（基础兽医学专业论文）原癌基因cmyc+rna干扰对细胞周期的影响.pdf

中文摘要 c - m y c 是永生性癌基因，在细胞的生长、繁殖、凋亡及分化中具有极重要的地位。c m y c 的过 废表达是人类癌症细胞最常见的变化之一，是细胞恶性转化的关键基因。奉研究用阳离子脂质体 转染法首次将针对c m y cm r n a 的s i r n a 表达质粒p s i l e n c e r - - c m y c 转染人肺癌细胞a 5 4 9 ，7 2 h 斤收 获细胞，r t p c r 检测结果表明，干扰细胞c m y cm r n a 水平降低至4 0 左右，w e s t e r n b i o t t i n g 分 析表明其蛋白水平约降低了7 0 。说明r n a 干扰成功。 应用流式细胞术研究c - m y c 表达水平降低对a 5 4 9 细胞周期的影响。结果表明，与对照细胞 相比，r n a 干扰7 2 h 后g 0 g 1 期细胞比例由5 1 5 + 1 7 下降到3 5 1 士1 1 ，下降1 6 个百分点s 期细胞由4 1 3 士1 4 上升至5 5 1 + 1 6 ，提商1 4 个百分点，g 2 m 期则无明显差异( 驴0 0 5 ) ，显 示针对c - m y c 的r n a 干扰引起s 期阻滞。 为了探明c m y c r n a i 引起s 期阻滞的作用途径与机制，分折了细胞周期相关基因的m r n a 水平，包括c y c l i n 、c d k 和c k i 。试验结果显示，干扰7 2 h 后，干扰细胞与对照细胞比较：1 ) 细 胞周期素c y c l i nd 3 、e 、a 的m r n a 水平均出现不同程度的下降( p o 0 5 ) ，分别下降了2 2 8 、3 0 1 - 2 和4 5 7 ，c y c l i nd i 则无明显变化( p o 0 5 ) ；2 ) c d k 2 、c d k 4m r n a 水平下调 ( p 0 0 5 ) t h e s ed a t ad e c l a r e dt h a tc m y er n a ii n d u c e da s - a r r e s to f c e l lc y c l e t oi n v e s t i g a t eh o wt h es - a r r e s th a p p e n e d ，a n a l y s e so ft h em r n al e v e l so fc e l lc y c l e - r e l a t i v eg e n e w e r ep e r f o r m e d ，i n c l u d i n gc y c l i n ，c d ka n dc k i o u re x p e r i m e n t sr e v e a l e dt h a ta f t e rr n ai n t e r f e r e n c e ： 1 ) t h em r n al e v e l so f c y l c i nd 3 ，e ，aw e r em a r k e d l yd o w n r e g u l a t e di nd i f f e r e n te x t e n t s ( p 0 0 5 ) 2 ) c d k 2a n dc d k 4m r n a l e v e l sw e r ed e c r e a s e d ( p ( o 0 5 ) ，b y4 4 士4 ，3 9 土4 r e s p e c t i v e l y 3 ) i no p p o s i t i o nt ot h ef o r m e r s ，p 2 1a n dp 2 7m r n a w e r ee l e v a t e d ( p 0 0 5 ) ，b y3 6 6 a n d4 4 士8 ( p o 0 5 ) t ob ec o n s c i o u so f w h e t h e r t h ec h a n g e so f m r n ai n d u c e da l t e r a t i o n so f p r o t e i ne x p r e s s i o n p r o t e i n l e v e l so fc y c l i na n dc d kw e r ed e t e c t e d o u rd a t as h o w e dt h a t7 2 ha f t e rt r a n s f e c t i o n ，t h ep r o t e i nl e v e l s o f c y c l i n d 3 ，e , aa n d c d k 2 , 4 w e r ed e c r e a s e d ( p 2 7 的降解，该途径与泛素化无关，必须有a t p 参 与。