（预防兽医学专业论文）金黄色葡萄球菌α溶血素基因的克隆与表达.pdf

摘要 * 溶血素是金黄色葡萄球菌最重要的毒力因子，它可引起多种疾病，奶牛乳房炎的主要致病因子之 一就是金黄色葡萄球菌分泌的* 溶血素。奶牛乳房炎严重影响牛奶的品质，患牛牛奶中体细胞数大幅增 加，会降低乳蛋白、乳糖和乳脂肪的含量，使用抗生素治疗，又会引起大量残留，从而使鲜奶受到体细 胞和抗生素的双重污染，严重损害乳制品的质量和风殊。奶牛乳房炎严重阻碍了我国畜牧业的发展，每 年均给奶牛业造成巨大的经济损失。由于治疗严重影响牛奶的品质，而且金黄色葡萄球菌非常容易产生 耐药性，其引起的感染很难治愈，因此接种疫苗就成为最理想的防制措施；但金黄色葡萄球菌常规疫苗 效果不理想。故研常蛙因工程疫苗就成为解决问题的主要途径。 本实验使用从奶牛乳房炎奶样中分离到的一株金黄色葡萄球菌致病菌株，采用p c r 法扩增出编码 成熟蛋白渤素基因的全亭歹0 ，与p m d l s - t 载体相连，构建金黄色葡萄球菌* 溶血素克隆质粒， 进行测序。结果表明临同源性在9 9 9 以上，编码的蛋白质氨基酸同源性在9 9 9 8 以上，说明金 黄色葡萄球菌分泌的毒力因子“溶血素序列高度保守，同源性极高。 再将导入克隆质粒的外源片段构建删吲达载体质粒，并对表达质粒经砷r g 诱导进行表达，用 s d s p a g e 电泳分析表达产物。表达产物金黄色葡萄球菌a 一溶血素蛋白的分子量约3 3 如与天然的金 黄色葡萄球菌m 溶血素蛋白分子量相近。金黄色葡萄球菌* 溶血素蛋白的成功表达，为研制* 溶血素的 基因工程疫苗奠定了物质基础。 关睫词：金黄色葡萄球菌，o 一溶血素，奶牛乳房炎，克隆，表达 a b s t 艘i c t t h eg r a m p 0 s i t i v eo 玛a i l i s m 口印咖，0 c 。c c 淞口z 朋淞i sam 面o rb a c t e a lp a m o g e n i ti sa s s o c i a t e d w i t l lt 1 1 ee t i o l o g i c a lo f av a r i e t yo f i n f b 吐i o i l sd i s e a s e si n 卸i m a l s ，i n c l u d i n gm 雒t i t i s a l p h a _ h e m o l y s i n i st l l em o s ti m p o r l a n to ft 1 1 ee x 订_ a c e l l u l a rt o x i n s p r o d u c e db yv i r u l e n t s 廿a i n so f & n l 胖瑚 c 删e r a i s i n gi st h el e a d t n g 咖c k b r e e d i n gi n d u 泖i nc h i n aa n dt 1 1 ep p o d u c t i o no fm i l kp l a ya n i m 呻t r 0 j ej n 廿l ef e s o u r c eo f r e v e n u ee v e r yy e 越b u tm eq u a l 睁a f l d a s t eo f m j l k 州l ib e 捻c t e d t 墙m l f u l l yd u et ot h ei l lc o wi n f e c t e db ym a s t i t i s ，t h e r e f 0 li ti sap r i m a r yo b s t a c l et om a k em o r e d e v e l 0 p m e mo fm i l c hc o wi n d u s t r yi nc h i n a ，m o r e o v e lt l l ef 痂e r sw i l ls u 圩醯g 陀a tl o s s 劬mt h e e ) me x p e n d i t i l r eo f 抒e a 仰e n t t h e 廿e a t m e n t so fa n t i b i o t i c sn o to n l yd e c r e a s et l l eo u t p u to fm i l kb u t a l s of c s u l ti ns e r i o u ss i d ee 丘b c ti nt e 兀i lo ft l l eh e a l t l lo fc o n s 岫e r s t h ee 丘b c tt 瑚l d i 廿o n a iv a c c m eo f 母q 葩d c c 淞口删础i si n v a l i d a t i o n a sar e s u 也i ti st 1 1 eb e s tw a y t op r o 协c tc o w 丘d mm a s t n i sl l s i n g e n g i n e e 血培v a c c i n e t h es t r a m so fs 日舯淞u s e d mt l l i sr e s e 疵hw e r eg a l i l e df r o mt h em i 墩s 锄p 】e sc o m a i n i n gt 1 1 e m a s t i t i s ，锄dt t l eg e n ee n c o d i n ga l p t l a - h e m o l y s i no f 岛印砂如c d c c 珊口州埘w a s 咖p l 讯e db y p o l y l i l e r a s ec h a j nr e 枷o n ( p c r ) 1 1 1 ec o 唧l 既ed n as e q u e n c eo fac i o n e da l p h h e m o l y s i ng c n e 丘口m 印b 妇c d c c 瓣。