（基础兽医学专业论文）鸡海马结构向小脑的直接投射——顺行溃变法电镜研究.pdf

河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论 鸡海马结构向小脑的直接投射顺行溃 学位 硕士 文题目 变电镜研究级别 学生 学科 导师 姓名 张艳晓基础兽医 刘忠虎 专业姓名 学位论文 是否保密 否如需保密，解密时间年月日 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中特别 加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包括为获得河南农、j k 大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师 对此进行了审定。与我。同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了 明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：张彬吃师签导师签名：副洛夕 r 期：弦毋年月吗t ：t日期：妒踔莎月计同 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷本和电子版 本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编 学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文 的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离) 1 ：河南 农业大学后，就在校期问从事的科研工作发表的所彳j 论文，第一署名单位为河南农业 大学，试验材料、原始数掘、申报的专利等知识产权均归河南农业大学所有，否则， 承担相应的法律责任。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 研究生签名：纭旋吨导师签名：少移汤- 学院领导签名： ；宝翻 日期：僻月衫日日期：口g 年6 月讲日日期：弪彩月： f 印# ； t 一 ，钼 致谢 感谢河南农业大学牧医工程学院和佛山科技大学生命科学院为我提供了良 好的学习和生活环境。 在我三年研究生生涯中，无论是在理论学习阶段，还是在论文研究和撰写阶 段，都得到导师刘忠虎副教授的悉心指导和帮助。导师严谨的治学态度，渊博的 学识，深邃的思想，雄阔的视野，以及他朴实无华、平易近人的人格魅力，无微 不至、感人至深的人文关怀，让我在三年中不仅积累了丰富的学识，更让我学到 了很多做人的道理。 特别感谢指导老师刘为民教授! 本文的选题、丌题、研究和撰写都是在刘老 师的悉心指导和亲切关怀下完成的。两年来，刘老师在学习和生活上给予了无微 不至的关怀和帮助。导师一丝不苟的治学态度，渊博的学识，严谨、创新的科学 素养是我获益匪浅；导师宽广豁达的胸怀，积极向上的工作作风，平易近人的处 世方式将使我获益终生。 感谢河南农业大学牧医工程学院肖传斌教授、佛山科技学院王丙云教授、马 春全教授、计慧琴老师、王政富老师、赵海全老师和陈芳老师的亲切关怀和热情 帮助! 感谢佛山科技学院已经毕业的硕士研究生蓝赐华、李阳、张萍、许苗苗等提 供的无私帮助和有益建议! 感谢河南农业大学在读硕士研究生袁文菊、都军霞、范沛、赵蕾等提供的无 私的帮助! 感谢在佛山科技学院进行论文实验的在读硕士研究生钱君娣、黄文静、李冬 虹、王娟；本科生李燕华、粱嘉铃等人提供的无私的帮助! 感谢中山医科人学投射电镜实验室提供了投射电镜的观察甲台! 最后，深深感谢直以来给我无限关爱和支持的家人! 河南农业大学硕士论文 摘要 为明确家禽端脑向小脑直接投射这一长期悬而未决的问题，证实家禽海马结构小脑 直接投射通路是否存在，以及明确这一通路抵达小脑后的确切投射部位，本实验以粤禽黄鸡 为研究对象，采用顺行溃变电镜追踪法，在本实验室前期工作的基础上对青年鸡端脑海马结 构小脑直接投射这一神经联系进行系统、深入研究和确认，为脊椎动物端脑对躯体运动 机能调控机制的研究提供形态学证据，促进人们对这一投射系统功能意义的揭示。 选取2 4 月龄的粤禽黄鸡6 0 只，未分雌雄，常规饲养，作为试验动物。以单电极和双 电极电损毁双侧海马结构的海马部( f i p ) 、旁海马区内侧部( a p i - i m ) 以及旁海马中间部 ( 舢) ，动物存活7 d ，灌杀，取端脑进行甲苯胺蓝染色，判定损毁情况，取小脑进行电镜 观察。 结果：存小脑深核( 内、外侧核) 以及d , n t 。髓质内出现火量的溃变纤维；小脑1 时 皮质的分f 层、蒲氏细胞层以及颗粒层的浅层中出现人量溃变终末。前划采川h r p ( 辣根 过氧化物酶) 顺行示踪法将h r p 通过压力注射引入鸡海马结构的旁海马内侧区( a p h m ) ， 在中脑导水管背侧发现酶标纤维存在。 结论： 1 在青年鸡确实存在海马结构一一小脑的直接投射，主要起始核是旁海马内侧区 ( a p h m ) 。 2 海马结构小脑直接投射t 要投射到小脑前叶的分子层深层以及蒲氏细胞层，有 少量投射剑中叶的分子层深层，较少投向小脑深核，尤其是内侧核儿乎不见溃变终末。 