（内科学专业论文）三氧化二砷对急性髓系白血病细胞凋亡及survivin表达的影响研究.pdf

iiyiitllllll89lllllllllllllltlll2lllqq螋 目录 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要3 二、英文缩略语6 三、论文 前言7 刚舌”“”。， 材料与方法8 实验结果1 3 讨论1 7 结论2 2 四、本研究创新性的自我评价2 3 五、参考文献? 2 4 六、附录 综j 苤2 8 在学期间科研成绩4 0 致谢4 1 个人简介4 2 ) 中文论著摘要 三氧化二砷对急性髓系白血病细胞凋亡及s u r v i v i n 表达的影响研究 目的 应用白血病细胞体外培养的方法，观察三氧化二砷( a s 2 0 3 ) 对急性髓系白血 病( 创l ) 原代细胞增殖、凋亡及对s u r v i v i n 基因表达的影响，探讨a s 2 0 3 抗肿 瘤可能的作用机制，为临床提供理论依据。 方法 1 、骨髓单个核细胞( m n c ) 分离及培养：无菌条件下采集a m l 骨髓液2 m l ( 肝 素抗凝) ，用f i e o l l 淋巴细胞分离液提取单个核细胞，培养于含1 0 胎牛血清( f b s ) 、 i o o i u m l 青霉素、1 0 0 i u m l 链霉素的r p m i1 6 4 0 培养液中，置于3 7 * ( 2 、5 c 0 2 饱和湿度的培养箱中培养。 2 、分为五个组，不加药对照组、1 i - t m o l l a s 2 0 3 组、2 1 a m o l l a s 2 0 3 组、 5 l a m o l l a s 2 0 3 组、1 0 1 x m o l l a s 2 0 3 组，作用时间分为6 、1 2 、2 4 、4 8 小时，应用 噻唑蓝( m t t ) 比色法检测不同浓度不同时间点作用后细胞的活力，观测细胞增 殖是否受到抑制。 3 、用流式细胞仪对5 i t m o l l a s 2 0 3 组、1 0 i t m o u l a s 2 0 3 组作用2 4 小时的细胞 进行凋亡检测，以明确a s 2 0 3 对a m l 原代细胞凋亡的影响。 4 、用实时荧光定量p c r ( r e a lt i m ep c r ) 方法检测a m l 抑凋亡基因s u r v i v i n 表达情况，以及1 0 t m o l l a s 2 0 3 作用2 4 小时后a m l 原代细胞s u r v i v i n 基因的表 达水平。 钴里 宝口7 尺 1 、m t t 结果显示：6 、1 2 、2 4 、4 8 小时时间点，与对照组比较，a s 2 0 3 均能抑 制a m l 原代细胞的增殖，呈浓度依赖关系，其中以1 0 i t m o l l a s 2 0 3 对细胞增殖抑 制作用最强( p o 0 5 ) ， 1 0 i _ t m o l l a s 2 0 3 组凋亡率为3 4 8 2 - 土1 7 7 3 ，与对照组相比差异显著( p o 0 5 ) 。 3 、r e a lt i m ep c r 检测结果显示：a m l 抑凋亡基因s u r v i v i n 阳性表达率为 5 2 9 4 ，阳性表达者进一步检测a s 2 0 3 对s u r v i v i n 表达的影响，1 0 p m o u l a s 2 0 3 作用2 4 小时能下调s u r v i v i n 基因的表达，处理前后差异显著( 尸 0 0 1 ) 。 结论 1 、a s 2 0 3 能抑制a m l 原代细胞增殖，在一定范围内呈浓度时间依赖关系。 2 、a m l 原代细胞表达抑凋亡基因s u r v i v i n 。 3 、a s 2 0 3 促进凋亡，可能与下调s u r v i v i n 基因表达有关。 关键词 三氧化二砷；急性髓系白血病；细胞凋亡；s u r v i v i n 2 英文论著摘要 e f f e c to fa r s e n i ct r i o x i d eo n a p o p t o s i sa n d s u r v i v i n e x p r e s s i o no f a c u t em y e l o i dl e u k e m i ac e l l s o b j e c t i v e t os t u d yt h ee f f e c to fa r s e n i ct r i o x i d e ( a s 2 0 3 ) o np r o l i f e r a t i o n , a p o p t o s i sa n d s u r v i v i ng e n ee x p r e s s i o no fp r i m a r ya c u t em y e l o i dl e u k e m i a ( a m l ) c e l l st h r o u g ht h e c u l t u r eo fl e u k e m i ac e l l si nv i t