5 8 l 。 1 3 1 产氢蓝藻藻种的研究 蓝藻是众多光合自养放氧的原核生物之一。它们中的许多种类具有产氢的能 力。人们已经对蓝藻不同藻种及其变种进行了广泛而多样的产氢研究。 在不同培养条件下，至少有1 4 个属的蓝藻存在产氢现象( 见表1 2 ) ，如一些 没有固氮能力的单细胞蓝藻( 高山黏球藻g f d p d c 印s 口口勿耙d ，口) 在硫缺乏的状态 下显示出很强的产氢能力【5 9 】：钝顶螺旋藻( 彳，r 向加印砌跏驴“，f ，z 口p 肠，p 珊圳) 在黑 暗、厌氧环境中能产氢( 1 m g 细胞干重1 2 小时能产生1 “m o l 氢气) 【6 0 1 ；另一些固 氮蓝藻( 柱孢鱼腥藻彳胛口6 口p 舰，f 珂办耙口，) 在氩气环境中以及低光照条件下， 能连续3 0 天同时产氢和氧；共生在苏铁类植物( c 弦伽旭，d ，“砌仞馏& g d 朋，叫 和z a 肌砌，h ，勿，口c p 口) 珊瑚状根部的蓝藻对于氢的吸收有着重要意义f 6 2 1 ；鱼腥藻 ( 彳胛口6 口p 门口s p ) 能产生大量的氢气，在柱孢鱼腥藻缺氮细胞中能产生高产量的 氢( 光照培养下每小时能产生3 0 m l 氢气) ；在长时i 日j 、高光照、直至二氧化碳耗 尽的状态下培育出的氢化酶缺陷型蓝藻点形念珠藻( d s ，d c p “门c ，咖册p ) n h m 5 显示出强大的产氢能力【6 3 】。 而研究得最多的则是鱼腥藻属和念珠藻属的藻种，如多变鱼腥藻、柱胞鱼腥 藻、水华鱼腥藻“圳】、普通念珠藻、林氏念珠藻、点形念珠藻【6 3 6 5 1 。 l o f ：海师范人学硕l ：学位论文文献综述 表1 2 各种蓝藻产氢情况【5 】 m a ) i m u mh y d r o g e n 0 r g 帅i s mn 啪e g r o 、v t hc o n d i t i h 2e v o l u t i 伽硒s a yc o n d i t i o n e v o l u t i o n a n a b q e c y l i n d r i c n0 1 0 3 lm o l m gd 叫a i rc o n t a i n e d5 c 0 27 0 0 0 l xa t t h ea 唱o n e n v i r o n m e n tw n h3 c 0 2 4 0 0 0 l xa lt i i es u r f h c co fc u i t u 他 b 一6 2 9ms u r f h c eo fc u l t u r ev e s s e l s v e s s e l s o s c i t | n “r i ob ，l e v i so 1 6 8um o l m gd r ya i rc o n t a i n e d5 c 0 27 0 0 0 l xa lt h ea 唱o n e n v i r o n m e n tw i t h3 c 0 2 4 0 0 0 l x 砒t i l es u r f 如eo fc u l t u r e b - i5 6 7w 俑s u r i a c eo fc u l t u r ev e s s e l s v e s s e i s c n l o t h r i x 0 1 2 8u m o l ，m gd r ya i rc o n t a i n e d5 c 0 27 0 0 0 i xa tt h ea 唱o n e n v i r o n m e n tw i t h3 c 0 2 4 0 ( ) 0 l xa lt i l cs u 哺a c eo fc u i t u r e ，f f z p l ，d r “，竹l4 l0 5w 俑s u r f a c eo fc u l t u r ev e s s e l s v e s s e l s c n t o t h r t x 0 1 0 8u m o i m gd r ya i rc o n t a i n c d5 c 0 27 0 0 0 i xa tt h e a 唱o ne n v i r o n m e n lw i t h3 c 0 2 4 0 0 0 l x砒t 量l e鲫晌c eo fc u i t u r e m p ，1 6 m 口f p 口b 一3 7 9 w t h s u r f a c eo fc u i t u r ev e s s e l s v e s s e l s o s c i | i n t o r i q s p 0 2 5 0 u m o i m gd 彤a i r ：l o oue m 2 s ：n h 4 c l ( 2 5 m 1 )a r ( 1 0 0 ) ：9 0pe m 2 s l ld a yo l d m i a m ib g 7w t hu s e da sc o m b i n e dn i t r o g e ns o u r c ec e i l s3 7 a i r ；i n c u b a t i o ni n l6 h l i g h t ，8 h o s c i l l n “r i nl m o s o 0 8 3um 0 1 m gc h ia ，hs 踟ea sc u l t u r ec o n d i t i o n d a r k n e s sc y c i e s ( ) ，口胛， p f p7 8 2 2 0 9 2u m o l m gc h la hn 2 w i t h5 c 0 2s a m ea sc u l n i r cc o n d i t i o n d 门口6 口p n 口s p p c c 2 6um o l m gc h la ha i r ：2 0 ue m 2 sa i r ：6 0 ue m 2 s 7 1 