3 在蒲氏细胞层观察到较多的溃变终末，并且可见其与蒲氏细胞形成突触。这一发现 说明：海马结构小脑直接投射系统中从海马结构发出的纤维与小脑内蒲氏细胞形成单突 触联系。 4 在分子层发现火的由蒲氏细胞发出的树突，其周嗣包嗣有终末，说明端脑小脑 直接投射通路中由端脑发出的纤维是以攀缘纤维的形式与小脑蒲氏细胞树突形成联系的。 关键词海马结构小脑顺行溃变电镜研究 河南农业大学硕士论文 1 文献综述 1 1 海马结构的研究现状 1 1 1 哺乳类海马结构的研究现状 哺乳类海马结构、海马的纤维联系以及海马的功能已经有大量研究1 1 】：海马结构由嗅 脑边缘部的海马( a m m o n 氏角) 、齿状回、下托以及属于海马残体的灰被( 骈胝体上回) 和 束状回组成。海马结构属于古皮质，为沿着侧脑室弯曲的弓形结构。海马的纤维联系十分广 泛和复杂，各种纤维的起止点不同研究者在不同动物上得到的结果也不完全相同。传入纤维 来自内嗅区和隔区，也有报道来自内侧前脑束，杏仁核簇，间脑，脑干蓝斑核、缝际背核和 上中央核的若干纤维。传出纤维由海马锥体细胞的轴突组成，主要通过穹窿( 海马的主要传 出通路) 到同侧内侧隔核、两侧外侧隔核、b r o c a 氏斜角带核、下丘脑前区、内侧视前区、 乳头体、丘脑前核、前嗅核、终纹床核、额叶、中脑被盖中央区、中央水管周围灰质及脑桥 核。海马与嗅觉的传入有间接j _ 泛的联系。以前认为它是嗅觉中枢，但从比较解剖学来看， 哺乳动物中海马形态的大小，与嗅觉的发达程度并无直接关系。海马的功能如同它的纤维联 系一样相当复杂。根据许多动物实验和海马受损病人的的临床表现，海马受刺激或损伤，动 物有以下多种表现：( 1 ) 自主反虑如乖体t s h 和a c t h 的释放、瞳孔散大、竖毛、呕吐等； ( 2 ) 性反应，如阴攀勃起、舐外生殖器等；( 3 ) 防御性躯体运动，如猛扑，转头定点凝视 等；( 4 ) 躯体运动反应，刺激海马的不同区，可分别引起面肌、颈肌、肩带肌、前肢肌的运 动；备肌群在海马有一定的代表区，有人已在猴海马上作出躯体定位模式图：( 5 ) 影响血压 和呼吸运动( 抑制或停i 上) ：( 6 ) 有些受试者的膝跳反射和踝反射增强；( 7 ) 近事记忆障碍 或丧失但往事记忆不受影响；( 8 ) 有人认为与情感反应和情感控制有关。 在爬行类，n o r t h c u t t l 2 3 ，u l i n s k i t 4 ，b r u c ea n db u t k e r l 5 妞过对有鳞爬行类( 蜥蜴和蛇) 端脑皮质的研究将爬行类端脑皮质分为内侧、背内侧、背侧和外侧4 个区。许多学者通过对 其细胞刑态的研究指出爬行类端脑内侧皮质，背内侧皮质分别与哺乳动物海马结构的齿状 同，a m m o n 氏角具有高度相似性1 6 , 7 , 8 】。 1 1 2 禽类海马结构的研究现状 1 1 2 1 禽类海马结构的位置以及亚核划分 在鸡等禽类，海马结构( h i p p o c a m p a lf o r m a t i o n ，h f ) 是位丁人脑半球侧脑室内侧及背内 侧的皮质，t 叶据内侧肇后2 3 。背内侧皮质的外侧接副高纹状体，内侧皮质的腹侧与隔相 连。近年来，国际上比较神经学领域对禽类海马的研究出现，人精的文献报道，许多学者通 过对哺乳类和禽类海马的个体发生、神经递质分布、神经纤维联系、细胞构筑以及功能诸多 方面进行了比较解剖学的研究。g r a i g i e 9 1 于1 9 3 5 年，k a r t e n 和h o d o s 1 0 l 于1 9 6 7 分别用尼 氏染色法对海马结构进行亚区划分，特别是k a r t e n 和h o d o s 用根据s p 神经活性物质的分布 界定了海马结构的外缘和腹缘界限行绘制出海马结构及其弧核划分图，将海马结构分为背 侧区( d ，d o r s a lr e g i o n ) 、背内侧区上部( d m s ，s u p e r i o rp a r to fd o r s o m e d i a lr e g i o n ) 、 2 河南农业大学硕上论文 背内侧区。卜部( d m i ，i n f e r i o rp a r to fd o r s o m e d i a lr e g i o n ) 和腹内侧区( v m ，v e n t r o m e d i a l r e g i o n ) 4 部分。m o n t a g n e s e l l l 】等于1 9 9 6 年采用尼氏染色与锌染色相结合的方法对海马结 构进行研究。e r i c h s e n l l 2 垮丁1 9 9 1 年采用免疫组织化学的方法研究了鸽海马结构的亚核划 分并绘制了亚核分区图谱，将海马结构分为背外侧区( d l ，d o r s o l a t e r a lr e g i o n ) 、背内侧 区( 删，d o r s o m e d i a lr e g i o n ) 、“v ”海马层区( v - s h a p e dh i p p o c a m p a ll a y e r ) 以及位于” v ”形区两侧臂之间的三角区。