r o ，t oe x p l o r et h ep o s s i b l em e c h a n i s mo fa s 2 0 3o l l a n t i t u m o r , p r o v i d et h e o r e t i c a le v i d e n c e sf o ru s i l l ga s 2 0 3i nc l i n i c m e t h o d s 1 i s o l a t i o na n dc u l t u r eo fm o n o n u c l e a rc e l l s ( m n c ) i nb o n e m a r r o w h e p a r i n i z e dm a r r o wo f2 m lw a st a k e nu n d e rs t e r i l i t y , t h e ni tw a sp u ti n t of i c o l l - i s o p a q u es o l u t i o na n dw a sc e n t r i f u g e d ( 4 c ，18 0 0 r p m ，15 m i n ) t op u r i f ym n c ，w a s h e d t w ot i m e sb yp h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n ( p b s ) a n dc u l t u r e di nt h er p m i16 4 0m e d i u m c o n t a i n i n g 10 f e t a lb o v i n es e r u m ( f b s ) ，10 0 i u m l p e n i c i l l i n a n d1o o i u m l s t r e p t o m y c i n ，p l a c e di nc u l t u r eb o x 谢t l l5 c 0 2s a t u r a t i o ni n3 7 ct op r o l i f e r a t e 2 m e a s u r i n gp r o l i f e r a t i o no fa m l c e l l sb ym t t a s s a y t h e r ew e r ef i v eg r o u p sw e r eh e l du p ：c o n t r o l ，lp m o l la s 2 0 3 ，2 9 m o l la s 2 0 3 ， 5j i i t l o l l a s 2 0 3a n d10 1 m l o l l a s 2 0 3 t h et i m ew a sd i v i d e di n t of o u rp h a s e s ：6 h o u r s ， 12 h o u r s ，2 4 h o u r sa n d4 8 h o u r s t h ep r o l i f e r a t i n ga c t i v i t yo ft h ec e l l sw a sm e a s u r e dw i t h ac o l o r i m e t r i c3 一( 4 ，5 - d i m e t h y l t h i a h i a z o - 2 - y 1 ) 一3 ，5 - d i p h e n y t e t r a z o l i u mb r o m i d e ( m r r ) a s s a y 3 a p o p t o s i sa n a l y s i s a p o p t o s i so fa m l c e l l st h a ta r et r e a t e dw i t h5 9 m o l la s 2 0 3a n d10 i _ t m o l la s 2 0 3 3 a f t e r2 4h o u r sw a sa n a l y z e db yf l o wc y t o m e t r y ( f c m ) ，t oi n v e s t i g a t et h ee f f e c to f a s 2 0 3o na p o p t o s i so fp r i m a r ya m l c e l l s 4 d e t e c t i o no fe x p r e s s i o no fs u r v i v i ng e n e e x p r e s s i o no fs u r v i v i nm r n aw a sd e t e c t e db yq u a n t i t a t i v er e a lt i m e r e v e r s e t r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( r e a lt i m ep c r ) t oi n v e s t i g a t et h ee x p r e s