（内科学专业论文）低剂量茶碱对丙烯醛诱导的大鼠气道重塑的干预作用.pdf

低剂量茶碱对丙烯醛诱导的大鼠气道重塑的干预作用摘要目的：通过雾化吸入丙烯醛建立s d 大鼠气道重塑模型，观察腹腔内分别注射不同剂量茶碱对大鼠气道重塑的影响，探讨低剂量茶碱在影响气道重塑中的作用机制。方法：s d 大鼠4 0 只随机分为4 组( n _ 1 0 ) ，空白对照( a ) 组：雾化吸入生理盐水；模型( b ) 组：雾化吸入4 p p m 丙烯醛，每次3 h ，每天两次；低剂量茶碱干预( c ) 组：吸入丙烯醛，处理同模型组，并给予茶碱4 m g k g 腹腔内注射，每天一次；治疗剂量( 1 0 - - 2 0 1 x g m l血浆) 茶碱干预( d ) 组：吸入丙烯醛，处理同模型组，并给予茶碱8 m g k g腹腔内注射，每天一次。于第2 8 天处死大鼠，采集肺泡灌洗液、肺组织标本和血标本。采用高效液相色谱法检测大鼠血浆茶碱浓度；e l a s a 法测定肺泡灌洗液( b j 6 衄) 中的e g f 的活性；免疫组织化学染色法观察肺内气道t g f 1 3 1 蛋白的含量，采集图象后分析t g f 1 3 1 蛋白的相对含量；免疫组织化学染色法检测肺内气道的n f r , b ，采集图象后分析细胞核阳染百分数；免疫组织化学染色法观察肺组织内m m p 2 的表达，采集图象后分析其蛋白酶的相对含量。结果：低剂量茶碱干预组及治疗剂量茶碱干预组大鼠血浆茶碱浓度分别为7 1 2 _ 4 ：0 3 3 m g l 和1 3 7 4 + 0 4 7 m g l ；o b l a f 中e g f 的含量：各组大鼠b a l f 中e g f 的含量分别为a 组( 1 2 7 4 - 0 1 6 ) n g m l ，b 组( 1 9 9 + 0 1 4 ) n g m l ，c 组( 1 7 5 = t - - 0 1 2 ) n g r n l ，d 组( 1 6 7 4 - 0 0 7 ) n g r r a 。与b 组相比，a 、c 、d 组e g f 含量降低，有明显差异( n = 1 0 ，p 0 0 5 ) ；与a 组相比，c 、d 两组e g f 含量升高，有明显差异( p o 0 5 ) 。肺内气道t g f 1 3 1 的表达：各组大鼠支气管肺组织t g f 1 3 1 的灰度值分别为a 组1 0 5 4 2 - - e 1 0 31 ，b 组为1 6 5 5 8 士1 3 9 1 ，c 组为1 2 9 6 4 士9 6 8 ，d 组为1 2 6 8 3 + 6 6 3 。与b 组相比，a 、c 、d 组t g f 1 3 1 的灰度值降低，有明显差异( n = 1 0 ，氏0 0 5 ) ；与a 组相比，c 、d 两组t g f p l 的灰度值升高，有明显差异( p o 0 5 ) 。肺内气道m m p 2 的表达：各组大鼠支气管肺组织m m p 2 的平均光密度值分别为a 组2 9 6 4 + 7 4 9 ，b 组1 1 1 0 8 + 9 7 3 ，c 组5 1 4 5 士8 7 6 ，d 组4 9 0 3 + 5 4 8 。与b 组相比，a 、c 、d组m m p 2 的光密度值降低，有明显差异( n = 1 0 ，p 0 0 5 ) ；与a 组相比，c 、d 两组m m p 2 的光密度值升高，有明显差异( p o 0 5 ) 。肺内气道n f r d 3 p 6 5 的表达：一各组大鼠肺内气道n f r , b p 6 5 的入核率分别为a 组( 5 8 5 ：t ：1 2 3 ) ，b 组为( 3 5 6 5 + 4 8 9 ) ，c 组为( 1 2 7 0 - a ：1 5 5 ) ，d 组为( 1 1 2 5 + 1 6 2 ) 。与b组相比，a 、c 、d 组n f 心p 6 5 入核率明显减少，有明显差异( n = 1 0 ，尺o 0 5 ) ；与a 组相比，c 、d 两组n f r , b p 6 5 入核率升高，有明显差异( p o 0 5 ) 。结论：丙烯醛雾化可以增加大鼠肺泡灌洗液中的e g f 的活性、肺内气道上皮细胞t g f p l 蛋白的含量及肺组织m m p 2 的含量，同时促进n f - r , b 入核。应用低剂量和治疗剂量茶碱干预均可明显降低大鼠肺b l a f 中e g f 的活性、气道上皮细胞t g f 1 31 蛋白的含量、肺组织m m p 2 的含量和n f r , b 的入核率，而低剂量和治疗剂量茶碱两组之间的干预作用无明显差异。本研究结果提示，低剂量与治疗剂量茶碱均可抑制丙烯醛所致的气道上皮的不规则修复、平滑，删肌的增生肥大、细胞外基质降解等一系列气道重塑的改变，其机制可能与其抑制n f - k b 的活化有关。