2 6 s 蛋白酶迅速降解p 2 7 的n 端，使其由完整的2 7 k d a 蛋白分子变为2 2 k d a 的分子片段。 降解后p 2 7 片段由于失去了n 端与c y c l i n c d k 复合物结合区，故而丧失了抑制c d k 2 的能力。 3 ) b c r a b l 可通过磷酯酰肌醇3 激酶p 1 3 k a k t 途径调节p 2 7 1 ”1 。 1 5 细胞周期与癌变 细胞增殖失控是肿瘤发生、发展的重要原因，癌症是一类细胞周期紊乱的疾病。最新研究表 明，c y c l i n 和c d k 复合物在细胞周期中有重要的正调控作用。c k i 是c y c l i n - c d k 复台物的抑制 因子，它对细胞周期具有负调控作用。由上述三种蛋白组成的细胞周期调控系统功能异常就可能 导致细胞增殖火控。细胞周期是细胞生命活动的基本过程，细胞在周期时相的变迁中进入增殖、 分化、衰老和，e 亡等生理状态。若细胞周期调控异常，细胞可能出现恶变2 0 l 。 4 中国农业大学硕 学位论文第一章绪论 2 原癌基因c - m y o 原癌基因家族m y e 是一类“快速早期反应”的细胞内信使，c m y c 姓m y c 基因家族中的一员， 目前已知其家族成员中有三个密切相芙的基因，称之为c m y c ，n m y c 和l m y c ，它们分别位于 第8 、2 和1 号染色体上，属核内蛋白类。 c m y c 癌基因最初是从鸡病毒v m y c 癌基因的同源物中分离出来的f ”。人c m y c 原癌基因正 常位于入染色体8 q 2 4 ，编码相关的c m y e 蛋白。c m y c 蛋白是最甲i 被发现与肿瘤细胞增殖活性相 关的原癌基因产物之一，定位于胞核中，它在胞浆内合成，与蛋白配基( 主要是m a x 蛋白) 形成杂 台体而转移刘胞核内，与特异性d n a 序列相结合，进两激活或抑制许多靶基因的转录，导致细 胞生长、凋亡和分化的改变“。 正常细胞中的c m y c 原癌基因一旦被异常激活为癌基因，c m y e m r n a 和c m y c 蛋白表达异 常增高，活化转录，使细胞脱离正常生长调节的限制而具有高度增生潜能，开始向恶性表型转化。 同时c - m y c 的高水平表达还抑制细胞的分化，其诱导细胞凋亡的作用也遭到破坏而参与到肿瘤形 成机制中去。 幺1o - n y c 的结构 c m y c 的结构( 图1 2 ) 可分为c 端( c - t e r m i n a l ) 、中间部分和n 端( n - t e r m i n a l ) 。c - m y c 的m r n a 能编码许多多肽。规范的a u g 转录起点产 宅6 4 k d a 的蛋白，而上游的c u g 编码6 7 k d a 蛋白，内部 的翻译起点则产生4 5 k d a 蛋白，1 3 m y c s ，这三种蛋白都能与m a x 形成杂台体。n 端1 4 3 个氨基酸是 转录激活功能域，c 端1 4 0 个氨基酸是d n a 结合和形成杂台体的结构域，这两个结构功能域是 c - m y c 的功能所必需的。 塑 t r a n s a f t i v a t i o d o m a i n c i#lm1 2 ，l 。- n 抽l 3 s 撕* 5 bj i i l | i j l i d 。m s 一 3 铲q 5 k - _ _ _ 一? i f a x 3 靴坤 k _ _ _ _ _ _ - _ _ _ 一s m a d 舢j 2 _ _ _ i _ _ - - - _ _ _ _ _ _ _ _ _ 州s p lh i l ! 一m l z - i w艄$ _ - - - - - - - 一y y 1 3 ，4 p 一t n l i 田j 2c - m y c 蛋白结构 5 中国农业大学碗士学位论文 第一章绪论 n 端包含两个m y e 家族特有的高保守序列，目 3 m y c 盒( m y cb o x ，m b ) 包括m bi ( 4 5 6 3 a a ) 和m b l i ( 1 2 8 - 1 4 3 a a ) 。m b i l 的剔除并不影响c m y c 的转录激活功能，但可消除c - m y c 的转录抑 制作用口。