s i o n o fs u r v i v i nm r n at r e a t e dw i t hlo p m o l la s 2 0 3a f t e r2 4h o u r sf u r t h e l r e s u i t 1 t h eo u t c o m eo fm t t a s s a ys h o w e dt h a ta s 2 0 3t r e a t e da f t e r6h o u r s ，12h o u r s ， 2 4h o u r s ，4 8 h o u r s ，c o m p a r e dw i t h t h ec o n t r o lg r o u p ，a s 2 0 3c o u l di n h i b i tt h e p r o l i f e r a t i o no fp r i m a r ya m l c e l l si nad o s e - d e p e n d e n tm a n n e ri nv i t r o t h ei n h i b i t e f f e c to fa s 2 0 3o na m lc e l l sr e a c ht h ep e a l 【i nlo p m o l la s 2 0 3 ，t h e r ew a ss i g n i f i c a n t d i f f e r e n c eb e t w e e nt h e m ( 尸 0 0 5 ) t h e a p o p t o s i so flo m n o l la s 2 0 3w a s3 4 8 2 + 17 7 3 ，t h e r e w a ss i g n i f i c a n td i f f e r e n c e b e t w e e nt h e m ( p 0 0 5 ) 3 q u a n t i t a t i v er e a lt i m er e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nd i s c l o s e d t h a te x p r e s s i o no fs u r v i v i n go fa m lp r i m a r yc e l l sw a s5 2 9 4 t od e t e c tt h ee f f e c to f a s 2 0 3o ns u r v i v i nf u r t h e r , i tw a sc o n c l u d e dt h a tlo p m o l la s 2 0 3 c o u l dd o w n - r e g u l a t e t h ee x p r e s s i o no fs u r v i v i n , t h e r ew a ss i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nc o n t r o lg r o u pa n d 10 p x n o l la s 2 0 3 衅0 0 1 ) c o n c l u s i o n 1 a s 2 0 3c o u l di n h i b i tt h ep r o l i f e r a t i o no fp r i m a r ya m l c e l l si nc o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n ta n dt i m ed e p e n d e n tm a n n e r s 2 p r i m a r ya m l c e l l se x p r e s ss u r v i v i ng e n e 4 3 a p o p t o s i so ft h ep r i m a r ya m l c e l l si n d u c e db ya s 2 0 3m a yb ec o r r e l a t e dw i t h d o w n - r e g u l a t i o no fe x p r e s s i o no fs u r v i v i n k e y w o r d s a r s e n i ct r i o x i d e ；a c u t em y e l o i dl e u k e m i a ；a p o p t o s i s ；s u r v i v i n 5 英文缩略语 6 论文 三氧化二砷对急性髓系白血病细胞凋亡及s u r v i v i n 表达的影响研究 刖吾 急性白血病是一类起源于造血干细胞病变的恶性克隆性疾病，是我国常见的 恶性肿瘤之一，居3 5 岁以下人群恶性肿瘤死亡率的首位。在成人中以急性髓细胞 白血病( a c u t em y e l o i dl e u k e m i a ，a m l ) 多见，近年来a m l 的诊断、治疗取得 了长足发展，主要以化学药物治疗及造血干细胞移植为主。