关键词：丙烯醛气道重塑茶碱e f f e c to fl o wd o s et h e o p h y l l i n eo na i r w a yr e m o d e l i n ga b s t r a e t ：o b je c t i v e ：t oi n v e s t i g a t et h ee f f e c to fl o wd o s et h c o p h y l l i n eo na i r w a yr e m o l d i n gi nr a tm o d e li n d u c e db yi n h a l i n ga c r o l e i na n de x p l o r e si t sm e c h a n i s m m e t h o d s ：t h es p r a g u e - d a w l e y ( s d ) r a t sw e r er a n d o m l ya s s i g n e di n t o4g r o u p s ( n = 10 ，r e s p e c t i v e l y ) ：a c o n t r o lg r o u p ( i n h a l e do 9 n o r m a ls a l i n e( n s ) f o r3h o u r s ，t w i c ee v e r yd a y ) ；b m o d e lg r o u p ( s t i m u l a t e dw i t h4 p p ma c r o l e i nf o r3h o u r s ，t w i c ee v e r yd a y ) ；c 1 0 wd o s et h e o p h y l l i n ei n t e r v e n t i o ng r o u p ( i n h a l e da c r o h a n di n t , t p e f i t o n e a li n j e c t i o nw i t ht h e o h y l l i n eof(1nllaleda c r o l e mi n t e r a p e r i t o n e a li n i e c t i o nw i t ht h c o h y l l i n e4 m g k g d a y ) d t h e r a p yd o s et h e o p h y l l i n e ( 1o 2 0 g m l 、i np l a s m a )i n t e r v e n t i o ng r o u p ( i n h a l e da c r o l e i na n di n t e r a p e r i t o n e a ! i n j e c t i o nw i t ht h e o h y l l i n eo f8 m g k g d a y ) l u n gt i s s u e sw e r ea c q u i r e da f t e rt h er a t sw e r es a c r i f i c e do nt h e2 8 t hd a y t h e o p h y l l i n ec o n c e n t r a t i o ni nb l o o dw a se x a m i n e dw i t hh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ；t h el i v e n e s so fe p i d e r m a lg r o w t hf a c t o ri nl u n gl a v a g ef l u i dw a se x a m i n e dw i t he 1 a s a t g f - 1 31c o n t e n t sw e r ed e t e c t e db yi m r n u n o h i s t o c h e m i s y , t h er e l a t i v ea m o u n to ft g f plw a sa n a l y z e da f t e ri m a g eg r a b b i n g n u c l e a rf a c t o r - r , bw a st e s t e dw i t hi m n m n o h i s t o c h e m i s y t h ep e r c e n t a g eo ft r a n s f e c t e dc e l l sw a sa n a l y s i s e da f t e ri m a g ea c q u i s i t i o n ；t h ee x p r e s s i o no fm a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e2 ( m m p 2 ) i nl u n gt i s s u ew a so b s e r v e dw i t hi m m u n o h i s t o c h e m i s y t h er a t i oi np r e l e a s e sw a sa n a l y z e da f t e ri m a g eg r a b b i n g r e s u l t s ：t h ep l a s m at h e o p h y l l i n ec o n c e n t r a t i o n sw e r er e s p e c t i v e l y7 1 2 - 士0 3 3 m g li nl o wd o s et h e o p h y l l i n ei n t e r v e n t i o ng r o u p4 a n d13 7 4 4 - 0 4 7 m g li nt h e r a p yd o s et h e o p h y l l i n ei