珊“w a sc 加胁e db yd n as e q u e n c e 柚a l y s i s ，蛐d 吐l ed n as e q u c e h o m o l o g yi sm o r et 1 1 a n9 9 9 9 a 船rc o m p 曲g 州t ls e q u e n c ep u b l i s h e dp r e v i o u s l mf o j l o w i n gm e e n z y m ed i g e 蚶皿a n dp c ra t l a l y s i s ，ac l o n i gv 。咖fc 0 酏l i i i i n gd n as e q u 锄c eo fa l p h a _ h e m 0 1 y s i n w a sd e v e l 叩e d 胁a l l y 、w9 0 tar e c o m b i n a n te x p f e s s i o np l 髂m i dm 衄e dp q b 3 0 - t h ee x p r e s s i o n o fr e c o m b i n a n ta l p h a - h e m o l y s i np r o t e i l lw a sd e t e c t e d 、v i t l ls d s - p a g ea s s a y1 1 1 em o l e c l l l a rw e i 出 o fr e c o m b 证a mp r o t e i no fa l p h a h e m o l y s i ni sn e a rt on a t i l r ep r o 钯抽o fa l p h a - h e m o l y s i n t h e s u c c e s s f i l le x p r e s s i o no ff e c o m b i n a n ta l 曲a - h e m o l y s i 工lp r o v i d e dw e l lf o l l l l d a t i o nf o rm e 血曲e r 啷e a r c ht h ee n c o d i i l gv a c c i n ef o rm a s t i t i s k 吖w o r i l s ：咖o c c 淞口矾她写a l p h a h e m o l y s i n ，m i l c hc o wm a s t i t i s ，c l o n e ，e x p r c s s i o n i v 英文缩略语表 v i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得黑龙江八一农垦大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：了匆一强 时间： 坷年月，日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解黑龙江八一农垦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意黑龙江八一农垦大学可以用不同方式 在不同刊物上发表，传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名 时间：纠 年6r1 日 吣间：叉砖 零 黾f 晦 撅纪幻 掀稻 1 1 前言 第一章文献综述 葡萄球菌( 涮加c c w ) 是革兰氏阳性球菌中的一种，广泛分布于自然界，如空气、水、 土壤、饲料和一些物品上，也存在于人、动物的体表、鼻咽部及肠道。致病性葡萄球菌常引起 各种化脓性疾患、败血症或脓毒败血症。其中金黄色葡萄球菌( 印咖k o c c mn ) 致病力 最强，也最重要。 溶血素( n h a e m o l y s i l l ) 是金黄色葡萄球菌的最主要致病因子，与牛的乳房炎有关，它还 导致白细胞等崩解，并作用于平滑肌细胞，引起平滑肌收缩、麻痹，最终坏死。a 溶血素是不 耐热的蛋白质，分子量是3 3 ，0 0 0 。对多种哺乳动物红细胞有溶血作用，其原理是毒素分子插入 红细胞的细胞膜疏水区，形成微孔，破坏了膜的完整性，而造成细胞溶解，因此它属于穿孔毒 素。 能否提高奶牛业的经济效益，提高牛奶质量高度依赖于能否有效地控制奶牛乳房炎的发 生。免疫接种己被证明是最广泛有效的防病手段。