随着细胞遗传学及分 子生物学进展，对白血病病因、发病机制有了极大更新。 自二十世纪七十年代以来，三氧化二砷( a r s e n i ct r i o x i d e ，a s 2 0 3 ) 用于治疗 初治及复发的急性早幼粒细胞白血病( a c u t ep r o m y e l o c y t i cl e u k e m i a ，a p l ) 患者， 在临床上取得了显著疗效，a s 2 0 3 治疗a p l 是白血病治疗机制研究中的一个重大突 破，其药理机制主要是诱导a p l 细胞凋亡【l 】。近年来，a s 2 0 3 的应用不仅仅限于a p l ， 也开始应用于其他a m l 、骨髓增生异常综合征( m d s ) 、多发性骨髓瘤( m m ) 、 恶性淋巴瘤( h l ) 等血液系统疾病及实体瘤的治疗1 2 卅。a s 2 0 3 主要通过抑制细胞 增殖，诱导细胞分化，促进细胞凋亡以及抑制骨髓微血管生成等起抗肿瘤作用【5 羽， 促进凋亡是其主要的机制。此外，a s 2 0 3 对细胞周期的影响可能是协同增强其他化 疗药物抗肿瘤作用的一个原斟丌。 s u r v i v i n 是细胞凋亡抑制蛋白( i n h i b i t o ro f a p o p t o s i sp r o t e i n ，t a p ) 家族成员之 一，是迄今发现的最强的抗凋亡因子，选择性表达于胚胎和发育的胎儿组织以及 大多数人类肿瘤细胞。a m b r o s i n i 等于1 9 9 7 年在人类基因组库的杂交筛选中分离出 来的【8 】，结构简单，只有一个杆状病毒i a p 重复子( b a c u l o v i r a ll a pr e p e a t ，b i r ) 结 构，没有锌指环结构。目前对s u r v i v i n 的研究主要集中在实体瘤和成人白血病【9 1 2 】。 正常骨髓中无s u r v i v i n 表达，提示s u r v i v i n 的过度表达可能是引起白血病的因素之 一【1 3 】，并有研究表明与肿瘤细胞耐药机制密切相关【1 4 1 。s u r v i v i n 主要通过直接抑制 7 凋亡终末效应因子c a s p a s e 3 和c a s p a s e - 7 活性，从而阻断各种刺激诱导的细胞凋亡过 程15 1 。本研究利用细胞培养技术，观察a s 2 0 3 在体外对a m l 原代细胞的作用，应 用m t t 法、a v - p i 双染流式细胞仪分析、实时荧光定量p c r ( r e a lt i m ep c r ) 等 检测手段，了解a s 2 0 3 对a m l 细胞增殖、凋亡及作用前后抑凋亡基因s u r v i v i n 表达 水平的影响，探讨a s 2 0 3 对a m l 细胞可能的促凋亡机制。 材料和方法 一、材料 ( 一) 细胞来源 从2 0 1 0 年3 月至u 2 0 1 0 年8 月，我科收治的2 8 例a m l 初诊患者骨髓单个核细胞 ( m n c ) ，其中男1 6 例，女1 2 例，年龄1 9 8 1 岁，其中a m l m 2 型6 例，a m l m 3 型5 例，a m l m 4 型5 例，a m l m 5 型1 1 例，a m l m 6 型l 例。 ( 二) 主要设备 设备名称生产商 恒温二氧化碳培养箱t e r m os c i e n t i f i c 公司 v s 8 4 0 k u 超净工作台苏州安泰空气技术有限公司 倒置相差显微镜日本o l y m p u s 公司 自动酶标仪上海科学仪器有限公司 c e n t r i f u g e5 8 1 0 r 高速冷冻离心机 日本h i t a c h i 公司 u v - 1 6 0 1 紫外分光光度计日本岛津公司 高速离心机 s i g m a 公司 f a c s c a b i b u r 流式分析仪 b d 公司 g e n e a m pp c rs y s t e m9 7 0 0 a p p l i e db i o s y s t e m s 公司 l i g h t c y e l er e a lt i m ep c r 扩增仪 r o c h e 公司 涡旋混合器苏州捷美电子有限公司 微量振荡器江苏省泰县医疗器械厂 电热恒温水浴锅北京市六一仪器制造厂 电热恒温干燥箱上海金忠科学仪器有限公司 8 超低温冰箱日本s a n y o 公司 ( 三) 药物及试剂 试剂名称生产厂家 a s 2 0 3哈尔滨伊达药业有限公司 r p m i16 4 0 培养基h y e l o n e 公司 胎牛血清天津灏洋生物制品科技有限公司 人淋巴细胞分离液天津灏洋生物制品科技有限公司 m t t 试剂 s i g m a 公司 d m s o s i g m a 公司 台盼蓝 s i g m a 公司 a n n e x i nv - f i t c 凋亡检测试剂盒北京众康志恒生物科技有限公司 s u r v i v i n 弓i 物上海生工公司 g a p d h 内参宝生物工程( 大连) 有限公司 t r i z o l宝生物工程( 大连) 有限公司 d e p c 处理水宝生物工程( 大连) 有限公司 反转录反应试剂盒宝生物工程( 大连) 有限公司 r e a lt i m ep c r 试剂盒宝生物工程( 大连) 有限公司 二、方法 ( 一) 试剂配制 l 、a s 2 0 3 溶液：用生理盐水配成1 m m o l l a s 2 0 3 储存液，4 。