n t e r v e n t i o ng r o u p e g fc o n c e n t r a t i o ni nb a l f ：ag r o u p ( 1 2 7 + 0 1 6 ) n g m l ，bg r o u p ( 1 9 9 士0 1 4 )n g m l ，cg r o u p ( 1 7 5 + 0 1 2 ) n 鲋向，dg r o u p ( 1 6 7 + 0 0 7 ) n g m 1 c o m p a r e dw i t hb ，c o n c e n t r a t i o n so fe g fo fa 、c 、dg r o u pd e c r e a s e d ，i th a ss i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( n = lo , p o 0 5 ) ；c o m p a r e dw i t ha ，c o n c e n t r a t i o n so fe g fi nc 、dg r o u p sw e r ei n c r e a s e d ，i th a ss i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( p o 0 5 ) ，c 、dn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nt h et w og r o u p sp0 0 5 ) ( g ) e x p r e s s i o no ft g f 一1 31i nl u n ga i r w a y ：t h eg r a yv a l u eo ft g f p1i ne v e r yg r o u pi s ：ag r o u p1 0 5 4 2 _ - ! ：1 0 3 1 ，bg r o u p1 6 5 5 8 士1 3 9 1 ，cg r o u p1 2 9 6 4 4 - 9 6 8 ，dg r o u p1 2 6 8 3 + 6 6 3 c o m p a r e d 丽mb ，t h eg r a yv a l u eo ft g f p li na 、c 、dg r o u pd e c r e a s e d ，i th a ss i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( n = lo , p o 0 5 ) ；c o m p a r e dw i t ha ，t h eg r a yv a l u eo fc 、dg r o u p sw e r ei n c r e a s e d ，i th a ss i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( p 0 0 5 ) e x p r e s s i o no fm m p 2i nl u n ga i r w a y ：ag r o u p2 9 6 4 士7 4 9 ，bg r o u p1 11 0 8 + 9 7 3 ，cg r o u p51 4 5 + 8 7 6 ，dg r o u p4 9 0 3 + 5 4 8 c o m p a r e dw i t hb ，e x p r e s s i o no fm m p 2i na ，c ，dg r o u pd e c r e a s e d ，i th a ss i g n i f i c a n td i f f e r e n c e( n = lo , p o 0 5 ) ；。c o m p a r e d 谢t ha ，e x p r e s s i o no fm m p 2i nc 、dg r o u p si n c r e a s e d ，i th a ss i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( p 0 0 5 ) q e x p r e s s i o no fn f r , b p 6 5i nl u n ga i r w a y ：t h ee n t r yo fn u c l e a rn f r , b p 6 5r a t ei ne v e r yg r o u pi s ：ag r o u p( 5 8 5 + 1 2 3 ) ，bg r o u p ( 3 5 6 5 士4 8 9 ) ，cg r o u p ( 1 2 7 0 - x 1 5 5 ) ，dg r o u p( 11 2 5 士1 6 2 ) c o m p a r e dw i t hb ，t h ee n t r yo fn u c l e a rn f r , b p 6 5r a t ei na ，- 5 -c 、dg r o u pd e c r e a s e d ，i th a ss i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( n = 10 ， 0 0 5 ) ；e o m p a r e d奶t ha ，t h ee n t r yo fn u c l e a rn f r b p 6 5i nc 、dg r o u p si n c r e a s e