s z d k l e y 和k r e b s 2 3 】于1 9 9 6 年采用菜豆凝集素顺行神经示踪 方法对斑雀海马结构进行研究。t s m b 5 1 1 4 ，1 5 】于2 0 0 0 年采用高尔基法分别研究了鸡和鸽的海 马结构。s u d r e z 1 6 】等采用神经型一氧化氮合酶以及g a b a 对青年鸡和成年鸡海马结构的亚核 划分进行了研究，将海马结构化分为：海马( 船) 、旁海马内侧区( a p h m ) 、旁海马中闻 内侧区( a p h i m ) 、旁海马中间外侧区( a p h i l ) 、旁海马外侧区( a p h i ) 和“v ”形海马层 6 部分。尽管不周的学者采用不同方法在不同禽类有不同的结论，对海马结构及其亚核的划 分不尽相同，但是这些研究成果舀：宏观上还是统一的，使我们对海马结构有了全面系统的认 识。总结不同学者的研究成果我们可以知道：禽类海马结构位于侧脑室背内侧，其背外侧与 副高纹状体相邻，腹侧与隔相邻，吻端与副高纹状体相邻；不同学者对海马结构划分的不同 弧核的对应关系如下： k a r t e n 背侧区背内侧区上部背内侧区。卜| 部 e r i c h s e n 背外侧区背内侧区 s u d r e z 旁海马外侧区中间内、外侧区旁海马内侧区 腹内侧区 三角区“v ”形层 海马“v ”层区 为了避免名词使用的错乱，本研究中我们采用s u d r e z 的划分法：海马( 唧) 、旁海马 内侧区( a p h m ) 、旁海马中间内侧区( a p h i m ) 、旁海马中间外侧区( 肿h i l ) 、旁海马外侧 区( a p h l ) 乖“v ”形海马层6 部分。 许多学者认为禽类海马与哺乳类海马在端脑内的位管以及个体发生( k u h l e n b e c k l l 7 1 ， k 勐l e n f l 8 1 r e die s1 1 9 1 ) ，细胞构筑( m o l l f i l 2 0 l ，m o n t a g n e s e 1 1 l ，t s m b s l i t 1 5 1 ) ，免疫组织化学反应 ( 酬c h 1 2 l 】，k r e b s 2 2 1 ，s z a k l e y 【2 3 1 方面具有高度相似性：( 1 ) e f i c h s e n1 2 1 增于1 9 9 1 年采 用免疫组织化学的方法，在禽类海马结构的“v ”层区发现胆囊收缩素( c c k ) 标记的纤维 终末包同着“筐”状物的人细胞，而n u n z i 2 4 l 等丁1 9 8 5 年在哺乳类海马结构的a m m o n 氏 角发现其锥形细胞也存在这样的现苏；s m i t h l 2 5 】1 9 8 9 年采用g o l g i 法对两种燕雀的研究发现 其海r - 5 的“v ”层的锥形细胞见有瞩赢“v ”形层内侧以及外侧臂的定向树突，这一细胞 形态与哺乳类锥形细胞的形态相似，说明禽类海马结构的“v ”层区与哺乳类海马结构的 a m m o n 氏角相对应。( 2 ) 禽类海马结构的海马( 肿) 区内的大型、中型多态细胞具有生长 激素抑制素( s s ) 和神经肽y o n p y ) 免疫反应活性( a m a r a la n dc a l l l p e l l l 2 6 1 ，1 9 8 6 ；k s h l e r 【2 7 1 1 9 8 6 ) ，而在哺乳类海马结构fj 区的细胞也具有这两种神经肽免疫活性反府( 1 ( 6 h l e r i z 7 j 1 9 8 6 ) 。这说明禽类海马结构的海马( 册) 区与哺乳类海马结构的门区具有同源性( 3 ) 禽 3 河南农业大学硕上论文 类旁海马内侧区( a p h m ) 存在具有舒血管肠肽( ) 免疫反应活性的细胞( e r i c h s e n 【2 1 1 1 9 9 1 ) ，k s h l e r 嚣 于1 9 8 3 年通过对鼠齿状回的免疫化学研究证实哺乳类齿状回的颗粒层 细胞也具有这一免疫反应活性。从而禽类旁海马内侧区( a p h m ) 与哺乳类齿状回具有高度 相似性。( 4 ) k r e b s m l 等于1 9 9 1 年指出：禽类海马内侧纤维壁具有传入到海马的儿茶酚胺 能纤维、5 一羟色胺能纤维和胆碱能纤维，与哺乳类的穹窿相似。 1 1 2 2 禽类海马结构的功能研究 近年来关于禽海马结构的功能研究，特别是大量关于禽类海马结构在空间辨识和空间记 忆方面的研究，引起了研究者的广泛关注。1 9 8 4 和1 9 8 7 年b i n g i i l a n 【2 9 删等实验性地切除鸽 子的海马结构，结果发现鸽子对鸽巢附近地标物的熟悉程度减退，从而造成归巢困难。国外 许多学者认为：候鸟的远程迁徙( a l e r s t a 皿p 1 1 ，1 9 9 0 ，b e r t h o l d 【3 2 】，2 0 0 1 ) ，斑雀类的储存食 物( k a m ila n db a l d a d 3 1 ，1 9 9 0 ，s h e t t l e w o r t h 3 4 l ，1 9 9 0 ，s h e r r ya n dd u f f d 5 1 ，1 9 9 6 ) 以及鸽子 的门巢( k r a m e r ! 