m bi i 突变不仅导致转录抑制作用的消失，还失去提高鸟氨酸脱羧酶o d c ( o m i t h i n e d e c a r b o x y t a s e ) 表达的功能，说明m b i i 参与一系列基困的转录激活。但m bl l 的突变只导致一部 分激活功能的丢失而非全部，说明c - m y c 的不同结构域可能通过不同的机制转录调节不同的目的 基因。m b i 在乙酰化激活的基因表达中是必需的，而不依赖m b i i 的转录激活主要依赖于转录复 合体对已经乙酰化的基因的促进作用。 c 端包含碱性螺旋环- 螺旋亮氨酸拉链结构( b a s i ch e l i x l o o p h e l i x l e u c i n ez i p p e r ， b h l h - l z ) ，此结构是c - m y c 与其他蛋白相互作用的主要结构域，也是与d n a 特异结合的结构 域。 c - m y e 蛋白只有形成二聚体后，才能与d n a 结合，进而行使其转录调节功能。研究发现与 c - m y c 特异结合的m a x 蛋白也是个b h l h l z 蛋白，c m y c 蛋白在体内和体外均可与m a x 蛋白形成 稳定的二聚体，形成的二聚体与d n a 有根强的亲和性，可以特异地识另q d n a 序列中的c a c g t g 核心序列( f l p e 盒) 并通过碱性医与之结合，使被调节的基因转录增强。碱性区紧接于h l h 的氨 基端，由碱性氨基酸残基组成，这些成行排列的氨基酸残基对c m y c 与d n a 的直接接触和高效结 合有重要意义，其突变将影响c m y c 蛋白的d n a 结台能力口“。 c - m y c 的中间部分包含一个1 f 特异性d n a 结合区和一个核定位信号( n u c l e a rl o c a l i z a t i o n s i g n a l ，n l s ) 。前者的功能是协助碱性区寻找d n a 特异结合何点。后者是c - m y c 蛋白迸入核内 所必需的结构，负责将d m y c 蛋白转入并定位于核内。 2 2c - m y c 与细胞增殖 c m y c 在细胞生物学中具有多方酝的功能+ 其中最重要的是其促进细胞增殖作用。在静止细 胞中，检测不到c - m y c 的袭达，而经过有丝分裂原或血清刺激后，c m y c 的m r n a 和蛋白水平迅 速上调，细胞进入g 1 期。在人类的许多肿瘤细胞中都能检测剑c m y c 的过度表达，说明它与 肿瘤细胞的快速增殖有关。 c m y c 促进细胞周期进程主要是通过调节系列基因的表达。一方面c m y c 激活细胞周期促 进基因如c d c 2 5 a 、c d k 4 、c y c l i nd 2 、e 、a 等的转录，加强其表达；另一方面，c - m y e 抑制细 胞周期生长限制基因，如g a s l 、p 1 5 、p 2 1 、p 2 7 和g a d d s 等的表达，消除这些基因对细胞周期的 负控作用。c - m y c 对p 2 7 的调节还表现在翻译后水平，它通过促进c u l l 和c k s 基因表达，加 速p 2 7 的降解”。 c 。m y c 在细胞由g o 期进入g lj | j ，即由静息状态进入增殖状态前就可囡有丝分裂原刺激而表 达大增。在大多数生k 刺激因素作用下，在g 1 期的头两个小时d m y c 即被强烈诱导并在连续增 殖细胞的整个细胞周期中保持高表达。c m y c 蛋白被认为对促进细胞进入s 期完成d n a 合成具 有关键意义：在其他快速早期基冈朱被诱导表达的情况下，c m y c 激活可使细胞提早进入s 期。 血小板生长冈子( p l a t e l e td e r i v e dg r o w t hf a c t o r , p d g f ) 、成纤维细胞生 乏因子( f i b r o b l a s tg r o w t h f a c t o r , f g n 、佛波酯( t u m o rp r o m o t e r1 2 0 - t e t r a d e c a n o y l p h o r b o l 一1 3 - a c e t a l e ，t p a ) 等可促进c m y c 基 因转录，推动细胞周期和增殖，而血清则可在后转录水平上影响c m y c 表达。