d ，i th a ss i g n i f i c a n td i f f e r e n c ep 0 0 5 ) c o n c l u s i o n ：a c r o l e i np u l v e r i z a t i o nc o u l di n c r e a s et h el i v e n e s so fe p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r ( e g f ) i nl u n gl a v a g ef l u i do ft h er a t s ，a n di ta l s oi n c r e a s e dt g f 一1 31c o n t e n t so fe p i t h e l i a lc e l lo na i r w a ya n dt h ec o n t e n t so fm a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e2 ( m m p 2 ) i nl u n gt i s s u e m e a n w h i l e ，i ts t i m u l a t e dt r a n s f e ro fn f r , b a f t e ri n t e r v e n e db yl o wd o s ea n dt h e r a p yd o s et h e o p h y l l i n e ，a l la b o v e - m e n t i o n e dw e r eo b v i o u s l yr e d u c e d t h el o wd o s ea n dt h e r a p yd o s eo ft h e o p h y l l i n eb e t w e e nt h et w og r o u p sn o ts i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n tb e t w e e nt h ei n t e r v e n t i o n t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tl o wd o s et h e o p h y l l i n ea n dt h e r a p yd o s et h e o p h y l l i n ec a ns u p p r e s sa i r w a yr e m o l d i n gt h a ti n c l u d i n gi r r e g u l a ra i r w a ye p i t h e l i a lr e p a i r , s m o o t hm u s c l eh y p e r t r o p h y , e x t r a c e l l u l a rm a t r i xd e g r a d a t i o na n ds oo n ，c a u s e db ya c r o l e i n ，w h i c hw a sl i k e l yr e l a t e dt ot h es u p p r e s s i o no fa c t i v a t i o no fn f 心k e yw o r d s ：a c r o l e i na i r w a y r e m o l d i n gt h e o p h y l l i n e静古莉昌气道重塑( a i r w a yr e m o d e l i n g ) 是慢性阻塞性肺疾病( c o p d ) 、支气管哮喘等多种呼吸道慢性炎症性疾病的重要病理生理特征之一，气道重塑的病理学组织显示气道管壁增厚变形，其中又以平滑肌增厚最显著，从而导致气道管腔狭窄和气道阻力增加【1 1 ，其组织学改变主要包括基质沉积，胶原沉积，上皮下纤维化，平滑肌增生和肥大，肌成纤维细胞增殖及黏液腺，杯状细胞化生及增生，上皮下网状层增厚，微血管生成等。最近的研究发现c o p d 及哮喘早期气道重塑即已开始启动 2 】，气道重塑是慢性气道炎症发生、发展的最终结果。目前，气道重塑的机制还未完全明白，但大量研究表明，炎症细胞、细胞因子、炎性介质、生长因子和酶等多种因素参与气道重塑的形成。在慢性炎症状态下，炎症细胞( t 淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞) 、炎症介质【白介素8 ( i l - 8 ) 、肿瘤坏死因子a ( t n f 仅) 、干扰素吖( i f n - q )和血管内皮素1 ( e t 1 ) 】等的生成异常增多，反复刺激气道上皮，造成气道上皮的慢性炎症损伤和异常的不完全修复，最终导致各种生长因子分泌增加，腺体高分泌状态，气道平滑肌增生、肥大，细胞外基质( e c m )的降解、沉积等一系列的气道重塑改变。近年，有研究表明气道平滑肌细胞不仅是神经递质和炎症因子的靶组织而且也能分泌细胞因子，细胞因子可作用于气道上皮细胞，后者可分泌基质金属蛋白酶( 脚s ) 并活化各种生长因子。