自巴斯德以来，对疫苗的研究一直是免疫学 研究的重点，并已在防制人畜传染病的斗争中取得了巨大的成绩。但是，一百多年来，在制蓖 工艺上，仍停留在以培养大量致病性微生物为基础的第一代疫苗的基础上。 2 0 世纪8 0 年代，出现了基因工程疫苗，突破了常规疫苗的生产程序，在短短的几年内涌 现出可以称之为第二代疫苗的新型的高科技疫苗。比如，基因工程亚单位疫苗、基因工程活载 体疫苗、基因缺失疫苗、d 1 q a 疫苗等。重组d n a 技术的诞生，使动物疫苗研制发生了一场重 大改革，为工业化生产安全可靠的各类生物制品展示了光辉的前景。 乳制品是我们生活需要的主要副食品，牛奶又是人们动物蛋白的主要来源之一，是人体中 不可缺少的营养成分的一部分。所以，牛奶质量在很大程度上影响到我国人民的生活水平和健 康水平，因此，防制奶牛乳房炎为我国人民提供安全、高质、无潜在传染的乳制品，并准备 积极参与竞争国际乳制品市场已成为我国畜牧业长远发展的大计。本实验从基因水平入手， 进行了奶牛乳房炎主要致病因子金黄色葡萄球菌一溶血素的表达，为进一步研制奶牛乳房炎基 因工程亚单位疫苗奠定了物质基础，从一定意义上说，为无奶牛乳房炎乳制品的生产和销售， 推动经济增长，促进人民健康都具有深远意义。 1 2 金黄色葡萄球菌a 溶血素研究进展 1 2 1 发现及影响 1 8 7 8 年，k 0 c h 最早发现了球菌，之后不久，o g s t o n 就鉴定出金黄色葡萄球菌是多种疾病 的病原菌。又在随后的几十年中，金黄色葡萄球菌成为细菌感染中最常见的病原菌，从表层皮 肤化脓到威胁生命的败血症，能广泛的引起各种疾病。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌成为获得性 感染的最主要病原体。 发现金黄色葡萄球菌是多种疾病的主要致病菌后不久，通过观察分离到的金黄色葡萄球菌 株，检测到金黄色葡萄球菌* 溶血素接种到实验动物后可引起炎症反应。金黄色葡萄球菌通过 血平板培养可检测到一种或几种溶血剂，当时就以能否看到清晰的b - 溶血环来作为判断是否为 金黄色葡萄球菌感染的一种诊断标准。后来引入凝固酶阳性试验作为检测金黄色葡萄球菌的唯 一标准，因为能产生b 一溶血的金黄色葡萄球菌株毫无例外地均能产生凝固酶。 最初对a 溶血素的一系列研究是由1 9 2 8 年在澳大利亚b l 】i l d 曲e 睹喊发生的一场悲剧开始的。 2 1 名进行白喉类毒素预防接种的儿童突发烈性疾病，导致1 2 名儿童死亡。在对这次灾难原因的调 查中，b u m e t 口1 从白喉类毒素疫苗中分离到金黄色葡萄球菌。几十年后确定q 溶血素是金黄色葡 萄球菌致病性的最主要原因。一溶血素为外毒素，是一种分泌蛋白，具有溶血性、细胞毒性，可 引起皮肤坏死，并具有致死性。当含有n 溶血素的金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上培养时，能看 到清晰的b - 溶血环。* 溶血素基因定位在金黄色葡萄球菌染色体上。在3 0 株凝固酶阴性分离株中 没有检测到a 溶血素基因。o r e i l l y 等人【”1 观察到，在毒素休克综合征( t 0 x i cs h o c ks y n d m m e ， t s s ) 分离株中虽然包含* 溶血素基因，但是却检测不到* 溶血素。这是由于* 溶血素结构基因 突变，阻止了蛋白质的翻译。 1 2 2 功能研究 对于* 溶血素的研究，一个具有里程碑意义的发现是，a 一溶血素对不同动物物种的红细胞 的溶解程度不同，易感性有变化。例如，* 溶血素溶解人红细胞比溶解兔的红细胞的浓度要高 大约4 0 0 倍。除红细胞外，皮肤上皮细胞、兔肾细胞、原纤维细胞、平滑肌细胞、柱状细胞和 肥大细胞也易受q 溶血素侵袭，使这些细胞释放细胞溶解酶，引起平滑肌细胞痉挛式收缩等”5 7 3 1 。 对n 溶血素的作用机制和由它引起的细胞效应的研究中，b e l 1 e i i n e r p j 提出细胞溶解动力 学分析理论，c 0 0 p e r 等人1 4 1 进行了研究工作，最后他们提出溶血包括一系列特定的过程：首先 是毒素与细胞之间的相互作用：其次是k + 的释放；最后才引起溶血。a 一溶血素能使红细胞和有 核细胞发生裂解，是它具有致死性的原因。但致死性也可能是* 溶血素对中枢神经系统的侵袭 引起的，应用放射性同位素示踪法研究静脉内毒素积累时发现，溶血素不仅在肾和肺中积累， 而且在脑中也有积累f q ，较大量的n 溶血素可引起大脑生物电的迅速停止而导致死亡1 7 27 “。 致死性还可能是心脏血管衰竭引起的，* 溶血素可使心脏输出量降低，还能促使小血管平滑肌 收缩、痉挛，并导致毛细血管血流阻滞和局部缺血坏死【5 】。 尽管众多研究阐述了m 溶血素在体内和体外的生物学效应，但它对人类的致病性却引发了持 续的争论。人红细胞对* 溶血素具有天然抵抗力，使某些人认为m 溶血素的致病作用可能仅仅被 限制在某些动物物种中。金黄色葡萄球菌还分泌大量的其他毒素物质，包括杀白细胞素、凝固酶、 蛋白酶和脂肪酶，许多人认为这些毒素作为对人类的细菌毒力可能比* 溶血素更有意义。然而， s i e g e l 和c o h p 1 报道说使用* 溶血素处理富含血小板的人血浆，可使血小板变形和聚集。