许多化学物质，如 6 刀豆球蛋白c o n a ( c o n c a n a v a l i n ) 、脂多糖l p s ( 1 i p o p o l y s a e c h a r i d e ) 、植物血球凝集素p h a ( p h y t o h e m a g g l u t i n i n ) 等可使c - m y cm r n a 活化i 。 2 3c 一时c 与细胞凋亡 c m y c 失调( d e r e g u l a t i o n ) 不仅促进细胞繁殖，还能引起特殊培养条件的细胞趋向凋亡，这首 先在i l - 3 依赖3 2 d c l 3 胃髓母细胞中发现。存在i l 3 的高密度培养细胞表现生长限制，但仍有生存 能力，c m y e 下调；当c - m y c 表达上调时，细胞掏亡。e v a n 等也发现过表达的c - m y c 起无血清培 养的r a t - 1 纤维细胞和早期鼠胚胎成纤维细胞凋亡，且凋亡程度与c m y c 表达水平相关2 ”。 23 ，1 c 时c 引起凋亡的下游基因 尽管一些已知基因，如c d c 2 5 a 和o d c 被证明参与c m y c b i 起的凋亡，但目前还没分离到此 途径关键的目的基因。 c d c 2 5 代表c d k 磷酸激酶家族。与h a - r a s 一起引起啮齿动物细胞的转化。缺乏生长因子的成 纤维细胞稳定表达c d c 2 5 a 觚i 起凋亡。c m y e g 起的凋亡反应需要c d c 2 5 a ，但是阻t h c d c 2 5 a 表达并不能消除c m y c 介导的凋亡，说明它并不是c m y 0 3 起的凋亡反应所必需的基因，可能存在 某些候补基因。 p a c k h a m 等研究证实鸟氨酸脱羧酶( o m i t h i n ed e c a r b o x y l a s e ，o d c ) 是c m y c 介导3 2 吣j 3 细胞凋亡的一个介质，但o d c 的阻断也不能完全消除凋亡，据此推测可能还存在其他不依赖0 1 9 ( 2 的凋亡途径。 2 32c - m y o 与抑癌基因6 5 3 d n a 损伤激活肿瘤抑f b l l 司t - p 5 3 通过转录激活p 2 1 、p i g 3 i i p u m a ( p 5 3u p r e g u l a t e dm e d i a t o r o f a p o p o t o s i s ) 等基因，引起生长限制或凋亡。在某些细胞型中，c m y c 介导的凋亡依赖p 5 3 ，如缺 i f - p 5 3 表达的m e f s ，过表达的c m y c 在血消饥锻的条件下不引起凋亡，而存在p 5 3 表达时则引起凋 亡。淋巴细胞和骨髓细胞中，c - m y c 介导的凋亡不依赖p 5 3 ，而上皮细胞中，两种凋亡机制都存在。 2 4c - m y c 癌基因的转录激活功能 c - m y e 的转录激活功能需要三个结构，即n 端的转录激活区( t r a n s a c t i v a t i o n a ld o m a i n ，t a d ) 、 与m a x 结合的结构h l h l z 和d n a 的特异结合区。c m y c 首先与m a x 形成杂台体，然后与靶基 囡启动子的e 盒序列特异性结合l ，此种结合可能引起组蛋白的乙酰化。使基因转录活性增强。 组蛋白乙酰化过程可能还需要一些共作用因子，如t r r a p 和t i p 4 8 4 9 。t r r a p 是组蛋白乙酰化 酶活性复合体的一部分，与m b l l 相互作并j ， i 起染色体重排p ；t i p 4 8 4 9 作用于c - m y c 的n 端， 由丁它们具有a t p 水解和螺旋酶活性，被认为与染色体重排有关p “。e - m y e 正是通过这种途径提 高g 1 甲期c y c l i n d - c d k 4 的活性。c y c l i n d - c d k 4 可以使r b 蛋白磷酸化，随后e 2 f 与高磷酸化 韵r b 分离。e 2 f 是一种转录因子，它能促进一系列细胞周期相关蛋白包括c y e l i ne 、a 的表达， 加速细胞从g 1 剃进入s 期p 。“。m a x 也能与其它b h l h l z 蛋白形成异源复台物，包括m a d l 、 中国农业大学硕上学位论文 第一章绪论 m x i l 、m a d 3 、m a d 4 和m n t 。这些杂台体与m y c - m a x 复合物竞争靶基囡，抑制组蛋白的乙酰化， 从而对抗c - m y c 的转录激活和转化活性。