圳，1 9 5 9 ，b e r t h o 】d 【明，1 9 9 1 ) 都能准确无误是闪为这些i 弓类能够在空间环境 中获得记忆从而指导它们能够找回到目标位置，从而说明鸟类具有较强的空间辨识和空间记 忆能力。在哺乳类已经明确证实动物认识区别能力与海马结构的纤维联系有关。s q u i r e d 8 l 和w o o d 3 9 j 认为哺乳动物存在一个有海马结构参与的摄食神经同路，这个神经同路与其空间 识j ! ； | 和空间记忆有关。在鼠，这个复合突触通路已经研究的比较清楚【删：神经投射从内嗅 区皮质投射到齿状回，由齿状同投射到a i i 珈o n 氏角的c a 3 区，再由c a 3 区投射到c a l 区，最 后由a m m o n 氏角的c a l 区投射到海马网。1 9 8 9 年和1 9 9 2 年s h e r r y l 4 1 t 4 2 1 ，19 9 4 年g o o d 【4 3 1 ，1 9 9 9 年g a g i a r d 0 1 “ 以及c o l o m b 0 1 4 5 4 6 等许多外国学者关r 鸟类海马结构的研究认为鸟类在寻同 储存的食物以及归巢行为中所表现的空间记忆及空间辨识能力与鸟类的海马结构有关。从而 证明禽类海马结构与哺乳类海马结构在功能上也存在较高的相似性。 1 1 2 3 禽类海马结构的纤维联系 有关禽类海马结构的性质和纤维联系，较少有文献叙及。犬丁禽类海马结构的纤维联系 的研究较多的是有关鸽子的研列4 7 , 4 8 , 4 9 l ，由了二研究方法的局限，甲期的这些关于海马结构纤 维联系的研究都局限于海马结构与隔核的纤维联系吲或是关于海马结构的传入神经联系 1 4 引，直到1 9 9 6 年a n d r e 8 【5 0 j 采刚顺行神经示踪方法对斑雀类海马结构的纤维传出联系进行了 研究。2 0 0 2 年a t o j l 5 l 】等采用b d a 顺行追踪和c t b 逆行追踪相结合的方法详尽地研究了鸽 子海马结构与端腩内不同l 又：域问的纤维联系。总结关下海马结构与端脑其它部位的纤维联系 的文献报刽我们得出如卜概念：( 1 ) 讶侧端脑问存在相互投射。剑对侧端脑的投射存在两个 通路：一，端脑尾部海马内神经元发出的纤维主要是通过海马结构腹内侧的纤维壁投射到对 侧海马结构；二，端脑吻端以及中部海马结构内的神经元发出的纤维主要是沿隔一海马连合 投射到对侧海马结构。这两支通路都经过皮质连合。( 2 ) 海马结构存在向双侧隔、背外侧皮 质的投射，其传出纤维通过皮质连合。( 3 ) 海马结构与同侧旁海马、背外侧皮质以及副高 纹状体之闻存在相互投射，隔向同侧海马的投射比较弱。( 4 ) 海马与“v ”形层的外侧臂的 4 河南农业大学硕【：论文 神经细胞层存在投射关系。k a h n 5 2 j 等于2 0 0 3 年同样采用b d a 顺行追踪和c t b 逆行追踪相结 合的方法证明鸽子海马结构内不同分区间存在投射关系：外周感觉区投射到旁海马中间内侧 区( a p h h n ) 以及旁海马内侧区( a p h m ) 的背侧部，旁海马内侧区( a p h m ) 存在向海马 腹内侧部以及腹外侧部神经元细胞层的投射；海马腹内侧部存在向腹外侧部的投射；腹内侧、 腹外侧以及旁海马内侧区( a p h m ) 存在向对侧腹侧部细胞层的投射；旁海马内侧区( a p ) 腹侧部接受腹内侧以及腹外侧海马细胞层的投射。2 0 0 4 年a t o j i 5 3 】采用神经示踪法以及 k a i n i c 酸损毁法详细系统地研究了海马结构、隔以及海马结构亚区之间的纤维联系。在禽 类，目前所有有关海马结构纤维联系的研究仅局限于海马结构不同区域之间或海马结构与端 脑内其它结构之间，海马结构向端脑外的投射鲜见报道。 1 2 小脑的划分及纤维联系 1 2 1 小脑的划分 哺乳动物的小脑略 球形，横向分为3 部分：中部为蚓部，两侧为小脑l ，球；纵向从前 向后分为3 部分：前叶、后叶、绒球小结叶；根据种系发生的先后分为：古小脑 ( a r c h e o c e r e b e l u m ) 、旧小脑( p a l e o c e r e b e l l u r e ) 和新小脑( n e o c e r e b e l l u m ) 3 部分，绒球 小结叶属古小脑又称前庭小脑，1 只小脑包括前叶的蚓部和后叶蚓部的蚓锥体和蚓垂。新小脑 包括小脑的其余人部分。在种系发生过程中，古小脑较稳定，变化较小：旧小脑有一定科度 的发展；新小脑的发展与人脑皮质的发展相关联。 禽类小脑只有蚓部和小脑耳，无小脑半球，表面有许多横沟和隆起，从前向后分为：前 叶( i v 叶) 、中叶( 叶) 后叶( x i x 叶) 。小脑皮质从外向内分别为：分子层， 蒲肯野氏细胞层，颗粒层。 1 2 2 小脑的纤维联系 小脑通过传入纤维接受来自运动中枢的信息及火革与运动有关的感觉信息，经小脑皮 质内众多神经元的整合作_ j ，最后汇集剑蒲肯野氏细胞：蒲旨野氏细胞的冲动传递到小脑核， 再由小脑核的传出纤维传出，仅少部分由蒲肯野氏细胞的轴突直接传递出，而影响脊髓、脑 干和大脑皮质的运动功能。 