2 0 a n n b n e n nc y t i n d r i c n 2 1um o i m gc h la ，ha i r ：2 0 “e ，m 2 s a i r ：6 0ue m 2 ，s l a m m - l a n n b a e n nv c i r t a b i “s i a m m 5 8 4 2um o l m gc h ia ，ha i r ：2 0 ue m 2 sa i r ：6 0 ue m 2 ，s a h n b n e n qc y l i h d r i c n0 9 l um o i m gc h ia ，ha i r ：2 0pe m 2 sa i r ：6 0 pe m 2 s u t e x b6 2 9 a n q b 口e n n 垂o s c i q u n e1 7p m o l m gc h i a ，i ia i r ：2 0 pe m 2 s a i r ：6 0ue m 2 s u t e x1 4 4 4 a n n b n e n nf l o s c i q u d e 3 2 “m o i m gc h ia i l a i r ：2 0ue m 2 sa i r ：6 0ue m 2 s u t e xl b2 5 5 8 a n n b n e n o p s i s o 3 ium o i m gc h i 斫la ir ：2 0 pe m 2 sa ir ：6 0 e m 2 s f i 憎“肠r 括i a m m 13 f ) 胃，d c 门q “j f d ，w 疗l i a m m 1 4 o 6um o l m gc h ia ，ha i r ：2 0ue m 2 sa i r ：6 0ue m 2 s ( s “) c | i n c k i n 1 人m m 3 0 01 7 m o l m gc h la ，ha i r ：2 0ue m 2 sa i r ：6 0 ue m 2 s f ) s r d fc 口，打伪九p i a m m 1 3 0 2 5um o i m gc h ia ，ha i r ：2 0ue ，m 2 sa i r ：6 0ue m 2 s a n 仅b n e r l qv o r i 8 b i | l s a v m1 3 6 8u m o i m gc h la i a i r 锄dl c 0 2 ：l o oue ，m 2 ，s 4 n n b 口e n qv q r i a b l i sa i r舯d 2 c 0 2 ； c o n t i n u o u 5 p k8 4 3 2 3p m o l m gc h ia 1 1 a 唱o ne n v i m n m e n t 【a r b i d o s t a tm o d e ：l l3ue m 2 s 4 n n b n e v n r t 8 b i l i s 7 3 a r ：2 5 n 2 ；2 c 0 2 ；9 0 “ p k8 4 1 6 7 6 m o i m gc h la h9 3 a r ；5 n 2 ；2 c 0 2 ：9 0ue m 2 s e m 2 s a n n b n e n qv n r i n b i t t sa i ra n d2 c 0 2 ；o u t d o o rc o n d i t i o n ； p k8 4 0 1 lum o l m gc h ia ，h a i r 柚d2 c 0 2 ：o u t d o o rc o n d i t i o n 4 0 0 w m 2 a n a b 口e n nv a r i 口b i t t s 7 3 a r ；2 5 n 2 ；2 c 0 2 ；9 0u a t c c2 9 4 1 3 4 5 1 6u m o i m gc h ia h 9 3 a r ；5 n 2 ；2 c 0 2 ：9 0ue m 2 s e m 2 s a n d b n e n nv n r t n b n 话 5 0 0 0 i xa tt h es u r f a c eo fc u l t u r ea r 硼d5 c 0 2 ：5 0 0 0 i xa d d i t i o no l a 丁c c2 9 4 1 3 0 0 5u m o i m g d 哆w 怕 v e s s e l si w e e n8 5 ( 7 7 m m ) 钱忠萍：丝状蓝藻产氧藻种的筛选及其产氧调控 表1 2 各种监藻产氢情况【5 】( 续) m a x i m u mh y d r o g e n o r g 明i s mn 帅e ( ；r o w t hc o n d i t i o nh 2c v o l u t i o n 舔s a yc o n d j t i e v o l u t i o n a n 口b 口e n ov 口r i n b i l sa j r锄d2 c 0 2 ：c o n t i n u o u s 1 c c 2 9 4 1 3 3 9 4p m o i m gc h ia i l a 唱o ne n v j r o n m e n t 【a r b i d o s t a tm o d e ：ll3ue m 2 s n og a sp h a s e ：c e l l si m m o b i i i z e dm a n 口b n e n nv 口r t 口b i | sh o i i o wn b e r ：2 5ue m 2 so nt h et o p 1 4 0 3 4 b 2 0 “m o l m gc h ia h a i r ：1 5ue m 2 s s u r f a c e 卸d1 3ue m 2 so nb o t t o m s u r f h c eo