1 3 4 ) 2 5o - m y o 的转录抑制功能 转化生长因子t g f - g ( t r a n f o r m i n gg r o w t hf a c t o r - b ) 在许多细胞类型中是潜在的生长抑制因子， 它通过下调c - m y c 的表达，同时促进细胞躅期素依赖性激酶c d k ( c y c l i nd e p e n d e n t k i n a s e ) 抑制 - f p ：5 、p 2 1 $ 1 1 p 2 7 等的表达而引起生长抑制，阻止细胞增殖，限制细胞丁g l 期。c ，m y c 过度表达的 细胞能对抗t g f - p ，这些证据很好地证明了c m y c 对细胞周期阻滞基囡的负性调节作用叫。c m y c 抑制细胞周期，生长阻滞基因( c e l lc y c l e g r o w t ha r r e s tg e n e s ) 转录至少有两条不同途径。 2 5 1 转录起始子l n r ( i n i t i a t o r ，l n r ) 依赖途径的转录抑制 l n r 是一段y y c a y y y y y 序列( y = 嘧啶碱基) ，c m y c 能抑制启动子含有i n r 序列的基因转录。 关y c - m y e 抑制基因表达的i n r 依赖途径的最早报道显示e - m ”通过与y y i 和t f i i i 蛋白相互作用 引起对靶基因启动子的抑制”。最近的研究发现另个蛋白，m i z 1 ，在c m y c 抑制l n r 启动子的功 能中有重要作用。m i z - 2 是一种锌指蛋白( z i n c f i n g e r p r o t e i n ) 。被认为是c - m y c 的伴侣蛋白( p a r t n e r p r o t e i n ) ，它结台于被e - m y c 抑制的基因的起始点，激活他们转录。女l j m i z - i 能特异结合于p 1 5 、p 2 7 启动子的j n r 序列，促进转录。冈此m i z 1 的过度表达能引起细胞周期限制。c - m y e m a x 复合物能 结合m i z 1 ，阻止了p 3 0 0 的加入，从而消除m i z 1 对靶基因的激活作用。p “”】 2 5 2s o l 和s m d 依赖途径的转录抑制 p 1 5 除了受上述i n r 依赖的转录抑制，还受s p l 和s m a d 依赖途径抑制。此调节位点在p 1 5 启 动予核心部分的上游。c m y c 与活化的s m a d 2 3 结合，再与s p l 形成非活化的s p l s m a d c - m y c 复合体，结合于目的基因的启动子，抑制其转录9 。g a d d 基冈( g r o w t ha r r e s t a n dd n a d a m a g i n g - i n d u c i b l eg e n e ) 的转录调。诲很可能也是通过此种机制。g a d d 4 5 的启动子含有一段富含 g c 的序列，是许多转录因子包括s p l 的结合位点，与p 1 5 相似，c m y c 可能与s p l 相互作用而 抑制g a d d 4 5 的转录) 。 尽管p 2 1 的启动子含有潜在的i n r 序列，c m y c 抑制其表达并不需要d n a 结合，也不需要 m a x 。g a r t e l 等1 的研究表明，c - m y c 通过其中央的s p l 结合区与s p l t 3 的c 端锌指结构相互作 用，此复合物在转录水平抑制p 2 1 的表达。 2 6c 1 i t y c 的激活与肿瘤 2 6 1c - m y c 癌基因的激活 基因扩增即癌基因通过某些机制在原来染色体上复制成多个拷贝，超出止常细胞的癌基因 剂量，导致表达产物增加，干扰了细胞功能，促使细胞转化。研究表明在白血病、结肠癌、乳腺 癌、卵巢癌、小细胞肺癌中均可出现c - m y c 癌基因的扩增。d n a 扩增可达1 5 3 0 倍，此时染色体 8 上出现微粒染色体。 点突变这种机制在c - m y c 激活中不很常见，但近来研究发现，c m y c 在第一外显子不丢失的 染色体移位中，可出现启动子或第一外显子区内的点突变导致的c m y c 失调。 染色体易位也叫基因重排。正常情况下，人类c m y c 癌基因在染色体8 q 2 4 上。免疫球蛋白 基因重链基因，k 链基因及x 链基因分别位于染色体的1 4 q 3 2 ，2 p 3 2 和2 2 q 1 1 。在异常情况下 往往出现c m y c 癌基因易位到免疫球蛋白基因位点的高活性转录区，成为活化的癌基因。 