1 2 2 1 小脑的传入纤维 小脑的传入纤维多而复杂，主要米臼脊髓、前庭、卜- 橄榄核、脑桥核、外侧网状核和脑 桥被蔫网状核等腑干内的小脑前核。这些纤维传导来自火脑皮质运动中枢的信息，和来f 1 肌、 腱、芙1 7 、皮肤及前庭、视器、听器等0 运动有天的信息。传入小脑的信息苗是小脑传出的 信息量的3 倍。 前庭小脑束( v e s t i b u l o c e r e b e l l a rt r a c t ) 的纤维来自前庭器，有直接的初级纤维和 间接的次级纤维，该束的主要功能与维持平衡和身体姿势有关；脊髓小脑束 ( s p i n o c e r e b e ll a rt r a c t ) t 要传递1 卜意识性的本体感觉和外部感觉信息李小脑，包括肌 张力和关节位置的信息；橄榄小脑束( o l i o c e r e b l l a rt r a c t ) 发自延髓的下橄榄核，以攀 5 河南农业大学硕士论文 缘纤维的形式至小脑皮质，该束对小脑控制运动的功能具有重要影响：脑桥小脑束 ( p o n t o c e r e b e l l a rt r a c t ) 发白脑桥核，在哺乳动物是小脑最火的传入柬，此束是大脑皮 质脑桥一小脑系的一部分，通过此系，嗨小脑置于大脑皮质的影响之下；网状小脑束 ( r e t i c u l o c e r e b e l l a rt r a c t ) 发自网状结构核团，其中延髓网状核接受来自脊髓、大脑皮 质感觉运动区及红核等皮质下中枢的纤维，成为大脑与小脑之间的重要反馈环路；三叉小脑 束( t r i g e m i n o c e r e b e l l a rt r a c t ) 发自三叉神经中脑核、脑桥核( 感觉主核) 和脊束核， 此束与传递咀嚼肌和面肌的本体感觉有关；顶盖小脑纤维( t e c t o c e r e b e l l a rt r a c t ) 发自 前丘、后丘和项盖前区，除直接投射到小脑外，有些纤维经脑桥核和( 下) 橄榄核中继转递 到小脑。除以上这些传入来源外，红核、蓝斑、薄束核以及一些脑神经运动核，均有纤维投 射至小脑。 禽类小脑的传入纤维有：脊髓小脑束、橄榄小脑束、桥核小脑纤维、顶盖小脑束、半月 核小脑求、前庭小脑束、蜗小脑求、二义小脑束、纹状体小脑束、监斑小脑投射、网状小脑 纤维、小脑皮质核纤维。 1 2 2 2 小脑的传出纤维 小脑皮质的神经冲动少数由蒲肯野氏细胞的纤维商接传出，多数经小脑核间接传出，因 此可分为小脑皮质传出束路和i ，j 、脑核传出束路两人部分。 小脑皮质传出束路：绒球前庭束( f l o c c u l o v e s t i b u l a rt r a c t ) 发自绒球小结叶和前叶 蚓部及蚓毋的皮质，纤维经同侧小脑后脚的旁绳状体而i 卜丁前庭各核，主要为外侧核和前核； 此外从小脑前叶( 小舌、中央小n 1 和山顶) 、后叶( 小结希l 蚓乖) 也有纤维到前庭核。从小 结有纤维到延髓网状结构。 小脑核传出束路：小脑皮质神经元的轴突先至小脑核，人体可分三部：蚓部皮质的纤 维投射剑顶核；半球中间区的投射到间傅核；半球外侧区的投射剑外侧核( 齿状核) 。再南 三对小脑核分别发“ 小脑传山纤维，但这三二部之间囊：有重替；同时，小脑皮质二的颅尾部， 分别投射到各相应小脑核的颅尾部。顶核纤维包括发白顶核终丁同侧和对侧前庭核的顶核延 髓束( t a c t i g i o b u b a rt r a c t ) 和发自顶核终于脑桥和延髓内的网状结构的小脑脊髓束 ( c e r e b e l l o s p i n a lt r a c t ) ；间位核纤维包括发自间位核- l 卜予对侧红核的小脑红核求 ( c e r e b e l l o r u b r a lt r a c t ) ，还有发e j 间位核的纤维止丁对侧匠脑的腹外侧核、脑桥核、脑 桥网状结构和f 橄榄核；齿状核纤维包拒发亡】齿状核经脑桥被蔫至中脑被薷人部分纤维在中 脑后部交义剑对侧，绕过或穿过红核i 侍0 1 h j 脑终丁斤：脑的腹外侧核、腹前核、枕及某些板 内核，由此发出的纤维经内囊剑达入脑皮质的感觉运动区的齿状丘脑束( d e n t a t o t h a l a m i c t r a c t ) 和终止于红核的齿状红核束( d e n t a t o r u b r a lt r a c t ) 禽类小脑的传出纤维主要投射到脊髓、延髓和中脑的运动核。 1 2 2 3 端脑和小脑的纤维联系 脊椎动物端脑( 大脑) 皮质和小脑在控制动物运动方面共同发挥着重要作用。新小脑 6 河南农业人学硕：| ：论文 主要为小脑后叶的新小脑旁蚓部和外侧部，功能与精细的随意运动有关，特别在肢体末端， 其影响是通过小脑对大脑皮质的作用而实现的。新小脑旁蚓部的皮质，通过大脑皮质一脑桥 - d , 脑束，接受大脑皮质感觉运动区的传入联系；传出联系则是通过小脑间位核，经丘脑仍 返回大脑皮质同区，形成封闭环路。新小脑外侧部的皮质，通过大脑皮质一脑桥- d , 脑柬， 接受大脑皮联络区的传入联系，传出联系则通过小脑齿状核经丘脑而返回大脑皮质感觉运动 区，形成开放环路【5 4 1 。