生长因子( 尤其是转化生长因子p 1 ) 和m m - p $ 在气道重塑中起着非常重要的作用，转化生长因子7 p l ( t g f 1 3 1 ) 主要由气道上皮细胞、气道平滑肌细胞分泌，可促进i 、型胶原和纤连蛋白在肺内的沉积【3 1 ，并可刺激气道平滑肌增生、肥大 4 1 ，加重气道的阻塞；i v i v p s 主要由巨噬细胞和中性粒细胞产生，1 v m p 8 是调节细胞外基质的主要限速酶，当其产生过多，可使细胞外基质的降解和沉积失衡，导致气道壁结构异常构建、肺实质破坏和间质增生等改变。一核因子诏叩1 国) 是一种应激反应转录因子，存在于大多数细胞类型中，有广泛的生物活性，在免疫和炎症反应中起着重要作用。n f - r , b 激活后可促进许多细胞因子、炎症介质的转录，如t n f 吨、i l - 8 等。丙烯醛( a c r o l e i n ) 是一种低分子量的不饱和醛，是香烟成分之一【5 】，对人和实验动物的气道具有高度选择性。丙烯醛能引起气道管腔内上皮细胞：一间分离和基底细胞分裂，暴露上皮下的神经末梢，刺激气道敏感性增高，损害气道内上皮保护性屏障，促进表皮生长因子( e g f ) 的分泌及气道上皮的不规则修复。茶碱应用于c o p d 等呼吸道疾病，已有7 0 余年的历史，但由于治疗剂量( 1 0 2 0 9 9 m l l 缸浆) 有较多副作用，治疗剂量和中毒剂量十分接近，有报道，2 0 i _ t g m l 的血药浓度即可出现中毒反应，血药浓度 3 5 9 9 m l l 缸浆时- - i z j i 起呼吸急促、惊厥甚至死亡 6 1 ，使茶碱的应用受到限制。随着对c o p d 发病机制及低剂量茶碱( 5 1 0 9 9 m l l 血浆) 作用机制的深入探讨，加之低剂量茶碱价廉、有效、安全，在c o p d 治疗中的地位有所提高。茶碱是弱的、非特异性的磷酸二酯酶( p d e ) 抑制剂，可通过降低环磷腺苷( c a m p ) 的水解速度，升高c a m p c g m p ! # , 值开放钙激活的钾通道，而达到舒张支气管平滑肌的目的。近年发现茶碱除了具有支气管舒张作用外还具有抗炎作用和免疫调节作用等。茶碱的抗炎作用可能通过抑制p d e 和神经肽的释放而实现，n i e l s o n 等忉认为茶碱的抗炎作用与中性白细胞的激活受到抑制和p d e 抑制- 所引起的介质释放有关。研究表明，低剂量茶碱能减少c o p d 病人诱导痰中炎性细胞总数和中性粒细胞比例，使i l - 8 水平和中性粒细胞趋化性降低，提示茶碱具有抗炎作用【8 1 。另有研究发现，c o p d 急性加重期患者诱导痰中巨噬细胞以及外周肺组织、气道上皮细胞n f r , b 的活性明显升高，而肺泡巨噬细胞、支气管及外周肺组织组蛋白去乙酰化酶( h d a c ) 的活性显著减少【9 】，导致n f r , b 的增高，介导炎症因子的表达【1 0 1 。低剂量茶碱能直接激活h d a c 活性，从而抑制炎症因子的表达【1 1 】，但其机制尚不清楚。虽然目前气道重塑的机制还不完全明确，但现有的研究发现在气道重塑过程中涉及了许多炎性细胞、炎症介质、细胞因子和生长因子的参与，因此有效的控制炎症有可能是一种阻止气道重塑发生、发展的有效的治疗方法。目前尚无低剂量茶碱与气道重塑的相关性研究，本研究采用丙烯醛雾化吸入制作大鼠气道重塑模型，并使用低剂量茶碱与治疗剂量茶碱分别进行干预，以观察不同剂量茶碱对气道重塑影响的差异性，进而就茶碱对大鼠气道重塑抑制作用的可能机制进行探讨。材料与方法1实验材料与仪器一_1 1实验动物。健康清洁雄性s d 大鼠4 0 只，鼠龄l o - 1 2 周，体重1 8 0 - 2 2 0 9 ，购于重庆第三军医大学实验动物中心，饲养于泸州医学院动物饲养中心。室内温度恒定。每笼放置l o 只大鼠，置于自然昼夜光照条件中，自由迸食、饮水。2 主要实验试剂丙烯醛( a c r o l e i n )成都市医药中心茶碱( t h e o p h y l l i n e )常州兰陵制药公司t g f p 1 小鼠抗大鼠单克隆抗体北京中杉生物工程有限公司a b c 免疫组化检测试剂盒北京中杉生物技术有限公司小鼠抗大鼠n f 心( p 6 5 ) 单克隆抗体美国s a n t ac r u z 公司d a bz l i 9 0 3 1北京中杉金桥生物有限公司姗小鼠抗大鼠单克隆抗体北京中杉生物工程有限公司e g f 酶联免疫试剂盒博士德公司3 主要实验仪器电子显微镜( l e i c a ，德国)隔水式电热恒温箱( h h w 2 14 2 0 ，北京市光明医疗仪器厂)电子分析天平( f a 2 0 0 4 ，上海上平仪器设备公司)切片机( l e i c ar m2 2 3 5 ，德国)70冰箱haier隔水式电热恒温培育箱上海跃进- 1 0 -免疫组化图像分析仪e 6 0 0 型电动雾化箱自制雾化器4 实验方法4 1建立模型日本n i k o n德国产自制按照b o r c h c r s r l 2 】丙烯醛致大鼠气道黏蛋白分泌模型的制作方法，建立丙烯醛雾化致大鼠气道重塑模型。s d 大鼠4 0 只随机分为4 组( n _ 1 0 ) ，空白对照组，雾化吸入生理盐水；模型组雾化吸入4 p p m 丙烯醛，每次3小时，每天两次；低剂量茶碱干预组，吸入丙烯醛，处理同模型组，并给予茶碱4 m g k g 腹腔内注射，每天一次。治疗剂量茶碱干预组，吸入丙烯醛，处理同模型组，并给予茶碱8 m g k g 腹腔内注射，每天一次；共2 8 天。