c 保存，使用前以 r p m i16 4 0 培养液稀释至所需浓度。 2 、m t t 溶液：取m t t 粉剂5 0 m g 溶于1 0 m l p b s ，涡旋振荡仪充分混匀，用0 2 2 1 a m 孔径的滤膜过滤除菌，配置成l m g m l i 作液，分装后- 2 0 。c 避光保存。 3 、台盼蓝溶液：取4 0 0 m g 台盼蓝粉剂，加少量双蒸水研磨，加双蒸水至1 0 r a l 充分溶解，滤纸过滤后置于4 。c 保存。使用时用0 0 5 m o l l p b s 稀释1 0 倍。 ( 二) 骨髓单个核细胞( m n c ) 提取及培养 无菌条件下抽取a m l 患者骨髓2 m l ，肝素抗凝，用p h 值为7 4 的p b s l ：1 稀释，取 9 1 5 m l 无菌离心管预先加入3 m lf i c o l l 淋巴细胞分离液，然后将稀释后的骨髓液沿离 心管壁缓慢加入使二者形成清晰界面， 1 8 0 0 r p m 离一l 二, 1 5 m i n ，吸取中间层m n c 置 于另一无菌离心管中。加入5 m l p b s ，重悬细胞，2 4 0 0 r p m 离一1 5 , 5 m i n ，弃上清。再用 p b s 洗涤1 次( 1 0 0 0r p m 离- t , 5 m i n ) ，加入含1 0 f b s 的r p m i1 6 4 0 培养液，重悬细 胞，移入培养瓶中，置于3 7 c 、5 c 0 2 饱和湿度的细胞培养箱内培养，每天在倒 置显微镜下观察细胞生长情况并计数，及时更换培养液，取台盼蓝拒染法测定活 性在9 5 以上的细胞进行实验。 ( 三) m t t 法检测细胞增殖抑制率 a m l 原代细胞以每孔8 x 1 0 3 个的浓度，体积1 0 0 1 d 接种至9 6 孔培养板，3 7 c 、 5 c 0 2 饱和湿度培养，各组分别加入l o o r t l 用r p m i1 6 4 0 培养液稀释的2 、4 、1 0 、 2 0 1 a m o l l a s 2 0 3 工作液，终浓度为1 、2 、5 、1 0 “r n o l l 实验组，每组设6 个复孔。 空白组为不含有细胞的r p m i1 6 4 0 培养液，对照组加入1 0 0 i d r p m i1 6 4 0 培养液， 每孔终体积均为2 0 0 r t l 。分为6 、1 2 、2 4 、4 8 h 组，向每孔中加入2 0 i t lm t t ( 5 m g m l ) ， 置于培养箱中孵育4h 后，平板离心机离一c , , ( 1 0 0 0 r p m ，1 0 m i n ) ，弃上清，每孔加 d m s o1 5 0 i _ t l ，避光振荡1 0m i n ，充分溶解孔内紫色结晶。于自动酶标仪5 7 0n l t i 波长处检测吸光度数值( o d 值) ，计算细胞增殖抑制率，以空白组o d 值调零。 细胞增殖抑制率= ( 对照组o d 值一实验组o d 值) 对照组o d 值x1 0 0 ( 四) a n n e x i n v - p i 流式细胞仪检测细胞凋亡 将待测细胞以l x l 0 6 个m l 接种至6 孔培养板，分别用不同浓度a s 2 0 3 ( 5 、 1 0 1 t m o l l ) 干预，同时设立对照组，置于细胞培养箱中培养2 4 h ，收集细胞，按照流 式凋亡检测试剂盒处理细胞。 l 、1 0 0 0 r p m ，4 c 离心1 0 r a i n 弃上清。 。 2 、加入l m l 冷的p b s ，轻轻震荡使细胞悬浮，1 0 0 0 r p m ，4 。c 离心1 0 m i n 弃 上清。 3 、重复步骤2 两次。 4 、将细胞重悬于2 0 0 i - t l 结合缓冲液中。 5 、加入1 0 9 l a n n e x i n v ，轻轻混匀，4 避光反应3 0 m i n 。 1 0 6 、加入3 0 0 t l 的结合缓冲液，再加入1 0 i t lp i ，5 分钟后上流式分析仪检测。 ( 五) r e a lt i m ep c r 检测s u r v i v i n 基因表达 1 、总r n a 的提取 ( 1 ) 将2 4 h 收获的1 0 1 m a o l la s 2 0 3 处理的实验组及对照组细胞，2 x 1 0 6 m l 细胞 悬液每组5 m l 从培养瓶移到1 5 m l 离心管中，1 0 0 0r p m 离心5 m i n ，弃培养液后加 入p b sl m l ，悬浮于e p p e n d o r f 管中，8 0 0 0 94 c 离心2 m i n , 弃上清； ( 2 ) 每个e p p e n d o r f 管加入l m lt r i z o l 用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉 淀，室温静置5 m i n ； ( 3 ) 向上述细胞裂解液中加入2 0 0 i _ t l 氯仿，盖紧离心管盖，用手剧烈震荡1 5 s ， 待溶液充分乳化，无分相现象后再室温静置5 m i n , 1 20 0 0 94 c 离心1 5 m i n ； ( 4 ) 从离心机中小心取出离心管，吸取无色上清液3 0 0 1 x l ，向上清液中加入等 体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在1 5 , - - - 3 0 c 下静置1 0 m i n , 1 20 0 0 94 。c 离心1 0 m i n ； ( 5 ) 小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入7 5 乙醇l m l ( 切勿触及沉淀) ，轻 轻上下颠倒洗涤沉淀，1 20 0 0 94 c 离心5 m i n 后弃去乙醇保留沉淀； ( 6 ) 室温干燥沉淀2 - - 5 m i n ，加入适量的r n a s ef r e e 水溶解沉淀( 必要时可用 移液枪轻轻吹打沉淀) ，待r n a 沉淀完全溶解后8 0 保存。 将提取出的总r n a 以紫外分光光度计检测其浓度和纯度，可用电泳鉴定其完 整性。 2 、c d n a 的合成 反转录反应体系： 5 x p r i m e s c r i p tb u f f e r ( f o rr e a lt i m e ) 2 9 l p r i m e s c r i p tr te n z y m em i 】【10 5 山 o l i g od tv r i m e r ( 5 0 i - t m )0 5 “l r a n d o m6m e r s ( 1 0 0 r t l v l ) 0 5 山 t 0 t a lr n a 5 0 0 n g 用r n a s 9f r e ed h 2 0 补足 ( 总体系) 1 0 i t l 反应液配制在冰上进行。 反转录反应条件：3 7 反应1 5 m i r a 8 5 反应5 s 。 引物的设计与合成： s u r v i v i n ( n m _ 0 0 1 16 8 ) _ 1 = 游引物：5 - c c ag a t g a c g a cc c ca t ag a g - 3 ； 下游引物：5 - t t gt t gg t t t c ct t tg c aa t tt t 一3 。； s u r v i v i n 扩增片段长度为1 5 2 b p ，由上海生工生物技术有限公司合成； g a p d h 上游引物：5 - t g gt g a a g ac g c c a gt g g a 3 ； 下游引物：5 - g c ac c gt c a a g gc t ga g a a c 一3 ； g a p d h 扩增片段长度为1 4 6 b p ，由宝生物工程( 大连) 有限公司合成。 3 、r e a lt i m ep c r 扩增反应 应用l i g h t c y c l e ( r o c h ed i a g n o s t i c s ) r e a lt i m ep c r 扩增仪进行反应。 s y b r 反应体系：s y b rp r e m i xe xt a q r m i i 5 p l 上游引物 0 5 m 下游引物 0 5 山 模板c d n a l l x l r n a s ef r e ed h 2 0 3 m 总体系1 0 山 调整好反应程序，将上述反应体系稍加离心( 2 0 0 0 r p m 离心l m i n ) 立即置r e a l t i m ep c r 上进行扩增。 p c r 反应条件：预变性 9 5 c1 0 s2 0 s p c r 扩增 9 5 5 s2 0 s 6 0 2 0 s2 0 s ( 4 5 个循环) 融解曲线分析9 5 o s 2 0 s 6 5 1 5 s2 0 s 9 5 0 s0 1 s 记录循环阈值( c t 值) 。 1 2 4 、p c r 产物的相对定量分析 以g a p d h 为内参照，r o c h el i g h t c y c l er u n5 3 2 软件分析，采用2 - q 相对定 量方法计算目的基因s u r v i v i n 的相对表达量。实验重复3 次，取平均c t 值进行分 析。 计算公式如下： a a c t = 实验组( 目的基因c t - 内参c o - 对照组( 目的基因c t 内参c o f o l di n d u c t i o n = 2 - a a c t 其中假定对照组目的基因表达量为1 ，f o l di n d u c t i o n 即为实验组目的基因的 相对表达量。 ( 六) 统计学处理 采用s p s s1 7 0 软件进行统计学分析，数据以牙士s d 表示，组间比较应用t 检验 及单因素方差分析( d u n n e t t s 检验) ，p 0 0 5 为差异具有统计学意义。 