正是由于小脑与大脑的皮质间的相互联系，使大脑皮质发出的运动 指令，一方面能符合当时的具体情况，一方面可依据随时反映的运动信息而对指令进行修正。 才能使小脑对肌张力进行精确的调节，从而使动物得以完成精细的、非刻板的运动，特别是 像需要练习和学习的运动。 1 3 端脑到小脑直接投射的研究现状与分析 1 3 1 哺乳类研究现状 有关端脑与小脑的直接联系一直是人们探索的。个重要问题。按照一般的理解，名词“人 脑小脑系统”( c e r e b r o c e r e b e l l a rs y s t e m ) 意味着上述这一个间接的“大脑皮质脑桥 小脑”以及“大脑皮质下橄榄小脑”的投射系统【5 5 1 。但是上世纪8 0 年代已有数篇 报道在哺乳类动物发现直接的大脑皮质小脑投射，然而这些研究发现投射仅在动物非常 幼小的时期存在，即仅在嗣产期一过性的出现，剑青年期就已完全消失【5 6 l 。在小猫，端脑 小脑直接投射具有对应的对位投射特点，轴突起源于额叶初级感觉运动区( s l 区) 的 锥体细胞，其轴突加入锥体系，以侧支投向小脑皮质及小脑深核【5 7 , 5 踟，这种侧支丁出生后的 第七周消火1 5 6 - 5 引。在家兔，端脑小脑直接投射出现_ 出生前5 天内，丁出生时消欠， 其轴突起源丁大脑枕叶皮质，通过内囊、人脑脚、小脑中脚到达小脑旁绒球的白质【硎。其 它一些作者( f e u e m 柚删等1 9 8 3 年，t o l b e r t l 5 6 1 等，1 9 8 3 年，b 她a 【6 2 】等，1 9 8 6 年) 分别在 美洲负鼠也发现存在端脑小脑的直接投射，也是一过性的，功能意义不详。新近国外学 者w i l d 【6 3 】采用生物素化的葡聚胺( b d a ) 顺行示踪技术已经发现在成年大鼠也存在端脑一 小脑的直接投射，这一发现将突破沿袭至今的“在正常成年哺乳类不存在端脑一小脑的直接 投射”这一理论框架，在哺乳动物对躯体运动调节的研究上提供了新的形态学证据和线索， 开辟了一个崭新的研究领域。 爬行类的端脑与哺乳类的端脑在进化上有密切关系。1 9 7 7 年h o o g l a n d 等【“l 采刚顺行溃 变法证明蜥蜴的腹侧纹状体发出纤维投向小腑深核，1 9 7 9 年v o n e i d a 等1 6 5 l 采川删位素示踪 法证明蜥蜴的端脑有向小脑深核的商接投射，但1 9 8 2 年b a n g m a 6 6 l 等对两种龟类，一种蛇 类和一种蜥蜴采川h r p 逆行追踪法研究，并朱发现端脑向小脑的投射。这意味着作为现代 神经示踪手段，h r p 逆行追踪法也许有其局限性。 1 3 2 禽类研究现状 植：禽类。早期的研究者c r a i g i e ( 1 9 2 8 ) 6 7 1 ，h u b e r ( 1 9 2 9 ) i 醅1 采_ 日| 普通组织学观察的方法认为 存在纹小脑束，此束起自旧纹状体。然而1 9 5 2 年w h i f l o c l ：6 9 墚用溃变法在鸡，鸽方面 7 河南农业人学硕士论义 的研究，以及1 9 7 7 年c l a r k e i v o ! 采用h r p 逆行追踪法进行的研究并未在鸡和鸽发现任何端脑 小脑的直接投射。然而2 0 0 0 年新西兰学者w f l d 6 3 培采用逆行示踪法将c r b - h r p ( 霍 乱毒素b 亚单位结合的阳婢) 注入斑雀的小脑，在端脑前端部副高纹状体的腹侧区发现少 量逆行标记细胞：采用顺行示踪法将生物素化的葡聚胺( b d a ) 注入斑雀副高纹状体腹侧 区，在小脑深核和小脑皮质发现标记纤维，它们主要分布于分子层。从而证实了在成年鸟类 存在端脑小脑的直接投射。我国学者刘为民于1 9 9 6 年【7 1 l 和2 0 0 1 1 7 2 年将h r p 注入2 月 龄青年鸡的小脑，在端脑的海马、副高纹状体、隔区、旁嗅叶、古纹体、带核、嗅结节发现 逆标细胞；采用c t b - h r p 注入鸡古纹状体，在小脑的分子层深部出现标记终末，小脑深核 未见明显标记。从而证实在鸡也存在端脑一小脑直接投射。 1 3 3 国内外不同动物研究现状的分析 根据前人在哺乳类所做的结果，可见幼猫、胎兔的端脑小脑直接投射仅在发育的围 产坶j 矩衍地山现，而w i l d 等在成年人鼠也发现小脑皮质存住这种投射，但很微弱。传统的 观点认为止常成年哺乳动物不存在端脑- d , 脑直接投射，但若实验性地去除某些小脑的传入 纤维的起始核，则可出现端脑一小脑的直接投射。这一方面表明在小脑传入投射的靶核上存 在着某种竞争机制，重要的纤维得到优先安排，以至于次要的投射逐渐消退。另一方面也可 推测直接的端脑小脑投射可能是一种原始的投射类型，在动物的进化过程中逐渐被新发 生的间接投射所取代。根据重演律，即个体发育将重演系统发生的过程这一规律，在较低等 的脊椎动物可能存在恒定的端脑一小脑直接投射。在鸟类已经存在桥核和下橄榄核两个联系 端脑剑小脑的“桥梁”，但均不如哺乳类发达。w i l d 等已经在成年斑雀证实了成年鸟类存在 端脑小脑的直接投射。我国学者刘为民也已经证实在青年鸡广泛存在着端脑小脑投 射的起始核，部分核团对小脑有很强的投射。