4 2 标本收集、处理于第2 8 天雾化完毕后，以3 戊巴比妥1 2 0 m g k g 腹腔注射麻醉大鼠并固定，分离出气管，暴露胸腔，结扎右肺，用5 m l 注射器吸取生理盐水2 m l 进行左肺灌洗三次，回收率达9 0 以上，收集的支气管肺泡灌洗液( b a l f ) 置于7 0 c 保存待检。留取右肺中叶组织，用1 0 中性甲醛液固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋并作连续切片，片厚4 u m ，切片置于乳胶打底的清洁玻片上，置于6 0 烤箱内2 小时，在放入3 7 c 孵箱内1 2 小时固片。茶碱干预组大鼠每只各取静脉血2 m l ，置于用抗凝剂预处理的e p管中送血浆浓度检测，同时h e 染色。4 3 实验方法4 3 1苏木精一伊红( h e ) 染色4 3 1 1石蜡切片，常规脱蜡至水，中性甲醛液固定组织，石蜡包埋切片，切片常规脱腊至水，蒸馏水浸洗l m i n ；4 3 1 2 染色。( 1 ) 苏木精染液5 m i r a( 2 )自来水洗l m i m( 3 ) l 盐酸酒精l o s ；( 4 ) 自来水洗3 0 m i r a( 5 ) 1 稀氨水返蓝3 0 s ；( 6 ) 自来水洗l m i m( 7 ) 伊红染液3 m i n 。4 3 1 3 脱水( 1 ) 7 0 乙醇2 0 s ；( 2 ) 8 0 乙醇2 0 s ；( 3 ) 9 5 乙醇i2 m i r a( 4 ) 9 5 乙醇i i2 m i r a( 5 )1 0 0 乙醇i2 m i r a( 6 ) 1 0 0 乙醇i i2 m i n 。4 3 1 4 透明( 1 ) 二甲苯i2 m i r a( 2 ) 二甲苯i i2 m i r a( 3 ) 二甲苯i i i2 r a i n 。4 3 1 5 封片中性树胶封片，光学显微镜下观察。4 3 2 高效液相法测定c 、o 两组血浆茶碱的血药浓度，测定结果以均数标准差( 孑s ) 表示，使用统计分析软件s p s s l 6 0 进行数据分析。4 3 3e l a s a 测肺泡灌洗液的表皮生长因子1 2 4 3 3 1试剂组成( 1 ) 精密度微孔板9 6 孔2 8 干燥保存；( 2 ) 酶标偶合液1 瓶1 0 0 m l2 8 冷藏保存；( 3 ) 生物素标记液1 瓶1 0 m l2 8 冷藏保存；( 4 ) 标准品6 瓶各1 0 m l2 8 冷藏保存；( 5 ) 呈色剂a l 瓶6 0 m l2 8 避光冷藏保存；( 6 ) 呈色剂b 1 瓶6 0 m l2 8 避光冷藏保存；( 7 ) 终止液l 瓶6 0 m l1 8 2 5 常温冷藏保存；( 8 ) 浓缩洗涤液1 瓶5 0 0 m l2 8 冷藏保存。4 3 3 2 操作步骤( 1 ) 取出酶标板，依照次序对应分别加入5 0u l 的标准品于空白微孔中；( 2 ) 分别标记样品编号，加入5 0u 1 样品于空白微孔中；( 3 ) 在样品孔中加入1 0u l 的生物素标记液；( 4 ) 在标准品孔和样品孔中加入1 0 0u l 的酶标记溶液；( 5 ) 3 6 4 - 2 孵育反应6 0 m i n ；。( 6 ) 洗板机清洗5 次，每次静置1 0 2 0 s ；( 7 ) 每孔加入底物a 、b 液各5 0 u l ；( 8 ) 3 6 ：t ：2 。c 下避光孵育反应15 m i n ；( 9 ) 每孔加入5 0 u l 终止液，终止反应。4 3 3 3 结果判断( 1 ) 仪器值：于波长4 5 0 n m 的酶标仪上读取各孔的o d 值；( 2 ) 以o d 值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，绘制曲线图；1 3 ( 3 ) 根据样品的o d 值查找对应的浓度范围。4 3 3 4 敏感度：0 0 1 n g m l4 3 9免疫组织化学染色检测肺内t g f p1 的表达( 采用a b c 法进行肺组织免疫组织化学染色)4 3 4 。1 操作步骤( 1 ) 石蜡切片脱蜡至水( - - 甲苯脱蜡1 5 m i n x 2 ，1 0 0 i 、1 0 0 i i 、9 5 、8 0 、7 0 酒精依次脱水各1 5 m i n ，自来水冲洗1 5 m i n )( 2 ) 加3 h 2 0 2 - 甲醇，室温2 0 m i r a( 3 ) 微波加热2 0 r a i n 行抗原修复处理，冷却；( 4 ) 力i ：1 5 b s a 封闭液，室温2 0 m i n ，甩去多余液体，不洗；( 5 ) 加一抗小鼠抗大鼠单克隆抗体( 1 ：1 0 0 ) ，4 c 孵育过夜，0 0 1 mp b s 洗3 次；( 6 ) 加二抗生物素化山羊抗兔i g g ( 1 ：2 0 0 ) ，室温孵育2 h ，0 0 1 mp b s 洗3 次；( 7 ) 加a b c 复合物室温作用3 0 r a i n ，0 0 1 mp b s 洗3 次；( 8 ) d a b h 2 0 2 液显色，进行免疫组织化学显色，苏木精复染，中性树胶孰ro。阴性对照以磷酸盐缓冲液( p b s ) 代替一抗而其它条件均相同。4 3 4 3阳性结果判定：t g f 1 31 蛋白阳染细胞呈棕黄色或黄色，高倍镜下可见主要在胞浆显色，细胞膜也有阳性反应。