实验结果 一、m t t 法检测a m l 原代细胞增殖抑制率 对3 例非a p l 的a m l 患者骨髓单个核细胞培养，进行m t t 法检测细胞增殖抑 制率，采用单因素方差分析。与对照组相比，6 、1 2 、2 4 、4 8 h 时间点a s 2 0 3 对a m l 原代细胞增殖均有抑制作用，一定范围内呈浓度依赖性。5 l a n l o l l a s 2 0 3 处理后， 与对照组相比差异显著( 6 、1 2 h 组p o 0 5 ，2 4 、4 8 h 组p 0 0 1 ) ，1 0 p m o l l a s 2 0 3 抑 制作用最强，4 个时间点差异显著( p o 0 1 ) 。a s 2 0 3 对a m l 细胞的增殖抑制作用随 作用时间呈增强趋势，在一定范围内呈时间依赖性。( 见表1 、图1 ) 。 t a b1 ，t h ei n h i b i t o r ye f f e c to fa s 2 0 3o na m l c e l l s ( ，重士s d ，n = 3 ) p 0 0 5 ，”p o 0 5 ) ，1 0 p m o f l a s 2 0 3 组凋亡率为 3 4 8 2 = 1 = 1 7 7 3 ，与对照组相比差异显著( p 锄0 5 ) ，见( 图2 、图3 ) 。 1 1 罐：1 j 叠- 趟i雾 蕃鼍一； 1 1 芒潼 ： 旧 。 j 心 1 + !一j 寨： 量鞫遂! 乏 茹! ：t c o n t r o l 5 1 a n o l la s - g h1 0 p m o l la s 2 0 ， f i g u r e2 ，f l o wc y t o m e a i ca n a l y s i so f a v - p is t a i n e da m l c e l li n d u c e db ya s 2 0 3 1 4 气-拿飞ooi f i g u r e3 ，a p o p t o s i so f a m l c e l li n d u c e db ya s 2 0 3 ( 8s a m p l e s ) 三、a s 2 0 3 对a m l 细胞s u r v i v i n 基因表达的影响 对1 7 例a m l 进行s u r v i v i n 基因检测，其中9 例s u r v i v i n 表达阳性，阳性表达 率为5 2 9 4 ( 见图4 ) 。阳性表达者进一步检测a s 2 0 3 对s u r v i v i n 表达的影响。与 对照组相比，1 0 t u n o f la s 2 0 3 组处理a m l 细胞2 4 h 后，s u r v i v i n 表达量明显下降， 说明1 0 t t m o l l a s 2 0 3 作用2 4 h 能下调s u r v i v i n 基因表达，处理前后差异显著 ( p o 0 1 ) 。 f i g u r e4 ，e f f e c to f1 0 t t m o f la s 2 0 3o ns u r v i v i ni na m lc e l l s ( 9s a m p l e s ) t a b 2 ，e x p r e s s i o no fs u r v i v i nt r e a t e dw i t h10 t t m o f la s 2 0 3i na m lc e l l s ( 9 s a m p l e s ) 1 5 dd 7 0 0 ，2 且7 4 0 7 0 d 7 踟2 0 o 8 8 n- 正 n 2 d o d f i g u r e 5 ，e f f e c to flo p m o f la s 2 0 3o ns u r v i v i n 1 6 一rk一oed蓉：一k 卜p j i 芷i 8暑譬o：正 一rk一，c8g：一k 讨论 三氧化二砷是中药砒霜的主要成分，在中国和西方医学中的应用历史悠久。最 早应用于肿瘤记载是1 8 7 8 年，b o s t o n 市医院用含a s 2 0 3 的f l o w e r s 液治疗慢性粒 细胞白血病( c m l ) ，但由于发现砷是一种能与含巯基蛋白高度结合的原浆毒，具 有致癌、致畸、致突变的协同作用，限制了a s 2 0 3 的临床应用。2 0 世纪7 0 年代， 我国学者首先使用a s 2 0 3 治疗复发性和难治性a p l ，取得了5 2 , - 一9 2 的完全缓 解率( c r ) ，引起了国内外血液肿瘤界的兴趣，并对其治疗血液系统恶性肿瘤进 行了深入研究和探索，成为肿瘤治疗研究的热点之一。 研究发现，a s 2 0 3 可以抑制多种癌基因及上调抑癌基因的表达从而诱导肿瘤细 胞调亡、抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤血管生成、部分逆转肿瘤耐药性达到治疗 肿瘤的作用。a s 2 0 3 具有很广的抗肿瘤谱，不仅能诱导血液肿瘤细胞株的凋亡，而 且对许多实体瘤细胞系如肺癌、胃癌、卵巢癌、子宫内膜癌、结肠癌、乳腺癌、 肝癌等具有抑制肿瘤细胞增殖及诱导肿瘤细胞凋亡的作用。 