血小板 虽然渗漏n a d + 和k + ，但并不渗漏蛋白质；因此，很显然没有发生细胞溶解。b h e i m 目和 s c h w a r d ”注意到兔血小板对* 溶血素也高度易感。随后电子显微照片证实，n _ 溶血素处理的人 血小板虽然发生肿胀，但并不溶解1 7 “。进一步观察显示【7 6 j ，人血小板是对_ 溶血素；甑度易感的靶 细胞，因此必需纠正n - 溶血素不能损伤人红细胞这一盛行很广的教条，随后证明单棱细艟p 7 l 和内 2 皮细胞是另外两种高度易感的人类细胞型。 1 2 3n 溶血素的结构和特性 k e h o e 和他的同事们”“克隆并测定了a 溶血素基因，推导出n 一溶血素的氨基酸顺序，推测d 溶血素单体的分子量为3 3 ，4 0 0 。t 、v e t e n 等人”最早检测了n 一溶血素的信号肽序列。 早期有报告指出， 溶血素可由不同的细菌菌株产生，这可能显示出具有重要意义的分子异 质性1 4 j 。然而，在进一步的文献中没有证实这种论断，从分离的2 0 株金黄色葡萄球菌做d 1 q a s o u t l l e m 分析，在限制性片段中，没有异质性。此外，免疫学实验和d n a 杂交实验都没有检测到 任何结构和遗传上与微生物相关的产物。在* 溶血素和其他孔形成蛋白之间没有同源性，包括补 体和淋巴细胞。 最近正在研究m 溶血素基因的表达调控。n 溶血素是以单拷贝的形式存在于细菌染色体上。 r e c s e i 等人检测到一种反式作用正调控元件，称为a f i ”j 或e x p l “j 。这种元件的图谱在p u r b 和i l v l o c 一1 之间，调控几种外毒素蛋白的产生，包括有葡激酶和 、b 和& 溶血素也包括丝氧酸和 金属蛋白酶口o ，“j 。这发现解释了更早观察到的现象，金黄色葡萄球菌许多外毒素蛋白的产生 是严格同步化的，并主要在对数后期和稳定期产生，这样就可能获得几种外毒素蛋白表达同时受 到影响的突变株，已经克隆了其染色体调控位点口”。 m 溶血素暴露广泛伸展的疏水氨基酸。用圆二色法分析* 溶血素溶液表明，n 一溶血素含有丰 富的p 折叠结构( 6 8 ) 和少量的q 螺旋结构( 1 0 ) 。王i i g a e 和n a k a e ”等人的研究表明，* 溶血 素低聚物的全部二级结构和其单体没有明显差异。这表明寡聚化作用在分子的二级结构上并不引 起大的变化。m e m 幽从理论上得出结论，构建* 溶血素至少需要十种两性的b 折叠结构，并 推定每个长3 m 。旺- 溶血素序列的中心部分包含丰富的甘氨酸残基。随意缠绕的概率很高，表明 这个区域是作为c 域和n 域之间折叠的铰链区。另外，产生一个两性* 螺旋至少需要一个伸展的 氨基酸。现已明确孔形成蛋白理论上不必包含伸展的疏水氨基酸，但是两性的b 折叠或* 螺旋结 合可产生孔。因此，m 溶血素的一个表面可同脂质相互作用，而另一个表面将排斥非极性的膜成 分，从而产生了一个水通道。到目前为止，所得到的所有孔结合蛋白的证据同这个观点都是一致 的。值得注意的是大多数孔形成蛋白的详细的结构知识都是来自于细菌的孔蛋白，每个环b 折叠 结构与膜平面垂直，细菌孔蛋白具有高度的序列同源性，并有大量的两性b 折叠结构。 包括补体成分c 9 和埃希氏大肠杆菌溶血素在内的几种孔形成蛋白都显示出c a 2 十结合活性， 然而这些蛋白质，在e d t a 中延长温育时间就会丧失孔形成能力。但d 溶血素的孔形成能力在此 情况下不会丧失，d 一溶血素对于细胞溶解酶功能的结合和表达不需要二价阳离子。 可使用两种简单有效的方法分离n 溶血素。第一种方法是快速蛋白液相层析柱一步纯化法。 第二种方法是c m 葡聚糖凝胶浓缩细菌培养上清液单步离子交换层析柱法。第二种方法纯化回收 的a - 溶血素制剂，用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 和分析离心来判断，纯 化效率在9 5 以上。冻于m 溶血素制剂可将其加入到5 0 m m 醋酸铵中，在这种状态下，蛋白质在 - 2 0 可稳定保存几年，在室温条件下也可保存几星期。o 5 m 咖l 的溶液在a 2 8 0 下近似值为1 0 。* 溶血素可溶于水或任何p h 5 9 的缓冲液中。 但是仍然不能用x - 射线分析天然的或七聚体形式的* 溶血素。尽管大规模纯化天然a 溶血素 已不成问题，但都没有获得结晶体，得到的都是非结晶体或纤维聚合体形式。分离制备同源七聚 3 体制剂很困难，因为不能排除较少原体低聚物污染的可能性；而呈现七聚体两性分子性质的处理 则更困难。 1 2 4 主要的靶膜结合方式 研究者使用高纯度的n 溶血素来分析其对不同细胞类型和物种的不同敏感性的反应机制，而 接下来的发现使调查者感到很困惑。首先，不同物种的红细胞对- 溶血素的易感性差异很大【4j 。 其次，溶血素能损害无蛋白脂质体p “i ，从兔或人的红细胞中萃取的脂质体配制的脂质具有相 似的易感性p j 。第三，无论是易感性的细胞还是具有抵抗力的细胞结合* 溶血素的数目都是很少 的。在1 9 6 5 年早期，b e m h e i m e r 和s c h w a r 乜i ”报道，一溶血素介导的血小板功能的改变不带有可察 觉的n 溶血素的消耗。