4 3 4 4切片图像分析将待测切片放在连接计算机的显微镜下放j c 4 0 0 倍，每张切片在4 0 0 倍视野下随机采集5 个含气道的染色区域，视野中含支气管粘膜上皮至粘膜下层，测定每个视野o p t g f 一1 3 1g t 性染色的平均光密度值并记录，采用l e i c a q 5 0 0 分析系统测定各气道的灰度值。统计学处理：各实验数据均以2 + s 表示，采用s p s s1 6 0 统计软件进行统计分析，组间差异采用单因素方差分析。4 3 5免疫组织化学染色检测肺内n f 1 c b 的表达( 采用链亲和素一生物素s p 法进行肺组织n f r , b 免疫组织化学染色)4 3 5 1操作步骤：以下操作过程中，经比较染片的效果确定下述浓度为合适浓度，一抗稀释度1 ：2 0 0 ，二抗为即用型，设立正常组及实验组磷酸缓冲液( p b s ) 代替一抗作为空白对照。操作按说明书进行( 1 ) 石蜡包埋切片，切片常规脱腊至水。脱蜡：首先用二甲苯1 2 0 分钟，二甲苯1 1 2 0 分钟，再用梯度酒精( 1 0 0 5 r a i n 、9 5 5 r a i n 、8 0 5 r a i n 、7 0 5 r a i n ) 浸泡，蒸馏水冲洗，最后用p b s 液( 0 0 1 m 、p h7 4 ) 冲洗5 m i n x 2 次；( 2 ) 3 h 2 0 2 避光室温孵育3 0 m i n ，清除内源性过氧化物酶，再用蒸馏水冲洗，p b s 液冲洗5 m i n x 2 次；( 3 ) 切片置入盛有枸橼酸盐缓冲液( o 0 1 m 、p h6 o ) 的容器中，在微波炉中行抗原热修复1 5 m i r a 取出容器，置室温冷却3 0 r a i n ，p b s 液冲洗5 m i n x 3 次；( 4 ) 加兔血清封闭，置湿盒内于3 7 。c 温箱孵育2 0 r a i n ，倾去血清勿洗；( 5 ) 用滤纸吸干，小鼠抗大鼠n f r b ( p 6 5 ) ，置湿盒内3 7 c 温箱孵育3 0 r a i n ，然后置4 冰箱过夜；( 6 ) p b s 液冲洗5 m i n x 3 次；分别滴加二抗，生物素标记的兔抗山羊i g g ，湿盒内3 7 温箱孵育3 0 m i n ，p b s 液冲洗5 m i n x 3 次；( 7 ) 加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素液，湿盒内3 7 温箱孵育3 0 m i n ，p b s 液冲洗5 m i n x 3 次；( 8 ) d a b 显色：用新配制的d a b ( 配制：双蒸水l m l 加a 、b 、c 液各l 滴混匀) 滴加在切片上，室温显色，自来水终止；( 9 ) 苏木素轻度复染3 m i n ，自来水( 细水流) 冲洗l m i m( 1 0 ) 1 盐酸酒精( 7 5 酒精1 0 0 m l 加盐酸l m l ) 冲洗2 0 s 分色，自来水( 细水流) 冲洗l m i n ；( 1 1 ) 用1 稀氨水返蓝3 0 s ，自来水( 细水流) 冲洗l r n i n ，无水乙醇2 m i n x 2次，二甲苯3 m i n x 3 次，清水漂洗玻片2 0 s ，显微镜下观察着色是否满意；( 1 2 ) 置于3 7 烘箱中烘干，封片；( 1 3 ) 载玻片置于抽屉中，避光，一周内采图。4 3 5 2 阳性结果判定：n f r , b 棕黄色或黄色为阳性表达，免疫组化阳性表达为胞核内有棕黄色颗粒。4 3 5 3 图像采集及分析：应用采图软件s p o ta d v a n c e d ( 美国) 进行图像采集i 采用i m a g e p r op l u s5 0 1 软件进行图像分析。每张n f 心免疫组化切片随机计数2 0 0 个阳染上皮细胞中胞核阳性的细胞数，计算胞核阳性数占阳染上皮细胞总数的百分比，作为气道上皮细胞n f r d 3 的入核率。以上数据均以均数标准差( 孑士s ) 表示，使用统计分析软件s p s s l 6 0 进行数据分析，组间差异的比较采用o n e - w a ya n o v a 方差分析。4 3 6 免疫组织化学染色检测肺内m m p 2 的表达4 3 6 1操作步骤( 1 ) 石蜡切片脱蜡至水( - - 甲苯脱蜡1 5 m i n x 2 ，1 0 0 i 、1 0 0 i i 、9 5 、8 0 、7 0 酒精依次脱水各15 m i n ，自来水冲洗15 m i n ) ；( 2 ) j 1 1 3 h 2 0 2 甲醇，室温2 0 m i n ；( 3 ) 微波加热2 0 m i n 行抗原修复处理，冷却；( 4 ) j j n 5 b s a 封闭液，室温2 0 m i n ，甩去多余液体，不洗；( 5 ) 加一抗小鼠抗大鼠单克隆抗体( 1 ：1 0 0 ) ，4 c 孵育过夜，0 0 1 mp b s 洗3 次；( 6 ) 加二抗生物素化山羊抗兔i g g ( 1 ：2 0 0 ) ，室温孵育2 h ，0 0 1 mp b s 洗3 次；( 7 ) 加a b c 复合物室温作用3 0 m i n ，0 0 1 mp b s 洗3 次；( 8 ) d a b h 2 0 2 液显色，苏木精复染，中性树胶封片，阴性对照以磷酸盐缓冲液( p b s ) 代替一抗而其它条件均相同。4 3 6 2 阳性结果判定：m m p 2 蛋白阳染细胞呈棕黄色或黄色，高倍镜下可见主要在胞浆显色，细胞膜也有阳性反应。