肿瘤病毒插入有些反转录病毒的转化潜能是由于它含有长末端重复序列( 1 0 n gt e r m i n a l r e p e a t ，l t r ) 。l t r 含有强启动子和增强子序列，当它插入到原癌基因特别是插入到原癌基因的 启动子区域或邻近处后，可导致该基因正常调控功能改变，启动和促进基因转录。 d n a 甲基化d n a 甲基化在真核生物基因的表达调控中起着重要作用，d n a 转录非常活跃 的区域，通常甲基化程度较低。在c - m y c 癌基因中，有4 个极易甲基化的c c g g 位点。许多研究 表明在肿瘤细胞中d n a 的甲基化水平和类型发生改变，癌变的细胞总是处于不充分甲基化状态。 2 6 2c - m y c 与肿瘸 c m y c 基因是不死性或永生性癌基因，可使原代细胞持续传代而不出现肿瘤表型。在人类的 i ，= 多肿瘤中，都伴有c - m y e 基因的激活、扩增。单独c m y e 作用并不能引发恶性肿瘤。但其作用 是向恶性转化的重要阶段。c m y e 过度表达可改变细胞内的基因调控，使细胞易于转化为恶性表 型，其他癌基因的活化或抑癌基因的失活均可加速或启动肿瘤发生。c m y c 诱发肿瘤还因为c m y e 可激活基因端粒酶。c m y c 激活端粒酶是通过上调端粒酶的催他理单位t e r t 的m r n a 表达水平 束实现的。正是由于c m y c 与肿瘤的密切关系，才使其成为国内外研究的热点。 2 6 3o - m y o 基因及其蛋白与肿瘤治疗 对化疗药物产生耐药性是人类肿瘤化疗失败的主要原因之一。1 9 9 6 年d o n g 等”“的研究提出， c m y c 基因链问交联( d n ac r o s s l i n k i n g ) 修补增多是导致髓母细胞瘤体外培养d 2 8 3 m e d 细胞系 对环磷酰胺产生耐药性的重要冈素之一。有关c m y c 癌基因在人类肿瘤化疗耐药性方面作用的具 体机制尚需更深入的研究，以指导综合治疗方案的制订和从分子水平解决化疗耐药性问题。 基因疗法为肿瘤治疗带来了新的希望，关于癌基因、抑癌基因的研究进展提示，从根本上治 愈这种疾病最终要落实在分子水平的治疗上。在这方面有关c m y e 癌基因的研究刚刚起步，士要 以反义核酸技术为重点。反义核酸指与m r n a 序列互补的r n a 及寡聚脱氧核萤酸，能与m r n a 杂交形成稳定的双链，阻断其止常翻译，从而在翻译水平抑制基因的表达。1 9 8 8 年w i c k s t r o r n l 4 ” 成功地应用针对c - m y c m r n a 的反义核酸抑制了体外培养h l 6 0 细胞中c m y c 基因的表达和细胞 增生。之后又有人先后j = i j 针对c ，m y cm r n a 翻译起始位点的反义核酸特异性抑制了人脑胶质瘤 b t 3 2 5 和u 8 7 m g 体外培养细胞系中c m y e 蛋白的表达和细胞增生。 反义核酸技术及r n a i 的兴起有可能通过特异性抑制人类肿瘤细胞中c m y c 癌基冈的表达而 抑制肿瘤生k = ，促使细胞向正常表型转化，同时可为综合治疗的改进提供强有力的手段。 9 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 3r n a i 技术 3 1r n a i 介绍 r n a i ( r n ai n t e r f e r e n c e ，r n a i ) 是种由双链r n a 介导的特异性抑制同源基因表达的技术。 r n a i 的首次提出要追溯到1 9 9 8 年，f i r e l 4 4j 等在研究隐杆线虫( c e l e g s ) 基因功能时发现，纯化的 双链r n a ( d o u b l es t r a n dr n a ，d s r n a ) 比反义r n a 更能高教、特异阻断特定基因的表达，它能 导致整个线虫的同渊基因沉默，而且还能阻断其子代第一代同源基因的表达。随后发现在多种生 物，包括果蝇、拟南芥菜、小鼠胚胎细胞及哺乳动物成体细胞中均存在d s r n a 介导的r n a i 现 象，表明r n a i 是生物界普遍存在的一种生命现象。 研究表明，通过转基因、病毒感染或者注入外源基因都能诱发基因沉默。而且这种现象与早 年在植物及真菌的转基因研究中观察到的协同抑制( c o - s u p p r c s s i o n ) 和阻抑( q u e l l i n g ) 现象有高度的 相似性，即抑制基因表达都是由d s r n a 介导的，且出现在转录后水平，故被命名为转录后基因 沉默( p o s t - t r a n s c r i p t i o ng e n es i l e n c i n g ，p t g s ) 。 