后来，a r b u l h n o n l 6 估测仅有大约5 的”c 标记的a 溶血素能结合到完整的 兔红细胞上。这些观察晟初在概念上显出某些局限性，因为- 溶血素的细胞溶解作用可使它牢固 地结合到细胞膜上。 与此相反，有些研究指向检测位于高度敏感的兔红细胞上的受体。然而，权威性的结合研究 指出，只有具有高特异活性标记，又没有重要的生物功能丢失的适当的示踪剂才是可行的。配制 具有适当标记的毒素示踪剂制剂是很困难的，而已证明存在* 溶血素受体的几种研究都是基于间 接的方法得出的结论。 k a t o 和n a i 1 发现，神经节苷脂能抑制旺- 溶血素失活，因此提出这些分子具有表面受体的 作用，然而，这种结合可能仅仅是由于静电的相互作用。事实上，b u c k c l e w 和c o l a c i c c o i ”1 观察， * 溶血素的穿透率在含有神经节苷脂的脂单层中是最低的，而在无神经节苷脂的胆固醇单层中是 最高的。由此推断，神经节苷脂事实上可能是阻止而不是增加* 溶血素的膜损伤作用。 m a h a m i 和f a c h e l l 田1 假定，红细胞的阴离子反向转运是一溶血素的受体。他们也是基于间接 证据得出下列结论：( 1 ) 使用链霉蛋白酶或胰凝乳蛋白酶消化兔红细胞后，再用a 溶血素作用， 红细胞的敏感性降低。而这些酶可切开带3 蛋白；( 2 ) 通过结合某些外源凝集素可使细胞敏感性 降低，推测可能是屏蔽了受体，经神经氨酸苷酶处理后也可降低敏感性：( 3 ) 纯化带3 蛋白可使* 溶血素失活。这些资料显示，结合有洳溶血素的糖蛋白表面存在有一个或几个糖残基。k a l o 等口4 1 也报道了溶血的兔红细胞上的外源凝集素具有保护效应。然而，作为受体，带3 蛋白必需具有严 格的同一性。兔红细胞上特异性结合位点的数量比带3 蛋白分子的数量少，并且也不能排除制剂 被辅助成分污染的可能性。关于带3 蛋白是否是n 一溶血素受体的争论仍在继续。现已发现，虽然 清洗过几次但没有除去蛋白酶的细胞，不能切开带3 蛋白，然而当加入到温育的混合物中时，残 留的蛋白酶却能切开q 溶血素，因此可能产生带3 蛋白是a 一溶血素受体的假象。使用经神经氨酸 苷酶处理的- 溶血素也不能降低兔红细胞的敏感性。h h s h m m 和b o n d u r m t 口”发现用鼠红细胞与 成熟细胞和成体红细胞相比较，对* 溶血素的易感性没有差别。因此他们的结果不能支持在鼠细 胞中，任何在红细胞分化晚期合成的分子( 包括带3 蛋白) 即为* 溶血素受体的这个观点。而鼠 红细胞对* 溶血素表现为中度易感性的原因1 4 i ，可能仅仅是由于存在低亲和力的结合位点的原 故。 1 9 7 6 年，c a s s i d y 和h a r s h m a n 1 用放射性同位素示踪* 溶血素，使用的示踪剂是具有高特异 活性的放射性碘，但是溶血效价却只有原始溶血效价的1 0 。资料表明，兔的红细胞可表达有限 数量的* 溶血素表面受体，而人的红细胞则不表达* 溶血素表面受体。一溶血素与兔红细胞表面 4 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第一章文献综述 受体结合的最理想温度是2 4 ，此时表现出不可逆性结合。经总结认为，兔红细胞对* 溶血素具 有高度易感性的原因就是由于这些受体的存在。还有一种结论认为，在高浓度下，a 溶血素是经 另外的方式结合，即在具有抗性的细胞间经非特异性的相互作用结合，例如人红细胞。因为只有 使用高浓度的溶血素引起的细胞溶解中才能检测到环结构所以认为这一现象可能是由于在高 浓度和低浓度下引起的膜损伤存在不同的机制引起的。 后来，p h i m i s t e r 和f r e e ”用以碘处理的功能上完整的n 一溶血素做了结合实验。他们报道，始 终有大约2 0 的结合超过浓度测试范围。这些结果不支持受体观点。当使用酶联免疫吸附实验 ( e l i s a ) 研究一溶血素的结合时，也没有得出在兔红细胞上存在受体的证据唧j 。然而，后一种 方法的灵敏度不能检测到少量的特异性结合位点。 c a s s i d y 和h 幽a i l l 2 6 j 的主要结果和结论，解决了关于受体的争论。h i l d e b r a n d 等人i ”】标记的 n 溶血素不仅具有高特异性活性并保持了其功能活性，他们的结合研究表明，兔红细胞表达一种 对n 溶血素平均为l ，5 0 0 2 ，0 0 0 高亲和力的特异性结合位点。m 溶血素用两种截然不同的交互作用 类型结合靶细胞。在低浓度时，n 一溶血素专有地结合到特异性位点；在浓度是2 r l m 时发生半数致 死量结合。在高浓度时( 2 0 0 n m ) ，溶血素经非特异性方式，有吸引力的交互作用结合到膜上。 这种方式是人红细胞溶解和脂质体损伤的方式。结合到人和兔红细胞上的- 溶血素经放射自显影 术分析显示，溶血是不可避免的，他同七聚体形成有关；因此，寡聚化作用是低m 溶血素剂量孔 形成的先决条件。简单的计算显示，兔红细胞溶血可通过非常少的七聚体结合诱导就可产生，以 至于每个七聚体就可能形成一个孔。