4 3 6 3 切片图像分析将待测切片放在连接计算机的显微镜下放大4 0 0 倍，每张切片在4 0 0 倍视野下随机采集5 个含气道的染色区域，视野中含支气管粘膜上皮、粘膜下层及基质，测定每个视野中m m p 2 阳性染色的平均光密度值并记录，采用l e i c a q 5 0 0 分析系统测定各气道的灰度值。统计学处理：各实验数据均以油表示，采用s p s s1 6 0 统计软件进行统计分析，组间差异采用单因素方差分析。，结果1高效液相色谱法测定茶碱血浆浓度低剂量茶碱组的血药浓度：7 1 2 4 - 0 3 3 m g l治疗剂量茶碱组的血药浓度：1 3 7 4 + 0 4 7 m g l2h e 染色见模型组气道黏膜上皮层增厚，杯状细胞增生，黏膜下腺体增生肥大，支气管管周大量炎症细胞浸润，少量红细胞渗出，气道壁增厚，上皮下纤维化，胶原沉积，平滑肌增生和肥大，肌成纤维细胞增殖及黏液腺，杯状细胞化生及增生。气道发生不完全阻塞，肺泡扩张，肺泡问隔破坏，肺泡纤维化及上皮细胞增生，肺结构发生显著改变。空白对照( a ) 组模型( b ) 组低剂量茶碱干预( c ) 组治疗剂量茶碱干预( d ) 组图1 各组大鼠支气管肺组织h e 染色结果( 4 0 0 )由h e 染色结果可以看出应用丙烯醛雾化吸入刺激大鼠气道制作气道重塑模型是成功的。3e l a s a 法测定肺泡灌洗液e g f 的含量结果显示，各组大鼠b a l f 中e g f 含量的比较。与a 、c 、d 组相比，b 组e g f 含量增高，有明显差异( n = l o ，p o 0 5 ) ；与a 组相比，c 、d 两组e g f 含量升高，有明显差异( p o 0 5 ) 。茶碱干预可明显抑制丙烯醛诱导的表皮生长因子的分泌。( 表l 、图2 )表1 各组大鼠b a l f 中e g f 浓度( 孑s )t a b e l1t h ee g fc o n c e n t r a t i o no fb a l fi nr a t s ( i s )与b 组相比，乍 o 0 5与a 组相比，p 0 0 5卑p 式。0 5v s j g r o u pb p 娟0 5v s g r o u pa辜事曩r jli jjjjel 。l 协叠图2各组大鼠b a l f 中e g f 浓度f i g2t h ee g fc o n c e n t r a t i o no fb a l fi nr a t s奎p 0 0 5v sb ( n 2 1 0 ，f = 6 11 )4免疫组织化学染色检测肺内气道t g f - 1 31 的表达结果显示，在正常大鼠的小气道上皮细胞中的t g f p 1 表达很少，丙烯醛雾化吸入可使b 组气道中的t g f 1 3 1 表达明显增加，与其余三组比较差异有统计学意义( p o 0 5 ) ，c 、d 两组分别与a 组比较均有统计学意义( p o 0 5 ) 。给予低剂量、治疗剂量茶碱干预均可明显抑制丙烯醛诱导的气道上皮t g f d l 增加。( 图3 、表2 、图4 )空白对照组模型组低剂量茶碱干预组治疗剂量茶碱干预组图3各组大鼠支气管肺组织t g f d 1 免疫组织化学染色结果( 4 0 0 )表2 各组大鼠t g f 一1 3 1 灰度值( y + s )t a b e l2t h eg r a yv a l u eo f t g f p 1i nr a t s ( 孑s )与b 组相比，尸 o 0 5 - l j a f t f n 仁l ，尸 o 0 5母p 0 0 5v s g r o u pb p 0 0 5v s g r o u pa空白对照组模型组低剂量干预组治疗剂量干预组图4各组大鼠t g f b 1 灰度值f i g4t h eg r a yv a l u eo ft g f - 1 31i nr a t sp 0 0 5v sb ( n = 1 0 ，f = 8 2 6 2 )2 2 oooooo0000o加埔埔h 他加86425免疫组织化学染色检测肺内及气道m a p 2 的表达结果显示，在正常大鼠的气道上皮下层、基底层及肺间质m m p 2 的表达很少，丙烯醛雾化吸入可使b 组肺组织内的m m p 2 的表达明显增加，与其余三组比较差异有统计学意义( p o 0 5 ) ，c 、d 两组分别与a 组比较均有统计学意义( p o 0 5 ) 。给予低剂量茶碱干预可明显抑制丙烯醛诱导的肺组织m m p 2 表达。( 图5 、表3 、图6 )空白对照组模型组低剂量茶碱干预组治疗剂量茶碱干预组图5 各组大鼠支气管肺组织m m p 2 免疫组织化学染色结果( 4 0 0 )表3 各组大鼠m m p 2 的表达( i s )t a b e l3t h eo p t i c a ld e n s i t yo f m m p 2i nr a t s ( i s )与b 组相比， 0 0 5与a 组相比，p 0 0 5毒p 0 0 5v s g r o u pbp 0 0 5v s g r o u pa模型组低剂量干预组治疗剂量干预组图6各组大鼠m m p 2 光密度值f i g6t h eo p t i c a ld e n s i t yo fm m p 2i nr a t s木p 0 0 5v sb ( n = 1 0 f = 4 3 9 8 5 )6免疫组织化学染色检测肺内气道n f - 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