a s 2 0 3 作用的生化基础在于与含巯基的化合物相互作用，影响巯基酶活性。谷 胱甘肽氧化还原酶和还原型谷胱甘肽( g s h ) 两者都含有巯基，g s h 是细胞在对 抗氧化损伤时的关键物质。a s 2 0 3 与g s h 的巯基结合，抑制g s h 抗氧化和解毒功能 或选择性抑制细胞内活性氧( r o s ) 的产生。研究表明，a s 2 0 3 通过改变线粒体中 的氧化还原状态，改变细胞内信号传导，从而导致细胞凋亡。 多药耐药( m u l t i d r u gr e s i s t a n c e ，m d r ) 指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药产生耐药性 后，对结构与作用机制不同的抗肿瘤药物产生交叉耐药的现象。主要有2 种基因表 达与人类肿瘤细胞上的多药耐药表现有关：一种是多药耐药基因( m u l t i d r u g r e s i s t a n c eg e n e1 , m d r l ) ，编码跨膜糖蛋白p - g p ( p - g l y e o p r o t e i n ) ；另一种是多药耐 药相关蛋f 刍( m u l t i d r u gr e l a t e dp r o t e i n ，m r p ) 基因，其耐药的发生与谷胱甘肽s 转移 酶( g l u t a t h i o n est r a n s f e r a s e ，o s t ) 的活性提高有关。关于a s 2 0 3 逆转耐药肿瘤细胞 的机制研究比较深入的是a s 2 0 3 可以降低g s t 的活性。冯觉平等【1 6 1 报道，a s 2 0 3 可以降低耐a d m 肺癌细胞株m r pm r n a 的表达，并且降低g s t 的活性，使得 耐药肺癌细胞株a 5 4 9 r 对细胞毒药物的解毒作用下降，部分逆转其耐药性。研究 表明a s 2 0 3 同样能诱导非a p l 的a m l 细胞株产生凋亡，还能下调耐药细胞p g p 1 7 的表达和抑制其功能【17 1 ，提示a s 2 0 3 和化疗药物合用能提高耐药细胞对抗癌药物 的敏感性，从而逆转耐药。应用a s 2 0 3 联合化疗治疗2 0 例难治、复发性白血病， 临床有效率达5 0 ；a s 2 0 3 的促凋亡作用可能与其作用时间和累计剂量有关，提 示临床上观察a s 2 0 3 作用的不同剂量和不同时间对临床疗效的影响，有助于选择 更加合适的剂量和作用时间来提高a s 2 0 3 联合化疗治疗难治性白血病的临床疗 效。a s 2 0 3 没有明显的骨髓抑制，减少了大剂量化疗后多并发症的发生，且经临床 使用不良反应小，故难治性白血病患者在难以承受大剂量化疗时或使用联合化疗 无效时，可试用砷剂联合化疗进行治疗。 肿瘤血管生成是肿瘤恶性生长、浸润和转移的形态学基础，与预后密切相关。 血管内皮生长因子( v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r , v e g f ) 是目前发现的最重要 的促血管生成因子之一，具有促进肿瘤血管内皮细胞增殖、迁移及诱导血管生成 等作用。目前在肝癌、卵巢癌、白血病等细胞株的相关研究中发现，a s 2 0 3 能够抑 制v e g f 表达，且呈明显的剂量依赖性【1 8 1 。 信号的转录和活化因子( s t a t ) 蛋白家族是一族d n a 结合蛋白，它们与酪氨酸 磷酸化信号通路耦联发挥转录调控作用。目前在哺乳动物中已鉴定出s t a t l 、 s t a t 2 、s t a t 3 、s t a t 4 、s l 盯5 a 、s t a t 5 b 、s t a t 6 等7 个亚型，参与细胞生长、 细胞凋亡、血管生成、免疫监视等。w e t z l e r 等【1 9 1 认为a s 2 0 3 通过显著抑制蛋白酪 氨酸激酶( p t k s ：f l t 3 ，z n f l9 8 f g f r l ，b c r a b l ) 活性，选择性地减少s t a t s 的磷 酸化，抑制s t a t s ( s t a t 3 ，s t a t 5 ) 活化，从而诱导人红白血病细胞株h e l 和肝癌 细胞株h e p g 2 凋亡，而s t a t s 总量没有明显变化。 本实验通过对a m l 骨髓单个核细胞分离并行体外培养的方法，对3 例非a p l 的a m l 细胞进行a s 2 0 3 干预，发现a s 2 0 3 能抑制a m l 原代细胞增殖，呈浓度依 赖性及时间依赖性，其中1 0 1 m a o l l a s 2 0 3 抑制作用最强；而且与流式细胞仪检测 a s 2 0 3 诱导a m l 原代细胞的凋亡结果一致，1 0 p m o l l a s 2 0 3 组凋亡率为 3 4 8 2 - + 1 7 7 3 ，与对照组( 1 5 4 2 士1 2 0 3 ) 相比差异显著( 尸 o 0 5 ) 。蔡艳霞【2 0 】 等研究也同样证实a s 2 0 3 对