在低u 溶血素浓度时低聚物产生的量非常少，这就使通过电 子显微镜检测根本看不到生成的低聚物，也就解释了为什么c a s s i d y 和h a r s h m 1 2 6 1 不能在低剂量 a - 溶血素作用时，在兔溶解细胞上检测到环。 天然的特异性结合位点仍不清楚，但其中一小部分，最可能呈现的是蛋白质性质。人们试图 通过使用配体印记法、亲合层析法或交联的方法确定粘合剂分子，都没有成功，通过神经节苷脂 或阴离子反向转运的方式来证明少量的结合位点也不可行。m a h a m i 和f a c k r e l l 口3 j 的资料能显示出 粘合剂分子具有糖蛋白性质。k a l o 等人口”做了一个实验，使用黄素单核苷酸结合并阻断兔了红细 胞上的n 一溶血素结合位点。在人血小板和单核细胞中也检测到旺- 溶血素的特异性结合位点。 结合的途经解释了为什么”溶血素的消耗量一般都很低。因为当高浓度时，结合经固有的、 效率差的、相互吸附的方式产生。低浓度时，结合仅限于某些细胞表达的少量特异性位点。因此， 这就可以理解* 溶血素为什么通常能扩展到相当远的距离去损伤距产生位点相当远的易感细胞。 l - 2 5 结构和功能关系 结构和功能关系的研究是- 溶血素研究中有争议的领域。有的研究认为分子域必须要与膜结 合，也就是说，域是与低聚物生成和孔形成相关的。还有的研究试图通过生物化学修饰方法证明 氨基酸残基是毒素功能所必需的。 h a r s h m a n 等人”生产出抗n 一和c 末端多肽域的单克隆抗体。一个抗体直接抗一个定位在c 末端片段的抗原决定簇，以抑制a - 溶血素结合到细胞上，因为结合区域在分子c 端部分。抗n 端部分的抗体不能抑制结合，但是能抑制毒素低聚物的生成。在放射性碘标记实验基础上， c a s s i d y 和h a r s l m a n l j 认为在n - 末端域的酪氨酸残基是低聚物形成过程中必不可少的。但是，抗 体分子r 是比n 一溶血素大很多的分子团，不可能成为十分精确的探针来阐明结构与功能之间的关 系，因为抗体结合会造成空间位阻分子区域同抗原决定簇之间也存在差异。是终，结合域必需 使用更精确的方法，如自然分子的结合竞争来确定。可直接证明多肽域或溶血素片段能各自结 合。b l o m q u i s t 和t h e l e s t m i l ”1 分离到了天然存在的* 溶血素片段，鉴定为c 一端部分，可结合细 胞，并显示出完全溶血活性i j “。这些资料指出只有大约半数的n 一溶血素分子在红细胞上需要孔 形成活性，n 端部分不必非要形成低聚物。由此可知，* 溶血素的结合域定位在分子的c 端部分。 b l o m q u i s t 和s i 嘴e n 【”1 报道，不同的单克隆抗体抑制* 溶血素的溶血、皮肤坏死和致死效应 的能力是不同的。例如，一种抗体不能中和溶血或皮肤坏死效应，但是却可消除致死性。因此， 可以认为* 溶血素的不同生物活性是由不同的分子域携带和诱发的。这个论点意味着要么* 溶血 素对于不同的靶细胞有不同的结合位点，要么由于七聚体跨膜孔的形成导致不同的毒素效应是不 一致的。b 1 0 m q l l i s t 等人i ”，”j 也报道，c 一端天然存在的1 8 k 的一溶血素片段，尽管能产生溶血，但 是对鼠的y 1 细胞没有细胞毒性或致死性。这个片段的出现并结合，阻断了y l 细胞上的受体，使 y l 细胞不会遭到任何损害，顸处理带有此片段的细胞，呈现对天然毒素的抗感染性【i ”。此外， 此片段在y 1 细胞上出现寡聚现象，形成无细胞毒性的二聚体”。 f a c 虹e l l 和h e b e r t i 圳报道，使用精氨酸修饰的制剂处理* 溶血素，可破坏溶血素的溶血活性。 所使用的修饰制剂的浓度很高，但不清楚是否修饰过的毒素不能结合或抑制寡聚化过程。 m e n e s 弧m 等人【4 0 j 使用了包括化学修饰在内的多种方法进行了更多信息的研究。他们发现，用焦 碳酸二乙酯对两个或更多组氯酸残基进行修饰，会导致有缺陷的结合和低聚化。滴定显示，三个 组氨酸残基在毒素单体中对焦碳酸二乙酯反应是有效的，而仅有一个残基植入膜的七聚体，才是 有活性的。用去垢剂萃取的七聚体，存在两个有活性的组氨酸残基。g m y 和k e h o e i l ”报道，在基 因序列的第3 5 、1 4 4 和2 5 9 位上有三个组氨酸残基；而另一个残基在基因序列的第4 8 位上。 l - 2 60 【溶血素的孔形结构 关于* 溶血素的研究是从2 0 世纪6 0 年代中期高纯度毒素分离方法建立后开始的例。在1 9 6 7 年，a r b u t l l i l 0 札等i l q 通过超速离心法获得了高纯度的m 溶血素i g 9 】，确定了n 一溶血素的分子量范围 是从2 6 ，0 0 0 一3 6 ，0 0 0 之间m 。天然的* 溶血素是亲水分子，在水溶液中以单体的形式存在。沉降平 衡法测定a - 溶血素单体的分子量是3 3 ，0 0 3 4 ，0 0 0 ，沉降系数是3 3 s ，分子量估计是2 8 ，0 0 0 3 0 ，0 0 0 。 在1 9 6 7 年到1 9 7 3 年，a r b u t h n o t t 、b e n l h e i m e r 等人i lo t “1 开始研究m 溶血素的作用机制。