r n a i 广泛存在于多种生物体表明它对生物的生存意义重大，主要表现在：( 1 ) 防止外来 孩酸的干扰，维持生物体遗转信息传递表达的稳定性。无论是病毒、转基因还是转座子，对生物 体而言都是诱发突变的外来侵入核酸，它们在细胞内引起相应d s r n a 的产生，诱导r n a i 效应， 从而沉默这些基因，避免其基因产物对细胞功能的影响这是生物在长期进化中形成的一种保护 机制m 5 1 。( 2 ) 参与机体发育及细胞分化。对果蝇及线虫的研究表明，一些r n a i 发生不可缺少的 组分同时是机体发育成熟的重要调节因子，可见r n a i 与机体细胞的发育、分化密切相关h “”】。 ( 3 ) 调节基因的表达。在植物中，d s r n a 还可指导同源d n a 序列的甲基化，以调节其表达【4 ”。 r n a i 是在研究反义r n a 技术中首先发现的，它与反义r n a 技术既有联系，又存在差别。 反义r n a 技术是利用完全互补的r n a 与同源性m r n a 仍n a 禁交，封闭m r n a 仍n a ，以阻断 基因的表达。r n a i 则是通过d s r n a 引起同源m r n a 特异性降解引起基因沉默。然而，反义 r n a 亦可麓与m r n a 形成d s r n a ，在一定程度上生成小片段于扰r n a ( s m a l li n t e r f e r e n c er n a ， s i r n a ) 而发挥基因抑制作_ j 。 3 2r n a i 研究进展 随着研究的深入，科学家对于r n a i 的发生机制己达成了初步共识。即外源性( 如病毒) 或内 源性的d s r n a 在细胞内与r n a 酶i i i ( r n a a s el l ie n d o n u c l e a s e ) 一d i c e r 结合，随即被切割成2 1 2 3 n t 的、带有3 端单链尾巴及磷酸化的5 端的2 1 2 3 n t 的短链d s r n a ，是r n a i 的起始诱导物，即 s i r n a 。随后s i r n a 与d i c e r 形成r n a 诱导沉默复台俸( r n ai n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e x ，r i s c ) ， 也称为小干扰性核糖核蛋白复合体( s m a l li n t e r f e r i n gr i b o n u c l e o p r o t e i nc o m p l e x ，s i r n p ) ，并以 s i r n a 作为引导序列，按照碱基互补原则识荆靶m r n a ，引导r i s c 复合体结合m r n a 。接着s i r n a 与m r n a 在复合体中换位，核酸酶d i c e r 将m r n a 切割成2 1 - 2 3 n t 的片段特异性地抑制靶基因 的表达。丽新产生的双链r n a 片段可再次形成r i s c 复台体。继续降解m r n a ，扶而产生级联 放人效应。因此，每个细胞只需要几个s i r n a 分子就能够引起强烈的r n a i 效应”， 人们利用遗传突变子，己经筛选出了大最r n a i 必需基因包括核酸酶基因m u t - 7 ( 线虫) ； 0 中营农业大学礤士学位论文第一章绪论 解旋酶基因：q d e - 3 ( 链孢霉菌) 、s d e 3 、m u t - 6 ；r n a 依赖性r n a 聚合酶基因( r n a d e p e n d e n t r n a p o l y m e r a s e ，r d r p ) ：e g o - 1 、q e d - 1 s d e i 、s g s 2 ( 拟南芥菜) 。 3 3r n i 的应用 3 3 1r n a i 的特点 特异性d s r n a 介导的r n a i 只特异地降解同源m r n a ，其它m r n a 的表达并不受影响，这 是由于s i r n p 对m r n a 降解的选择取决于s i r n a 碱基序列，无关m r n a 不能被识别。 高效性少量d s r n a 即可抑制大量同源m r n a 的表达。 对靶m r n a 切割位点的确定性在s i r n p 核酸酶作用f ，同源m r n a 被切割，切割位点之间 相差2 1 2 3 m 。