由此可以重新审视在哺乳类出现的现象，提出 假说“哺乳类暂时性的端脑小脑商接投射可能是一种发育现象”，而不是t o l b e r t s s 认为 的是一种锥体束纤维误导( m i s d i r e c t e da x o n s ) 入小脑的现象。从进化角度讲，禽类端脑与 哺乳类端脑相比更为原始，它们是沿着两条不同的进化路线从原始的有尾两栖类进化来的。 对禽类端脑小脑直接投射系统的确认对于证明哺乳类端脑小脑投射结构和功能方 面的进化历程有重要的理论意义，同时由于禽类端脑小脑直接投射较哺乳类更为明显和 丰富，对禽类端脑小脑直接投射系统的确认有助丁建立以禽类为模型的功能研究体系， 加速人f i j 对这一投射系统功能意义的揭示。 彬拆：t o l b e r t l 5 8 1 等、w i l d 6 3 l 等的观察哺乳类端脑小脑投射属锥体求侧支的投射。 在禽类已经具备了锥体束的类似结构，这一纤维束起白副高纹状体。w i l d 等已经证实此束 发出纤维抵达小脑，然而我国学者刘为民1 9 9 6 - 2 0 0 1 年的研究表明鸡的端脑小脑直接 投射不仅仅起源于副高纹状体，尚有许多其它来源( 海马结构、隔区、旁嗅叶、古纹状体、 带核、嗅结m 。 1 4 海马结构小脑直接投射的研究 8 塑夏垒些查竺堡：竺丝义 3 j 有关海马结构是否存在向小脑的直接投射的研究儿乎没有报道。哺乳类，在出生7 周内 的小猫，端脑小脑直接投射源于初级感觉运动区( s i 区) 的锥体细胞，其轴突加入锥体 系，以侧支投向小脑皮质及小脑深核。在出生前5 周的家兔，端脑小脑直接投射系统中 的轴突起于人脑枕叶皮质，通过内囊、大脑脚、小脑中脚到达小脑旁绒球的白质。在爬行动 物有研究证明蜥蜴的腹侧纹状体发出纤维投向小脑深核。但一直没有有关海马是否存在向小 脑的直接投射的研究。在禽类，一般认为海马是二级嗅觉中枢。依n o r t h c u t t 7 3 l 的观点，禽 类旁海马内侧区( a p h m ) 与蜥蜴类和鳄类的背内侧一般型皮层( d o r s o m e d i a le l e m e n to f g e n e r a lc o r t e x ) 在进化上同源，而蜥蜴类和鳄类的这部分皮层具有重要的功能意义，电刺 激它，可导致动物类似游泳或步行的全身性活动，显然这部分皮层为运动皮层。但r o g e r s i v 4 在鸽电刺激端脑半球背内侧表面的一个区域仅出现瞬膜的活动，并未引出其它任何躯体运 动。本实验室采用h r p 逆行追踪法，将5 0 的i - i r p 水溶液经压力注射引入鸡小脑、v 、 、i x 再n 1 逆行追踪海马结构向小脑投射的终末部化。结果除第1 x 叶外，在 双侧端脑的旁海马内侧区( a p h m ) 、隔核均出现逆标细胞，以旁海马内侧区( a p h m ) 的 标记细胞最多，标记最深。发现禽海马有向小脑的商接投射，并且这种投射很可能可抵达小 脑皮质，初步表明在旁海马内侧区( a p h m ) 和小脑皮层之间存在往返神经环路，这将为揭 示小脑在参与动物的空间辨识和空间记忆的作州提供：= i | 常有价值的线索。 根据目前在禽类有关海马结构小脑直接投射的研究，仅有本实验室采用逆行示踪技 术做出证实。但只是证明了旁海马内侧区( a p h m ) 与小脑之间存在直接投射关系，由予此 种方法的局限并未证明海马结构小脑直接投射在小脑的具体投射部位。这就需要采用顺 行追踪的研究方法加以证实。有关海马结构小脑直接投射的顺行研究在国内外还是空 白。为了从顺行方面进一步证实禽类海马结构小脑直接投射，并探明海马结构一小脑直 接投射通路以及在小脑内的具体投射部何。本实验采用电损毁溃变电镜技术对海马结构 小脑直接投射进行研究。探明海马结构小脑直接投射在小脑的具体投射部何，拓展人们 对端脑小脑功能联系的认识，以及这类联系的系统发生和个体发生的认识。 9 河南农业大学硕i ：论文 2 引言 小脑是一个重要的运动调节中枢，主要接受与运动有关的信息，维持身体平衡和正常姿 势。而精细的随意运动则是由端脑和小脑共同发挥作用，传统的观点认为：是通过“大脑皮 质一脑桥一小脑”以及“大脑皮质一下橄榄一小脑”这两条间接的投射系统完成的。直到上 世纪年代已有数篇报道在哺乳类动物发现直接的大脑皮质小脑投射，然而这些研究发现 投射仅在非常幼小的时期存在，即仅在围产期一过性的出现，到青年期就已完全消失。爬行 类的端脑与哺乳类的端脑在进化上有密切关系，上世纪7 0 年代有两位学者采用不同的神经 学示踪方法在蜥蜴发现端脑向小脑的直接投射。在禽类，2 0 0 0 年新西兰学者w f l d 等采用 c t b - h r p ( 霍乱毒素b 噩单位结合的i - i r p ) 逆行示踪法以及b d a ( 生物素化的葡聚胺1 顺行 示踪法发现：斑雀端脑前端部的副高文状体与小脑存在直接的神经投射，从而证实了在成年 鸟类存在端脑一小脑的直接投射。我国学者刘为民于1 9 9 6 年采用h p 3 ( 辣根过氧化物酶) 逆 行示踪法发现在2 月龄青年鸡存在端脑的海马、副高纹状体、隔区、旁嗅叶、古纹状体、带 核、嗅结节向小脑的直接神经投射；于2 0 0 1 年又采用c t b h r p 顺行示踪法再次证实：青年 鸡古纹状体存在向小脑皮质的直接神经投射。从而证实成年鸡也存在端脑一小脑直接投射。 