由高剂量的 n 一溶血素处理过的细胞膜在电子显微镜下可观察到带有一直径约l o i l i l l 的环形结构。并偶然发现， 在不存在细胞的情况下，当纯的* 溶血素溶液加热到6 0 时有上述相似的结构，在缺乏脂质结构 的蛋白质中也存在类似的结构i l “。因此，可以得到以下结论：( 1 ) * 溶血素牢固地结合到靶膜 上；( 2 ) 结合不需要蛋白质受体的存在；( 3 ) 结合伴随有环结构的毒素七聚体形成；( 4 ) 膜损伤 是由a - 溶血素结合到靶膜上引起的。 c a s s i d y 等人9 1 证实，高纯度的溶血素可与脂膜相互作用，由此推知，脂质体可作为细胞膜 损伤和渗漏的指示分子，* 溶血素可使脂质单层解体1 1 2 】。在1 9 7 3 1 9 7 5 年间，1 1 1 e l e s 忱m 等人报 道了当一溶血素攻击有核细胞时可使细胞中低分子量标记物渗漏而保留r n a 。他们因此问接提 出功能性“孔”的概念，这些孔显然是n 一溶血素在脂膜上形成的。 一溶血素孔形成作用和补体相似，补体引起的细胞损伤带有有限的功能性膜损害，并在这些 膜上也观察到环形结构。在1 9 7 2 年。m a y e r 【1 4 】提出，补体蛋白c 5 到c 9 通过聚合成大分子c 5 b - 9 复 6 合物而形成环结构，插入到双分子层，产生水合跨膜孔。这个假设主要是水合血浆蛋白可能使本 身一部分转变成两性分子，推测这种转变大概是通过构象改变，导致脂质结合域暴露而产生的。 后来通过超微结构、生物化学和功能研究证实了m a y e r 提出的假设是正确的，c 5 b - 9 复合体是第 一个被证实的形成孔的大分子细胞溶解素。 补体作用的概念源于2 0 世纪7 0 年代早期的发现，微生物中小的两性分子，例如多烃抗生素和 多肽，短杆菌肽a 等能自发插入到细胞膜中，形成不连续的孔。补体的实验方法随后应用到n 溶 血素的研究中。经m 溶血素处理的红细胞膜溶解在温和去垢剂中时，保持了孔结构，并作为两性 物质分离鉴定，环形七聚物带有脂质和去垢剂结合域i l 。功能研究表明损伤的红细胞可渗漏有 效直径不超过1 2 1 1 l n 的分子；通过电子显微镜观察，它们的大小近似符合横跨七聚体内部的通道 的大小。1 9 8 1 年阐明了n 溶血素可形成跨膜孔的概念天然溶血素是分子量为3 3 ，0 0 0 的亲水分 子。结合到靶膜后，a - 溶血素分子寡聚形成非共价结合的稳定的七聚体蛋白复合物。这个过程同 脂质结合域暴露有关，大概是构象改变的结果，这样可以使七聚体自发的插入膜中。七聚体内部 中空产生一个亲水通道横跨脂质层，经由细胞溶解素产生的膜损伤的主要机制与孔的形成有关 “t ”“j 。m 溶血素成为第一个鉴定为有孔形成蛋白的细菌细胞溶解素，许多其他蛋白质毒素也发 现以一种类似的方式损伤膜。今天，孔形成蛋白细胞溶解素谱不仅包括补体和这些细菌毒素，而 且也包括细胞毒性t 淋巴细胞的效应物蛋白，真菌，和更高等的寄生虫等。 1 2 7 孔形成模型 m 溶血素以单体形式结合于膜上，随后七聚体在双分子层侧面扩散时发生碰撞。为支持此论 点，在o 时，给兔红细胞使用低剂量的q 溶血素，导致没有实质的七聚体形成和没有细胞溶解 的结合。洗过之后在3 7 孵育这些细胞，七聚体溶解。由于在细胞温育前已经洗掉了没有结合毒 素的细胞，所以一定是由于膜结合单体的寡聚化作用形成了七聚体。 b l o m q l l i s t 和t h e l e s t a i q 也用* 溶血素在o 时处理肾上腺皮质y l 瘤细胞，并指出在o 时结 台膜的溶血素分子与在3 7 时形成具有细胞溶解酶性质的七聚体之何具有不同的特性。因而， 低温结合后短时间内，用多克隆抗体孵育或胰岛素处理，可使结合细胞的毒索失活。细胞在3 7 孵育后则会丧失这些性质。 每个毒素分子都包含相互之间有亲和力的两个域( a 和b ) 。当两个分子在膜平面横向运动时 发生碰撞，作为定向分子结合到脂质双分子层中，使这些域在理想的位置互锁，形成的二聚体伴 有两性的b - 折叠域插入双分子层中。而在溶液中，毒素分子是不定向的，因此要使两个分子发生 定向碰撞就需要引发一定限度的解折叠。事实上，七聚体在水溶液中是自发形成的，虽然这个过 程是非常缓慢的。膜表面结合位点的主要功能是使毒素分子均一的定向，当发生碰撞时使它们主 要出现解折叠。当环结构七聚体形成时，低聚物形成过程结束，所有的反应位点( q 和b ) 被相互 占据。 完整的膜成分从原始定居场所替换后的命运是什么? 理论上，存在两种可能性。第一，脂质 和完整的膜蛋白可能从膜上排除。并作为微胶粒或小的聚集物进入水相中。另一种是，这些组分 可能被迫侧向分离。分别用低剂量和高剂量的q 一溶血素处理分离的红细胞膜，以研究浮在膜表面 上的脂质，但这种方法不能检测到任何脂质体被排除。因此，有理由相信虽然完整的组分是必需 的，但释放完整的膜组分到环境中，通常情况下是不会发生的。 7 1 2 8 孔的结构和成分 首先考虑孔是由七聚体单独组成的，还是由膜成分的一部分组成的。 当用毒素处理过的膜溶解于温和去垢剂中时，毒素经分子筛层析法洗提，在七聚体形成相对 应处出现对称峰。分离的七聚体能再并入脂质体卵磷脂中。在电子显微镜下观察，它们存在典型 的圆柱状外观，在s d s p a g e 中在与a 溶血素单体相对应的位置产生单一的蛋白带。