长链d s r n a 可降解为多种不同序列的s i r n a s ，井生成相应的s i r n p ，由此可在多 个位点切割m r n a 。但这些切点并不是随机的，均位于与s i r n a 反义链的互补序列之中，即在 m r n a5 端与s i r n a s 互补碱基的第1 0 - 11 位之间。 3 3 2r n a i 与基因功能研究 人工诱导r n a i 技术的建立，为人们提供了一种高效的基因功能研究方法。t u s c h l 实验组将 体外构建的s i r n a 分别导入h e l a 细胞( 人类宫颈癌细胞) 、大鼠成纤维细胞和小鼠3 t 3 细胞，分 别抑制了哺乳动物的l a m i nb 1 ，l a m i nb 2 ，n u p l 5 3 ，g a s 4 1 ，a r c 2 l ，c d k l ，p - a c t i n 和7 - a c t i n 等2 1 个不同类型基闪，均获得成功，并重新界定了部分必须基因和非必须基因”。 构建以d n a 为模板的s i r n a 表达载体，将1 9t i t 的目的序歹4 及其反向重复序列插入含有启 动子质粒染色体，同时插入作为检测标志的报告基l 蜀( r e p o r t o r ) ，如g f p ，该表达载体转染细胞后 能够转录出含有】9 个碱基对的茎环状( 发夹状) s i r n a ，诱导r n a i ，有效抑制目的基囚p “。表达 载体的方法将合成s i r n a 的过程转移至细胞内进行，不但效率大大提商，而且可以排除r n a 酶 的干扰，延民s i r n a 的半衰期p ”。更重要的，随着载体质粒的复制、扩增，r n a i 能扩散到整个 机体体，基因抑制效果能够传代。这一方法的应用，使r n a i 技术的应用进入了新阶段。 3 3 3r n a i 与基因治疗 与基冈替代、反义寡核苷酸治疗、细胞因_ f 基因治疗等传统的基因治疗方法相比，r n a i 技 术有着无可比拟的优贽。首先，r n a i 基因抑制效果确切。微量的s i r n a 即可使其编码致病基因 产物的含量下降9 0 以上，达到基因敲除( k n o c h o u t ) 的效果。其次，r n a i 抑制具有严格的序列特 异性，治疗的针对性强，副作用小。 r n a i 技术在抗病毒研究中已经取得了许多重人突破，如抑制爱滋病病毒、肝炎病毒等在细 胞中的表达及复制。美国冷泉港实验室的m c c a f f r e y a p 研究组第一次在活体大鼠体内成功诱导了 r n a i ，使其肝脏内的h c v ( 丙型肝炎病毒) 含肇平均f 降8 1 p “。 肿瘤是多基田、多闪素疾病，单个癌基冈的抑制往往很难达到治疗敛果。由于r n a i 可同时 特异性引起多个不同基冈表达的抑制，而且抑制效果互不干扰，故可利用r n a i 技术特异性封f j 】 在细胞癌变过程中发挥重要作用的原癌基硐、抑癌基冈、凋亡相关基因、生长因子和肛戈其受体、 l l 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 部分关键酶以及多药耐药基因，从而达到治疗肿瘤的目的。 癌基因b c r t a b l 是导致慢性髓性自血病( c m l ) 和急性淋巴细胞白血病( a l l ) 发生的主要致 病基因。w i l d a 等p 4 1 将针对m - b c r a b l 融合基因设计合成的d s r n a 转染慢性髓细胞白血病k 5 6 2 细胞系，结果发现m r n a 的转录和m b c r a b l 原癌蛋白的表达减少；并且由实时定量p c r 和 w e s t e m b l o t t i n g 证实b c r a b l 基冈被敲除，引起强烈的细胞凋亡反应。s u m i m o t o 等p 1 人麻用 r n a i 技术，有效降低了s k p 一2 的水平，通过引起细胞周期调悟蛋白p 2 1 、p 2 7 表达水平的提高， 抑制了人小细胞肺癌细胞( h u m a ns m a l l - c e l ll u n gc a r c i n o m ac e l l s ) 的体外生长。 实验证明。b c l 2 ，c d k 2 ，p l k i ，p 5 3 等肿瘤相关基因的r n a i 抑制能够使人类宫颈癌细胞 增殖速度减慢，恶性程度降低，凋亡加快。肝癌( h e p 3 b ) 、非小细胞肺癌( h 1 2 9 9 ) 、头颈部鳞