从进化角度讲，禽类端脑与哺乳类相比更为原始，它们是沿着两条不同的进化路线从原 始的有尾两栖类进化米的。近2 0 余年来，国际上比较神经学领域对禽类海马的研究出现了 人量的研究报道，许多学者认为禽类海马与哺乳类海马在端脑内的位置以及个体发生，细胞 构筑，免疫组织化学反应方面具有高度相似性。所以本课题预期通过对禽类端脑一小脑直接 投射系统的深入研究，和确认建立以禽类为模型的功能研究体系，为脊椎动物端脑对躯体运 动机能调控机制的研究提供形态学证据，加速人们对这一投射系统功能意义的揭示。 本实验室采用h r p 逆行示踪技术证明了背内侧海马与小脑之间存在直接投射关系，由 于此种方法的局限。并未证明海马一小脑直接投射在小脑的具体投射部位。这就需要采用顺 行追踪的研究方法加以证实。前期我们采用多种顺行示踪方法进行研究，均未在小脑发现标 记纤维或终木，这说明顺行示踪技术具有定的局限性；传统的溃变方法( 即光镜卜的溃变) 在上世纪近1 0 0 多年的时间里为神经解剖学的主体理论框架的建立奠定了雄厚的基础，但这 类方法由丁结果不稳定，判定凼难，如：银染法需要不断摸索才能找到适合的最佳条件，观 察需要相当有经验的研究人员才能胜任而逐渐不被采川。电镜渍变法在一定程度上可以克服 光镜溃变法的缺点。为了克服顺行示踪削传出距离不足以及光镜溃变法结果不稳定的局限， 本实验预j j 采川电镜溃变顺行示踪方法，从顺行方面进一步t l e 实禽类存在海马一小脑直接 投射，探明海马一小脑直接投射通路以及在小脑内的具体投射部位。 1 0 河南农业大学硕1 j 论文 3 材料与方法 3 1实验材料 3 1 1 实验动物2 - - 4 月龄粤禽黄鸡生产代青年鸡，雌雄不拘，均购自佛山南海联营种鸡 场。 3 1 2 主要试剂及配制 3 1 2 1禽用生理盐水 n a c i 蒸馏水 3 1 2 2 阳母液 7 5g 1 咖m l a 液( 酸性) ：0 2 m o l ln a h 2 p 0 4 h 2 0 ( 分子量1 3 8 0 1 ) 2 7 6g 溶解后加入到1 0 0 0m l 容 量瓶中，加蒸馏水到终刻度。 b 液( 碱性) ：0 2 m o l l n a 2 h p o 1 _ 1 2 h 2 0 ( 分f 鹫3 5 8 1 4 ) 7 1 6 3 2g ，溶解后加入剑1 0 0 0m l 容量瓶中，加蒸馏水剑终刻度。 0 2 m o l l p h 4 的p b 母液( 1 0 0m 1 ) a 液1 9m l b 液8 1m l 3 1 2 3 固定液( 2 多聚甲醛1 2 5 戊二醛溶液) ( 1 0 0 0m 1 ) 取2 0g 多聚甲醛于锥形瓶中，加蒸馏水至4 0m 1 ，加热沸腾6 - - 8 分钟使之充分解聚， 加0 2 m o l lp h 7 4 的磷酸缓冲液5 0 0m l ，等温度降剑4 0 左右加2 5 戊二醛5 0m 1 ，再加 蒸馏水至1 0 0 0m l 。 3 1 2 4 粘片液( 铬矾明胶溶液，1 0 0m 1 ) 取明胶0 5g ，加蒸馏水1 0 0m l ，加热至沸腾，加铬矾( 硫酸铬钾) 0 0 5 o 5g ，溶 解后过滤，冷却至室温备刖。 3 1 2 51 甲苯胺蓝复染液( 5 0 0m 1 ) 取5 9 甲苯胺监溶于5 0 0 m l 蒸馏水中，过滤备用。 3 1 2 6 环氧树脂包埋剂 a 液： e p o n 8 1 2 ( 一种进口树脂) 5 1m 】 d d s a ( 软性i 司化刺j 1 2m 】 m n a ( f i 史性- i a l 化刺) 3 7m 1 d m p ( 加速固化剂) 1 8 2m 1 b 液：d b p ( 苯二甲酸二丁脂) 增塑剂 a 液：b 液= 1 ：4 3 1 3 主要仪器 江湾i 型c 小动物脑立体定位仪上海澳尔科特生物科技有限公司 河南农业大学硕? l ：论文 k d 一5 0 0 型推拉式三用切片机 光学显微镜 l k b - v 型超薄切片机 p h i l i p sc g - 1 0 型透射电镜 电热恒温水浴锅 3 1 4 玻璃仪器处理 浙江省金华市科迪仪器设备有限公司 重庆奥特光学仪器有限公司 l e i c a 公司 荷兰p h i l i p 公司 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 载玻片放入无水酒精中浸泡2 4h ，绸布擦干防尘保存备用。盖玻片放入5 的盐酸酒精 中浸泡3 0m i n ，后放入无水酒精中浸泡2 4h ，绸布擦干防尘保存备用。 3 1 ，5 损毁电极的制作 选用质量较好的钢质针灸用细针( 3 2 号较好) ：用9 5 的酒精浸泡2 4h 以上，之后用酒 精棉球反复擦拭以除去油污；然后涂上稀绝缘漆，在1 3 0 c 温度下烘干。然后，再涂上一层 曛新烘烤，共涂烘7 1 0 次，直至成金黄色；然后做漏电实验：将一个6 伏电池的阴极接住 电极末涂漆的柄上，电池的阳极接在一根碳棒上，将电极和碳棒同时浸入盐水杯中，经l o 分钟，看是否有气泡发生。若无气泡，即可将涂好漆的电极取下擦干备用。用时将尖端的漆 用油石磨掉少许以露出针尖0 5 - 1i m 。用胶布将两根电极并列制成双电极。 3 2 实验方法 3 2 1 损毁海马的电压及通电时间预试验 3 。2