这些资料显 示七聚体代表了伍溶血素孔的主要形式，膜组分不参与通道的形成。以下的结论支持上述观点： ( 1 ) 如果存在低分子量寡聚体，那么它们在温和去垢剂中保持完整，( 2 ) 温和去垢剂不能分离 任何膜结合蛋白质。以上结论和旺- 溶血素能单独损伤非蛋白脂质体的事实表明，七聚体的概念是 正确的。 分析m 溶血素物理状态的另一种方法是在常温下用s d s 溶解膜，而在低温下( 寒冷状态) 跑 胶。m 溶血素七聚体只溶解在热的s d s 中，而不溶于冷的s d s 中，经电泳的蛋白质可通过放射能 照相或蛋白质免疫印记法( w e s t e m ) 检测。所有的方法，包括此种方法仪能检测到单体和七聚 体。因此，如果有中间形式存在，那么它们在s d s 中也是不稳定的。另外也从未得到与膜蛋白相 关的证据，虽然这些相互作用也可能被去垢剂破坏掉。 没有证据表明在低浓度溶血素剂量时m 溶血素七聚体的数量增加；也就是，七聚体形成的 数目是固定的，他与结合位点的数目是成比例的口。这点不包括受体接触反应作用，由此推论， 受体很可能与己形成七聚体的* 溶血素有关。因为每个细胞上结合位点的数目是很少的，这就使 在低毒素浓度时产生孔提出技术上的质疑。 第二，关于在膜上七聚体的结构和定位问题。也就是产生七聚体是否就不可避免的导致孔产 生的问题。 在电子显微镜下，溶血素七聚体呈现壁厚大约4 n r n 高、1 0 m 宽的圆柱体，显然可隐藏一直 径为1 2 n m 的中心孔。此圆柱体与膜平面垂直。功能研究甚至显示旺- 溶血素处理的膜可隐藏有效 直径在1 - 2 n r n 的孔。毒素和脂质之间一定存在非常紧密的相互作用，因为它们仅能被去垢剂分离。 因此没有理由假定大的亲水分子能够克服如此障碍，故而返回到偶然孔穿过七聚体中心的概念。 如果每一个七聚体充分地插入到双分子层中，如果在开放构型中通道扩展穿过七聚体的全长，那 么将产生跨膜渗漏。关于插入的深度，电子显微镜显示溶血素七聚体大多数定位于脂质双分子 层的外侧。* 溶血素圆柱体出现于从膜表面突出到细胞外相( 水相) 3 4 n m 的位置【1 ”。由于七聚 体壁的厚度是3 - 3 5 n m ，分子量大约在1 5 0 ，0 0 0 2 0 0 ，0 0 0 之间的物质，适合于这样的膜外域。虽然 估计这个分子量是天然的，但是这也表明仅有小部分七聚体不参与形成膜内孔域。这个域的壁可 能是相当薄的，七聚体不能穿透整个双分子层的可能性也必需考虑，这可能也是事实，因为各种 各样的膜因子显然可能影响甚至抑制孔的形成。 o 1 0 6 s o n 等人p 1 “1 报道，通过使用电子显微镜图象处理，对* 溶血素孔进行低分辨率结构分 析。他们发现在血小板膜上存在单一低聚物的随机分布口”，在人造脂质双分子层上积聚成两维 晶体的低聚物口“。出乎意料的是，两维低聚物制剂显示出十分不同的结构，单一的粒子的内径 更小，只有7 n m ，晶体内径是l o m 。七聚体的结构进展来自对单个粒子的分析，晶体结构显示有 四或八个蛋白峰。在晶体低聚物中有个盖子封闭了中央通道。而在血小板上毒素七聚体形成中， 没有观察到中央孔的阻塞。低聚物在生物膜( 例如：血小板) 上形成的七聚体在其中心处有一充 水通道。 8 尽管发生膜损伤一定伴有七聚体形成，但并不是所有的七聚体必需一定要形成孔。首先， 高浓度的c a 2 + 能关闭细胞0 3 1 和血小板脂质膜上的毒素孔。b a s h f b r d 等人3 3 l 认为细胞外的c a 2 + 在生物学意义上具有保护有核细胞的作用，但有人不同意它们的观点，如血小板、内皮细胞和 单核细胞等易感细胞，在低浓度溶血素及生理c 扩水平时迅速发生渗漏，丽c 矿流入孔中 可能是许多有害的细胞反应的最重要的触发点。 其次是虽然七聚体形成普遍性伴有膜渗漏，但是* 溶血素结合到某些细胞上形成七聚体时 并没有引起膜渗漏。很显然，在这些情况下七聚体不产生孔。 总之，七聚体形成绝对伴有膜渗漏发生孔可能穿过七聚体结构的内部。 1 2 9 洳溶血素孔的功能性质：对脂质体的损伤和溶血能力 在易感细胞膜上，a 溶血素七聚体产生非选择性的孔，有效直径是1 2 t l i i l ，允许离子和低分 子量分子，例如核苷等通过，阻断分子量在1 ，0 0 0 q ，0 0 0 之间的分子。右旋糖苷( 葡聚糖) 4 ( 分 子量为4 ，0 0 0 ) 不能通过孔，可用于防止细胞渗透性膨胀。当使用一定浓度的右旋糖苷平衡溶血 索时，引起的胶体渗透压，可完全抑制溶血。n - 溶血素孔在脂质双分子层平面具有类似的特性， m e n e s 打i n s 和他的合作者们i l ”认为，n 溶血素孔在本质上是非选择性的、直径为1 1 5 m 的充满 水的通道。孔对电压钝感，膜电位改变不影响孔通道的开放。溶血素孔一旦在膜平面上形成， 不能通过胰岛素处理而破坏。然而，以上提及的，高c 一+ 离子浓度关闭孔的过程是可逆的i l ”。 咀脂质体为靶细胞的研究表明，胆固醇、不饱和脂肪酸和卵磷脂能增加* 溶血素攻击的效率。 由于卵磷脂温育可导致* 溶血素失活，所以包含氯化胆碱的磷脂可能包含* 溶血素结合位点。r a f r 等人川观察到皮质醇( 氢化可的松) 和甲泼尼龙( 甲基强的松龙) 可使小溶血素失活，也